Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

Protein Film infraröd elektrokemi visat för studie av H2 Oxidation av en [NiFe] Hydrogenase

doi: 10.3791/55858 Published: December 4, 2017
* These authors contributed equally

Summary

Här, beskriver vi en teknik, protein film infraröd elektrokemi, som tillåter immobiliserade redox proteiner studeras spectroscopically under direkt kontroll av elektrokemiska på en kol elektroden. Infraröda spektra av ett enda protein prov kan registreras på ett utbud av tillämpad potentialer och under en mängd lösning villkor.

Abstract

Förstå kemi redox proteiner krav metoder som ger exakt kontroll över redox centra inom proteinet. Tekniken med protein film elektrokemi, där ett protein är orörlig på en elektrod ytan så att elektroden ersätter fysiologiska Elektronoljedoseringar eller acceptorer, har lämnat funktionella inblick in i redoxreaktioner av en rad olika proteiner. Fullständiga kemiska förståelse kräver elektrokemiska kontroll ska kombineras med andra tekniker som kan lägga till ytterligare strukturella och mekanistiska insikt. Här visar vi en teknik, protein film infraröd elektrokemi, som kombinerar protein film elektrokemi med infraröd spektroskopiska provtagning av redox proteiner. Tekniken använder en multipel-reflektion försvagat totala reflektans geometri sond en redox protein orörlig på en hög yta kimrök elektrod. Införlivandet av denna elektrod i en flöde cell tillåter lösning pH eller Lösningens koncentration ändras under mätningarna. Detta är särskilt kraftfull i att ta itu med redox enzymer, där snabb katalytisk omsättning kan bevaras och kontrollerade på elektroden tillåter spektroskopiska observationer av långlivade mellanliggande arter i katalytiska mekanismen. Vi demonstrera tekniken med experiment på E. coli hydrogenase 1 omsättning (H2 oxidation) och icke-omsättning villkor.

Introduction

En viktig utmaning i studien av proteinfunktion innebär utveckling av i situ metoder som tillåter direkt observation av proteiner som utför sina fysiologiska roller, antingen i vivo eller använda isolerade protein prover. Detta kräver integrering av kontroll eller utlösa processer experimentella rutiner och användning av kombinerade tekniker som tillåter både reaktiviteten bedömas och enskilda kemiska steg under proteinfunktion skall mätas, samtidigt. När det gäller redox proteiner motsvarar detta ofta kombinera elektrokemiska tekniker, som exakt styr tillämpad potential men ger ingen direkt kemisk information, med spektroskopiska tekniker som är känsliga för kemiskt-specifika förändringar i samband med proteinfunktion. 1 , 2 , 3 Spectroelectrochemistry är en allmän term för en rad kopplat elektrokemiska och spektroskopiska metoder som omfattar en mängd olika spektroskopiska tekniker och elektrokemiska kontroll. Många proteiner kan utbyta elektroner med konstgjorda, lösligt Elektronoljedoseringar och acceptorer och detta har utnyttjats i studier som använder små molekyler för att medla elektronöverföring, inklusive koppling med UV-synliga,4,5 , 6 , 7 magnetisk cirkulärdichroism8 och infraröd5,9,10,11,12,13,14 (IR) spektroskopier. I ett begränsat antal fall har det visat sig möjligt att utnyttja oförmedlat, diffusion-kontrollerad elektron utbyte mellan proteiner och elektroder. 15 , 16

För katalytiska reaktioner som utförs av redox enzymer, lösning elektrokemi metoder finns en klar nackdel. Diffusion-controlled electron överföring via redox medlare i lösningen kommer sannolikt att bli hastighetsbegränsning. Kinetiska och mekanistiska information om enzymet kan förloras eller åtminstone bli svårt att deconvolute från diffusion artefakter som härrör från den experimentella metoden. Direkt och oförmedlat elektrokemiska kontroll är därför ett viktigt verktyg för studiet av redox proteiner och enzymer. Tekniken med protein film elektrokemi (PFE) sysselsätter elektrod-orörlig redox proteiner, på ett sådant sätt att elektroner överförs direkt till eller från de redox kofaktorer inom proteinet som elektroden är polariserat på en rad möjligheter. 17 , 18 , 19 PFE är av särskilt värde för studien av oxidation eller reduktion reaktioner katalyseras av enzymer som redox, gränsskiktspänning elektronöverföring kan uppnås med en mycket hög hastighet. Exempelvis mättes elektrokatalytiska Omsättningshastigheten av det nickel-järn ([NiFe]) hydrogenase från Allochromatium vinosum av PFE som ca 1.000-10.000 s−1 för H2 oxidation. 20 elektroden potentiella fungerar som en utlösare att vända katalys 'på' eller 'off', och elektrokatalytiska aktuella rapporter på enzymaktivitet. PFE är därför en värdefull metod för att analysera Reaktiviteten hos komplexa enzymer som intimt beroende av potential, såsom reaktioner av di-järn aktiva platsen för [FeFe]-hydrogenases med CO och O2,21 eller potential-inducerad inaktivering reaktioner av hydrogenases,22 kolmonoxid dehydrogenas,23 och andra komplexa redox enzymer. 24

Det främsta hindren för att kombinera spektroskopiska tekniker med direkt elektrokemiska kontroll ges av PFE uppstår från den låga yttäckning av redox enzymer, storleksordningen 1-2 pmol cm-2 för den [NiFe] hydrogenase från A. vinosum, 20 i förhållande till i situ ytan naturvetenskapliga studier av små molekyler adsorbates på bulk metallelektroderna. Detta är en utmaning för känsligheten i spectroscopic mätningen. Flera spektroelektrokemisk metoder har rapporterats för att studera orörlig redox proteiner på en rad olika elektroder: UV-synliga spektroskopi på transparent metalloxid elektroder; 25 , 26 , 27 fluorescens-spektroskopi på guld elektroder; 28 , 29 surface enhanced infraröd absorption (SEIRA) spektroskopi på guld elektroder; 30 , 31 , 32 , 33 och surface enhanced Raman spektroskopiska tekniker, främst på silver elektroder. 34 , 35

Här beskriver vi en metod för koppling PFE med IR spektroskopi, i en teknik som kallas protein film infraröd elektrokemi (PFIRE). 36 den PFIRE metoden studier redox enzymer orörlig på en hög yta kol arbetselektroden i samband med ett försvagat totala reflektans IR (ATR-IR) geometri, att utnyttja användarvänlighet adsorption av en rad proteiner på kol ytor. IR-spektroskopi är användbar i studier av redox enzymer och proteiner som många små molekyler, ligander och kofaktorer har diagnostiska absorbanserna som kan användas för att bedöma reaktivitet, bindande, hämning och redox tillstånd. Exempel: bindande av nej till järn-svavel centrerar,37 studie av andningskedjans,38,39,40 liten molekyl binder till heme centers etc. 41 ATR-IR-geometri tillåter byggandet av en optimerad tre-elektrod (spectro) elektrokemiska cellen42 och ger därför utmärkt elektrokemiska kontroll. Lösning motstånd och potentiella drift minimeras genom att placera en referenselektrod nära arbetselektroden. Höga yta counter elektroder används som är kompatibla med hög elektrokatalytiska strömmar produceras av snabb enzym omsättning på arbetselektroden. Flödet av lösning genom den spektroelektrokemisk cellen tillåter lättköpt kontroll över koncentrationen av substrat, hämmare och pH. 36 , 43 , 44 den PFIRE metoden tillåter därför IR spectra att vara inspelad i situ under ihållande enzym elektrokatalys. 36 , 44 PFIRE är också kan ge kemisk information i avsaknad av katalytisk nuvarande,43 i motsats till PFE där det kan vara svårt att utvinna information från icke-katalytiska processer i redox enzymer. 45 , 46

Vi har visat den PFIRE metoden för studien av elektrokatalytiska H2 oxidation av [NiFe] hydrogenases, som innehåller inneboende CO och CN ligander samordnas till Fe på en bimetallic aktiv webbplats. 36 , 43 , 44 [NiFe] hydrogenases är därför särskilt väl lämpade att studera genom PFIRE. Metoden PFIRE ger information om de arter som är närvarande under steady state omsättning, och därför ger avgörande mekanistisk insikt förutom rikedomen av litteratur om IR spektroskopi av hydrogenases utan experimentell kontroll över omsättningen. 47 , 48 Dyer och medarbetare har sysselsatt tid-löst IR metoder för att studera av NiFe hydrogenases,49,50,51 med en ljus utlösare att antingen använda ett litet negativa potentiella steg (via användning av lösning medlare och en 'bur' elektron källa) eller photolyse en bunden hydrid. Även om metoden PFIRE kan för närvarande ge tidsupplösning att matcha dessa mätningar,40 det tillåta studie av både reduktiv och oxidativ katalytiska processer, finns på en rad väldefinierade potentialer och fri från masstransporter begränsningar.

