Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Protein Film kızılötesi elektrokimya H2 oksidasyon çalışma için [NiFe] Hydrogenase tarafından gösterdi

Published: December 4, 2017 doi: 10.3791/55858
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Chemistry, University of Oxford, Inorganic Chemistry Laboratory
* These authors contributed equally

Summary

Burada, bir tekniği, spectroscopically karbon elektrot, doğrudan elektrokimyasal kontrol altında incelenecektir immobilize Redoks proteinler sağlar protein film kızılötesi elektrokimya açıklayın. Kızılötesi spectra tek protein örneği bir mesafeden uygulanan potansiyelleri ve çözüm koşulları çeşitli altında kaydedilir.

Abstract

Kimya Redoks üzerinde tam denetim sağlamak Redoks protein talepleri yöntemlerini anlama protein içinde ortalar. Bir elektrot yüzeyinde böyle olduğunu fizyolojik elektron bağış veya alıcısı, elektrot değiştirir bir protein immobilize neden protein film elektrokimya tekniği farklı bir dizi Redoks reaksiyonları fonksiyonel içgörü sağlamıştır proteinler. Tam kimyasal ek yapısal ve mekanik fikir ekleyebilirsiniz diğer teknikleri ile kombine olarak elektrokimyasal denetim gerektirir. Burada biz bir tekniği, protein film elektrokimya Redoks proteinler kızılötesi spektroskopik örnekleme ile birleştiren protein film kızılötesi elektrokimya göstermek. Yüksek yüzey alanı karbon siyah elektrot üzerinde immobilize bir Redoks protein yoklama için birden çok yansıma zayıflatılmış toplam yansıma geometri tekniğini kullanır. Bu elektrot birleşme bir akış hücreye çözüm pH veya çözünen konsantrasyonları ölçümleri sırasında değiştirilecek sağlar. Bu özellikle Redoks enzimler, nerede hızlı katalitik ciro sürekli ve uzun ömürlü ara türlerin spektroskopik gözlem katalitik yönteminde izin elektrot, kontrollü ele güçlüdür. Biz tekniği E. coli hydrogenase 1 ciro (H2 oksidasyon) ve ciro olmayan koşullar altında üzerinde deney ile göstermek.

Introduction

Çalışmada protein işlevi, önemli bir sorun doğrudan gözlem fizyolojik rollerini, in vivo veya kullanarak taşıyan proteinlerin protein örnekleri izole izin in situ yöntem geliştirme içerir. Bu protein işlevi aynı anda ölçülen sırasında denetim veya işlemleri deneysel prosedürler ve her iki reaktivite değerlendirilmek izin kombine tekniklerin kullanılması halinde tetikleme bütünleştirilmesi ve bireysel kimyasal adımları gerektirir. Redoks proteinler durumunda bu kez kesin olarak uygulanan potansiyel kontrol ama özel için kimyasal hassas spektroskopik teknikleri ile doğrudan hiçbir kimyasal bilgi sağlamak elektrokimyasal teknikleri birleştirerek için eşittir protein fonksiyonu ile ilgili değişiklikler. 1 , 2 , 3 Spectroelectrochemistry spektroskopik teknikler ve düzeyde elektrokimyasal denetimler kapsayacak eşleşmiş elektrokimyasal ve spektroskopik yöntemleri bir dizi için genel bir terimdir. Çoğu protein yapay, çözünür elektron bağış ve alıcısı ile elektron alış verişi yapabilir ve bu çalışmalarda hangi küçük moleküller elektron transferi kavraması ile UV-görünür,4,5 de dahil olmak üzere, arabuluculuk için istismar , 6 , 7 manyetik dairesel dichroism8 ve kızılötesi5,9,10,11,12,13,14 (IR) spectroscopies. Sınırlı bir dizi davayı proteinler ve elektrotlar arasında unmediated, difüzyon kontrollü elektron alış verişi yararlanmaya mümkün kanıtlamıştır. 15 , 16

Katalitik reaksiyonlar için açık bir dezavantaj Redoks enzimler, çözüm elektrokimya yaklaşımlar mevcut tarafından yürütülen. Difüzyon kontrollü elektron transferi yoluyla Redoks arabulucu çözüm olmak büyük olasılıkla hızı sınırlaması. Kinetik ve mekanik enzim hakkında bilgi kayıp veya en azından deneysel yönteminden kaynaklanan Difüzyon eserler üzerinden deconvolute zor olur. Doğrudan, unmediated elektrokimyasal kontrol bu nedenle Redoks proteinler ve enzimler için önemli bir araçtır. Protein film elektrokimya (PFE) tekniği Redoks elektrodu immobilize proteinler, elektrot potansiyelleri bir dizi polarize gibi elektron doğrudan yerel bilgisayardan veya Redoks Kofaktörler protein içinde transfer edilir şekilde çalışmaktadır. 17 , 18 , 19 interfacial elektron transferi çok yüksek bir oranda elde edilebilir gibi PFE oksidasyon veya azaltma reaksiyonları katalize Redoks enzimler tarafından incelenmesi için belirli değeri var. Örneğin, nikel-demir ([NiFe]) hydrogenase Allochromatium vinosum gelen electrocatalytic Ciro oranı olarak ca 1.000 10.000 s– 1 H2 oksidasyon için PFE tarafından ölçüldü. 20 elektrot potansiyel kataliz 'on' veya 'off' ve electrocatalytic geçerli raporlar enzim aktivite için tetikleyici olarak davranır. PFE bu nedenle potansiyel reaksiyonlar [FeFe] di-demir etkin sitenin gibi yakından bağlıdır karmaşık enzimler reaktivite analiz etmek için değerli bir yöntem-CO ve O2,21 ile hydrogenases veya potansiyel kaynaklı hydrogenases,22 karbon monoksit dehidrojenaz,23 ve diğer karmaşık Redoks enzimler inactivation reaksiyonları. 24

1-2 pmol cm-2 [NiFe] hydrogenase A. vinosumgelen sırasına Redoks enzimlerin düşük yüzey kapsama PFE tarafından tanınan doğrudan elektrokimyasal kontrol spektroskopik teknikleri birleştiren için asıl engel kaynaklanmaktadır, 20 in situ yüzey bilim çalışmaları toplu metal elektrotlar üzerinde küçük molekül adsorbates göre. Bu bir meydan okuma spektroskopik ölçüm hassasiyeti sunuyor. Birkaç Spektroelektrokimyasal yöntem bildirilmiştir eğitimi için immobilize Redoks proteinler farklı elektrotlar bir mesafeden: UV-görünür spektroskopisi, şeffaf metal oksit elektrotlar; 25 , 26 , 27 Floresans spektroskopisi, altın elektrot; 28 , 29 yüzey kızılötesi emme (SEIRA) spektroskopisi altın elektrotlar, Gelişmiş; 30 , 31 , 32 , 33 ve yüzey Raman spektroskopik teknikleri, gümüş elektrotlar, prensip olarak gelişmiş. 34 , 35

Burada PFE IR spektroskopisi, protein film kızılötesi elektrokimya (PFIRE) bilinen bir tekniği ile kaplin bir yöntem açıklanmaktadır. 36 PFIRE yöntemi bir yüksek yüzey alanı karbon çalışma elektrot adsorpsiyon proteinler karbon yüzeyler üzerine bir dizi kolaylığı istismar bir zayıflatılmış toplam yansıma IR (ATR-IR) geometri ile birlikte üzerinde immobilize Redoks enzimler çalışmaları. Gibi birçok küçük moleküller, ligandlar ve Kofaktörler reaktivite, bağlama, inhibisyonu ve Redoks durumu değerlendirmek için kullanılan tanı absorbances IR spektroskopisi Redoks enzimler ve protein çalışmalarda yararlı olur. Bağlama No37 çalışma flavoproteins,38,39,40 küçük molekül heme merkezleri vbbağlama demir-kükürt merkezlerine, örnekler. 41 ATR-IR geometri inşaat bir en iyi duruma getirilmiş üç-elektrot (spectro) elektrokimyasal hücre42 ve bu nedenle mükemmel elektrokimyasal kontrol sağlar. Çözüm direnç ve potansiyel drift bir referans elektrot çalışma elektrot yakın yerleştirerek en aza indirilir. Yüksek yüzey alanı counter elektrotlar hızlı enzim ciro çalışma elektrot, tarafından üretilen yüksek electrocatalytic akımları ile uyumlu kullanılır. Solution'ı Spektroelektrokimyasal hücre akışının yüzeylerde, inhibitörleri ve pH konsantrasyon üzerinde facile kontrolü sağlar. 36 , 43 , 44 PFIRE yöntemi bu nedenle IR spectra sürekli enzim electrocatalysis sırasında kaydedilen situ içinde olmasını sağlar. 36 , 44 PFIRE Ayrıca katalitik geçerli,43 nerede Redoks enzimlerin katalitik sigara süreçleri gelen bilgileri ayıklamak zor olabilir PFE aksine yokluğunda kimyasal bilgi verebilmektedir. 45 , 46

Bimetal aktif Fe için koordine içsel CO ve CN ligandlar içeren [NiFe] hydrogenases tarafından eğitim electrocatalytic H2 oksidasyon PFIRE yöntem göstermiştir. 36 , 43 , 44 [NiFe] hydrogenases bu nedenle PFIRE tarafından çalışma özellikle de uygundur. PFIRE yöntemi kararlı durum ciro sırasında mevcut türler hakkında bilgi sağlar ve bu nedenle çok önemli mekanik kavrama yanı sıra edebiyat hazinesi IR spektroskopisi, hydrogenases deneysel kontrol olmadan sağlar ciro. 47 , 48 Dyer ve ortak çalışanlar NiFe hydrogenases,49,50,ya da küçük bir negatif potansiyel adım (kullanımyolu ile uygulamak için hafif bir tetikleyici kullanma51 çalışmaya zaman çözüldü IR yöntemler çözüm arabulucu ve bir 'Kafesli' elektron kaynağı) veya photolyse bağlı Hidrit. Her ne kadar PFIRE yöntemi şu anda, bu ölçümler maç için zaman çözünürlüğü iyi tanımlanmış potansiyelleri mesafeden erişilen indirgeyici ve oksidatif katalitik işlemler çalışma izin ve toplu taşıma ücretsiz40 sağlayamaz sınırlamalar.

PFIRE yöntemi SEIRA çalışmaları da bir ATR-IR geometri kullanabilecek ve IR Absorbans moleküllerinin elektrot yüzeyinde adsorbe geliştirmek için bir Nano-pürüzlü metal elektrot istihdam Redoks proteinlerin ayrıdır. 30 SEIRA membran proteinlerinin, özellikle üzerinde adsorbe çalışmak için son derece değerli bir tekniktir veya içinde mimetic membran mimarileri,32 ama metal elektrot için ihtiyaç nedeniyle reaktivite substrat ve inhibitörü kapsam sınırlayabilirsiniz CO, CN-, CO2 vb gibi küçük moleküllerin doğru elektrot desteği Her ne kadar korumasız olarak enzim electrocatalysis elektrot metal proton azaltma ve kendi kendine monte monolayer desorpsiyon çok olumsuz potansiyelleri, metal yüzeylerde sorunlu olabilir,1,52 bildirilmiştir. 53 , 54 yerel veya mimetic membran mimarileri membran proteinlerinin birleşmeyle göreli zorluk PFIRE SEIRA göre bir dezavantajdır. Ancak, karbon elektrotlar rakip küçük molekül harekete geçirmek reaksiyonlar için göreli kimyasal hareketsizlik enzim electrocatalysis, özellikle de düşük potansiyel etki alanı için biyolojik Redoks ilgili çalışmak için mükemmel bir teknik PFIRE yapar proton azaltma tarafından hydrogenases gibi süreçleri. 1 , 43

Bu makalenin amacı Redoks elektrodu immobilize proteinler, Escherichia coli üzerinden NiFe hydrogenase 1 (Hyd1) örnek olarak kullanarak eğitim için bir teknik olarak PFIRE yöntemi tanıtmaktır. Numune hazırlama, iyi yüzey akışı ve veri işleme gereksinimini konuları ele alınmıştır. PFIRE bir tekniktir geniş uygulanabilir, karbon elektrotlar de doğrudan adsorbe herhangi bir Redoks protein (ile karakteristik IR absorbances) eğitim veya yüzey modifikasyonu, öyle ki elektron ile değiştirebilirsin kullanarak uygun elektrot.

Protocol

1. bir FTIR Spektrometre bir anaerobik, Kuru torpidoda ve genel deneysel koşullar içinde iç örnek bölmesinin yeniden

  1. Bir dış Merkür kadmiyum telluride (MCT) dedektörü ve ATR aksesuar ile donatılmış bir ticari FTIR Spektrometre kullanın. Kuru hava veya diazot Spektrometre gövdesini temizlemek veya alternatif olarak bir Spektrometre ile tahliye bir optik tezgah kullanın.
  2. Bir anaerobik olarak aynı yükseklikte Spektrometre istikrarlı, titreşim içermeyen bir tablo üzerine yerleştirin (< 1 ppm O2), Kuru (çiğ noktası <-75 ° C) torpidoda. Spektrometre IR demeti ufuk ışın kapsayacak kadar geniş bir IR şeffaf pencere üzerinden torpidoda içine başka yöne çek.
    Not: özellikle NaCl veya KBr gibi higroskopik pencere malzeme Örneğin, kullanılırsa torpidoda ve Spektrometre arasındaki boşluğu da tasfiye veya tahliye, önemli değildir.
  3. Spektrometre torpidoda içinde iç örnek bölmesinin çoğaltmak.
    1. Işını Spektrometre iç odaklanma ayna olarak aynı odak uzaklığı ile ideal bir eksen dışı ellipsoidal ayna üzerine torpidoda içinde doğrudan.
      Not: Yüksekliği ve torpido içinde ayarlanacak IR ışın yönünü izin vermek için bu odak ayna önce yerleştirilen iki ek düzlem aynalar yararlıdır; Bu ilk Spektrometre yerleşimini herhangi bir yanlışlık mahsup.
    2. Bir dış MCT dedektörü yer, tam ile uygun bir torpido içinde (kısa odak uzaklığı ZnSe lens veya eksen dışı parabolik ayna kısa bir odak uzaklığı ile gibi) optik odaklama konumlandırılmış gibi iç örnek boyutları çoğaltmak için Spektrometre bölmesinin.
    3. Odaklama ayna ve MCT Dedektör arasında yaklaşık olarak eşit uzaklıkta olması IR demetinin odağı ayarlayın.
  4. Dış MCT bulmak sıvı azot ile dewar ne yapıyorsun?
  5. ATR Aksesuar torpidoda örnek yuvası içine monte. Giriş ve çıkış optik ve ATR Aksesuar MCT Detector maksimum verim elde etmek için odaklanan hizalayın. Gerekirse, bir diyafram veya uygun diğer zayıflama (örneğin bir tel ızgara) oversaturation Dedektör sinyal engellemek için kullanın.
    Not: Burada, tüm yansıtıcı optik ve çıkarılabilir bir trapez Si iç yansıma öğesi (IRE) kullanılan beş-yansıma ATR aksesuarıyla sunulan veriler için (Crystal GmbH, boyutları ca 5 × 8 × 1 mm3, yüz açısı 39,5 °). IRE polieter eter keton (göz) işlenmiş çıkarılabilir bir baseplate monte edilir.
  6. Bir harici olarak yer alan potansiyostat izin vermek için uygun feedthroughs ile yeniden oluşturulmuş örnek bölme evine bir torpido kullanın (gaz sıkı BNC bağlantıları yararlı bu amaç için), gaz erişim ve kablolarını sinyal MCT aktarmak için Dedektör. Herhangi bir tanıtımı gürültü ya da müdahale ölçümleri için önlemek için Dedektör kablonun koruyucu korumak önemlidir.
  7. Peristaltik pompa, Kabil akış hızı 60 mL/dak torpidoda içinde daha büyük bir yer. Spektrometre şematik, ATR Aksesuar, Peristaltik pompa ve potansiyostat Kur şekil 1' de gösterilen.
  8. ATR mühürler Şekil 2, şematik gösterilen aksesuar gibi bir Spektroelektrokimyasal hücre oluşturmak. Hücre bir yüksek yüzey alanı counter elektrot (Pt tel veya gazlı bez), çalışma elektrot (karbon çubuk) ve bir minyatür referans elektrot için bir bağlantı içermelidir. Hücre olarak giriş ve çıkış hücre çözümleri hızlı akışı için en az iki başka bağlantı noktaları içermelidir.
    Not: Bir minyatür doymuş kalomel referans elektrot bu amaç için idealdir. 36

2. E. coli Hydrogenase 1 ile modifiye karbon siyah parçacıklar hazırlanması

  1. Bir 'ıslak' anaerobik torpido, 20 mg yüksek yüzey alanının karbon siyah parçacıklar mix (> 1000 m3/g) 1 mL ultrahigh saflık su ile (direnci > 18 MΩ cm) bir microcentrifuge tüp. Parçacıklar tarafından düşük güç sonication dağıtmak (< 100W) en az 15 dk ya kadar dağılım üniforma ve yaklaşık 20 mg/mL bir karbon siyah dağılımı bir yükleme ile vermek değil tortu 1 h içinde yok.
  2. ~ 7 mg protein/mL konsantrasyonu E. coli hydrogenase 1 (Hyd1, yayımlanmış yordamı55göre hazırlanan yaklaşık 50 µL) bir aliquot alın ve içine bir düşük iyonik gücü arabellek (için isoelectric noktası yakın bir pH değişimi örnek potasyum fosfat, 15 mM, pH 5.8, ek tuz). En iyi sonuçları elde etmek için etkin olarak bir enzim hazırlık kullanın. Arabellek exchange (Hyd1 için de için 50 kDa çalışır) konsantrasyon ve seyreltme, uygun bir molekül ağırlığı kesme santrifüj filtre aygıtla tarafından gerçekleştirin.
    1. Hyd1 filtre aygıt ekleme.
    2. Exchange arabellek yaklaşık 450 µL ile sulandırmak.
    3. 50 µL hafif Santrifüjü kullanarak bir birime reconcentrate (< ~ 2700 × g) geri dönüşü olmayan yağış önlemek için.
    4. Arabellek exchange (genellikle ~ 5 döngü içinde) tamamlanana kadar 2.2.2 ve 2.2.3 adımları yineleyin.
  3. 20 mg/mL 5 µL hacmi (2.1 hazır) karbon siyah dağılım arabellek değiş tokuş Hyd1 50 µL aliquot ile karıştırın. Enzim-parçacık karışımı bir buzdolabı (0 ° C'de) gecede enzim absorbe izin vermek için saklayın. Zaman zaman parçacıkları dağınık kalır emin olmak için karışım sallamak için gerekli olabilir.
  4. Bir microcentrifuge (~ 2.700 × g) birbirini izleyen sedimantasyon ve yeniden dağılım döngüleri tarafından Hyd1-modified parçacıklar düşük iyonik gücü arabelleği (potasyum fosfat, 15 mM, pH 5.8, ek tuz) ile yıkayın. Bu işlemi 3 - 5 kez tekrarlayın sigara adsorbe enzim kaldırmak için.
    Not: daha önce ilk yıkama süpernatant neredeyse renksiz, enzim iyi adsorpsiyon gösteren olmalıdır.
  5. ~ 5 µL, son hacmiyle parçacıklar ~ 20 mg/mL enzim-modified parçacıkların son yüklenmesini vermek için konsantre ol.
    Not: susuz kalırsa Hyd1-modified parçacıklar 4 ° C'de iki haftaya kadar saklanabilir; Bu en iyi ~ 50 µL ultrahigh saflık su ile seyreltilmiş parçacıklar depolayarak gerçekleştirilir.

3. E. coli Hydrogenase 1 PFIRE ölçümler için hazırlık

  1. Si IRE düşük enerjili sonication (< 100 W), ilk olarak H2tarafından çok temiz4 (< %90 w/w) ~ 15 dakika ve sonra HNO3 (% 70 w/w) için ilâ 1 saat içinde. Bu temizlik yordamı hidrofilik bir öfke yüzeye götürmesi gerekiyor. Daha fazla temizlik gerekliyse IRE-ebilmek var olmak konulmak piranha çözümde (H2O21:3 oranında: H2SO4) kalan herhangi bir organik madde okside için kullanılır.
    Not: Sert asidik Temizleme yöntemleri tüm öfke malzemeler ile kullanım için uygun olmayabilir. Piranha çözüm son derece korozif ve güçlü bir oksidan, yüzeyler ve piranha çözüm sürecinin - her zaman ekzotermik olması nedeniyle Ekle H2O piranha çözüm ve bakım hazırlık sırasında alınması gereken makul temiz olmalıdır önce 2 yavaş yavaş H2SO4 ve uygun güvenlik prosedürleri hazırlık, kullanımı ve bertaraf için başvurulacak.
  2. Ultrahigh saflık su temiz IRE durulayın ve kuru azot gazı akışı altında kuru. Kirlenmesini önlemek için temiz cımbız kullanarak tüm prizma işlemenin dışarı taşımak.
  3. IRE elektrik-grade silikon dolgu macunu bir ince şerit kullanarak ATR Aksesuar baseplate mühür. Dolgu macunu IRE kenarlarını kısıtlamak için dikkat ediniz. Dolgu macunu tamamen kurumasını sağlar.
  4. ATR Aksesuar baseplate Spektrometre torpidoda aktarmak ve ATR Aksesuar monte edin. Ölçü bir başvuru (arka plan) spektrum arasında 4000-1000 cm-1 standart hızlı kullanarak 4 cm-1 çözünürlükte tarama moduna Spektrometre ve 1024 ortalama interferograms (ölçüm zaman ~ 3-5 dk). Bu yelpazenin girdi olarak hesaplama Absorbans spectra ürününün daha sonra denemeye izin vermek için kullanın.
    Not: Hyd1 etkin site için beklenen küçük Absorbans nedeniyle bu spectra ile yüksek sinyal gürültü oranı toplamak gereklidir.
  5. ATR Aksesuar baseplate önceden hazırlanmış Hyd1-modified parçacık dağılım (Bölüm 2) içeren 'ıslak' torpidoda aktarın. Damla-döküm IRE, parçacık dağılım büyük yüz üzerine bir 1 µL aliquot ve onları eşit yüzeyi boyunca yayıldı. Not: IRE üzerinde tamamen kuru olmak parçacıkları izin vermez.
  6. Karbon kağıdı, gaz Difüzyon tabakası malzemesi olarak Yakıt pilleri, mm IRE (Yani ca. 8.2 × 4.9 mm2) yüzey boyutları küçük bir boyut ~0.1 için kullanılan gibi bir parça kesti. Karbon kağıdı yüzey alanı damla-cast Hyd1-modified parçacıklar kapsayacak kadar büyük olmalı, ama değil çok büyük üst üste olarak silikon dolgu macunu eskiden IRE güvenli. Karbon kağıdı suda ıslatın ve yavaşça parçacık filmin üstüne yerleştirin. Karbon kağıdı tüm parçacık film arasında iyi bir elektrik bağlantısı sağlar.
    Not: Karbon kağıdı gibi birkaç önceden hazırlamak ve ultrahigh saflık su 'ıslak' anaerobik torpidoda içinde önceden batırılmış depolamak yararlıdır.
  7. (1,7 içinde açıklanan ve şematik Şekil 2' de gösterilen) Spektroelektrokimyasal hücre üzerinde IRE mount, içine baseplate vida ile güvenli. ~ 200 µL sulu enzim tutmak için deneysel arabelleği ekleyin. Karma arabellek sistem, bir geniş pH aralığında arabelleğe alma yeteneğine sahip NiFe hydrogenases araştırmalar yararlıdır:56 sodyum asetat, 2-[N'-morpholino] etan-sulfonic asit (MES), N'-[2-hydroxyethyl] piperazin -N' -[2-etan-sulfonic asit] (HEPES), N'-tris [hydroxymethyl] metil-3-amino-propan-sulfonic asit (MUSLUKLAR) ve 2-[N'-cyclohexylamino] her bileşen, 15 mM son bir konsantrasyon ile etan-sulfonic asit (CHES), ve 0.1 M içeren NaCl ile pH pH 6 kullanmaya ayarlanabilir elektrolit, destek olarak NaOH ve HCl yoğunlaşmıştır.
    Not: Çalışan elektrot bağlantı biraz Karbon kağıdı (Şekil 2) iyi elektronik bağlantı sağlamak için Spektroelektrokimyasal hücre üst (~0.1 mm) boyutunda altında çıkıntı.
  8. Çözüm giriş ve çıkış Spektroelektrokimyasal hücrenin Peristaltik pompa boru ve deneysel arabellek bir şişe içeren bir akış sisteme bağlayın. Birleştirilmiş hücre içeren Spektrometre 'kuru' torpidoda aktarın.
  9. Spektroelektrokimyasal hücre derleme ATR Aksesuar üzerine monte. Çalışma, sayaç ve referans elektrotlar potansiyostat için bağlayın. Peristaltik pompa boru pompa bağlayın.
  10. Spektral Aralık 3.4 içinde başvuru/arka plan olarak toplanan spektrumu kullanılarak 4.000 1.000 cm-1üzerinde bir Absorbans spektrum ortalama olarak 1024 interferograms 4 cm-1 çözünürlükte ile kaydedin. Bu noktada spektrum önemli içermelidir (> 100 mO.D.) Amid II ~ 1,540 cm-1 bantları ve Hyd1 etkin site grupları spektral bölge 1,850-2150 cm-1, büyük ölçüde Devletleri'nde oksitlenmiş, etkin olmayan (şekil 3 belirgin olmalı ).

4. E. coli Hydrogenase 1 ve test Spektroelektrokimyasal hücre aktivasyonu

  1. Azaltılması potansiyeli (−0.8 V vs SCE) Hyd1-modified parçacık film için geçerlidir. H2 ve akış arabellek yavaş yavaş Spektroelektrokimyasal hücre aracılığıyla Deneysel önbellekle doyurmak. Örnek tamamen Hyd1 etkinleştirmek için gece bırakın.
    Not: Bu önemlidir anaerobik H2, N2 vbve böylece tüm anaerobik gazlar kullanmak için bir O2 süzgeci kabul edilmelidir.
  2. Örnek bir Absorbans spektrum etkinleştirmeden sonra kaydedin. νCO ve vCN etkin site grupları artık azaltılmış, 'etkin' Birleşik bir dağılımının gösterilmesi gerekir. Bu en kolay kullanımı ile 3.10 (şekil 4) kaydedilen spektrum göre bir fark spektrum görülmektedir.
  3. Spektroelektrokimyasal hücre elektrik bağlantısını sınayın. Bunu yapmak için N2 gaz ile deneysel arabellek doyurmak. Oksitleyici (0 V vs SCE) ve (−0.8 V vs SCE) potansiyelleri ( ca 30 dk süresi) Hyd1-modified parçacık filmin bir dizi uygulamak ve her bir Absorbans spektrum kaydedin. Hyd1 hızla okside olur ve azaltılmış ve parçacık film iyi bağlanmış ise % 100 örnek uygulamalı potansiyeline yapmalıdır.
  4. Uygun bir Debi deneysel arabelleği ayarlayın. Bunu yapmak için azalan bakiyeli potansiyel (−0.8 V vs SCE) için örnek uygulama ve deneysel arabellek H2ile emdirmek. -0.707 arasında çevrimsel voltammograms bir dizi kayıt - 0,039 V vs SCE 10 mV/s. tarama oranında yavaş yavaş H2akış hızı artırmak-katalitik waveshape bir düzlemsel döner benzer kadar voltammograms arasında doymuş tampon elektrot55 disk ve maksimum akım akış hızı (şekil 5) bağımsızdır.
    Not: H2 suda çözünürlük sınırının 293 K ve 1 bar ~0.8 mm'dir.
  5. Örnek şimdi PFIRE ölçümleri için hazır olduğu gibi spectra potansiyelleri, çözüm koşullar (pH, sıcaklık, H2 konsantrasyon vb) bir dizi altında bir mesafeden toplamak. Spektroskopik ve elektrokimyasal veri, özellikle H2 oksidasyon Hyd1 tarafından gibi electrocatalytic süreçleri okurken ilişkilendirmek önemli olduğu gibi potansiyostat yazılımı kullanarak tüm elektrokimyasal verilerini kaydeder.

5. spektroskopik veri işleme

  1. Etkin siteyi kalıcı olarak ölçümleri boyunca spectra 0 V ile −0.8 V vs SCE deneme sonunda kaydı tarafından değiştirilmiş değil olduğunu onaylayın. Bunlar 4,3 kaydedilen spectra için aynı olması gerekir ve aktif kaybı olmaksızın (şekil 6) ölçüm sırasında dikkat edilmelidir.
  2. Spektrometre yazılım uygun bir biçimde mutlak Absorbans spectra verilecek (.csv, ASCII, 'matlab', Jcamp vb) kökenli veya Matlab gibi yazılım kullanarak işleme.
  3. Temel Şekil 7' de gösterilen süreci kullanarak verileri düzeltmek.
    1. Küçük tanımlamak için Aralık 1800-2150 cm-1içinde her Absorbans spektrum ikinci türev almak (< 1 mO.D.) aktif bantları su son derece eğimli arka planı.
    2. Temel işaret noktaları orijinal Absorbans spektrumda yerleştirin ve ' deneysel spektrum yapıştırmak ' noktaları ayarlayın.
    3. Temel bir enterpolasyonlu kübik spline işlevi veya bir polinom fonksiyon kullanarak noktaları üzerinden uygun. Bu temel işlevi deneysel verilerden çıkarma.

Representative Results

Şekil 1 PFIRE ölçümleri için kullanılan Spektrometre, torpido, ATR Aksesuar, potansiyostat ve gaz akış sistemi deneysel düzenlenmesi şematik gösterimi gösterir. Şekil 2 bir temsilcisi Spektroelektrokimyasal hücrenin çizim göstermektedir.

Şekil 3 gösterir Absorbans spectra parçacıkların damla-cast Hyd1-modified, deneysel arabelleği (3.7, pH 6.0 açıklanan bir karma arabellek sistem,) ile Spektroelektrokimyasal hücre akan. Hyd1 yüzey kapsama ile ~ 235 mO.D bir Amid II grup yoğunluk şekil 3' te gösterilen örnekte özellikle yüksektir. ve en az 'toplu' kanıtladığı gibi O-H germe bölge (~ 3.000-3600 cm-1) büyüklük ~ 1,640 cm-1Amid bir evrişim olduğunu, band göre ben Hyd1 bant ve su H-O-H bend su. Protein nedeniyle ek bantları C-H germe bölgede (ca 2900 cm-1) görülebilir. Geniş bant 2,100 cm-1 merkezli bir kombinasyon H-O-H bükme titreşim H2O molekülleri nedeniyle sıvı su hidrojen bağı ağınızda sınırlı rotasyonları vardır düşük enerji libration bandından bir dizi grubudur. νCO grup aktif oksitlenmiş, etkin olmayan, Ni-B devleti 1,943 cm-1, temel düzeltme, olmasa bile, açıkça belirgindir ve νCN özellikleri 2,050 2.100 cm-1 arasında açıkça görülebilir . Yüksek Hyd1 özel kapsamlı, çok gözenekli yapısı karbon siyah film57 enzim tarafından bloke olur ve bu nedenle 'toplu' su toplama PFIRE ölçümler sırasında indirilir.

Şekil 3 ' te spectra gösteriyor ki, daha önce harekete geçirmek, Hyd1 Filmler Hyd1 oksitlenmiş, etkin olmayan Birleşik Devletleri içeren. Harekete geçirmek harekete geçirmek (indirimli) eksi (oksitlenmiş) fark olarak hazırlanan spektrum gösteren şekil 4 ' te gösterildiği gibi −0.8 V vs catalytically etkin Birleşik SCE H2 atmosfer altında azalmış, oluşumuna yol açar gecede Hyd1. Hyd1 fark spectra νCO bölgesini kullanma en açık biçimde yorumlanabilir. Etkin site benzersiz her durumunu tek bir CO grup iki CN grup karşılaştırıldığında sahip ve bu nedenle νCN bölge özünde daha karmaşık, pek çok örtüşen bands ile. Şekil 4 fark spektrumunda aktivasyon kaybı (negatif emme bantları), oksitlenmiş, etkin olmayan Ni-B ve Ni-SI (en oksitlenmiş "etkin" Devlet) hazırlanan Hyd1 filmde mevcut oldu küçük bir miktar yol açar gösterir. Bunlar Hyd1 'etkin' devletler tarafından değiştirilir; Ni-C, bu tür Şekil4 için Ni-R ve Ni-L. iki νCO grup tarafından kanıtlanan Ni-R ve Ni-L Türkiye, iki biçimi vardır Not görülmektedir. Birden fazla Ni-R ve Ni-L durum gözlem diğer NiFe hydrogenases ile anlaşma olmasıdır. 48 , 58 , 59

Bir anahtar PFIRE yönteminin çevrimsel voltammograms benzer katalitik waveshapes bu düzlemsel dönen disk elektrot üzerinde kaydedilen Spektroelektrokimyasal akışı hücre göstermek içinde Hyd1 kaydedilen doğrulanmasıdır. 55 pratikte bu substrat (H2) ve ürün (H+) / Spektroelektrokimyasal hücredeki immobilize Hyd1 dan kitle taşımacılığı PFIRE ölçümler sırasında kullanılan akış hızlarında etkili olduğu anlamına gelir. Akış hızı etkisi katalitik waveshape art arda gelen voltammograms Spektroelektrokimyasal hücreye çözüm akış hızı arttıkça H2 atmosfer (1 bar) altında kaydedilmiş gösteren şekil 5' te, gösterilir. H2 oksidasyon Hyd1 tarafından aynı (kırmızı gölgeli dikdörtgen), için toplamda oksidatif inactivation ölçüde overpotential durumlarda (histeresis oksidatif ve indirgeyici sırasında geçerli arasında piyango potansiyelleri ca 0 V yukarıda, vs SCE) ve en büyük H2 oksidasyon geçerli çözüm akış hızı bağımlı. Akış oranları 52 mL/dk (ışık gri voltammogram) katalitik waveshape daha fazla duyarsız yukarıda, akış hızı artar.

Şekil 6 anaerobik oksidatif inactivation altında ve sonra ilk harekete geçirmek ve anaerobik re-oksidasyon 0 V vs SCE (altında bir Ar atmosfer, 4,3 açıklandığı gibi), νCO grup Ni-B devletin göreli yoğunluklarda karşılaştırır 0 V vs SCE 48 saat sonra bir Ar atmosferinin sürekli deneyler (5.1 açıklandığı gibi). Etkin site grubu yoğunluğu kaybı olmaksızın ölçüm sırasında gözlenen ve Hyd1 örnek uygulamalı potansiyelleri yanıt verir.

Şekil 7 bu iş kullanılan temel düzeltme yordam gösterir. Hyd1 örnek bölgede aktif (Şekil 7bir) mutlak spektrum önemli eğriliği nedeniyle su içerir. Aslında, su bir çözücü kullanmak için gereksinim IR spektroskopisi Yaşam Bilimleri içinde çoğu uygulama için bir sorundur. Savitsky-deniyordun bir 9 nokta pencere üzerinde yumuşatma ile kökenli yazılım kullanılarak hesaplanan mutlak spektrum (Şekil 7b), ikinci türevi Hyd1 aktif kavisli arka planı keskin grupları tanımlamak için kullanılabilir. Bir ikinci türev spektrumu kullanılarak yaklaşık tepe pozisyonları tanımlaması temel bağlantı noktalarını bölgelerinde etkin site gruplarından (daireler çizerek Şekil 7bir) ücretsiz mutlak spektrum yerleştirilmesini sağlar. Kübik spline fonksiyonu sonra sonra düşülen bir temel işlevi sadece tepeler (Şekil 7 Hyd1 aktif doğan içeren bir temel düzeltilmiş spektrum vermek mutlak spektrum oluşturmak için bu bağlantı noktaları üzerinden monte c).

Şekil 8 sigara-ciro (Ar atmosfer) ve potansiyelleri bir mesafeden ciro (H2 atmosfer) koşulları altında Hyd1, PFIRE ölçüm sonuçlarını gösterir. 36 geçerli saat izlemeler (şekil 8bir) raporda her katalitik mevcut potansiyel uygulanan ve yakın ciro olmayan koşullarda (Ar atmosfer) sıfır geçerli kalır. Kısmi Spektroelektrokimyasal Redoks titrasyon şekil 8b bu nedenle her potansiyel katalitik ciro yokluğunda, beklenen Birleşik dağılımını gösteren aktif denge Redoks davranışını raporlar. Şekil 8c spectra (altında bir H2 atmosfer) ciro koşullarda kaydedildi ve bu nedenle aktif Birleşik Hyd1 tarafından katalitik H2 oksidasyon sırasında kararlı durum dağıtımını temsil eder. Kararlı durum koşulları elde edilmiştir katalitik H2 oksidasyon geçerli (şekil 8bir, H2) −0.199 V ve −0.074 V vs o anda bir fonksiyonu olarak sabit kalır Aslında tarafından doğrulanır; +0.356 V mevcut içinde monoton çürüsün tanınmış anaerobik oksidatif inactivation, Hyd1 nedeniyle bir kız vs . 55 aktif Birleşik dağıtım nerede Hyd1 kataliz gerçekleştirir açıkça altında Ar ve H2 , tüm potansiyelleri farklıdır (şekil 8b, −0.199, −0.074 ve +0.356 V spectra vs o). AR ve H2 altında kaydedilen spectra −0.594 V vs o, hemen hemen aynıdır ve bu deneysel tutarlılık önemli bir testi temsil eder; Hyd1 H+ pH ( şekil 8bir Ar ve H2 altında mevcut sıfıra yakın olduğunu) 6.0 önemli bir oranda azaltmaz ve spectra −0.594 V, bu nedenle aynı olacağı tahmin ediliyor.

Şekil 9 anaerobik oksidatif inactivation gösterir, Hyd1 üzerinden Ni-Ni-SI B'den oluşumu sırasında H2 oksidasyon +0.35636 V., Spectra geçerli saat izleme üzerinde kaydetti gri zaman aralıkları sırasında kaydedildi Şekil 9biriçinde. −0.074, V Hyd1 oksidatif inactivation geçmesi değil ve aktif Birleşik dağıtım tüm potansiyel adım sabit kalır. Bu −0.074 potansiyel adım ve bir sonradan kaydedildi Şekil 9bII başında mutlak temel düzeltilmiş spektrum rapor Şekil 9bbeniçinde spectra tarafından gösterilmiştir zaman potansiyel adımı sırasında ve bir fark spektrum Şekil 9bbengöreli olarak bildirilmektedir. Şekil 9bIII spectra ve bIV da fark spectra şekil 9bbengöreli olarak bildirilir ve yavaş yavaş dönüştürme Ni-SI Ni-B sırasında yüksek potansiyel göstermek inactivation, +0.356 V Şekil 9biriçinde gösterilen geçerli monoton azalma ile tutarlı.

Bir çözüm pH mesafeden kaydedilen spectra adımları sırasında katalitik Hyd1 döngüsü içgörü proton transferi ver. 43 Şekil 10 bir pH 3.0 ve deneysel arabellek değişimi için Spektroelektrokimyasal hücreye çözüm akışı kullanarak pH 9.0, aynı Hyd1 filmde kaydedilen PFIRE spectra gösterir. Ni-C ve Ni-L Birleşik göreli konsantrasyonları açıkça bu iki spectra farklıdır. Cirosu olmayan koşullar altında uygulanan potansiyel değiştirerek NIC ve Ni-L potansiyel bağımlılığının hızla pH değerleri (şekil 10b) bir mesafeden tespit edilecek ve her iki Birleşik isopotential geniş pH aralığında olduğu tespit devletler. ( Şekil 10b en yüksek absorbances sadece Ni-C ve Ni-L Birleşik netlik, tam Redoks Hyd1 titrations Hidalgo vdtarafından bildirilmiştir için göstermek unutmayın) 36 Ni-C ve Ni-L konsantrasyonları bir pH titrasyonu, toplam Ni-C ve Ni-L konsantrasyonu ise en her pH (şekil 10c) nerede potansiyelleri tepe Absorbans alarak ayıklanabilir. Bu şekilde ve EPR veri ile birlikte Ni-C ve Ni-L Türkiye arasında bir pH denge tespit edilmiştir. 43

Figure 1
Şekil 1: IR Spektrometre, anaerobik torpido, ATR Aksesuar, MCT dedektörü, düzenlemenin şematik gaz akış sistemi ve PFIRE ölçümleri için kullanılan potansiyostat. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: Giriş/çıkış bağlantıları elektrotlar ve çözüm düzenini gösteren PFIRE ölçümleri için kullanılan Spektroelektrokimyasal hücre şematik diyagramı. Hücre ve baseplate elektrot bağlantı, Pt tel sayaç elektrot, doymuş kalomel referans elektrot ve çözüm giriş ve çıkış çalışan bir karbon çubuk için vida delikleri polieter eter keton (göz), işlenmiş. Doymuş kalomel referans elektrot İnşaat olarak önceden bildirilmektedir. 36 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: IRE yatırılır ve arabellek ile rehydrated karbon siyah Hyd1-modified parçacıkları, Absorbans spektrum. Ben grup Amid, Amid II grup ve Hyd1 aktif bölge konumları birlikte C-H esneme titreşimleri ve çözelti su nedeniyle ek özellikleri gösterilir. İlave etiketli vCO ve vCN bantları ile aktif bölge büyütülmüş bir görünümünü gösterir. Hyd1 başta olmak üzere oksitlenmiş, etkin olmayan Ni-B devlet 'Olarak hazırlanan' parçacıklar içerir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : Hyd1 −0.8 V vs SCE bir azaltılmış eksi oksitlenmiş fark spektrum sunulan bir H2 atmosfer altında aktivasyonu. Okside düşük potansiyel harekete geçirmek, etkin olmayan Ni-B (ve Ni-SI küçük bir konsantrasyon) daha fazla azaltılmış, aktif Amerika'ya Ni-C, Ni-R ve Ni-L. Hyd1 Ni-L ve Ni-R. iki ayrı alt durumu olduğunu not dönüştürür Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 : Çözüm Debi etkisi katalitik çevrimsel voltammograms waveshape kayıt Spektroelektrokimyasal hücreye. Voltammograms H2akış hızı artırmaya kaydedildi-belirtildiği gibi arabellek doymuş. 20 mL/dk (kırmızı) debisi voltammogram 0 V vs o yukarıda önemli inactivation üzerinde ileri tarama gösterir. Yukarıda 52 mL/dk akış hızlarında inactivation ölçüde büyük ölçüde ve geçerli bağımsız olarak tüm potansiyelleri, akış hızı düşüktür. Diğer parametreleri: 1 H2, 10 mV/s tarama hızı bar. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6 : Temel düzeltilmiş IR spectra 0 V vs SCE oksitlenmiş, etkin olmayan Ni-B devletin etkin site νCO bölgedeki. Sürekli PFIRE ölçümler sırasında 48 h aktif yoğunluğu ölçülebilir kaybı var ve bu nedenle Hyd1 sağlam karbon siyah parçacıkları üzerinde adsorbe. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7: Veri işleme için kullanılan temel düzeltme yordamlar ayrıntılarını. Temel bağlantı noktalarını bir ikinci türev analiz (b) tanımlanan herhangi bir νCO ve νCN doruklarına önlemek için dikkat çekici mutlak Absorbans spektrumda etkin site bölgesi (bir), üzerine yerleştirilir. Elde edilen temel düzeltilmiş spektrum (c) gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 8
Şekil 8: Hyd1 PFIRE ölçümler sigara-ciro (Ar) ve ciro (H2) koşulları altında. Hyd1 Ar-doymuş (gri) ve H2Spektroelektrokimyasal hücresinde (bir) geçerli saat izleri-doymuş (siyah) arabellek; (b), (c) PFIRE spectra νCO bölge her potansiyel Ar (b) ve H2 (c) altında gösterilen. Potansiyelleri V vs o alıntı. Hidalgo vd izniyle çoğaltılamaz 35 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 9
Şekil 9: Ni-B Ni-SI için Hyd1 yolu ile oluşum anaerobik inactivation. (bir) geçerli saat izleme istikrarlı bir electrocatalytic +0.356 V −0.074 V ve yavaş anaerobik inactivation (monoton azalma mevcut) geçerli gösterilen bir H2 atmosfer altında vs o. (b) Spectra kaydedilen sırasında işaretlenmiş gri gölgeli bölgeler (a). Spektrum bben −0.074 V potansiyel adım başında kaydedilmiş bir temel düzeltilmiş spektrumdur. Spektrum bII−0.074 V adım sırasında bir sonraki zaman kaydedilmiş, bir fark spektrum bben göreli olarak bildirilir ve aktif Birleşik dağılımında değişiklik oluştuğunu −0.074 V potansiyel kararlılığını ile uyumlu sinirlerde. Spectra bIII ve bIV da fark spectra bben göreli olarak bildirilir ve yavaş yavaş dönüştürme Ni-SI Ni-B anaerobik inactivation sırasında V +0.356 göstermek vs o. Hidalgo vd izniyle çoğaltılamaz 35 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 10
Şekil 10 : Çözüm pH bir mesafeden kaydedilen spectra Hyd1 katalitik döngüsü sırasında adımları proton transferi içgörü verin. Hyd1, νCO bölgenin gösterilen (bir) IR spectra kaydedilen pH 3.0 (-54 mV vs o) ve pH 9.0 (-334 mV vs o). (b) Spektroelektrokimyasal titrations hangi çözüm pH değerleri aralığı en Ni-C ve Ni-L konsantrasyonları altındadır olasılığını belirlemek için yapılmıştır. Sadece Ni-C ve Ni-L konsantrasyonları Hyd1 bkz: Hidalgo vd. , tam Spektroelektrokimyasal titrasyon için netlik için gösterilir Ni-C ve Ni-L olanlar (b) gösterildiği gibi deneyler bir dizi belirlendiği gibi göreli yoğunlaşmasını 36 (c) pH bağımlılığı. Spectra 20 ° C'de kaydedildi Murphy ve ark. izniyle uyarlanmıştır 42 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

PFIRE Redoks elektrodu immobilize proteinler adresleme için bir genel olarak uygulanabilir IR spektroskopik tekniktir. Özellikle, electrocatalytic reaksiyonlar Redoks enzimlerin hızlı ciro koşullar altında probed. PFIRE yöntemi doğrudan yapısal bilgi sağlar ve IR spektroskopisi, karbon elektrot için çiftler PFE tekniği ile sağlanan doğrudan elektrokimyasal denetimi üzerine kurar. PFIRE yaklaşım böylece kimyasal anlayış mevcut bilgilere elektrokimya yalnız ekler ve çalışma için son derece uygundur Redoks proteinler ve enzimler dahil küçük molekül bağlama ve harekete geçirmek. Buna ek olarak, PFIRE katalitik ciro potansiyeli bağlı proteinler yokluğunda yapısal değişiklikleri hakkında bilgi sağlar. Bu tür ciro elektron transferi olayları PFE, 'standart' uygulamaları kullanarak tespit etmek zor çoğu kez PFE uzantısı Fourier dönüşüm AC voltammetry için büyük bir başarı ile. yolculuklarında uygulanmış olsa 45 , 46

PFIRE, prensip olarak, PFE kullanarak okudu herhangi bir Redoks protein çalışma için uygun bir yöntemdir. Bu nedenle, PFE gibi ile protein adsorpsiyon başarılı bir PFIRE deneme için önemli bir adım. Bu protokol için bir uygulama E. coli Hyd1 bir vaka çalışması olarak kullanarak PFIRE tekniği tarif. 36 , 43 ancak, biz de PFIRE tekniği sitoplazmik düzenleyici hydrogenase R. eutropha,44 üzerinden ve flavin karbon siyah üzerine adsorbe mononucleotide başvurdum. 40 tüm bu durumlarda, basit fiziksel adsorpsiyon değiştirilmemiş yüksek yüzey alanı karbon (Bu protokol için açıklandığı gibi) siyah bir yüzey kapsama için kayıt kaliteli IR spectra yüksek sinyal gürültü oranı ile yüksek protein sağlar. Nerede adsorpsiyon .yüksek seviyede elde edilemez durumda karbon parçacıkları, örneğin kovalent bağlanma elektrot yüzeyi protein izin vermek yüzey değiştirmek gerekli olabilir. 60 , 61 , 62 PFIRE ölçümleri için bir torpido kullanımını yalnızca anaerobik işlenmeli örnekleri okurken kesinlikle gereklidir. Ancak uygulama son derece sabit ve düşük (< 80 ° C çiğ noktası) su buharı torpidoda atmosfer tarafından sağlanan düzeylerde çok küçük absorbances çıkarma izin yüksek sinyal gürültü düzeyleri sağlar. 44 birçok durumda bir anaerobik ortamda torpidoda tarafından sağlanan gibi aynı zamanda geçerli çalışma elektrot O2 azalma nedeniyle önlemek için elektrokimyasal ölçüm (PFIRE tekniği için ayrılmaz) için istek uyandırıcı.

IR absorbances toplu su, deneysel arabellekleri ve üzerinde örnek adsorbe karbon partikülleri nedeniyle tüm önemli ölçüde deneysel spectra katkıda bulunur ve bantları örtüşme ilgi, özellikle Amid ı, II ve III bölgelerinde spektrum. 63 Amid bölge flavins veya Nikotinamid Kofaktörler, gibi yüzeylerde ve birçok oksidasyon ve Redüksiyon reaksiyonları ürünleri gibi organik türlerden bilgileri de içerir. NiFe hydrogenases, söz konusu olduğunda νCO ve νCN etkin site grupları spektrum nispeten açık bir bölgede düşer ve bu yüzden PFIRE tekniği çok iyi bu enzimlerin çalışmasına uygundur. Diğer durumlarda, ancak, fark spectra izotopik etiketleme yaklaşımlar ile birleştiğinde değişiklikleri immobilize protein nedeniyle yalıtmak için gerekli olabilir. Benzer yaklaşımlar tanımlamak, örneğin, protonation değişiklikler, yapısal düzenlemeler ve Michaelis-Menten kompleksleri IR Spektroskopi kullanarak eğitim için kullanılmıştır. 64 , 65 , 66 PFIRE bu nedenle, hydrogenases çalışma için sınırlı değildir, ancak herhangi bir Redoks protein içeren (veya olan yüzeylerde, ürün veya inhibitörleri içeren) gibi uygulanabilir grupları ile tanı IR-aktif titreşimler; karbon monoksit dehydrogeanses,67 nitrogenases,68,14 flavoproteins, örneğin40 ve format dehydrogenases.

İlgili teknik, SEIRA, çok iyi membran ilişkili proteinler biomimetic ortamında incelenmesi uygundur. 32 SEIRA da bir ATR-IR yapılandırmayı kullanır ve ATR prizma (IRE) yüzeyine yakın (içinde birkaç nm) yer alan moleküllerin IR Absorbans yükselterek bir yüzey geliştirme etkisi kullanımı yapar IR spektroskopisi bir uyarlamasıdır. SEIRA bu nedenle zarif adsorbed protein ve membran mimari içinde ortaya ve nispeten solvent rakip sinyalleri arınmış spektral değişiklik duyarlıdır ve yüzeylerde/inhibitörleri çözümde mevcut. Hangi öfke yüzeyinin üzerinde önemli ölçüde daha fazla penetrasyon derinliği kullanır biraz burada açıklanan PFIRE tekniği aksine bu (~ 1 µm), PFIRE yüzeyler için daha duyarlı olduğu anlamına gelir, ürün veya inhibitörleri çözüm sunuyoruz. Bu artan duyarlılık için 'toplu' solvent avantajlı olabilir; substrat veya ürün doğrudan IR tarafından görülebilir, her iki kararlı duruma Kinetik uzun ömürlü etkin tür ve ilişkili ürün oluşumu sırasında electrocatalysis üzerinde PFIRE spectra bildirin. 69 -ecek var olmak (ki CO-CO2, güçlü bir IR emici tersinir oksidasyonunu tromboksan) karbon monoksit dehidrojenaz gibi enzimler için özellikle önemli bir substrat ve ürün kararlı duruma konsantrasyonları gözlemlemek için yetenek ya da (hangi Format CO2ters çevrilebilir oksidasyonunu tromboksan) Format dehidrogenaz.

Şu anda, PFIRE enzim electrocatalysis 'veri toplama ve ATR-IR geometri için bir öfke yüzeyinin enzim konsantre eskiden makroskopik karbon elektrotlar nedeniyle kararlı durum Kinetik çalışmalar sınırlıdır. Bu bağlamda NiFe hydrogenases PFIRE çalışmaları Dyer ve iş arkadaşları, iş alt ciro Kinetik çalışma için geçici emme ışık tetiklemeli IR spektroskopisi kullanan49,50 için tamamlayıcı niteliktedir. Çalışmaları devam Spektroelektrokimyasal hücre,40 olmak için ve microelectrodes kullanımı ile zaman çözünürlüğü mikrosaniye sırasına ulaşılabilir olmalıdır. Bu enzimler ile ca kadar ciro Frekanslar için alt ciro Kinetik incelenmesi 100-500 s-1sağlayacak ve indirgeyici ve oksidatif süreçlerinin incelenmesi sağlayacaktır.

Genel olarak, PFIRE kimyasal electrocatalytic reaksiyonlar kararlı duruma koşullar altında Redoks enzimlerin karakterizasyonu sağlar spektroskopik bir tekniktir. PFIRE yaklaşım aynı enzim örnek üzerinde yüksek yüzey alanı elektrotları sağlam adsorpsiyon protein sağlamak ve ATR-IR geometri facile çözüm geçişine izin verir gibi gerçekleştirilebilmesi birden fazla kimyasal ve elektrokimyasal titrations sağlar. Enzim fonksiyonu sırasında böyle yapısal bilgi in situ toplamak için paha biçilmez bir araç daha geniş bioelectrochemistry toplum için yeteneğidir.

Disclosures

Yazarlar rakip mali ilgi bildirin.

Acknowledgments

K.A.V. ve P.A.A. çalışmalarını Avrupa Araştırma Konseyi (EnergyBioCatalysis-ERC-2010-StG-258600), mühendislik ve fizik Bilimleri Araştırma Konseyi IB Catalyst Ödülü EP/N013514/1 ve Biyoteknoloji ve biyolojik bilimler araştırma tarafından desteklenmiştir Konseyi (BB/L009722/1 ve 1/N006321/BB). Hirsch "gayri resmi" de Ciencia y Tecnologìa, Universidad de Kosta Rika ve Lincoln College, Oxford'da tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Bay Charlie Jones, Bay Charlie Evans ve mekanik Atölyesi (Kimya bölümü) personel için tasarım ve imalatı, bu çalışmada kullanılan Spektroelektrokimyasal hücre yardım etmiş oluyorsunuz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectrometer Agilent 680-IR with an external MCT detector
ATR accessory Pike Technologies GladiATR Customised for use with a 5-reflection Si IRE
Glovebox Glove Box Technology Ltd. N/A Custom designed 'wet' and 'dry' box for anaerobic sample handling and measurement
KBr window Crystran Custom To allow coupling of the glovebox with the external beam of the FTIR spectrometer
Additional optics Agilent N/A Components from a PM-IRRAS accessory
Silicon IRE Crystal GmbH Custom Trapezoidal: 8.4 mm x 5 mm (large face), 1 mm thickness, ca 39 degree face angle
Potentiostat Metrohm Autolab PGSTAT 128N
Nova 10.1 Metrohm Software for controlling the potentiostat
Peristaltic pump Williamson Manufacturing Company Ltd QL-1000-024-300
Pt wire Surepure Chemetals 3272 99.95% Pure Platinum Wire, 0.014 inch Diameter
Carbon rod WH Smith 30729209 0.7 mm HB pencil lead
Carbon black Cabot Corporation Black Pearls 2000
Ultrasonic bath Ultrawave U100 35 W
Centrifugal filter Merck Millipore UFC5050BK Amicon Ultra, 50 KDa MW cutoff
Microcentrifuge Eppendorf 5452000018 MiniSpin
NaCl Sigma 71376
H2SO4 Fisher S/9240/PB17
HNO3 Fisher N/2300/PB17
silicone sealant Cow Corning Toray Co., Ltd. SE 4486
Carbon paper Toray TGP-H-030
H2 gas BOC
N2 gas BOC
OriginPro 2015 OriginLab Data analysis/graphing software
Resolutions Pro 4.0 Varian Software for controlling FTIR spectrometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ash, P. A., Vincent, K. A. Spectroscopic analysis of immobilised redox enzymes under direct electrochemical control. Chem. Commun. 48 (10), 1400-1409 (2012).
  2. Sezer, M., Millo, D., Weidinger, I. M., Zebger, I., Hildebrandt, P. Analyzing the catalytic processes of immobilized redox enzymes by vibrational spectroscopies. IUBMB Life. 64 (6), 455-464 (2012).
  3. Melin, F., Hellwig, P. Recent advances in the electrochemistry and spectroelectrochemistry of membrane proteins. Biol. Chem. 394 (5), 593-609 (2013).
  4. Dong, S., Niu, J., Cotton, T. M. Ultraviolet/visible spectroelectrochemistry of redox proteins. Methods Enzymol. 246, 701-732 (1995).
  5. Hellwig, P., et al. Electrochemical and Ultraviolet/Visible/Infrared Spectroscopic Analysis of Heme a and a3 Redox Reactions in the Cytochrome c Oxidase from Paracoccus denitrificans Separation of Heme a and a3 Contributions and Assignment of Vibrational Modes. Biochemistry. 38 (6), 1685-1694 (1999).
  6. Wu, S., et al. Redox chemistry of the Schizosaccharomyces pombe ferredoxin electron-transfer domain and influence of Cys to Ser substitutions. J. Inorg. Biochem. 105 (6), 806-811 (2011).
  7. Whitehouse, C. J. C., et al. A Highly Active Single-Mutation Variant of P450BM3 (CYP102A1). ChemBioChem. 10 (10), 1654-1656 (2009).
  8. Marritt, S. J., van Wonderen, J. H., Cheesman, M. R., Butt, J. N. Magnetic circular dichroism of hemoproteins with in situ control of electrochemical potential: "MOTTLE". Anal. Biochem. 359 (1), 79-83 (2006).
  9. Moss, D., Nabedryk, E., Breton, J., Mäntele, W. Redox-linked conformational changes in proteins detected by a combination of infrared spectroscopy and protein electrochemistry. Eur. J. Biochem. 187 (3), 565-572 (1990).
  10. Iwaki, M., et al. Direct Observation of Redox-Linked Histidine Protonation Changes in the Iron-Sulfur Protein of the Cytochrome bc1 Complex by ATR-FTIR Spectroscopy. Biochemistry. 44 (11), 4230-4237 (2005).
  11. Marshall, D., et al. ATR-FTIR Redox Difference Spectroscopy of Yarrowia lipolytica and Bovine Complex I. Biochemistry. 45 (17), 5458-5467 (2006).
  12. Lacey, A. L. D., Gutiérrez-Sánchez, C., Fernández, V. M., Pacheco, I., Pereira, I. A. C. FTIR spectroelectrochemical characterization of the Ni-Fe-Se hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris Hildenborough. J. Biol. Inorg. Chem. 13 (8), 1315-1320 (2008).
  13. Millo, D., et al. Spectroelectrochemical Study of the [NiFe] Hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F in Solution and Immobilized on Biocompatible Gold Surfaces. J. Phys. Chem. B. 113 (46), 15344-15351 (2009).
  14. Paengnakorn, P., et al. Infrared spectroscopy of the nitrogenase MoFe protein under electrochemical control: potential-triggered CO binding. Chem. Sci. 8 (2), 1500-1505 (2017).
  15. Male, L., et al. Protein voltammetry and spectroscopy: integrating approaches. Theor. Chem. Acc. 119 (1-3), 107-111 (2008).
  16. Healy, A. J., Ash, P. A., Lenz, O., Vincent, K. A. Attenuated total reflectance infrared spectroelectrochemistry at a carbon particle electrode; unmediated redox control of a [NiFe]-hydrogenase solution. Phys. Chem. Chem. Phys. 15 (19), 7055-7059 (2013).
  17. Léger, C., Bertrand, P. Direct Electrochemistry of Redox Enzymes as a Tool for Mechanistic Studies. Chem. Rev. 108 (7), 2379-2438 (2008).
  18. Armstrong, F. A., Hirst, J. Reversibility and efficiency in electrocatalytic energy conversion and lessons from enzymes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (34), 14049-14054 (2011).
  19. Gates, A. J., et al. The relationship between redox enzyme activity and electrochemical potential-cellular and mechanistic implications from protein film electrochemistry. Phys. Chem. Chem. Phys. 13 (17), 7720-7731 (2011).
  20. Pershad, H. R., et al. Catalytic Electron Transport in Chromatium vinosum [NiFe]-Hydrogenase: Application of Voltammetry in Detecting Redox-Active Centers and Establishing That Hydrogen Oxidation Is Very Fast Even at Potentials Close to the Reversible H+/H2 Value. Biochemistry. 38 (28), 8992-8999 (1999).
  21. Goldet, G., et al. Electrochemical Kinetic Investigations of the Reactions of [FeFe]-Hydrogenases with Carbon Monoxide and Oxygen: Comparing the Importance of Gas Tunnels and Active-Site Electronic/Redox Effects. J. Am. Chem. Soc. 131 (41), 14979-14989 (2009).
  22. Vincent, K. A., Parkin, A., Armstrong, F. A. Investigating and Exploiting the Electrocatalytic Properties of Hydrogenases. Chem. Rev. 107 (10), 4366-4413 (2007).
  23. Parkin, A., Seravalli, J., Vincent, K. A., Ragsdale, S. W., Armstrong, F. A. Rapid and Efficient Electrocatalytic CO2/CO Interconversions by Carboxydothermus hydrogenoformans CO Dehydrogenase I on an Electrode. J. Am. Chem. Soc. 129 (34), 10328-10329 (2007).
  24. van Wonderen, J. H., Burlat, B., Richardson, D. J., Cheesman, M. R., Butt, J. N. The Nitric Oxide Reductase Activity of Cytochrome c Nitrite Reductase from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 283 (15), 9587-9594 (2008).
  25. Schaming, D., et al. Spectroelectrochemical Characterization of Small Hemoproteins Adsorbed within Nanostructured Mesoporous ITO Electrodes. Langmuir. 28 (39), 14065-14072 (2012).
  26. Kemp, G. L., et al. Opportunities for mesoporous nanocrystalline SnO2 electrodes in kinetic and catalytic analyses of redox proteins. Biochem. Soc. Trans. 37 (2), 368-372 (2009).
  27. Renault, C., et al. Unraveling the Mechanism of Catalytic Reduction of O2 by Microperoxidase-11 Adsorbed within a Transparent 3D-Nanoporous ITO Film. J. Am. Chem. Soc. 134 (15), 6834-6845 (2012).
  28. Krzemiński, Ł, et al. Spectroelectrochemical Investigation of Intramolecular and Interfacial Electron-Transfer Rates Reveals Differences Between Nitrite Reductase at Rest and During Turnover. J. Am. Chem. Soc. 133 (38), 15085-15093 (2011).
  29. Akkilic, N., Kamran, M., Stan, R., Sanghamitra, N. J. M. Voltage-controlled fluorescence switching of a single redox protein. Biosens. Bioelectron. 67, 747-751 (2015).
  30. Ataka, K., Heberle, J. Electrochemically Induced Surface-Enhanced Infrared Difference Absorption (SEIDA) Spectroscopy of a Protein Monolayer. J. Am. Chem. Soc. 125 (17), 4986-4987 (2003).
  31. Millo, D., Hildebrandt, P., Pandelia, M. -E., Lubitz, W., Zebger, I. SEIRA Spectroscopy of the Electrochemical Activation of an Immobilized [NiFe] Hydrogenase under Turnover and Non-Turnover Conditions. Angew. Chem. Int. Ed. 50 (11), 2632-2634 (2011).
  32. Ataka, K., Stripp, S. T., Heberle, J. Surface-enhanced infrared absorption spectroscopy (SEIRAS) to probe monolayers of membrane proteins. Biochim. Biophys. Acta, Biomembr. 1828 (10), 2283-2293 (2013).
  33. Kozuch, J., et al. Voltage-dependent structural changes of the membrane-bound anion channel hVDAC1 probed by SEIRA and electrochemical impedance spectroscopy. Phys. Chem. Chem. Phys. 16 (20), 9546-9555 (2014).
  34. Silveira, C. M., et al. SERR Spectroelectrochemical Study of Cytochrome cd1 Nitrite Reductase Co-Immobilized with Physiological Redox Partner Cytochrome c552 on Biocompatible Metal Electrodes. PLoS One. 10 (6), 0129940 (2015).
  35. Todorovic, S., Hildebrandt, P., Martins, L. Surface enhanced resonance Raman detection of a catalytic intermediate of DyP-type peroxidase. Phys. Chem. Chem. Phys. 17 (18), 11954-11957 (2015).
  36. Hidalgo, R., Ash, P. A., Healy, A. J., Vincent, K. A. Infrared Spectroscopy During Electrocatalytic Turnover Reveals the Ni-L Active Site State During H2 Oxidation by a NiFe Hydrogenase. Angew. Chem. Int. Ed. 54 (24), 7110-7113 (2015).
  37. Grabarczyk, D. B., Ash, P. A., Vincent, K. A. Infrared Spectroscopy Provides Insight into the Role of Dioxygen in the Nitrosylation Pathway of a [2Fe2S] Cluster Iron-Sulfur Protein. J. Am. Chem. Soc. 136 (32), 11236-11239 (2014).
  38. Kriegel, S., Uchida, T., Osawa, M., Friedrich, T., Hellwig, P. Biomimetic Environment to Study E. coli Complex I through Surface-Enhanced IR Absorption Spectroscopy. Biochemistry. 53 (40), 6340-6347 (2014).
  39. El Khoury, Y., Van Wilderen, L. J. G. W., Bredenbeck, J. Ultrafast 2D-IR spectroelectrochemistry of flavin mononucleotide. J. Chem. Phys. 142 (21), 212416 (2015).
  40. Ash, P. A., et al. Synchrotron-Based Infrared Microanalysis of Biological Redox Processes under Electrochemical Control. Anal. Chem. 88 (13), 6666-6671 (2016).
  41. Nakamoto, K. Infrared and Raman Spectra of Inorganic and Coordination Compounds. Part B. , John Wiley & Sons, inc. (2009).
  42. Bard, A., Faulkner, L. R. Electrochemical Methods: Fundamentals and Applications. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  43. Murphy, B. J., et al. Discovery of Dark pH-Dependent H+ Migration in a [NiFe]-Hydrogenase and Its Mechanistic Relevance: Mobilizing the Hydrido Ligand of the Ni-C Intermediate. J. Am. Chem. Soc. 137 (26), 8484-8489 (2015).
  44. Ash, P. A., et al. Electrochemical and Infrared Spectroscopic Studies Provide Insight into Reactions of the NiFe Regulatory Hydrogenase from Ralstonia eutropha with O2 and CO. J. Phys. Chem. B. 119 (43), 13807-13815 (2015).
  45. Lee, C. -Y., et al. Theoretical and experimental investigation of surface-confined two-center metalloproteins by large-amplitude Fourier transformed ac voltammetry. J. Electroanal. Chem. 656 (1-2), 293-303 (2011).
  46. Adamson, H., et al. Electrochemical evidence that pyranopterin redox chemistry controls the catalysis of YedY, a mononuclear Mo enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (47), 14506-14511 (2015).
  47. De Lacey, A. L., Fernández, V. M., Rousset, M., Cammack, R. Activation and Inactivation of Hydrogenase Function and the Catalytic Cycle: Spectroelectrochemical Studies. Chem. Rev. 107 (10), 4304-4330 (2007).
  48. Lubitz, W., Ogata, H., Rüdiger, O., Reijerse, E. Hydrogenases. Chem Rev. 114 (8), 4081-4148 (2014).
  49. Greene, B. L., Wu, C. -H., McTernan, P. M., Adams, M. W. W., Dyer, R. B. Proton-Coupled Electron Transfer Dynamics in the Catalytic Mechanism of a [NiFe]-Hydrogenase. J. Am. Chem. Soc. 137 (13), 4558-4566 (2015).
  50. Greene, B. L., Wu, C. -H., Vansuch, G. E., Adams, M. W. W., Dyer, R. B. Proton Inventory and Dynamics in the Nia-S to Nia-C Transition of a [NiFe] Hydrogenase. Biochemistry. 55 (12), 1813-1825 (2016).
  51. Greene, B. L., Vansuch, G. E., Wu, C. -H., Adams, M. W. W., Dyer, R. B. Glutamate Gated Proton-Coupled Electron Transfer Activity of a [NiFe]-Hydrogenase. J. Am. Chem. Soc. 138 (39), 13013-13021 (2016).
  52. Sezer, M., et al. Role of the HoxZ Subunit in the Electron Transfer Pathway of the Membrane-Bound [NiFe]-Hydrogenase from Ralstonia eutropha Immobilized on Electrodes. J. Phys. Chem. B. 115 (34), 10368-10374 (2011).
  53. Heering, H. A., Wiertz, F. G. M., Dekker, C., de Vries, S. Direct Immobilization of Native Yeast Iso-1 Cytochrome c on Bare Gold: Fast Electron Relay to Redox Enzymes and Zeptomole Protein-Film Voltammetry. J. Am. Chem. Soc. 126 (35), 11103-11112 (2004).
  54. dos Santos, L., Climent, V., Blanford, C. F., Armstrong, F. A. Mechanistic studies of the "blue" Cu enzyme, bilirubin oxidase, as a highly efficient electrocatalyst for the oxygen reduction reaction. Phys. Chem. Chem. Phys. 12 (42), 13962-13974 (2010).
  55. Lukey, M. J., et al. How Escherichia coli Is Equipped to Oxidize Hydrogen under Different Redox Conditions. J. Biol. Chem. 285 (6), 3928-3938 (2010).
  56. Jones, A. K., et al. Enzyme Electrokinetics: Electrochemical Studies of the Anaerobic Interconversions between Active and Inactive States of Allochromatium vinosum [NiFe]-hydrogenase. J. Am. Chem. Soc. 125 (28), 8505-8514 (2003).
  57. Quinson, J., et al. Comparison of carbon materials as electrodes for enzyme electrocatalysis: hydrogenase as a case study. Faraday Trans. 172 (0), 473-496 (2014).
  58. Shafaat, H. S., Rüdiger, O., Ogata, H., Lubitz, W. [NiFe] hydrogenases: A common active site for hydrogen metabolism under diverse conditions. Biochim. Biophys. Acta, Bioenerg. 1827 (8-9), 986-1002 (2013).
  59. Ash, P. A., Hidalgo, R., Vincent, K. A. Proton transfer in the catalytic cycle of NiFe hydrogenases: insight from vibrational spectroscopy. ACS Catalysis. , (2017).
  60. Krishnan, S., Armstrong, F. A. Order-of-magnitude enhancement of an enzymatic hydrogen-air fuel cell based on pyrenyl carbon nanostructures. Chem. Sci. 3 (4), 1015-1023 (2012).
  61. Baffert, C., et al. Covalent Attachment of FeFe Hydrogenases to Carbon Electrodes for Direct Electron Transfer. Anal. Chem. 84 (18), 7999-8005 (2012).
  62. Rüdiger, O., et al. Enzymatic Anodes for Hydrogen Fuel Cells based on Covalent Attachment of Ni-Fe Hydrogenases and Direct Electron Transfer to SAM-Modified Gold Electrodes. Electroanal. 22 (7-8), 776-783 (2010).
  63. Barth, A., Zscherp, C. What vibrations tell about proteins. Q. Rev. Biophys. 35 (4), 369-430 (2002).
  64. Jiang, X., et al. Resolving voltage-dependent structural changes of a membrane photoreceptor by surface-enhanced IR difference spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (34), 12113-12117 (2008).
  65. Kottke, T., Lòrenz-Fonfrìa, V. A., Heberle, J. The Grateful Infrared: Sequential Protein Structural Changes Resolved by Infrared Difference Spectroscopy. J. Phys. Chem. B. 121 (2), 335-350 (2017).
  66. Callender, R., Dyer, R. B. The Dynamical Nature of Enzymatic Catalysis. Acc. Chem. Res. 48 (2), 407-413 (2015).
  67. Ciaccafava, A., et al. When the inhibitor tells more than the substrate: the cyanide-bound state of a carbon monoxide dehydrogenase. Chem. Sci. 7 (5), 3162-3171 (2016).
  68. George, S. J., Ashby, G. A., Wharton, C. W., Thorneley, R. N. F. Time-Resolved Binding of Carbon Monoxide to Nitrogenase Monitored by Stopped-Flow Infrared Spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 119 (27), 6450-6451 (1997).
  69. McPherson, I. J., Ash, P. A., Jacobs, R. M. J., Vincent, K. A. Formate adsorption on Pt nanoparticles during formic acid electro-oxidation: insights from in situ infrared spectroscopy. Chem Commun. 52 (85), 12665-12668 (2016).

Tags

Biyokimya sayı: 130 Protein Film kızılötesi elektrokimya PFIRE hydrogenase electrocatalysis bioelectrocatalysis yakıt hücresi kataliz protein film elektrokimya situ spektroskopisi titreşim spektroskopisinin içinde operando zayıflatılmış toplam yansıma kararlı duruma Kinetik biyofizik redoks proteinler
Protein Film kızılötesi elektrokimya H<sub>2</sub> oksidasyon çalışma için [NiFe] Hydrogenase tarafından gösterdi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ash, P. A., Hidalgo, R., Vincent, K. … More

Ash, P. A., Hidalgo, R., Vincent, K. A. Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase. J. Vis. Exp. (130), e55858, doi:10.3791/55858 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter