Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

חלבון הסרט אינפרא-אדום אלקטרוכימיה שהפגינו למחקר של H2 חמצון Hydrogenase [ניפה]

doi: 10.3791/55858 Published: December 4, 2017
* These authors contributed equally

Summary

כאן, אנו מתארים טכניקה, חלבון הסרט אינפרא-אדום אלקטרוכימיה, המאפשר קיבוע חמצון-חיזור חלבונים שילמדו spectroscopically תחת שליטה ישירה אלקטרוכימי פחמן האלקטרודה. ניתן להקליט ספקטרום אינפרא-אדום של דגימה של חלבון יחיד בטווח של פוטנציאל יישומי, תחת מגוון תנאים פתרון.

Abstract

הבנת הכימיה של חמצון-חיזור חלבונים דרישות שיטות המספקים שליטה מדויקת חמצון-חיזור מרכזי בתוך החלבון. הטכניקה של חלבון הסרט אלקטרוכימיה, שבו חלבון זה ותשמרו על פני השטח אלקטרודה כך האלקטרודה מחליפה אלקטרונים פיזיולוגיים או acceptors, סיפקה פונקציונלי תובנה תגובות חמצון-חיזור של מגוון שונה חלבונים. ההבנה כימי מלא דורש שליטה אלקטרוכימי להיות משולבת עם טכניקות אחרות, באפשרותך להוסיף תובנה מכניסטית מבניים נוספים. כאן אנחנו מדגימים טכניקה, חלבון הסרט אינפרא-אדום אלקטרוכימיה, המשלב חלבון הסרט אלקטרוכימיה עם אינפרא אדום ספקטרוסקופיות דגימה של חלבונים חמצון-חיזור. הטכניקה משתמשת של הגיאומטריה מרובות-השתקפות השתקפות הכולל הקלוש כדי לחקור חלבון חמצון-חיזור ותשמרו על אלקטרודה פחמן שחור שטח גבוהה. תיאגוד זו האלקטרודה לתא זרימה מאפשר פתרון pH או ממס ריכוזים להשתנות במהלך המדידות. . זה חזק במיוחד בהתייחסות אנזימים חמצון-חיזור, תחלופה מהירה קטליטי יכול להיות מתמשכת ואיפה נשלטת על האלקטרודה ומאפשר תצפית ספקטרוסקופיות של מינים ביניים מאריכים את המנגנון קטליטי. נדגים את הטכניקה עם ניסויים על e. coli hydrogenase 1 תחת מחזור (H2 חמצון) ומצבים שאינם-מחזור.

Introduction

אתגר מפתח במחקר של פונקציה של חלבונים כרוך פיתוח שיטות בחיי עיר המאפשרים תצפית ישירה של חלבונים בביצוע תפקידיהם פיזיולוגיים, או ויוו או באמצעות דגימות חלבון מבודד. פעולה זו דורשת השילוב של שליטה או מפעילה תהליכים לתוך בצרות ושימוש בשילוב טכניקות המאפשרות את תגובתיות לפנות לבדיקה, של צעדים כימיים בודדים במהלך פונקציה של חלבונים כדי למדוד, בו זמנית. במקרה של חמצון-חיזור חלבונים זה לעיתים קרובות משווה ל המשלב טכניקות אלקטרוכימי, אשר בדיוק לשלוט פוטנציאל יישומי אבל לספק מידע כימי ישיר אין, עם שיטות ספקטרוסקופיות רגישים מבחינה כימית ספציפית שינויים הקשורים עם פונקציה של חלבונים. 1 , 2 , 3 Spectroelectrochemistry הוא מונח כללי עבור טווח בשילוב שיטות אלקטרוכימיות, ספקטרוסקופיות להקיף מגוון רחב של שיטות ספקטרוסקופיות ואת רמת השליטה אלקטרוכימי. חלבונים רבים יכולים להחליף אלקטרונים עם אלקטרון מלאכותי, מסיסים התורמים, acceptors, זו נוצלה במחקרים אשר השתמש מולקולות קטנות כדי לתווך העברת-אלקטרונים, כולל צימוד עם UV הגלוי,4,5 , 6 , קיווטות מגנטי 7 8 ו אינפרא-אדום5,9,10,11,12,13,14 (IR) spectroscopies. במספר מצומצם של מקרים הוכיחה אפשרות לנצל אלקטרונים בלתי מבוקרת דיפוזיה, חליפין בין חלבונים אלקטרודות. 15 , 16

לתגובות קטליטי ביצעו על ידי אנזימים חמצון-חיזור, גישות אלקטרוכימיה פתרון קיים חיסרון ברור. העברת אלקטרונים מבוקרת דיפוזיה דרך חמצון-חיזור מגשרים בתמיסה היא צפויה להפוך הגבלת קצב. קינטי, מכניסטית מידע אודות האנזים עלול ללכת לאיבוד או לפחות להקשות על deconvolute של חפצי אמנות טשטוש הנובע השיטה הניסיונית. ישירה, בלתי שליטה אלקטרוכימי לכן כלי חשוב לצורך המחקר של חמצון-חיזור חלבונים ואנזימים. הטכניקה של חלבון הסרט אלקטרוכימיה (PFE) מעסיקה חלבונים אלקטרודה. מרותק למיטה חמצון-חיזור, בצורה כזאת, כי האלקטרונים מועברים ישירות או ממנה את cofactors חמצון-חיזור בתוך החלבון כפי האלקטרודה היא מקוטב-סדרה של פוטנציאל. 17 , 18 , 19 PFE הוא בעל ערך מסוים לצורך המחקר של תגובות חמצון או הפחתת על ידי אנזימים חמצון-חיזור, כמו העברת-אלקטרונים פנים יכול להיעשות בקצב מאוד גבוה. לדוגמה, שיעור תחלופה electrocatalytic hydrogenase ([ניפה]) ניקל וברזל מן Allochromatium vinosum נמדדה על ידי PFE כמו ca 1,000-10,000 s− 1 עבור H2 חמצון. 20 האלקטרודה פוטנציאליים פועל כגורם מפעיל להפוך זרז 'על' או 'ביטול' ולאחר הדיווחים הנוכחי electrocatalytic על פעילות האנזים. PFE ולכן היא שיטה ערך לניתוח את תגובתיות של אנזימים מורכבים באופן אינטימי תלויים פוטנציאלית, כגון תגובות של האתר הפעיל di-ברזל של [FeFe]-hydrogenases עם CO ו- O2,21 או בהשפעת פוטנציאל השתקה של כרומוזום תגובות של hydrogenases דהידרוגנאז פחמן חד-חמצני22 ,23 , אנזימים חמצון-חיזור מורכבים אחרים. 24

המכשול העיקרי בפני שילוב שיטות ספקטרוסקופיות עם הפקד אלקטרוכימי ישירה המוענקת על ידי PFE נובע כיסוי משטחים נמוכה של אנזימים חמצון-חיזור, גודל 1-2 pmol ס מ-2 עבור hydrogenase [ניפה] מ- vinosum א, 20 יחסית בחיי עיר המדע משטח מחקרים של מולקולה קטנה adsorbates על גבי אלקטרודות מתכת בצובר. זה מהווה אתגר על הרגישות של המדידה ספקטרוסקופיות מספר שיטות spectroelectrochemical דווחו ללמוד מתאושש חמצון-חיזור חלבונים במגוון של אלקטרודות שונות: ספקטרוסקופיה UV-גלוי-אלקטרודות תחמוצת מתכת שקוף; 25 , 26 , 27 ספקטרוסקופיה זריחה-אלקטרודות זהב; 28 , 29 השטח משופרת ספקטרוסקופיית בליעה אינפרא-אדום (SEIRA)-אלקטרודות זהב; 30 , 31 , 32 , 33 , משטח משופרים שיטות ספקטרוסקופיות ראמאן, בעיקר על אלקטרודות כסף. 34 , 35

כאן נתאר שיטת צימוד PFE עם ספקטרוסקופיית אינפרא-אדום, בטכניקה המכונה חלבון הסרט אלקטרוכימיה אינפרא-אדום (PFIRE). 36 PFIRE שיטת מחקרים חמצון-חיזור אנזימים ותשמרו על אלקטרודה עבודה פחמן שטח גבוהה בשיתוף עם גאומטריה אינפרא-אדום (ATR-IR) השתקפות הכולל הקלוש, ניצול הקלות של ספיחה של מגוון של חלבונים על משטחי פחמן. ספקטרוסקופיית אינפרא-אדום שימושית במחקרים של חמצון-חיזור אנזימים וחלבונים כמו מולקולות קטנות רבות, ליגנדים, cofactors יש absorbances אבחון זה ניתן להשתמש כדי להעריך את מצב תגובתיות, איגוד, עיכוב, חמצון-חיזור. דוגמאות כוללות קשירה של לא למרכזי ברזל-גופרית,37 המחקר של flavoproteins,38,39,40 מולקולה קטנה איגוד מרכזי heme ועוד. 41 הגיאומטריה ATR ה-IR מאפשר בנייה של תא אלקטרוכימי שלוש ממוטבת-אלקטרודה (ספקטרו)42 , ולכן מספק שליטה אלקטרוכימי מעולה. פתרון התנגדות וטיילו פוטנציאליים הן מזעריות על-ידי הצבת של אלקטרודה הפניה ליד האלקטרודה עבודה. אלקטרודות שטח גבוהה מונה משמשים שעולות בקנה אחד עם זרמים electrocatalytic גבוהה המיוצר על ידי האנזים מהירה מחזור ב האלקטרודה עבודה. זרימה של פתרון באמצעות תא spectroelectrochemical מאפשר שליטה נתיישב על הריכוז של מצעים, מעכבי ו- pH. 36 , 43 , 44 PFIRE השיטה מאפשרת לכן ספקטרה IR להיות מוקלט בחיי עיר בזמן ממושך אנזים electrocatalysis. 36 , 44 PFIRE הוא גם מסוגל לספק מידע כימי בהיעדרו של הנוכחי, קטליטי43 בניגוד PFE איפה זה יכול להיות קשה כדי לחלץ מידע שאינו קטליטי בתהליכי חמצון-חיזור אנזימים. 45 , 46

הראו את שיטת PFIRE עבור המחקר של electrocatalytic H2 חמצון על ידי [ניפה] hydrogenases, אשר מכילים ליגנדים CO ו- CN מהותי מתואמת כדי Fe-אתר פעיל בי-מתכתיים. 36 , 43 , 44 [ניפה] hydrogenases ולכן הם התאימו היטב כדי ללמוד על-ידי PFIRE. שיטת PFIRE מספק מידע על מינים שנמצאים במהלך מחזור מצב יציב ומספק ולכן קריטי תובנה מכניסטית בנוסף העושר של ספרות על ספקטרוסקופיית אינפרא-אדום של hydrogenases ללא שליטה ניסויית על מחזור. 47 , 48 דייר ועמיתים המועסקים זמן לפתור IR שיטות ללימוד ניפה hydrogenases,49,50,51 באמצעות גורם אור כדי להחיל צעד פוטנציאל שלילי קטן (באמצעות שימוש של פתרון מגשרים ומקור אלקטרון "כלואה") או photolyse הידריד מאוגד. למרות השיטה PFIRE לא יכול, בזמן הנוכחי, לספק רזולוציה הזמן כדי להתאים את המידות האלה,40 זה לאפשר לימוד של תהליכים קטליטי חותכות והן חמצוני, לגשת במגוון של פוטנציאל מוגדרים היטב וללא התחבורה ההמונית מגבלות.

השיטה PFIRE היא נבדלת SEIRA מחקרים של חמצון-חיזור חלבונים, אשר גם להשתמש של הגיאומטריה ATR-IR ולהעסיק אלקטרודת מתכת של ננו-roughened כדי לשפר את ספיגת IR של מולקולות הספוחה על פני האלקטרודה. 30 SEIRA היא טכניקה בעלת ערך רב מאוד ללמוד קרום חלבונים, בפרט הספוחה על או בתוך הממברנה מימטי ארכיטקטורות,32 אבל את הצורך אלקטרודת מתכת יכול להגביל את טווח המצע והמעכב עקב תגובתיות את התמיכה אלקטרודה לכיוון מולקולות קטנות כגון CO, CN, CO2 וכו הפחתת פרוטונים ו טפט עצמית שהורכב desorption יכול להיות בעייתי על משטחי מתכת-פוטנציאל שלילי מאוד,1,52 למרות אנזים electrocatalysis על הגנה מתכת אלקטרודות דווח. 53 , 54 חיסרון של PFIRE ביחס SEIRA הוא הקושי היחסי של שילוב קרום חלבונים בממברנה מקורית או מימטי ארכיטקטורות. עם זאת, יחסי אינרטיות כימית מצוינת ועמידות של החקירה פחמן תגובות הפעלה מתחרה של מולקולה קטנה גורם PFIRE טכניקה מצוינת ללמוד אנזים electrocatalysis, במיוחד בתחום פוטנציאל נמוך הרלוונטיים ביולוגי חמצון-חיזור תהליכים כגון פרוטון הפחתת על-ידי hydrogenases. 1 , 43

מטרת מאמר זה היא להציג את השיטה PFIRE כמו שיטת לימוד חלבונים אלקטרודה. מרותק למיטה חמצון-חיזור, ניפה hydrogenase 1 (Hyd1) מ- Escherichia coli כדוגמא. שיקולים של הכנת הדוגמא, הדרישה זרימה טובה המצע ונתונים טיפול הם דנו. PFIRE היא טכניקה בהרחבה ישימים, מותאם היטב כדי ללמוד כל חלבון חמצון-חיזור (עם absorbances האופיינית IR) זה יכול להיות adsorbed על גבי אלקטרודות פחמן, או ישירות או באמצעות שינוי פני השטח, כך שזה יכול להחליף אלקטרונים עם אלקטרודה.

Protocol

1. מסעדה ובר תא הדגימה פנימי של ספקטרומטר FTIR בתוך הכפפות אנאירובית, יבש ודרישות ניסיוני כללי

  1. השתמש ספקטרומטר FTIR מסחריים המצוידים עם חיצוני כספית קדמיום טלוריד (MCT) גלאי, אביזר ATR. גוף ספקטרומטר עם אוויר יבש או dinitrogen, או לחלופין להשתמש ספקטרומטר עם ספסל אופטי פונו.
  2. למקם את ספקטרומטר על גבי שולחן יציב, ללא רטט באותו גובה כמו אנאירובית (< ppm 1 או2), יבשה, הכפפות (נקודת הטל <-75 ° C). להסיט את קרן IR ספקטרומטר לתוך בתא הכפפות, דרך חלון שקוף IR גדול מספיק כדי להכיל את קרן defocused.
    הערה: חשוב כי הרווח בין הכפפות ספקטרומטר גם לצמיתות או פונו, במיוחד אם חומר היגרוסקופי חלון, כגון NaCl או KBr לדוגמה, משמש.
  3. שכפל תא הדגימה פנימי של ספקטרומטר בתוך בתא הכפפות.
    1. כוונו את הקרן בתוך הכפפות אל ראי אליפסואידי מהציר, באופן אידיאלי עם אורך מוקד זהה במראה התמקדות פנימי של ספקטרומטר.
      הערה: זה שימושי שיש שתי מראות המטוס נוספים הממוקמים לפני הראי התמקדות הזה, על מנת לאפשר את הגובה וגם את הכיוון של קרן IR יותאם בתוך הכפפות; זה יהיה לקזז כל דיוקים להצבת הראשונית ספקטרומטר.
    2. המקום של גלאי חיצוני MCT, להשלים עם מתאים מיקוד הראייה (כגון אורך מוקד קצר ZnSe העדשה, או מראה פרבולית מהציר, עם אורך מוקד קצר) בתוך הכפפות ממוצבת כגון כדי לשכפל את הממדים של המדגם פנימי תא המטען של ספקטרומטר.
    3. להתאים את המוקד' ' של קרן IR להיות כ קו מקביל בין המראה התמקדות והגלאי MCT.
  4. מגניב של דיואר של הגלאי MCT חיצוני עם חנקן נוזלי.
  5. הר האביזר ATR לתוך תא הכפפות הדגימה. יישר את הקלט והפלט התמקדות אופטיקה וסיוע ATR כדי להשיג תפוקה מקסימלית כדי הגלאי MCT. אם יש צורך, להשתמש צמצם או אחרים הנחתה מתאימים (כגון רשת תיל) כדי למנוע oversaturation של האות גלאי.
    הערה: עבור הנתונים המובאים כאן, אביזר ATR חמש-השתקפות ועם כל אופטיקה רעיוני של Si הבסיסי נשלף רכיב השתקפות פנימית (חמתו) משמש (קריסטל GmbH, מידות ca 5 × 8 × 1 מ3, זווית פניה 39.5 מעלות). חמתו נטענה baseplate נשלף במכונה של פוליאטר אתר קטון (פיק).
  6. להשתמש עם הכפפות כדי לשכן תא הדגימה המשוחזר עם feedthroughs מתאימה כדי לאפשר חיבור potentiostat שוכן מבחוץ (חיבורי BNC חזק גז שימושיים למטרה זו), גישה לאינטרנט גז, כבל (י) כדי להעביר את האות MCT גלאי. חשוב לשמור על כל סיכוך הכבל גלאי כדי להימנע מציגה רעש או הפרעה למידותיו.
  7. המקום משאבה סחרור, מסוגל זרימה המחירים גדול מ 60 mL/min בתוך בתא הכפפות. נוף סכמטי של ספקטרומטר, ATR אביזר, סחרור משאבת, potentiostat ההתקנה מוצג באיור1.
  8. לבנות תא spectroelectrochemical, כמו זה המוצג סכמטי איור 2, כי החותמות על ATR אביזר. התא צריך להכיל שטח גבוהה מונה אלקטרודה (Pt תיל או גזה), חיבור האלקטרודה עבודה (מוט פחמן), אלקטרודה הפניה של מיניאטורי. התא צריך להכיל לפחות שתי יציאות נוספות כמו כניסת ו עודפים לזרימה מהירה של פתרונות דרך התא.
    הערה: אלקטרודה הפניה calomel רווי מיניאטורי אידיאלי למטרה זו. 36

2. הכנת חלקיקי פחמן שחור שופרת e. coli Hydrogenase 1

  1. בהכפפות אנאירובית, 'רטוב' לערבב 20 מ ג של שטח גבוהה חלקיקי פחמן שחור (> 1,000 m3/g) עם מים טוהר על קוליים 1 מ"ל (resistivity > 18 ס מ MΩ) צינור microcentrifuge. לפזר חלקיקי מאת sonication צריכת חשמל נמוכה (< 100 W) לפחות 15 דקות, או עד הפיזור אחיד ועושה את המשקע לא בתוך 1 h, לתת פיזור פחמן שחור עם טעינה של 20 מ"ג/מ"ל.
  2. קח aliquot של e. coli hydrogenase 1 (Hyd1, כ- 50 µL, המוכנים לפי הייתה הליך שפורסמו55)-ריכוז חלבון ~ 7 מ"ג/מ"ל, להחליף אותו לתוך מאגר כוח יונית נמוך ב- pH קרוב נקודה איזואלקטרית (עבור דוגמה אשלגן פוספט, 15 מ מ, pH 5.8, בלי. מלח נוספים). כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר, השתמש הכנה של אנזים זה פעיל ככל האפשר. לבצע את ההחלפה מאגר על ידי ריכוז דילול, התקן צנטריפוגלי מסנן עם משקל מולקולרי המתאים חיתוך (50 kDa זו פועלת היטב עבור Hyd1).
    1. להוסיף Hyd1 את המכשיר מסנן.
    2. לדלל עם µL בערך 450 מאגר exchange.
    3. Reconcentrate לאמצעי אחסון של 50 µL באמצעות צנטריפוגה מתון (< ~ 2700 × g) למניעת משקעים בלתי הפיך.
    4. חזור על שלבים 2.2.2, 2.2.3 עד מאגר exchange תושלם (בדרך כלל תוך ~ 5 מחזורים).
  3. מערבבים נפח 5 µL של 20 מ"ג/מ"ל פחמן שחור הפיזור (להכין ב 2.1) עם aliquot 50 µL של חילופי-מאגר Hyd1. לאחסן את תערובת אנזימים-חלקיקים מקרר (ב-0 מעלות צלזיוס) למשך הלילה כדי לאפשר את האנזים לספוח. יתכן צורך לנער את התערובת מידי פעם כדי להבטיח שהחלקיקים יישארו התפזרו.
  4. לשטוף את החלקיקים Hyd1-השתנה עם מאגר כוח יונית נמוך (אשלגן פוספט, 15 מ מ, pH 5.8, בלי. מלח נוספים) על ידי מחזורים רצופים שיקוע, פיזור מחדש ב microcentrifuge (~ 2700 × g). חזור על תהליך זה 3 - 5 פעמים כדי להסיר את האנזים הספוחה.
    הערה: על לפני כביסה ראשונה תגובת שיקוע צריך להיות כמעט נטול צבע, המציין ספיחה טובה של האנזים.
  5. רכז החלקיקים לאמצעי הסופי של µL ~ 5, לתת טעינה הסופי של ~ 20 מ"ג/מ"ל של חלקיקים אנזים-השתנה.
    הערה: החלקיקים Hyd1-לאחרונה ניתן לאחסן ב 4 ° C עד שבועיים אם הם נשארים hydrated; זו מושגת בצורה הטובה ביותר על-ידי אחסון חלקיקים מדולל עם ~ 50 µL של מים טוהר על קוליים.

3. הכנה המידות PFIRE e. coli Hydrogenase 1

  1. לנקות את חמתו סי על ידי מאפיק נמוך sonication (< 100 W), תחילה ב H2אז4 (< 90% w/w) ~ 15 דקות ולאחר מכן עב ס3 (70% w/w) עבור עד 1 משאבי אנוש. הליך ניקוי זה אמור להוביל חמתו הידרופילי. אם נדרש ניקוי נוסף ניתן להציב את חמתו בפתרון פיראניה (יחס של 1:3 של2O H2: H2אז4) להתחמצן כל חומר אורגני הנותרים.
    הערה: ייתכן קשים שיטות ניקוי חומצי לא להיות מתאים לשימוש עם כל החומרים חמתו. פתרון פיראניה קורוזיבית מאוד, חמצון חזקים, משטחים צריך להיות נקיות למדי לפני השימוש פיראניה פתרון וטיפול יש לנקוט במהלך ההכנה ולהוסיף שימוש בפתרון פיראניה בשל אופיו אקסותרמית של התהליך - תמיד H2O 2 לאט לאט H2אז4 ולהפנות נוהלי הבטיחות המתאים עבור הכנה, השימוש, סילוק.
  2. שוטפים את חמתו נקי במים טוהר על קוליים, ומייבשים תחת זרם של גז חנקן יבש. לבצע כל טיפול פריזמה באמצעות פינצטה נקי כדי למנוע זיהום.
  3. חותם את חמתו לתוך baseplate אביזר ATR באמצעות רצועה דקה של איטום סיליקון חשמל-כיתה. לטפל כדי להגביל את חומר האיטום על הקצוות של חמתו. לאפשר את חומר האיטום לייבוש מלא.
  4. להעביר את baseplate אביזר ATR בתא הכפפות ספקטרומטר והר זה אל האביזר ATR. מדד קשת הפניה (רקע) בין 4000-1, 000 ס מ-1 4 ס מ-1 רזולוציה, באמצעות תקן מהירה לסרוק במצב של ספקטרומטר 1024 interferograms בממוצע (מדידה time ~ 3-5 דקות). השתמש הספקטרום הזה כקלט כדי לאפשר חישוב של ספיגת ספקטרה בהמשך הניסוי.
    הערה: עקב ספיגת קטן הצפוי עבור האתר הפעיל Hyd1 יש צורך לאסוף ספקטרה קליטה גבוהה יחסי הרעש.
  5. להעביר את baseplate אביזר ATR בתא הכפפות "רטוב" אשר מכיל את פיזור חלקיקים Hyd1-השתנה מוכן מראש (סעיף 2). ירידה-שחקנים aliquot 1 µL של פיזור חלקיקים על הפנים גדול של חמתו, ולהפיץ את אותם באופן שווה על פני השטח. הערה: אל תאפשר את החלקיקים להיות יבש לחלוטין על חמתו.
  6. חותכים פיסת נייר פחם, כגון בשימוש כחומר דלק דיפוזיה שכבה בתאי דלק גודל ~0.1 מ מ קטן יותר מידות משטח חמתו (קרי ca. 8.2 × 4.9 מ מ2). פני השטח של הנייר פחמן צריך להיות גדול מספיק כדי לכסות את החלקיקים Hyd1-השתנה טיפה-שחקנים, אבל לא כל כך גדולים עד חופפים איטום סיליקון נהגו לאבטח את חמתו. משרים את הנייר פחמן במים, הנח אותו בעדינות מעל הסרט חלקיקים. הנייר פחמן תספק חשמל חיבור טוב לאורך הסרט כל חלקיק.
    הערה: מומלץ להכין מראש מספר פיסות נייר פחם, ולאחסן אותם מראש ספוגה במים טוהר על קוליים בתוך הכפפות אנאירובית 'רטוב'.
  7. הר spectroelectrochemical התא (המתוארים 1.7 סכמטי באיור 2) מעל חמתו, לאבטח אותו לתוך baseplate עם ברגים. להוסיף ~ 200 µL של המאגר ניסיוני לשמור את האנזים להתייבש. מערכת מאגר מעורב, יכולת אגירת מעל טווח pH רחב, שימושית עבור מחקרים על ניפה hydrogenases:56 סודיום אצטט, 2-[N'-מורפולינו] אתאן-sulfonic חומצה (MES), N'-[2-hydroxyethyl] piperazine -N' -[חומצה 2-אתאן-sulfonic] (HEPES), N'-טריס [hydroxymethyl] חומצה מתיל-3-אמינו-פרופאן-sulfonic (ברזים), ו 2-[N'-cyclohexylamino] אתאן-sulfonic חומצה (צ'ז), עם כל רכיב בריכוז סופי של 15 מ מ, המכיל 0.1 M NaCl תמיכה אלקטרוליט, עם pH להתאים ל- pH 6 שימוש מרוכז NaOH ו- HCl.
    הערה: החיבור אלקטרודה עבודה צריך לבלוט מעט מתחת למישור העליון תא spectroelectrochemical (~0.1 מ"מ) כדי להבטיח חיבור אלקטרונית טובה על הנייר פחמן (איור 2).
  8. לחבר את כניסת פתרון ו עודפים של התא spectroelectrochemical מערכת זרימת המכילה צינור משאבת סחרור, בקבוקון של המאגר ניסיוני. להעביר את התא התאספו בתא הכפפות 'יבש' המכיל את ספקטרומטר.
  9. טעינת ההרכבה תא spectroelectrochemical אל האביזר ATR. להתחבר potentiostat העבודה, מונה ואלקטרודות הפניה. להתחבר לאורך צינור משאבת סחרור המשאבה.
  10. להקליט על הספקטרום ספיגת עם 1024 בממוצע interferograms ברזולוציה-1 4 ס מ מעל מגוון ספקטרלי של 4,000-1, 000 ס מ-1, באמצעות הקשת שליקט 3.4 כרקע/הפניה. בשלב זה הספקטרום צריך להכיל משמעותי (> 100 mO.D...) להקות השנייה אמיד ב ~ 1,540 ס מ-1 , אתר פעיל להקות של Hyd1 צריך להיות ניכר ספקטרלי מהאולטרא 1,850-2,150 ס מ-1, בארצות הברית מחמצנים, לא פעיל (איור 3 ).

4. הפעלה של e. coli Hydrogenase 1 ובדיקות התא Spectroelectrochemical

  1. הפחתת פוטנציאל (−0.8 V vs SCE) חלות על הסרט חלקיקים Hyd1-השתנה. עיתוני המאגר ניסיוני עם H2 ואת זרימת מאגר באיטיות דרך התא spectroelectrochemical. להשאיר את הדגימה לילה מלא להפעיל את Hyd1.
    הערה: חשוב להשתמש H אנאירובית2, N2 וכווגזים אנאירובית אז כל צריך לעבור דרך מסנן2 O.
  2. שיא של ספקטרום ספיגת המדגם לאחר ההפעלה. ΝCO ולהקות vCN של האתר הפעיל כעת יופיע התפלגות של הברית מופחתת, 'פעיל'. זה הוא ציין ביותר בקלות באמצעות קשת ההבדל, ביחס הספקטרום טלקוה 3.10 (איור 4).
  3. בדוק את חיבור חשמל של התא spectroelectrochemical. כדי לעשות זאת, עיתוני המאגר ניסיוני עם גז2 N. להחיל רצף של חמצון (0 V vs SCE) וקיצור (−0.8 V vs SCE) פוטנציאל (משך 30 דקות ca ) הסרט חלקיקים Hyd1-לאחרונה, והקלטה של ספקטרום ספיגת בכל אחד. צריך להיות מחומצן, מופחתת במהירות Hyd1, אם הסרט חלקיקים מחובר היטב 100% מכלל המדגם צריך להגיב על פוטנציאל יישומי.
  4. הגדר של קצב הזרימה המתאימה המאגר ניסיוני. כדי לעשות זאת, להחיל הפחתת פוטנציאל (−0.8 V vs SCE) על המדגם, עיתוני המאגר ניסיוני עם H2. להקליט סדרה של voltammograms מחזורית בין-0.707 - 0.039 V vs SCE בקצב הסריקה של mV 10/ס להגדיל בהדרגה את קצב הזרימה של H2-רוויות חיץ בין voltammograms עד waveshape קטליטי דומה לזו-סיבוב מישורי דיסק אלקטרודה55 , הזרם המרבית היא עצמאית של קצב הזרימה (איור 5).
    הערה: מגבלת מסיסות של H2 במים הוא מ"מ ~0.8 293 K ו- 1 בר.
  5. כמו לדוגמה עכשיו הוא מוכן למדידות PFIRE, לאסוף ספקטרה במגוון של פוטנציאל, תחת מגוון תנאים פתרון (pH, טמפרטורה, H2 ריכוז וכדומה). להקליט את כל הנתונים אלקטרוכימי באמצעות התוכנה potentiostat כפי שזה חשוב שניתן יהיה להתאים נתונים ספקטרוסקופיות אלקטרוכימי, במיוחד כאשר לומד electrocatalytic תהליכים כגון H2 חמצון על ידי Hyd1.

5. טיפול נתונים ספקטרוסקופיות

  1. לאשר כי האתר הפעיל לא לצמיתות שונתה במהלך המדידות בהקלטת ספקטרה-0 V ו−0.8 V vs SCE בסוף הניסוי. אלה צריכים להיות זהים כדי ספקטרום טלקוה 4.3, ללא אובדן של אתר פעיל להתייחס בתקופת המדידה (איור 6).
  2. ייצוא ספקטרה ספיגת מוחלטת מתוך התוכנה ספקטרומטר בתבנית מתאימה (. csv, ASCII, 'matlab', Jcamp וכדומה) לצורך עיבוד באמצעות תוכנות כגון מקור או Matlab.
  3. הבסיס לתקן את הנתונים, באמצעות תהליך מאויר איור7.
    1. לקחת את הנגזרת השנייה של כל ספקטרום ספיגת ב- 1,800-2,150 ס"מ ' טווח '-1, על מנת לזהות קטן (< mO.D 1.) אתר פעיל להקות רקע מים עקומים מאוד.
    2. במקום בסיסית סמן נקודות על הספקטרום ספיגת המקורי, להגדיר את נקודות 'הצמד' אל הספקטרום ניסיוני.
    3. להתאים תוכנית בסיסית באמצעות נקודות באמצעות פונקצית spline מעוקב עם אינטרפולציה או פונקציה פולינום. חיסור פונקציה בסיסית זו מתוך נתוני ניסיוני.

Representative Results

איור 1 מציג ייצוג סכמטי של הסידור ניסיוני של מערכת הזרימה ספקטרומטר, הכפפות, ATR, potentiostat ומגילות גז המשמש למדידות PFIRE. איור 2 מציג את נציג ציור של התא spectroelectrochemical.

איור 3 מראה ספיגת ספקטרום של חלקיקים Hyd1-השתנה טיפה-שחקנים, עם המאגר ניסיוני (מאגר מעורבות מערכת, שמתואר 3.7, pH 6.0) זורם דרך התא spectroelectrochemical. סיקור Hyd1 פני השטח היא גבוהה במיוחד בדוגמה המוצגת באיור 3, עוצמה הלהקה השנייה אמיד של mO.D ~ 235. ומים מינימלית "בתפזורת" כפי שמעידים סדר הגודל של האזור מתיחה O-H (~ 3000-3,600 ס מ-1) ביחס הלהקה ב ס ~ 1,640 מ-1, אשר הוא קונבולוציה של אמיד אני הלהקה של Hyd1, העיקול מים H-O-H. ניתן לראות להקות נוספות בשל החלבון C-H מתיחה באזור (ca 2900 ס מ-1). הלהקה רחבה סביב ס מ 2,100-1 היא להקת הצירוף של הרטט כיפוף H-O-H עם סט של התחתון להקות ליברציה אנרגיה, אשר הם מוגבלים סבבים של מולקולות2O H כיוון שהרשת מליטה מימן במים זורמים. הלהקהCO νשל המדינה Ni-B מחמצנים, לא פעיל, של האתר הפעיל עולה בבירור אצל 1,943 ס מ-1, אפילו בלי תיקון בסיסית, והם νCN תכונות גלויים בבירור בין 2,050-2,100 ס"מ-1 . הכיסויים Hyd1 גבוה, הרבה של מבנה נקבובי. הסרט של פחמן שחור57 הופך חסום על ידי אנזים, ולכן ריכוז המים "בתפזורת" הוא הוריד במהלך המדידות PFIRE.

הספקטרום באיור 3 מראים כי, לפני ההפעלה, Hyd1 מהסרטים מכילים Hyd1 במדינות מחמצנים, לא פעיל. הפעלת לילה-−0.8 V vs SCE תחת אווירה2 H שמוביל היווצרות מופחת, המצבים הפעילים catalytically כפי שמתואר באיור 4 אשר מראה של הספקטרום-מוכן ההבדל (חמצון) מופעל (מופחת) מינוס של Hyd1. ההבדל ספקטרום של Hyd1 אפשר הדבר בבירור לפרש באמצעות האזור νCO . כל מצב ייחודי של האתר הפעיל יש להקת CO רק אחת לעומת שתי להקות CN ועל כן האזורCN νמיסודו מורכב יותר, עם הרבה להקות חופפים. הקשת ההבדל באיור 4 מראה כי הפעלת מוביל אובדן (ספיגת שלילית להקות) מחמצנים, לא פעיל Ni-B, כמות קטנה של ני-סי (המדינה 'פעיל' ביותר מחומצן) שהיו נוכחים בסרט Hyd1 איך מכינים. אלה מוחלפים המדינות 'פעיל' של Hyd1; Ni-C, Ni-R וני-ל' הערה כי ישנן שתי צורות של ני-R והן הברית Ni-L, כפי שמעידים על להקותCO שני νשנצפו המינים הללו באיור4. התצפית של מספר מצבי Ni-R וני-L הוא מסכים עם hydrogenases ניפה אחרים. 48 , 58 , 59

אימות מפתח של השיטה PFIRE הוא voltammograms מחזורית הקליטה של Hyd1 בתוך המופע זרימת spectroelectrochemical תא waveshapes קטליטי דומה לאלה הוקלט על אלקטרודה דיסק מסתובב מישורי. 55 בפועל פירוש התעבורה המונית של סובסטרט (H2) ואת המוצר (H.+) מ/קיבוע Hyd1 התא spectroelectrochemical הוא יעיל במחירים זרימה במהלך המדידות PFIRE. ההשפעה של קצב הזרימה על waveshape קטליטי מוצג באיור 5, אשר מראה voltammograms רצופים שנרשם תחת אווירה2 H (בר 1) כמו קצב הזרימה פתרון דרך התא spectroelectrochemical הוא גדל. כל המקרים overpotential את חמצון2 H על-ידי Hyd1 הוא זהה (אדום מוצל מלבן), אבל במידה האינקטיבציה חמצוני (היסטרזיס בין הזרם במהלך חמצוני, ממעיט מטאטא-פוטנציאל מעל ca 0 V vs SCE), חמצון2 H המרבי הנוכחי תלויות קצב הזרימה פתרון. במחירים זרימה מעל 52 mL/min (voltammogram אפור בהיר) waveshape קטליטי זה חסר רגישות נוספת מגביר קצב הזרימה.

איור 6 משווה בין עוצמות היחסי של הלהקה CO νשל המדינה Ni-B לאחר ההפעלה הראשונית של re-חמצון אנאירובי-0 V vs SCE (תחת Ar אווירה, כמתואר ב- 4.3) ואחרי איון חמצון אנאירובי תחת אווירה Ar-0 V vs SCE לאחר 48 hr של ניסויים רציפה (כפי שמתואר 5.1). אין איבוד עוצמת הלהקה אתר פעיל הוא ציין במהלך המדידה, ומגיב כל המדגם Hyd1 פוטנציאל יישומי.

איור 7 מדגים את הליך תיקון בסיסית בשימוש בכל רחבי עבודה זו. הספקטרום מוחלטת של הדגימה Hyd1 באזור אתר פעיל (איור 7) מכיל עקמומיות משמעותית עקב מים. למעשה, הדרישה לשימוש במים ממיס היא בעיה עבור מרבית היישומים של IR ספקטרוסקופיה במדעי החיים. הנגזרת השנייה של הספקטרום מוחלטת (איור 7b), מחושב באמצעות תוכנת מקור עם Golay סאוויצקי הדורים חלון נקודה 9, יכול לשמש לזיהוי להקות חדה של האתר הפעיל Hyd1 רקע מעוקל. זיהוי עמדות שיא משוער תוך שימוש בספקטרום נגזרות השני מאפשר בסיסית נקודות עיגון שימוקמו באזורים של הספקטרום מוחלטת חופשיים של אתר פעיל להקות (מעגלים ב איור 7). פונקציה spline מעוקב מצויד ואז דרך נקודות עיגון אלה כדי ליצור פונקציה בסיסית ואז ניתן להפחית מן הספקטרום מוחלט לתת קשת תוקן בסיסית המכילה רק פסגות הנובעים האתר הפעיל Hyd1 (איור 7 c).

איור 8 מציג את התוצאות של מדידה PFIRE Hyd1, תחת הלא-מחזור (Ar האווירה) והן התנאים (H2 האווירה) מחזור בטווח של פוטנציאל. 36 עקבות הזמן הנוכחי (איור 8) הדו ח הנוכחי קטליטי בכל מיושם הפוטנציאל, נשארים קרוב אפס הזרם בתנאים שאינם-מחזור (Ar אווירה). טיטרציה חמצון-חיזור חלקי spectroelectrochemical איור 8b ולכן דוחות על ההתנהגות חמצון-חיזור שיווי משקל של האתר הפעיל, מציג את ההתפלגות של הברית צפויה על כל הפוטנציאל בהיעדר תחלופה קטליטי. ספקטרום איור 8c נרשמו בתנאים מחזור (תחת אווירה2 H), לפיכך מייצגות את ההתפלגות מצב יציב של אתר פעיל הברית נוכח במהלך חמצון הקטליטי2 H על-ידי Hyd1. מצב יציב תנאים הושגו אושר על ידי העובדה כי H2 חמצון הקטליטי הנוכחי (איור 8, H2) נשאר קבוע כפונקציה של הזמן −0.199 V, −0.074 V vs היא; הריקבון המונוטוני זרם-+0.356 V vs היא עקב ידועים איון חמצון אנאירובי של Hyd1. 55 חלוקת מדינות אתר פעיל שונה בבירור תחת Ar ו- H2 -כל פוטנציאל איפה Hyd1 מבצעת זרז (איור 8ב', ספקטרה-−0.199, −0.074, +0.356 V vs היא). ספקטרום שנרשם תחת Ar ו- H2 כמעט זהים-−0.594 V vs היא, עם זאת, וזה מסמל מבחן חשוב של עקביות ניסיוני; Hyd1 אינה גורעת H+ בקצב משמעותי ב- pH 6.0 (הזרם באיור 8 תחת Ar ו- H2 היא קרובה לאפס), הספקטרום-−0.594 V ולכן צפויים להיות אותו הדבר.

איור 9 מדגים איון חמצון אנאירובי של Hyd1 דרך היווצרות של ני-B מ- Ni-סי במהלך חמצון2 H-+0.356 נ'36 ספקטרה נרשמו במהלך מרווחי זמן אפור ציין על הסימן הזמן הנוכחי ב איור 9. ב −0.074 V Hyd1 אינו עובר חמצון איון, ההתפלגות של אתר פעיל הברית נשאר קבוע לאורך כל השלב פוטנציאליים כולו. הדבר מומחש הספקטרום ב איור 9ב'אני, הכפוף הספקטרום בסיסית-מתוקן מוחלטת בתחילת שלב פוטנציאליים −0.074, ו-b איור 9השני שהוקלט במןעד במהלך השלב פוטנציאליים והזמן המדווח קשת ההבדל ביחס איור 9ב'אני. ספקטרום איור 9ב'השלישי , bהרביעי מדווחים גם כמו ספקטרה ההבדל ביחס איור 9bאני, ולהראות הדרגתית ההמרה של ני-סי ני-B במהלך התיכון פוטנציאליים השתקה של כרומוזום, עקבי עם הירידה הנוכחי שמוצג ב +0.356 V באיור 9המונוטוני.

ספקטרה הקליט במגוון של פתרון ה-pH לתת תובנות העברת פרוטון שלבים במהלך קטליטי Hyd1 מחזור. 43 איור 10 מראה ספקטרה PFIRE הוקלט על הסרט Hyd1 אותו ב- pH 3.0 ו- pH 9.0, באמצעות פתרון זרימה בתא spectroelectrochemical להחליף את המאגר ניסיוני. הריכוזים היחסיים של הברית Ni-C וני-L שונים באופן ברור באלה שני ספקטרה. על ידי שינוי פוטנציאל יישומי בתנאים שאינם-מחזור התלות פוטנציאלי של ה-NiC ושל Ni-L קובע יכול להיקבע במהירות במגוון של ערכי pH (איור 10ב'), ולאחר שתי המדינות נמצאות להיות isopotential על טווח pH רחב. (שים לב כי absorbances שיא איור 10b להראות רק את מדינות Ni-C וני-L עבור בהירות, חמצון-חיזור מלא titrations של Hyd1 דווחו על ידי הידאלגו. et al.) 36 טיטור pH של הריכוזים של ני-C וני-L ואז ניתן לחילוץ, לוקח את ספיגת שיא פוטנציאל איפה ריכוז מוחלט Ni-C וני-L מקסימום שלה ב- pH בכל (איור 10c). בדרך זו, יחד עם נתונים EPR, שיווי משקל-pH בין C-ני ני-L הברית זוהה. 43

Figure 1
איור 1: תיאור סכמטי של הסידור של IR ספקטרומטר הכפפות אנאירובית, אביזר ATR, גלאי MCT, גז הזרימה ומערכת potentiostat המשמש למדידות PFIRE. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: תרשים סכמטי של התא spectroelectrochemical המשמש למדידות PFIRE, מציג הסידור של אלקטרודות והפתרון חיבורי כניסה/יציאה- התא ואת baseplate הם במכונה של פוליאטר אתר קטון (פיק), עם חורי הברגים על מוט פחמן עובד חיבור האלקטרודה, Pt מונה אלקטרודות, calomel רווי הפניה אלקטרודה, ואת פתרון כניסת ו עודפים. הבנייה אלקטרודה הפניה calomel רווי כמו בעבר מדווח. 36 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: ספיגת הספקטרום של חלקיקים Hyd1-השתנה פחמן שחור, הנמסרים את חמתו של ולמיומנות עם מאגר. העמדות של אמיד שאני להקה, להקת השנייה אמיד, Hyd1 אתר פעיל באזור מוצגים, יחד עם תכונות נוספות עקב ויברציות מתיחה C-H ומים הממס. שיבוץ מראה תצוגה מוגדלת של האזור אתר פעיל, עם vCO ו- vCN הרצועות המסומנות. 'כמו פאגו' חלקיקים מכילים Hyd1 בעיקר במדינה מחמצנים, לא פעיל Ni-B. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : הפעלה של Hyd1-−0.8 V vs SCE תחת אווירה2 H, הציג כמו קשת ההבדל מחמצנים מופחתת מינוס . בעת הפעלת פוטנציאל נמוך מחומצן, ני לא פעיל-B (וגם ריכוז קטן של ני-סי) ממיר יותר מופחת, פעיל הברית Ni-C, Ni-R וני-ל' הערה כי Hyd1 יש שני מצבים המשנה ברורה של ני-L וני-R. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5 : ההשפעה של קצב הזרימה פתרון על waveshape של voltammograms מחזורית קטליטי שנרשם בתא spectroelectrochemical. Voltammograms נרשמו בהגברת זרימת שערי H2-רווי מאגר כמצוין. בספיקה של 20 mL/min (אדום) voltammogram מראה איון משמעותית מעל 0 V vs היא על הסריקה קדימה. במחירים זרימה מעל 52 mL/min להיקף של איון הוא נמוך בהרבה, הנוכחית היא עצמאית של קצב הזרימה-כל פוטנציאל. פרמטרים נוספים: 1 בר H2, 10 קצב סריקה mV/s. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6 : בסיסית מתוקן IR ספקטרה באזור CO νאתר פעיל של מצב Ni-B מחמצנים, לא פעיל 0 V vs SCE. שם אין הפסד מדיד בעוצמה אתר פעיל במהלך 48 שעות של מדידות PFIRE רציף, ולכן Hyd1 הוא הספוחה robustly על חלקיקי פחמן שחור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: פרטים של ההליכים תיקון בסיסית בשימוש לטיפול נתונים. נקודות עיגון בסיסית ממוקמים על גבי הקשת ספיגת מוחלט באזור אתר פעיל (), מקפיד להימנע מכל νCO וνCN פסגות זוהה דרך ניתוח נגזרות השני (b). הקשת המתוקן וכתוצאה מכך בסיסית מוצג (c). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 8
איור 8: המידות PFIRE Hyd1 תחת הלא-מחזור (Ar) ותנאי מחזור (ח2). () הזמן הנוכחי עקבות של Hyd1 התא spectroelectrochemical Ar-רווי (אפור) ו- H2-רוויות המאגר (שחור); (b), ספקטרה (c) PFIRE מציג את האזורCO νעל כל הפוטנציאל תחת Ar (b) ו- H2 (ג). פוטנציאל מצוטט V vs היא. לשכפל באישור הידאלגו. et al. 35 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 9
איור 9: איון אנאירובית של Hyd1 דרך היווצרות של ני-B מ- Ni-סי- () עקבות הזמן הנוכחי תחת אווירה2 H, מראה של electrocatalytic יציב הנוכחי −0.074 V, איון אנאירובית איטי (המונוטוני הנוכחי הדירי)-+0.356 V vs היא. (b) ספקטרה שנרשם במהלך אזורים מוצללים אפור המסומנים ב (א). ספקטרום bאני הוא ספקטרום המתוקן בסיסית שנרשם בתחילת השלב פוטנציאליים −0.074 V ספקטרום bii, נרשם במועד מאוחר יותר במהלך השלב החמישי −0.074, המדווח קשת ההבדל ביחס bאני ומראה כי מתרחשת ללא כל שינוי חלוקת מדינות אתר פעיל, תואם היציבות של הפוטנציאל-−0.074 V. ספקטרה biii ו- bהרביעי מדווחים גם כמו ספקטרה ההבדל ביחס bאני ולהראות הדרגתית ההמרה של ני-סי ני-B במהלך איון אנאירובית-+0.356 V vs היא. לשכפל באישור הידאלגו. et al. 35 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 10
איור 10 : ספקטרה הקליט במגוון של פתרון ה-pH לתת תובנות העברת פרוטון שלבים במהלך מחזור קטליטי Hyd1. () IR ספקטרה מציג את האזורCO νHyd1, הוקלט ב pH 3.0 (הערך-54 mV vs היא) ו- pH 9.0 (-334 mV vs היא). (b) Spectroelectrochemical titrations בוצעו כדי לקבוע את הפוטנציאל שבו ריכוז Ni-C וני-L הינם לכל היותר בטווח של ערכי pH הפתרונות. רק Ni-C וני-L ריכוז מוצגים עבור בהירות, עבור טיטור spectroelectrochemical מלאה של Hyd1 ראו הידאלגו. ואח 36 (ג) pH התלות של הריכוז היחסי של ני-C וני-L, כפי שנקבע מתוך סדרה של ניסויים כמו אלה המוצגים ב (b). ספקטרה הוקלטו ב 20 º C. הותאם באישור מרפי. et al. 42 אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

PFIRE היא טכניקה בהרחבה הישים של ספקטרוסקופיות IR למיעון חלבונים אלקטרודה. מרותק למיטה חמצון-חיזור. בפרט, electrocatalytic תגובות חמצון-חיזור אנזימים פתור בתנאים תחלופת מהירה. שיטת PFIRE מתבססת על הפקד אלקטרוכימי ישירה המסופקים על ידי הטכניקה של PFE, אשר מספק מידע מבניים ישירה, זוגות זה ספקטרוסקופיית אינפרא-אדום-פחמן האלקטרודה. הגישה PFIRE ובכך מוסיף תובנה כימי המידע הזמין של אלקטרוכימיה לבד, מתאימה מאוד ללמוד של חמצון-חיזור חלבונים ואנזימים מעורב מולקולה קטנה קשירה והפעלה. בנוסף, PFIRE יכול לספק מידע אודות שינויים מבניים תלויי-פוטנציאל בחלבונים בהיעדר תחלופת קטליטי. אירועים כאלה של העברת אלקטרונים בלתי-מחזור לעיתים קשה לזהות באמצעות יישומים 'תקן' של PFE, למרות ההרחבה של PFE AC טרנספורמציה-פורייה voltammetry שימש בהצלחה רבה. 45 , 46

השיטה PFIRE הוא, כעיקרון, מתאים המחקר של כל חלבון חמצון-חיזור שניתן ללמוד באמצעות PFE. לכן, בדומה PFE, ספיחה חלבון הוא שלב קריטי עבור ניסוי יירוט מוצלח PFIRE. ב פרוטוקול זה אנו מתארים יישום של הטכניקה PFIRE באמצעות Hyd1 e. coli כמקרה. 36 , 43 . אולם, לנו יש גם מוחלת הטכניקה PFIRE את hydrogenase תקינה cytoplasmic מ ר eutropha,44 ועל פלווין mononucleotide הספוחה על פחמן שחור. 40 בכל המקרים האלה, ספיחה פיסיקלית פשוט כדי שלא שונתה שטח גבוה פחמן שחור (כפי שמתואר פרוטוקול זה) מספק כיסוי השטח של חלבון זה מספיק גבוה כדי להקליט באיכות טובה ספקטרום אינפרא-אדום עם יחס אות לרעש גבוה. במקרים שבהם לא ניתן להשיג ברמה כה גבוהה של ספיחה זה ייתכן שיהיה צורך לשנות את פני השטח של חלקיקי פחמן, לדוגמה לאפשר מצורף קוולנטיות החלבון על פני השטח אלקטרודה. 60 , 61 , 62 השימוש הכפפות למדידות PFIRE נחוץ רק אך ורק כאשר לומד כי חייבים להיות מטופלים anaerobically. עם זאת ב אימון מאוד קבוע ונמוך (נקודת הטל < 80 מעלות) רמות של אדי מים המסופקים על ידי האווירה הכפפות לתת רמות גבוהות של אות לרעש המאפשרים הפקת absorbances קטן מאוד. 44 במקרים רבים סביבה אנאירובית, כגון זו הניתנת בתא הכפפות, רצוי גם עבור המידה אלקטרוכימי (חלק בלתי נפרד הטכניקה PFIRE) על מנת למנוע הנוכחי עקב ירידה של2 O על האלקטרודה עבודה.

IR absorbances עקב מים בכמות גדולה, מאגרי ניסיוני, חלקיקי פחמן שעליו המדגם הוא הספוחה כל לתרום באופן משמעותי ספקטרום ניסיוני, יכול לחפוף להקות של עניין, במיוחד אמיד, II ו- III מחוזות ספקטרום. 63 אזור אמיד מכיל גם מידע ממינים אורגניים כגון flavins או nicotinamide cofactors, כמו גם מצעים ומוצרי של תגובות חמצון וצמצום רבים. במקרה של hydrogenases ניפה, νCO וνCN להקות של האתר הפעיל ליפול באזור צלולים יחסית של הספקטרום, אז השיטה PFIRE הוא מאוד מתאים גם במחקר של אנזימים אלה. במקרים אחרים, עם זאת, ההבדל ספקטרה בשילוב עם גישות labelling איזוטרופי עשוי להיות נחוץ כדי לבודד את השינויים, כתוצאה הפרוטאין קיבוע. גישות דומות שימשו כדי לזהות, לדוגמה, פרוטונציה שינויים מבניים rearrangements וכדי ללמוד מתחמי קינטיקת מיכאליס-מנטן באמצעות ספקטרוסקופית אינפרא-אדום. 64 , 65 , 66 PFIRE ולא מוגבל, לכן, המחקר של hydrogenases, אבל ניתן להחיל על כל חלבון חמצון-חיזור המכיל (או של מי סובסטרטים, מוצרים או מעכבי מכילים) קבוצות עם תנודות IR-פעיל אבחון; פחמן חד-חמצני dehydrogeanses,67 nitrogenases,68,flavoproteins14 , dehydrogenases40 ו formate, למשל...

הטכניקה קשורים, SEIRA, מתאים מאוד במחקר של חלבוני ממברנה-הקשורים בסביבה ביונים. 32 SEIRA הוא עיבוד של ספקטרוסקופיית אינפרא-אדום גם משתמש בתצורת ATR-IR ולאחר עושה שימוש אפקט שיפור פני השטח זה מגביר את ספיגת IR של מולקולות ממוקם קרוב (במרחק כמה ננומטר) פני המנסרה ATR (חמתו). SEIRA ולכן הוא רגיש ביותר לשינויים ספקטרלי להטבה הארכיטקטורה חלבון וממברנה הספוחה והיא יחסית בחינם מהמודיעין מתחרות של הממס ולהציג מצעים/מעכבי בפתרון. . זה מעט לעומת הטכניקה PFIRE המתוארים כאן הנשענת על עומק החדירה גדול יותר באופן משמעותי מעל פני השטח של חמתו (~ 1 מיקרומטר), כלומר PFIRE הוא יותר רגישים סובסטרטים, מוצרים או מעכבי להציג פתרון. זו רגישות מוגברת ממס 'בצובר' יכול להיות יתרון; אם המצע או מוצר יכול להיות שנצפו ישירות על-ידי אינפרא-אדום, PFIRE ספקטרה דווח על שני קינטיקה מצב יציב של חיים ארוכים מינים הפעילים ויצירת מוצרים משויכות במהלך electrocatalysis. 69 היכולת להתבונן מצב יציב ריכוזי המצע והמוצר יהיה יקר במיוחד עבור אנזימים כגון פחמן חד-חמצני דהידרוגנאז (אשר מזרז חמצון הפיך של CO ל CO2, בולם חזק IR) או formate דהידרוגנאז (אשר מזרז חמצון הפיך של formate CO2).

בזמן הנוכחי, PFIRE מוגבל מחקרים קינטי מצב יציב של אנזים electrocatalysis עקב האלקטרודות פחמן מאקרוסקופית נהגה "להתרכז" האנזים על פני חמתו של איסוף נתונים, גיאומטריה ATR-IR. במובן זה PFIRE מחקרים של hydrogenases ניפה הם משלימים לעבודה של דייר ועמיתים,49,50 משתמשים מבוססות אור חולף IR בליעה ללמוד קינטיקה תת מחזור. העבודה מתבצע על ממוזער התא spectroelectrochemical,40 , עם השימוש microelectrodes הזמן רזולוציה גודל מיקרו השגה. זה יאפשר לימוד של משנה מחזור קינטיקה של אנזימים בתדירויות מחזור עד ca 100-500 s-1, ויאפשר המחקר של תצלום התקריב ותהליכי חמצון.

בסך הכל, PFIRE היא טכניקה ספקטרוסקופיות המאפשר אפיון כימי של electrocatalytic תגובות של חמצון-חיזור אנזימים בתנאים מצב יציב. הגישה PFIRE מאפשר titrations כימית, אלקטרוכימי מרובות להתבצע על הדגימה אנזים אותו, כמו אלקטרודות שטח גבוהה בשימוש לספק של ספיחה חזקים של חלבון, הגיאומטריה ATR-IR מאפשרת פתרון נתיישב חילופי. היכולת לאסוף כזה מידע מבני בחיי עיר במהלך הפונקציה אנזימים הוא כלי רב ערך עבור הקהל הרחב bioelectrochemistry.

Disclosures

המחברים מצהירים שום עניין פיננסי מתחרות.

Acknowledgments

העבודה של K.A.V. ו P.A.A. נתמכה על ידי המועצה האירופית למחקר (EnergyBioCatalysis-ERC-2010-StG-258600), פרס הנדסה, מדעים פיסיקליים מחקר המועצה ליברות זרז EP/N013514/1, וביוטכנולוגיה ו ביולוגי מחקר מדעי המועצה (BB/L009722/1 ו- BB/N006321/1). ר. ה נתמכה על ידי Ministerio דה Ciencia y Tecnologìa, למד דה קוסטה ריקה, לינקולן קולג, אוקספורד. המחברים להכיר מר צ'ארלי ג'ונס, מר צ'ארלי אוונס והצוות של הסדנה מכני (המחלקה לכימיה) לקבלת סיוע בעיצוב וייצור של תאים spectroelectrochemical נעשה שימוש בעבודה זו.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectrometer Agilent 680-IR with an external MCT detector
ATR accessory Pike Technologies GladiATR Customised for use with a 5-reflection Si IRE
Glovebox Glove Box Technology Ltd. N/A Custom designed 'wet' and 'dry' box for anaerobic sample handling and measurement
KBr window Crystran Custom To allow coupling of the glovebox with the external beam of the FTIR spectrometer
Additional optics Agilent N/A Components from a PM-IRRAS accessory
Silicon IRE Crystal GmbH Custom Trapezoidal: 8.4 mm x 5 mm (large face), 1 mm thickness, ca 39 degree face angle
Potentiostat Metrohm Autolab PGSTAT 128N
Nova 10.1 Metrohm Software for controlling the potentiostat
Peristaltic pump Williamson Manufacturing Company Ltd QL-1000-024-300
Pt wire Surepure Chemetals 3272 99.95% Pure Platinum Wire, 0.014 inch Diameter
Carbon rod WH Smith 30729209 0.7 mm HB pencil lead
Carbon black Cabot Corporation Black Pearls 2000
Ultrasonic bath Ultrawave U100 35 W
Centrifugal filter Merck Millipore UFC5050BK Amicon Ultra, 50 KDa MW cutoff
Microcentrifuge Eppendorf 5452000018 MiniSpin
NaCl Sigma 71376
H2SO4 Fisher S/9240/PB17
HNO3 Fisher N/2300/PB17
silicone sealant Cow Corning Toray Co., Ltd. SE 4486
Carbon paper Toray TGP-H-030
H2 gas BOC
N2 gas BOC
OriginPro 2015 OriginLab Data analysis/graphing software
Resolutions Pro 4.0 Varian Software for controlling FTIR spectrometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ash, P. A., Vincent, K. A. Spectroscopic analysis of immobilised redox enzymes under direct electrochemical control. Chem. Commun. 48, (10), 1400-1409 (2012).
  2. Sezer, M., Millo, D., Weidinger, I. M., Zebger, I., Hildebrandt, P. Analyzing the catalytic processes of immobilized redox enzymes by vibrational spectroscopies. IUBMB Life. 64, (6), 455-464 (2012).
  3. Melin, F., Hellwig, P. Recent advances in the electrochemistry and spectroelectrochemistry of membrane proteins. Biol. Chem. 394, (5), 593-609 (2013).
  4. Dong, S., Niu, J., Cotton, T. M. Ultraviolet/visible spectroelectrochemistry of redox proteins. Methods Enzymol. 246, 701-732 (1995).
  5. Hellwig, P., et al. Electrochemical and Ultraviolet/Visible/Infrared Spectroscopic Analysis of Heme a and a3 Redox Reactions in the Cytochrome c Oxidase from Paracoccus denitrificans Separation of Heme a and a3 Contributions and Assignment of Vibrational Modes. Biochemistry. 38, (6), 1685-1694 (1999).
  6. Wu, S., et al. Redox chemistry of the Schizosaccharomyces pombe ferredoxin electron-transfer domain and influence of Cys to Ser substitutions. J. Inorg. Biochem. 105, (6), 806-811 (2011).
  7. Whitehouse, C. J. C., et al. A Highly Active Single-Mutation Variant of P450BM3 (CYP102A1). ChemBioChem. 10, (10), 1654-1656 (2009).
  8. Marritt, S. J., van Wonderen, J. H., Cheesman, M. R., Butt, J. N. Magnetic circular dichroism of hemoproteins with in situ control of electrochemical potential: "MOTTLE". Anal. Biochem. 359, (1), 79-83 (2006).
  9. Moss, D., Nabedryk, E., Breton, J., Mäntele, W. Redox-linked conformational changes in proteins detected by a combination of infrared spectroscopy and protein electrochemistry. Eur. J. Biochem. 187, (3), 565-572 (1990).
  10. Iwaki, M., et al. Direct Observation of Redox-Linked Histidine Protonation Changes in the Iron-Sulfur Protein of the Cytochrome bc1 Complex by ATR-FTIR Spectroscopy. Biochemistry. 44, (11), 4230-4237 (2005).
  11. Marshall, D., et al. ATR-FTIR Redox Difference Spectroscopy of Yarrowia lipolytica and Bovine Complex I. Biochemistry. 45, (17), 5458-5467 (2006).
  12. Lacey, A. L. D., Gutiérrez-Sánchez, C., Fernández, V. M., Pacheco, I., Pereira, I. A. C. FTIR spectroelectrochemical characterization of the Ni-Fe-Se hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris Hildenborough. J. Biol. Inorg. Chem. 13