Den PFIRE metoden är skild från SEIRA studier av redox proteiner, som också använder ett ATR-IR-geometri och anställa en nanoskala ruggas-upp metall elektroden att förbättra IR absorbans molekyler adsorberat på elektrod ytan. 30 SEIRA är en ytterst värdefull teknik för att studera membranproteiner, särskilt adsorberat på eller inom mimetiska membran arkitekturer,32 men behovet av en metall elektrod kan begränsa substrat och hämmare på grund av reaktivitet av stödet som elektrod för små molekyler som CO, CN, CO2 osv Proton minskning och själv monterade enskiktslager desorption kan vara problematiskt på metallytor på mycket negativ potential, har1,52 även om enzym elektrokatalys på oskyddade metall elektroder rapporterats. 53 , 54 en nackdel med PFIRE i förhållande till SEIRA är relativa svårigheten att införliva membranproteiner i enhetligt eller mimetiska membran arkitekturer. Men gör den relativa kemiska tröghet av kol elektroderna till konkurrerande småmolekylära aktiveringen reaktioner PFIRE en utmärkt teknik för att studera enzym elektrokatalys, särskilt i låg-potential domänen relevanta för biologiska redox processer såsom proton minskning av hydrogenases. 1 , 43

Syftet med denna artikel är att införa metoden PFIRE som en teknik för att studera elektrod-orörlig redox proteiner, med NiFe hydrogenase 1 (Hyd1) från Escherichia coli som exempel. Överväganden för provberedning, kravet på bra substrat flöde och hantering av data diskuteras. PFIRE är en allmänt tillämplig teknik, väl lämpad att studera någon redox protein (med karakteristiska IR absorbanserna) som kan vara adsorberat på Kolelektroder, antingen direkt eller med hjälp av ytmodifiering, sådan att det kan utbyta elektroner med den elektroden.

Protocol

1. återskapa inre prov facket av en FTIR spektrometer inuti en anaerob, torr handskfack och allmänna experimentella krav

  1. Använda en kommersiell FTIR spektrometer utrustad med en extern kvicksilver kadmium telluride (MCT) detektor och ATR tillbehör. Rensa kroppen av spektrometern med torr luft eller Kvävetetroxid, eller alternativt använda en spektrometer med en evakuerade Optisk bänk.
  2. Placera spektrometern på en stabil och vibrationsfri tabell på samma höjd som en anaerob (< 1 ppm O2), torr (daggpunkt <-75 ° C) handskfack. Avleda strålen av spektrometern i glovebox, genom en IR genomskinliga fönster som är tillräckligt stor för att rymma oskärpa balken.
    Obs: Det är viktigt att utrymmet mellan handskfack och spektrometer också är renade eller evakueras, speciellt om en hygroskopisk fönster material, t ex NaCl eller KBr exempelvis används.
  3. Replikera den inre prov facket av spektrometern inuti glovebox.
    1. Rikta strålen inuti glovebox på en off-axeln elliptiskt spegel, helst med samma brännvidd som spektrometern inre fokuserande spegel.
      Obs: Det är bra att ha två ytterligare plan speglar placerade innan denna fokuserande spegel, för att möjliggöra både höjd och riktning mot strålen justeras inuti glovebox; Detta kommer att uppväga eventuella felaktigheter i inledande placeringen av spektrometern.
    2. Placera en extern MCT-detektor, komplett med en lämplig fokus optik (t.ex. ett objektiv med kort brännvidd ZnSe eller off-axeln parabolisk spegel, med en kort brännvidd) inuti glovebox, placerad såsom för att replikera dimensionerna av interna provet fack av spektrometern.
    3. Justera 'fokus' av strålen vara ungefär lika avstånd mellan de fokuserande spegeln och MCT detektorn.
  4. Cool dewar av externa MCT detektorn med flytande kväve.
  5. Montera ATR tillbehöret i handskfack prov facket. Justera indata och utdata fokus optik och ATR tillbehör för att uppnå maximal genomströmning till MCT detektorn. Om nödvändigt, använda en bländare eller annan lämplig dämpning (till exempel en tråd rutnät) att förhindra oversaturation av detektorsignalen.
    Obs: för de data som presenteras här, en fem-reflektion ATR tillbehör med alla reflekterande optik och en flyttbar Trapetsformat Si inre reflektion elementet (IRE) används (Crystal GmbH, mått ca 5 × 8 × 1 mm3, face angle 39,5 °). IRE är monterad i en löstagbar bottenplatta som bearbetas från etereterketonplast (PEEK).
  6. Använda ett handskfack att hysa det återskapade prov facket med lämpliga feedthroughs att tillåta anslutning till ett externt inrymt potentiostat (gas snäva BNC-anslutningar är användbar för detta ändamål), gas tillgång och kablar att överföra signalen från MCT detektorn. Det är viktigt att behålla någon avskärmning på detektorn kabeln att undvika införa brus eller störningar i mätningarna.
  7. Placera en Peristaltisk pump, kan flöden som är större än 60 mL/min släpper glovebox. En schematisk vy av spektrometern, ATR tillbehör, peristaltiska pumpen och potentiostat setup visas i figur 1.
  8. Konstruera en spektroelektrokemisk cell, som det visas schematiskt i figur 2, som tätar mot ATR tillbehör. Cellen bör innehålla en hög yta counter elektrod (Pt tråd eller gasväv), en anslutning för arbetselektroden (kolfiber stav) och en miniatyr referenselektrod. Cellen måste innehålla minst två ytterligare portar som inlopp och utlopp för snabba flödet av lösningar genom cellen.
    Obs: En miniatyr mättade kalomelelektrod som referens är idealisk för detta ändamål. 36

2. beredning av kimrök partiklar modifierad med E. coli Hydrogenase 1

  1. I ett 'vått' anaerob handskfack, blanda 20 mg hög yta kimrök partiklar (> 1 000 m3g) med 1 mL ultrahög renhet vatten (resistivitet > 18 MΩ cm) i en mikrocentrifug rör. Skingra partiklarna av lågenergi-ultraljudsbehandling (< 100 W) i minst 15 minuter, eller tills spridningen är enhetliga och gör inte sediment inom 1 h, för att ge en sotfördelningen med en lastning av cirka 20 mg/mL.
  2. Ta en alikvot av E. coli hydrogenase 1 (Hyd1, ca 50 µL, upprättad enligt en publicerade förfarande55) vid en koncentration på ~ 7 mg protein/mL och byta ut det till en låg jonstyrka buffert vid pH nära den isoelektriska punkten (för exempel kaliumfosfat, 15 mM, pH 5.8, inget extra salt). För att uppnå bästa resultat, Använd ett enzympreparat som är så aktiv som möjligt. Utföra buffert utbyte av koncentration eller utspädning, i en centrifugal filterenhet med en lämplig molekylvikt cutoff (50 kDa fungerar bra för för Hyd1).
    1. Lägga till Hyd1 på filter-enheten.
    2. Späd med ca 450 µL av exchange buffert.
    3. Reconcentrate till en volym på 50 µL med mild centrifugering (< ~ 2700 × g) att förhindra oåterkalleliga nederbörd.
    4. Upprepa steg 2.2.2 och 2.2.3 tills bufferten exchange är klar (vanligtvis inom ~ 5 cykler).
  3. Blanda en 5 µL volym av 20 mg/mL sotfördelningen (förberedd i 2.1) med den 50 µL alikvoten av buffert-utbytte Hyd1. Lagra enzym-partikel blandningen i kylskåp (vid 0 ° C) över natten för att tillåta enzymet att adsorbera. Det kan vara nödvändigt att skaka blandningen då och då för att säkerställa partiklarna förbli splittrade.
  4. Tvätta Hyd1 modifierade partiklarna med låg jonstyrka buffert (kaliumfosfat, 15 mM, pH 5.8, inget extra salt) genom successiva sedimentering och återdispergering cykler i en mikrocentrifug (~ 2 700 × g). Upprepa denna procedur 3 - 5 gånger att ta bort icke-adsorberat enzym.
    Obs: Innan första tvätten supernatanten bör vara nästan färglös, som visar bra adsorption av enzym.
  5. Koncentrera sig partiklarna till en slutlig volym av ~ 5 µL, för att ge en sista lastning ~ 20 mg/ml av enzym-modifierade partiklar.
    Obs: Hyd1-modifierade partiklarna kan lagras vid 4 ° C i upp till två veckor om de förblir återfuktad; Detta uppnås bäst genom att lagra partiklar späds med ~ 50 µL av ultrahög renhet vatten.

3. förberedelser för PFIRE mätningar på E. coli Hydrogenase 1

  1. Rengör den Si vrede genom låg-drivna ultraljudsbehandling (< 100 W), först i H24 (< 90% w/w) ~ 15 min och sedan HNO3 (70% w/w) för upp till 1 tim. Här rengöringsproceduren bör leda till en hydrofil IRE yta. Om ytterligare rengöring krävs IRE kan placeras i piranha lösning (förhållandet 1:3 H2O2: H2SO4) att oxidera resterande organiskt material.
    Obs: Hårda sura rengöring metoder kanske inte lämplig för användning med alla IRE material. Piranha lösningen är starkt frätande och en stark antioxidant, ytor ska vara någorlunda ren innan användning av piranha lösning och vård bör vidtas under beredning och användning av piranha lösning på grund av hur exoterma processen - alltid lägga till H2O 2 långsamt till H2SO4 och hänvisa till de lämpliga säkerhetsrutiner för förberedelse, användning och bortskaffande.
  2. Spola ren IRE i ultrahög renhet vatten, och torka under en ström av torr kvävgas. Utföra alla Prisma hantering med ren pincett för att undvika kontaminering.
  3. Försegla IRE i ATR tillbehör bottenplattan med hjälp av en tunn remsa av elektriska-grade silikon. Var noga med för att begränsa tätningsmedlet till kanterna på IRE. Tillåta tätningsmedlet att torka helt.
  4. Överföra ATR tillbehör bottenplattan till spektrometer glovebox och montera det på ATR tillbehöret. Åtgärd en referens (bakgrund) spektrumet mellan 4000-1000 cm-1 på 4 cm-1 upplösning, använder standard snabbt Skanna funktionsläget av spektrometern och 1024 i genomsnitt interferograms (mättid ~ 3-5 min). Använda detta spektrum som indata så att uträkningen av absorbansen spectra senare i experimentet.
    Obs: På grund av små absorbansen förväntas för den Hyd1 aktiva platsen är det nödvändigt att samla in spectra med hög signal till brus nyckeltal.
  5. Överföra ATR tillbehör bottenplattan till 'vått' glovebox som innehåller färdiga Hyd1-modifierade partikel dispersion (avsnitt 2). Drop-cast en 1 µL alikvot av partikel spridningen på de stora ansiktet av IRE, och Sprid ut dem jämnt över ytan. Obs: Låt inte partiklarna att bli helt torr på IRE.
  6. Skär en bit av karbonpapper, som används som gas diffusion lager material i bränsleceller, till en storlek ~0.1 mm mindre än ytan måtten av IRE (dvs. ca. 8,2 × 4,9 mm2). Ytan på karbonpapper bör vara tillräckligt stor för att täcka drop-cast Hyd1 modifierade partiklarna, men inte så stort att överlappa silikon används för att säkra IRE. Blötlägg karbonpapper i vatten och försiktigt placera den över toppen av partikel filmen. Karbonpapper kommer att ge en bra elektrisk anslutning över hela partikel filmen.
    Obs: Det är fördelaktigt att förbereda flera bitar av karbonpapper i förväg och förvara dem före indränkt i ultrahög renhet vatten inuti 'vått' anaerob glovebox.
  7. Montera spektroelektrokemisk cellen (beskrivs i 1.7 och visas schematiskt i figur 2) över IRE, säkra den i bottenplattan med skruvar. Tillsätt ~ 200 µL av experimentella bufferten att hålla enzymet hydrerad. En blandad buffertsystem kan buffring över ett brett pH-område, är användbart för studier på NiFe hydrogenases:56 natriumacetat, 2-[N'-morpholino] etan-sulfonsyra (MES), N'-[2-hydroxietyl] piperazin -N' -[2-etan-sulfonsyra] (HEPES), N'-tris [hydroxymetyl] metyl-3-amino-propan-sulfonsyra (kranar), och 2-[N'-cyclohexylamino] etan-sulfonsyra (CHES), med varje komponent med en slutlig koncentration på 15 mM och innehåller 0,1 M koncentrerad NaCl som stödjande elektrolyt, med pH justerat till pH 6 med NaOH och HCl.
    Obs: Arbetande elektroden anslutningen ska sticka ut något under planet av spektroelektrokemisk cell toppen (~0.1 mm) för att säkerställa bra elektronisk anslutning till karbonpapper (figur 2).
  8. Anslut lösning in- och utlopp av spektroelektrokemisk cellen till ett flödessystem som innehåller peristaltiska pumpen slangar och en flaska med experimentella bufferten. Överföra monterade cellen till 'torra' glovebox innehållande spektrometern.
  9. Montera spektroelektrokemisk cell församlingen på ATR tillbehöret. Anslut arbetande, räknare och referenselektroder till potentiostaten. Anslut den peristaltiska pump slangen till pumpen.
  10. Spela en absorbans spektrum med 1024 i genomsnitt interferograms 4 cm-1 upplösning över en spektralområde 4 000-1 000 cm-1, använder spektrumet samlas i 3.4 som referens/bakgrund. På denna punkt spektrumet bör innehålla betydande (> 100 mO.D.) amide II band på ~ 1 540 cm-1 och aktiva platsen band av Hyd1 bör vara tydligt i den spektrala regionen 1,850-2,150 cm-1, till stor del i oxiderat, inaktiva staterna (figur 3 ).

4. aktivering av E. coli Hydrogenase 1 och testning cellen spektroelektrokemisk

  1. Tillämpa en reducerande potential (−0, 8 V vs SCE) till Hyd1-modifierade partikel film. Mätta experimentella bufferten med H2 och flöde buffert långsamt genom den spektroelektrokemisk cellen. Lämna provet över natten för att fullt ut aktivera Hyd1.
    Obs: Det är viktigt att använda anaerob H2, N2 etc.och så alla anaeroba gaser ska skickas genom ett O2 filter.
  2. Spela in en absorbans spektrum av provet efter aktiveringen. De νCO och vCN band av den aktiva platsen bör nu visa en fördelning av reducerad, 'aktiv' stater. Detta observeras lättast med hjälp av en skillnaden spektrum, i förhållande till det spektrum som registrerats i 3.10 (figur 4).
  3. Testa den elektriska anslutningen av spektroelektrokemisk cellen. Detta gör att mätta experimentella bufferten med N2 gas. Tillämpa en sekvens av oxiderande (0 V vs SCE) och minska (−0, 8 V vs SCE) potentialer (av ca 30 min längd) till Hyd1-modifierade partikel filma och spela in en absorbans spektrum vid varje. Hyd1 bör bli snabbt oxideras och reduceras, och om partikel filmen är väl ansluten 100% av provet bör reagera på tillämpad potential.
  4. Ställ in en lämplig flöde av experimentella bufferten. För att göra detta, applicera en reducerande potential (−0, 8 V vs SCE) till provet, och mätta experimentella bufferten med H2. Spela in en serie av cykliska voltamogrammen mellan-0.707 - 0,039 V vs SCE på en avsökningshastighet av 10 mV/s. gradvis öka flödet klassar av H2-mättade buffert mellan voltamogrammen tills den katalytiska vågform liknar det vid en planar roterande skiva elektrod55 och den maximala strömmen är oberoende av flöde (figur 5).
    Obs: Löslighet H2 i vatten är ~0.8 mM på 293 K och 1 bar.
  5. Eftersom provet är nu redo för PFIRE mätningar, samla spectra på en rad potentialer, enligt en rad lösning tillstånd (pH, temperatur, H2 koncentration osv). Registrera alla elektrokemiska data med programvaran potentiostat eftersom det är viktigt att kunna korrelera spektroskopiska och elektrokemiska data, speciellt när man studerar elektrokatalytiska processer såsom H2 oxidation av Hyd1.

5. spektroskopiska datahantering

  1. Bekräfta att den aktiva platsen inte har permanent ändrats under mätningarna av inspelning spectra vid 0 V och −0, 8 V vs SCE slutet av experimentet. Dessa bör vara identisk med spektra registreras i 4.3 och ingen förlust av aktiv plats bör observeras under mätningen (figur 6).
  2. Exportera absolut absorbansen spectra från spektrometer mjukvaran i ett lämpligt format (CSV, ASCII, 'matlab', Jcamp etc.) för bearbetning med hjälp av programvara såsom ursprung eller Matlab.
  3. Baslinjen korrekt data, med hjälp av processen illustreras i figur 7.
    1. Ta andra derivatan av varje absorbansen spektrum i det intervallet 1 800-2 150 cm-1, för att identifiera små (< 1, mO.D.) aktiva platsen band mot högt-böjda vatten bakgrund.
    2. Placera baslinjen markören pekar på det ursprungliga absorbansen spektrumet och ange points to 'snap' till experimentella spektrum.
    3. Passa en originalplan genom punkter med en interpolerade kubisk spline-funktion eller ett polynom funktion. Subtrahera denna baslinje funktion från experimentella data.

Representative Results

Figur 1 visar en schematisk representation av den experimentella ordningen av spektrometer, handskfack, ATR-tillbehör, potentiostat och gas flöde systemet användas för PFIRE mått. Figur 2 visar en representant ritning av cellen spektroelektrokemisk.

Figur 3 visar absorbansen spektra av drop-cast Hyd1 modifierade partiklar, med experimentell bufferten (en blandad buffertsystem, beskrivs i 3.7, pH 6,0) flödar genom den spektroelektrokemisk cellen. Ytan täckningen av Hyd1 är särskilt hög i exemplet som visas i figur 3, med en amid II bandet intensitet av ~ 235 mO.D. och minimal 'bulk' vatten vilket framgår av omfattningen av regionen O-H stretching (~ 3 000-3 600 cm-1) i förhållande till bandet på ~ 1 640 cm-1, som är en faltning av amiden jag band av Hyd1 och vatten H-O-H böjen. Extra band på grund av proteinet kan ses i regionen C-H stretching (ca 2900 cm-1). Breda bandet centrerad kring 2 100 cm-1 är en kombination band av H-O-H böjande vibrationer med en uppsättning av lägre energi libration band, som är begränsad rotationer av H2O molekyler på grund av väte bindning nätverket i flytande vatten. ΝCO bandet i delstaten oxiderat, inaktiva, Ni-B den aktiva platsen är tydligt på 1 943 cm-1, även utan baslinjekorrektion, och νCN funktioner är klart synliga mellan 2 050-2 100 cm-1 . Vid hög Hyd1 omfattningar, mycket av den kimrök film57 mikroporös struktur blir blockerad av enzym och därför 'bulk' vatten koncentrationen sänks under PFIRE mätningar.

Spektra i figur 3 visar att, före aktivering, Hyd1 filmer innehåller Hyd1 i oxiderat, inaktiv stater. Aktivering övernattning på −0, 8 V vs SCE under en H2 atmosfär leder till bildandet av minskas, katalytiskt aktiv som visas i figur 4 som visar en aktiverad (nedsatt) minus som förberedda (oxiderat) skillnaden spektrum av Hyd1. Skillnaden spektra av Hyd1 kan tolkas tydligast med νCO regionen. Varje unik delstaten den aktiva platsen har bara ett CO band jämfört med två CN band och νCN regionen är därför intimt mer komplicerat, med många överlappande band. Skillnaden spektrumet i figur 4 visar att aktivering leder till förlust (negativa absorption band) av oxiderade, inaktiva Ni-B och en liten mängd av Ni-SI (mest oxiderade 'aktiv' staten) som var närvarande i filmen som förberedda Hyd1. Dessa ersätts med 'aktiv' påstår av Hyd1; Ni-C, Ni-R och Ni-L. Observera att det finns två former av både Ni-R och Ni-L stater, vilket framgår av de två νCO banden observerats för dessa arter i figur 4. Observationen av flera Ni-R och Ni-L stater är överens med andra NiFe-hydrogenases. 48 , 58 , 59

En verifiering av metoden PFIRE är att den cykliska voltamogrammen registreras av Hyd1 inuti spektroelektrokemisk flöde cell showen liknande katalytiska waveshapes de inspelade på en planar roterande skiva elektrod. 55 i praktiken innebär detta att mass transport av substrat (H2) och produkten (H+) till och från immobiliserade Hyd1 i cellen spektroelektrokemisk är effektiv vid de flöden som används under PFIRE mätningar. Effekten av flödet på den katalytiska vågform visas i figur 5, som visar successiva voltamogrammen registreras under en H2 atmosfär (1 bar) lösning flödet genom cellen spektroelektrokemisk ökas. I alla fall överspänning för H2 oxidation av Hyd1 är identiska (röd skuggade rektangel), men omfattningen av oxidativ inaktivering (hysteres mellan aktuellt under oxidativ och reduktiv sveper på potentialer ovan ca 0 V vs SCE) och maximal H2 oxidation nuvarande är beroende av lösning flöde. Vid flöden över 52 mL/min (ljus grå voltamogrammen) den katalytiska vågform är okänslig för ytterligare ökar flödet.

Figur 6 jämför νCO bandet Ni-B statens relativa stödnivåerna efter inledande aktivering och anaerob re-oxidering vid 0 V vs SCE (under en Ar atmosfär, som beskrivs i 4.3) och anaeroba oxidativ inaktivering under en Ar atmosfär på 0 V vs SCE efter 48 hr kontinuerlig experiment (enligt beskrivningen i 5.1). Ingen förlust av aktiv plats bandet intensitet observeras under mätningen, och alla Hyd1 provet svarar på de tillämpa potentialerna.

Figur 7 visar baslinjen korrigeringsförfarandet används i hela detta arbete. Den absoluta spectrumen av Hyd1 provet i regionen aktiva platsen (figur 7en) innehåller betydande krökning på grund av vatten. Kravet att använda vatten som lösningsmedel är i själva verket ett problem för de flesta tillämpningar av IR spektroskopi inom livsvetenskaperna. Andraderivatan av absoluta spektrumet (figur 7b), beräknas med hjälp av Origin programvaran med Savitsky-Golay utjämning över ett 9 punkt fönster, kan användas för att identifiera skarpa band av den Hyd1 aktiva platsen mot böjda bakgrund. Identifiering av ungefärliga topp positioner använder ett andra derivat spektrum tillåter baslinjen ankarpunkter att placeras i regioner av absoluta spektrumet som är fria från aktiva platsen band (cirklar i figur 7en). En kubisk spline funktion monteras sedan genom dessa fästpunkter att skapa en baslinje-funktion som kan sedan subtraheras från det absoluta spektrumet för att ge ett baslinje-korrigerade spektrum innehållande endast toppar som härrör från den Hyd1 aktiva platsen (figur 7 ( c).

Figur 8 visar resultaten av en PFIRE mätning på Hyd1, både icke-omsättning (Ar atmosfär) och omsättningen (H2 atmosfär) villkor på ett utbud av potentialer. 36 den aktuell tid spår (figur 8en) rapporten på den katalytiska aktuellt vid varje tillämpas potential och förbli nära noll ström villkor icke-omsättning (Ar atmosfär). Partiell spektroelektrokemisk redox titrering i figur 8b rapporterar därför på jämvikt redox beteendet hos den aktiva platsen, visar fördelningen av stater som förväntat vid varje potential i avsaknad av katalytisk omsättning. Spektra i figur 8c spelades omsättning villkor (under en H2 atmosfär) och därför representerar steady state fördelningen av aktiv webbplats stater närvarande under katalytisk H2 oxidation av Hyd1. Att steady-state-förhållanden har uppnåtts bekräftas av det faktum att katalytisk H2 oxidation nuvarande (figur 8en, H2) förblir konstant som en funktion av tiden vid −0.199 V och −0.074 V vs hon; monoton förfalla i strömmen vid +0.356 V vs hon beror på välkända anaerob oxidativ inaktivering av Hyd1. 55 fördelningen av aktiv webbplats stater är klart olika under Ar och H2 på alla potentialer där Hyd1 utför katalys (figur 8b, spectra på −0.199, −0.074 och +0.356 V vs hon). Spektra registrerats under Ar och H2 är nästan identiska på −0.594 V vs hon dock och detta utgör ett viktigt test av experimentella konsistens; Hyd1 minskar inte H+ med en betydande hastighet vid pH 6,0 (strömmen i figur 8en under både Ar och H2 är nära noll), och spektra på −0.594 V förväntas därför vara samma.

Figur 9 visar anaeroba oxidativ inaktivering av Hyd1 via bildandet av Ni-B från Ni-SI under H2 oxidering vid +0.356 V.36 Spectra spelades in under grå tidsintervall noterade på aktuell tid tracen i figur 9en. −0.074 V Hyd1 genomgår inte oxidativ inaktivering och fördelningen av aktiva platsen staterna förblir konstant under hela steget hela potential. Detta framgår av spektra i figur 9bi, som rapporterar absoluta baseline-korrigerade spektrumet i början av −0.074 potentiella steg och figur 9bii som spelades vid en senare tid under den potentiella steget och redovisas som ett skillnaden spektrum i förhållande till figur 9bjag. Spektra i figur 9biii och biv redovisas också skillnaden spectra i förhållande till figur 9bjagoch visar gradvis omvandling av Ni-SI till Ni-B under hög potential inaktivering, konsekvent med monoton minskningen i nuvarande visas på +0.356 V i figur 9en.

Spectra inspelad på en rad lösning pH ger inblick i proton överföringen steg under den katalytiska Hyd1 cykel. 43 Figur 10 en visar PFIRE spectra inspelade på samma Hyd1 film pH 3,0 och pH 9.0, med hjälp av lösning flöde i cellen spektroelektrokemisk för att utbyta experimentella bufferten. Relativa halterna av Ni-C och Ni-L staterna är klart olika i dessa två spectra. Vid varierande tillämpad potential under icke-omsättning förhållanden påstår det potentiella beroendet av NiC och Ni-L kan bestämmas snabbt på en rad olika pH-värden (figur 10b), och båda har befunnits vara isopotential över ett brett pH-område. (Observera att peak absorbanserna i figur 10b visar bara Ni-C och Ni-L staterna för tydlighetens skull full redox titreringar av Hyd1 har rapporterats av Hidalgo m.fl.) 36 en pH titrering av koncentrationerna av Ni-C och Ni-L kan då extraheras, med peak absorbansen vid potentialer där den totala koncentrationen av Ni-C och Ni-L är vid högsta vid varje pH (figur 10c). På detta sätt, och i samband med EPR data identifierades en pH balans mellan Ni-C och Ni-L stater. 43

Figure 1
Figur 1: Schematiskt ordningen av IR spektrometer, anaerob handskfack, ATR tillbehör, MCT detektor, gas flödessystem och potentiostat används för PFIRE mätningar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Schematisk bild av den spektroelektrokemisk cell som används för PFIRE mätningar, visar ordningen av elektroder och lösning inlopp/utlopp. Cellen och bottenplatta bearbetas från etereterketonplast (PEEK), med skruvhål för kol spö arbetar elektrod anslutning, Pt counter tråden, mättade kalomelelektrod som referens, och lösningen inlopp och utlopp. Mättad kalomel referens elektrod konstruktionen är som tidigare rapporterats. 36 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: absorbansen spektrum av Hyd1-modifierade kimrök partiklar, deponeras på IRE och uppblött med buffert. Positionerna för de amide jag bandet, amide II band och Hyd1 aktiva platsen region visas, tillsammans med ytterligare funktioner på grund av C-H stretching vibrationer och lösningsmedel vatten. Infällt visar en förstorad bild av regionen aktiva platsen, med vCO vCN banden och märkt. 'Som förberedda' partiklar innehåller Hyd1 främst i tillståndet oxiderat, inaktiva Ni-B. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Aktivering av Hyd1 på −0, 8 V vs SCE under en H2 atmosfär, presenteras som en minskad minus oxiderat skillnaden spectrum. Vid låga potentiella aktivering oxideras, konverterar inaktiva Ni-B (och en liten koncentration av Ni-SI) till mer reducerade, aktiv påstår Ni-C, Ni-R och Ni-L. Observera att Hyd1 har två distinkta undertillstånd av Ni-L och Ni-R. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Effekten av lösning flöde på vågform av katalytisk cykliska voltamogrammen registreras i cellen spektroelektrokemisk. Voltamogrammen spelades på ökande flöden av H2-mättade buffert som anges. Med en flödeshastighet av 20 mL/min (röd) visar i voltamogrammen betydande inaktivering ovan 0 V vs hon på framåt Skanna. Vid flöden över 52 mL/min omfattningen av inaktivering är betydligt lägre och strömmen är oberoende av flöde på alla potentialer. Andra parametrar: 1 bar H2, 10 mV/s samplingshastighet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : Baseline korrigerade IR spectra i regionen aktiva platsen νCO i oxiderat, inaktiva Ni-B tillstånd vid 0 V vs SCE. Det finns ingen mätbar förlust av aktiv plats intensitet under 48 h kontinuerliga PFIRE mätningar och därför Hyd1 är adsorberat kraftfullt på kimrök partiklarna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: Detaljer för de förfaranden för korrigering av baslinjen som används för datahantering. Baslinjen fästpunkter är placerade på absoluta absorbansen spektrumet i regionen aktiv webbplats (en), för att undvika eventuella νCO och νCN toppar identifierade från en andra derivat analys (b). Det resulterande baslinjen korrigerade spektrumet visas i (c). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 8
Figur 8: PFIRE mätningar på Hyd1 under icke-omsättning (Ar) och omsättningen (H2) villkor. (en) aktuell tid spår av Hyd1 i cellen spektroelektrokemisk i Ar-mättade (grå) och H2-mättade (svart) buffer; (b), (c), PFIRE spektra visar regionen νCO vid varje potential under Ar (b) och H2 (c). Potentialer citerat V vs hon. Reproducerad med tillstånd från Hidalgo m.fl. 35 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 9
Figur 9: Anaerob inaktivering av Hyd1 via bildandet av Ni-B från Ni-SI. (en) aktuell tid spår under en H2 atmosfär, visar en stabil elektrokatalytiska nuvarande −0.074 V och långsam anaerob inaktivering (monoton minskning i nuvarande) på +0.356 V vs hon. (b), Spectra noterats under de grå skuggade områden markerade i (a). Spectrum bjag är en baslinje korrigerade spektrum spelas in i början av −0.074 V potentiella steg. Spectrum bii, inspelad vid en senare tidpunkt under −0.074 V steg, redovisas som en skillnad spektrum i förhållande till bjag och visar att sker ingen förändring i distribution av aktiv webbplats stater, konsekvent med stabiliteten i potentialen vid −0.074 V. Spectra biii och biv redovisas också skillnaden spectra i förhållande till bjag och Visa gradvisa omvandlingen av Ni-SI till Ni-B under anaeroba inaktivering på +0.356 V vs hon. Reproducerad med tillstånd från Hidalgo m.fl. 35 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 10
Figur 10 : Spectra inspelad på en rad lösning pH ge inblick i proton överföringen steg under Hyd1 katalytiska cykeln. (en) IR spectra som visar regionen νCO i Hyd1, inspelad i pH 3,0 (-54 mV vs hon) och pH 9,0 (-334 mV vs hon). (b), spektroelektrokemisk titreringar genomfördes för att bestämma den potentialen som Ni-C och Ni-L halterna är högst vid en rad lösning pH-värden. Bara Ni-C och Ni-L koncentrationerna visas för tydlighetens skull för en full spektroelektrokemisk titrering av Hyd1 se Hidalgo m.fl. 36 (c) pH beroende av den relativa koncentrationen av Ni-C och Ni-L, bestämd genom en serie experiment som de visas i (b). Spectra registrerades vid 20 ° C. Anpassad med tillstånd från Murphy et al. 42 Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

PFIRE är en allmänt tillämplig IR spektroskopisk teknik för adressering elektrod-orörlig redox proteiner. Elektrokatalytiska reaktioner av redox enzymer kan i synnerhet vara probed snabb omsättning villkor. Metoden PFIRE bygger på direkta elektrokemiska kontroll som tillhandahålls av tekniken av PFE, som ger inga direkta strukturinformation, och par det att IR spektroskopi på en kol elektroden. Metoden PFIRE således lägger kemisk insikt till tillgänglig information från elektrokemi ensam och är mycket lämpad att studera redox proteiner och enzymer involverade i liten molekyl bindning och aktivering. PFIRE kan dessutom ge information om potential beroende av strukturella förändringar i proteiner i avsaknad av katalytisk omsättning. Sådana icke-omsättning elektron överföring händelser är ofta svåra att upptäcka med hjälp av 'standard' tillämpningar av PFE, även om tillägget av PFE att Fourier-omvandlad AC voltametri har använts med stor framgång. 45 , 46

Den PFIRE metoden är, i princip, lämplig för studier av något redox-protein som kan studeras med hjälp av PFE. Därför, som med PFE, protein adsorption är ett kritiskt steg för en framgångsrik PFIRE experiment. I detta protokoll beskriver vi ett program i PFIRE teknik med E. coli Hyd1 som en fallstudie. 36 , 43 men vi har också tillämpat PFIRE tekniken att den cytoplasmiska reglerande hydrogenase från R. eutropha,44 och titulerades mononucleotide adsorberat på kimrök. 40 i alla dessa fall, enkla fysiska adsorption till oförändrad hög yta kimrök (som beskrivs i detta protokoll) ger en yttäckning av protein som är tillräckligt hög för att bra inspelningskvalitet IR spectra med högt signal-brus-förhållande. I fall där sådana höga nivåer av adsorption inte kan uppnås kan det vara nödvändigt att ändra ytan av kolpartiklar, till exempel att tillåta covalent tillbehöret av protein till elektrod ytan. 60 , 61 , 62 ett handskfack för PFIRE mätningar används endast absolut nödvändigt när man studerar prover som måste hanteras anaerobt. Men i praktiken den extremt konstant och låg (< 80 ° C daggpunkt) nivåer av vattenånga som tillhandahålls av glovebox atmosfären ger hög signal-brus-nivåer som tillåter utvinning av mycket små absorbanserna. 44 i många fall en syrefri miljö, till exempel som tillhandahålls av glovebox, är också önskvärt för elektrokemisk mätning (integrerad med tekniken som PFIRE) för att undvika nuvarande på grund av O2 minskning på arbetselektroden.

IR absorbanserna på grund av bulk vatten, experimentell buffertar och de kolpartiklar som provet är adsorberat bidrar avsevärt till de experimentella spectrana och kan överlappa band av intresse, särskilt i amiden I, II och III regioner i den Spectrum. 63 regionen amide innehåller också information från organiska arter såsom flaviner eller nikotinamid kofaktorer, såväl som substrat och produkter av många oxidation och reduktion reaktioner. När det gäller NiFe hydrogenases, νCO och νCN band av den aktiva platsen faller i en relativt tydlig region av spektrumet och så den PFIRE tekniken är mycket väl lämpad för studier av dessa enzymer. I andra fall dock kan skillnaden spectra tillsammans med isotopiska märkning metoder behövas att isolera förändringar på grund av immobiliserade proteinet. Liknande metoder har använts att identifiera, exempelvis protonation förändringar, strukturella rearrangements och studera Michaelis-Menten komplex med IR spektroskopi. 64 , 65 , 66 PFIRE begränsas inte, därför att studien av hydrogenases men kan tillämpas på något redox protein som innehåller (eller vars substrat, produkter eller hämmare innehålla) grupper med diagnostiska IR-aktiva vibrationer; kolmonoxid dehydrogeanses67 nitrogenases,68,14 andningskedjans,40 formate mellan östradiol och östron, till exempel.

Den relaterade tekniken, SEIRA, är mycket väl lämpad för studier av membran-associerade proteiner i biomimetiska miljö. 32 SEIRA är en anpassning av IR spektroskopi som också använder ett ATR-IR, och använder sig av en yta enhancement effekt som förstärker IR absorbansen av molekyler som ligger nära (inom några nm) ytan av ATR prismat (IRE). SEIRA är därför utsökt känslig för spektrala förändringar som inträffar inom den adsorberade protein och membran arkitekturen och är relativt fri från konkurrerande signaler från lösningsmedel och substrat/hämmare finns i lösningen. Detta är något i motsats till den PFIRE teknik som beskrivs här som förlitar sig på en betydligt större genomträngningsdjupet ovanför ytan av IRE (~ 1 µm), vilket innebär att PFIRE är mer känsliga för substrat, produkter eller hämmare presentera i lösning. Denna ökade känslighet för 'bulk' lösningsmedel kan vara fördelaktiga; om den substrat eller produkt kan observeras direkt av IR, rapportera PFIRE spectra om båda steady-state kinetiken för långlivat aktiva arter och associerade produkten bildandet under elektrokatalys. 69 förmåga att iaktta steady state-koncentrationer av substrat och produkten kommer att vara särskilt värdefull för enzymer såsom kolmonoxid dehydrogenas (som katalyserar reversibel oxidation av CO till CO2, en stark IR absorbator) eller formate dehydrogenas (som katalyserar reversibel oxidation av formate till CO2).

För närvarande är PFIRE begränsad till steady state kinetiska studier av enzymet elektrokatalys på grund av de makroskopiska Kolelektroder brukade 'koncentrera' enzymet på ytan av en IRE för insamlingen av uppgifter och ATR-IR geometri. I detta avseende är PFIRE studier av NiFe hydrogenases kompletterande arbete Dyer och medarbetare,49,50 som använder ljus-utlöst övergående absorption IR spektroskopi för att studera sub omsättning kinetik. Arbete pågår för att krympa den spektroelektrokemisk cellen,40 och med användning av mikroelektroder tidsupplösning på order av mikrosekunder bör uppnås. Det gör att studien av sub omsättning kinetik för enzymer med omsättning frekvenser upp till ca 100-500 s-1, och gör det möjligt att studera både reduktiv och oxidativa processer.

Sammantaget är PFIRE en spektroskopisk teknik som tillåter kemisk karakterisering av elektrokatalytiska reaktioner av redox enzymer under steady state-förhållanden. Den PFIRE metoden tillåter flera kemiska och elektrokemiska titreringar skall utföras på samma enzym prov, eftersom de höga yta elektroder används ger en robust adsorption av protein och ATR-IR geometri tillåter lättköpt lösning exchange. Förmågan att samla sådan strukturell information i situ under enzym funktion är ett ovärderligt verktyg för samhället i bioelektrokemi.

Disclosures

Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

K.A.V. och P.A.A. arbete stöddes av Europeiska forskningsrådet (EnergyBioCatalysis-ERC-2010-StG-258600), teknik och Physical Sciences Research rådet IB katalysator award EP/N013514/1, och bioteknik och biologiska vetenskaper forskning Rådet (BB/L009722/1 och BB/N006321/1). R.H. stöddes av Ministerio de Ciencia y Tecnologìa, Universidad de Costa Rica, och Lincoln College, Oxford. Författarna erkänner Mr Charlie Jones, Mr Charlie Evans och personal på den mekaniska verkstaden (Institutionen för kemi) för hjälp med design och tillverkning av spektroelektrokemisk celler som används i detta arbete.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectrometer Agilent 680-IR with an external MCT detector
ATR accessory Pike Technologies GladiATR Customised for use with a 5-reflection Si IRE
Glovebox Glove Box Technology Ltd. N/A Custom designed 'wet' and 'dry' box for anaerobic sample handling and measurement
KBr window Crystran Custom To allow coupling of the glovebox with the external beam of the FTIR spectrometer
Additional optics Agilent N/A Components from a PM-IRRAS accessory
Silicon IRE Crystal GmbH Custom Trapezoidal: 8.4 mm x 5 mm (large face), 1 mm thickness, ca 39 degree face angle
Potentiostat Metrohm Autolab PGSTAT 128N
Nova 10.1 Metrohm Software for controlling the potentiostat
Peristaltic pump Williamson Manufacturing Company Ltd QL-1000-024-300
Pt wire Surepure Chemetals 3272 99.95% Pure Platinum Wire, 0.014 inch Diameter
Carbon rod WH Smith 30729209 0.7 mm HB pencil lead
Carbon black Cabot Corporation Black Pearls 2000
Ultrasonic bath Ultrawave U100 35 W
Centrifugal filter Merck Millipore UFC5050BK Amicon Ultra, 50 KDa MW cutoff
Microcentrifuge Eppendorf 5452000018 MiniSpin
NaCl Sigma 71376
H2SO4 Fisher S/9240/PB17
HNO3 Fisher N/2300/PB17
silicone sealant Cow Corning Toray Co., Ltd. SE 4486
Carbon paper Toray TGP-H-030
H2 gas BOC
N2 gas BOC
OriginPro 2015 OriginLab Data analysis/graphing software
Resolutions Pro 4.0 Varian Software for controlling FTIR spectrometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ash, P. A., Vincent, K. A. Spectroscopic analysis of immobilised redox enzymes under direct electrochemical control. Chem. Commun. 48, (10), 1400-1409 (2012).
  2. Sezer, M., Millo, D., Weidinger, I. M., Zebger, I., Hildebrandt, P. Analyzing the catalytic processes of immobilized redox enzymes by vibrational spectroscopies. IUBMB Life. 64, (6), 455-464 (2012).
  3. Melin, F., Hellwig, P. Recent advances in the electrochemistry and spectroelectrochemistry of membrane proteins. Biol. Chem. 394, (5), 593-609 (2013).
  4. Dong, S., Niu, J., Cotton, T. M. Ultraviolet/visible spectroelectrochemistry of redox proteins. Methods Enzymol. 246, 701-732 (1995).
  5. Hellwig, P., et al. Electrochemical and Ultraviolet/Visible/Infrared Spectroscopic Analysis of Heme a and a3 Redox Reactions in the Cytochrome c Oxidase from Paracoccus denitrificans Separation of Heme a and a3 Contributions and Assignment of Vibrational Modes. Biochemistry. 38, (6), 1685-1694 (1999).
  6. Wu, S., et al. Redox chemistry of the Schizosaccharomyces pombe ferredoxin electron-transfer domain and influence of Cys to Ser substitutions. J. Inorg. Biochem. 105, (6), 806-811 (2011).
  7. Whitehouse, C. J. C., et al. A Highly Active Single-Mutation Variant of P450BM3 (CYP102A1). ChemBioChem. 10, (10), 1654-1656 (2009).
  8. Marritt, S. J., van Wonderen, J. H., Cheesman, M. R., Butt, J. N. Magnetic circular dichroism of hemoproteins with in situ control of electrochemical potential: "MOTTLE". Anal. Biochem. 359, (1), 79-83 (2006).
  9. Moss, D., Nabedryk, E., Breton, J., Mäntele, W. Redox-linked conformational changes in proteins detected by a combination of infrared spectroscopy and protein electrochemistry. Eur. J. Biochem. 187, (3), 565-572 (1990).
  10. Iwaki, M., et al. Direct Observation of Redox-Linked Histidine Protonation Changes in the Iron-Sulfur Protein of the Cytochrome bc1 Complex by ATR-FTIR Spectroscopy. Biochemistry. 44, (11), 4230-4237 (2005).
  11. Marshall, D., et al. ATR-FTIR Redox Difference Spectroscopy of Yarrowia lipolytica and Bovine Complex I. Biochemistry. 45, (17), 5458-5467 (2006).
  12. Lacey, A. L. D., Gutiérrez-Sánchez, C., Fernández, V. M., Pacheco, I., Pereira, I. A. C. FTIR spectroelectrochemical characterization of the Ni-Fe-Se hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris Hildenborough. J. Biol. Inorg. Chem. 13, (8), 1315-1320 (2008).
  13. Millo, D., et al. Spectroelectrochemical Study of the [NiFe] Hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F in Solution and Immobilized on Biocompatible Gold Surfaces. J. Phys. Chem. B. 113, (46), 15344-15351 (2009).
  14. Paengnakorn, P., et al. Infrared spectroscopy of the nitrogenase MoFe protein under electrochemical control: potential-triggered CO binding. Chem. Sci. 8, (2), 1500-1505 (2017).
  15. Male, L., et al. Protein voltammetry and spectroscopy: integrating approaches. Theor. Chem. Acc. 119, (1-3), 107-111 (2008).
  16. Healy, A. J., Ash, P. A., Lenz, O., Vincent, K. A. Attenuated total reflectance infrared spectroelectrochemistry at a carbon particle electrode; unmediated redox control of a [NiFe]-hydrogenase solution. Phys. Chem. Chem. Phys. 15, (19), 7055-7059 (2013).
  17. Léger, C., Bertrand, P. Direct Electrochemistry of Redox Enzymes as a Tool for Mechanistic Studies. Chem. Rev. 108, (7), 2379-2438 (2008).
  18. Armstrong, F. A., Hirst, J. Reversibility and efficiency in electrocatalytic energy conversion and lessons from enzymes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, (34), 14049-14054 (2011).
  19. Gates, A. J., et al. The relationship between redox enzyme activity and electrochemical potential-cellular and mechanistic implications from protein film electrochemistry. Phys. Chem. Chem. Phys. 13, (17), 7720-7731 (2011).
  20. Pershad, H. R., et al. Catalytic Electron Transport in Chromatium vinosum [NiFe]-Hydrogenase: Application of Voltammetry in Detecting Redox-Active Centers and Establishing That Hydrogen Oxidation Is Very Fast Even at Potentials Close to the Reversible H+/H2 Value. Biochemistry. 38, (28), 8992-8999 (1999).
  21. Goldet, G., et al. Electrochemical Kinetic Investigations of the Reactions of [FeFe]-Hydrogenases with Carbon Monoxide and Oxygen: Comparing the Importance of Gas Tunnels and Active-Site Electronic/Redox Effects. J. Am. Chem. Soc. 131, (41), 14979-14989 (2009).
  22. Vincent, K. A., Parkin, A., Armstrong, F. A. Investigating and Exploiting the Electrocatalytic Properties of Hydrogenases. Chem. Rev. 107, (10), 4366-4413 (2007).
  23. Parkin, A., Seravalli, J., Vincent, K. A., Ragsdale, S. W., Armstrong, F. A. Rapid and Efficient Electrocatalytic CO2/CO Interconversions by Carboxydothermus hydrogenoformans CO Dehydrogenase I on an Electrode. J. Am. Chem. Soc. 129, (34), 10328-10329 (2007).
  24. van Wonderen, J. H., Burlat, B., Richardson, D. J., Cheesman, M. R., Butt, J. N. The Nitric Oxide Reductase Activity of Cytochrome c Nitrite Reductase from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 283, (15), 9587-9594 (2008).
  25. Schaming, D., et al. Spectroelectrochemical Characterization of Small Hemoproteins Adsorbed within Nanostructured Mesoporous ITO Electrodes. Langmuir. 28, (39), 14065-14072 (2012).
  26. Kemp, G. L., et al. Opportunities for mesoporous nanocrystalline SnO2 electrodes in kinetic and catalytic analyses of redox proteins. Biochem. Soc. Trans. 37, (2), 368-372 (2009).
  27. Renault, C., et al. Unraveling the Mechanism of Catalytic Reduction of O2 by Microperoxidase-11 Adsorbed within a Transparent 3D-Nanoporous ITO Film. J. Am. Chem. Soc. 134, (15), 6834-6845 (2012).
  28. Krzemiński, Ł, et al. Spectroelectrochemical Investigation of Intramolecular and Interfacial Electron-Transfer Rates Reveals Differences Between Nitrite Reductase at Rest and During Turnover. J. Am. Chem. Soc. 133, (38), 15085-15093 (2011).
  29. Akkilic, N., Kamran, M., Stan, R., Sanghamitra, N. J. M. Voltage-controlled fluorescence switching of a single redox protein. Biosens. Bioelectron. 67, 747-751 (2015).
  30. Ataka, K., Heberle, J. Electrochemically Induced Surface-Enhanced Infrared Difference Absorption (SEIDA) Spectroscopy of a Protein Monolayer. J. Am. Chem. Soc. 125, (17), 4986-4987 (2003).
  31. Millo, D., Hildebrandt, P., Pandelia, M. -E., Lubitz, W., Zebger, I. SEIRA Spectroscopy of the Electrochemical Activation of an Immobilized [NiFe] Hydrogenase under Turnover and Non-Turnover Conditions. Angew. Chem. Int. Ed. 50, (11), 2632-2634 (2011).
  32. Ataka, K., Stripp, S. T., Heberle, J. Surface-enhanced infrared absorption spectroscopy (SEIRAS) to probe monolayers of membrane proteins. Biochim. Biophys. Acta, Biomembr. 1828, (10), 2283-2293 (2013).
  33. Kozuch, J., et al. Voltage-dependent structural changes of the membrane-bound anion channel hVDAC1 probed by SEIRA and electrochemical impedance spectroscopy. Phys. Chem. Chem. Phys. 16, (20), 9546-9555 (2014).
  34. Silveira, C. M., et al. SERR Spectroelectrochemical Study of Cytochrome cd1 Nitrite Reductase Co-Immobilized with Physiological Redox Partner Cytochrome c552 on Biocompatible Metal Electrodes. PLoS One. 10, (6), 0129940 (2015).
  35. Todorovic, S., Hildebrandt, P., Martins, L. Surface enhanced resonance Raman detection of a catalytic intermediate of DyP-type peroxidase. Phys. Chem. Chem. Phys. 17, (18), 11954-11957 (2015).
  36. Hidalgo, R., Ash, P. A., Healy, A. J., Vincent, K. A. Infrared Spectroscopy During Electrocatalytic Turnover Reveals the Ni-L Active Site State During H2 Oxidation by a NiFe Hydrogenase. Angew. Chem. Int. Ed. 54, (24), 7110-7113 (2015).
  37. Grabarczyk, D. B., Ash, P. A., Vincent, K. A. Infrared Spectroscopy Provides Insight into the Role of Dioxygen in the Nitrosylation Pathway of a [2Fe2S] Cluster Iron-Sulfur Protein. J. Am. Chem. Soc. 136, (32), 11236-11239 (2014).
  38. Kriegel, S., Uchida, T., Osawa, M., Friedrich, T., Hellwig, P. Biomimetic Environment to Study E. coli Complex I through Surface-Enhanced IR Absorption Spectroscopy. Biochemistry. 53, (40), 6340-6347 (2014).
  39. El Khoury, Y., Van Wilderen, L. J. G. W., Bredenbeck, J. Ultrafast 2D-IR spectroelectrochemistry of flavin mononucleotide. J. Chem. Phys. 142, (21), 212416 (2015).
  40. Ash, P. A., et al. Synchrotron-Based Infrared Microanalysis of Biological Redox Processes under Electrochemical Control. Anal. Chem. 88, (13), 6666-6671 (2016).
  41. Nakamoto, K. Infrared and Raman Spectra of Inorganic and Coordination Compounds. Part B. John Wiley & Sons, inc. (2009).
  42. Bard, A., Faulkner, L. R. Electrochemical Methods: Fundamentals and Applications. John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  43. Murphy, B. J., et al. Discovery of Dark pH-Dependent H+ Migration in a [NiFe]-Hydrogenase and Its Mechanistic Relevance: Mobilizing the Hydrido Ligand of the Ni-C Intermediate. J. Am. Chem. Soc. 137, (26), 8484-8489 (2015).
  44. Ash, P. A., et al. Electrochemical and Infrared Spectroscopic Studies Provide Insight into Reactions of the NiFe Regulatory Hydrogenase from Ralstonia eutropha with O2 and CO. J. Phys. Chem. B. 119, (43), 13807-13815 (2015).
  45. Lee, C. -Y., et al. Theoretical and experimental investigation of surface-confined two-center metalloproteins by large-amplitude Fourier transformed ac voltammetry. J. Electroanal. Chem. 656, (1-2), 293-303 (2011).
  46. Adamson, H., et al. Electrochemical evidence that pyranopterin redox chemistry controls the catalysis of YedY, a mononuclear Mo enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, (47), 14506-14511 (2015).
  47. De Lacey, A. L., Fernández, V. M., Rousset, M., Cammack, R. Activation and Inactivation of Hydrogenase Function and the Catalytic Cycle: Spectroelectrochemical Studies. Chem. Rev. 107, (10), 4304-4330 (2007).
  48. Lubitz, W., Ogata, H., Rüdiger, O., Reijerse, E. Hydrogenases. Chem Rev. 114, (8), 4081-4148 (2014).
  49. Greene, B. L., Wu, C. -H., McTernan, P. M., Adams, M. W. W., Dyer, R. B. Proton-Coupled Electron Transfer Dynamics in the Catalytic Mechanism of a [NiFe]-Hydrogenase. J. Am. Chem. Soc. 137, (13), 4558-4566 (2015).
  50. Greene, B. L., Wu, C. -H., Vansuch, G. E., Adams, M. W. W., Dyer, R. B. Proton Inventory and Dynamics in the Nia-S to Nia-C Transition of a [NiFe] Hydrogenase. Biochemistry. 55, (12), 1813-1825 (2016).
  51. Greene, B. L., Vansuch, G. E., Wu, C. -H., Adams, M. W. W., Dyer, R. B. Glutamate Gated Proton-Coupled Electron Transfer Activity of a [NiFe]-Hydrogenase. J. Am. Chem. Soc. 138, (39), 13013-13021 (2016).
  52. Sezer, M., et al. Role of the HoxZ Subunit in the Electron Transfer Pathway of the Membrane-Bound [NiFe]-Hydrogenase from Ralstonia eutropha Immobilized on Electrodes. J. Phys. Chem. B. 115, (34), 10368-10374 (2011).
  53. Heering, H. A., Wiertz, F. G. M., Dekker, C., de Vries, S. Direct Immobilization of Native Yeast Iso-1 Cytochrome c on Bare Gold: Fast Electron Relay to Redox Enzymes and Zeptomole Protein-Film Voltammetry. J. Am. Chem. Soc. 126, (35), 11103-11112 (2004).
  54. dos Santos, L., Climent, V., Blanford, C. F., Armstrong, F. A. Mechanistic studies of the "blue" Cu enzyme, bilirubin oxidase, as a highly efficient electrocatalyst for the oxygen reduction reaction. Phys. Chem. Chem. Phys. 12, (42), 13962-13974 (2010).
  55. Lukey, M. J., et al. How Escherichia coli Is Equipped to Oxidize Hydrogen under Different Redox Conditions. J. Biol. Chem. 285, (6), 3928-3938 (2010).
  56. Jones, A. K., et al. Enzyme Electrokinetics: Electrochemical Studies of the Anaerobic Interconversions between Active and Inactive States of Allochromatium vinosum [NiFe]-hydrogenase. J. Am. Chem. Soc. 125, (28), 8505-8514 (2003).
  57. Quinson, J., et al. Comparison of carbon materials as electrodes for enzyme electrocatalysis: hydrogenase as a case study. Faraday Trans. 172, (0), 473-496 (2014).
  58. Shafaat, H. S., Rüdiger, O., Ogata, H., Lubitz, W. [NiFe] hydrogenases: A common active site for hydrogen metabolism under diverse conditions. Biochim. Biophys. Acta, Bioenerg. 1827, (8-9), 986-1002 (2013).
  59. Ash, P. A., Hidalgo, R., Vincent, K. A. Proton transfer in the catalytic cycle of NiFe hydrogenases: insight from vibrational spectroscopy. ACS Catalysis. (2017).
  60. Krishnan, S., Armstrong, F. A. Order-of-magnitude enhancement of an enzymatic hydrogen-air fuel cell based on pyrenyl carbon nanostructures. Chem. Sci. 3, (4), 1015-1023 (2012).
  61. Baffert, C., et al. Covalent Attachment of FeFe Hydrogenases to Carbon Electrodes for Direct Electron Transfer. Anal. Chem. 84, (18), 7999-8005 (2012).
  62. Rüdiger, O., et al. Enzymatic Anodes for Hydrogen Fuel Cells based on Covalent Attachment of Ni-Fe Hydrogenases and Direct Electron Transfer to SAM-Modified Gold Electrodes. Electroanal. 22, (7-8), 776-783 (2010).
  63. Barth, A., Zscherp, C. What vibrations tell about proteins. Q. Rev. Biophys. 35, (4), 369-430 (2002).
  64. Jiang, X., et al. Resolving voltage-dependent structural changes of a membrane photoreceptor by surface-enhanced IR difference spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, (34), 12113-12117 (2008).
  65. Kottke, T., Lòrenz-Fonfrìa, V. A., Heberle, J. The Grateful Infrared: Sequential Protein Structural Changes Resolved by Infrared Difference Spectroscopy. J. Phys. Chem. B. 121, (2), 335-350 (2017).
  66. Callender, R., Dyer, R. B. The Dynamical Nature of Enzymatic Catalysis. Acc. Chem. Res. 48, (2), 407-413 (2015).
  67. Ciaccafava, A., et al. When the inhibitor tells more than the substrate: the cyanide-bound state of a carbon monoxide dehydrogenase. Chem. Sci. 7, (5), 3162-3171 (2016).
  68. George, S. J., Ashby, G. A., Wharton, C. W., Thorneley, R. N. F. Time-Resolved Binding of Carbon Monoxide to Nitrogenase Monitored by Stopped-Flow Infrared Spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 119, (27), 6450-6451 (1997).
  69. McPherson, I. J., Ash, P. A., Jacobs, R. M. J., Vincent, K. A. Formate adsorption on Pt nanoparticles during formic acid electro-oxidation: insights from in situ infrared spectroscopy. Chem Commun. 52, (85), 12665-12668 (2016).
Protein Film infraröd elektrokemi visat för studie av H<sub>2</sub> Oxidation av en [NiFe] Hydrogenase
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ash, P. A., Hidalgo, R., Vincent, K. A. Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase. J. Vis. Exp. (130), e55858, doi:10.3791/55858 (2017).More

Ash, P. A., Hidalgo, R., Vincent, K. A. Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase. J. Vis. Exp. (130), e55858, doi:10.3791/55858 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter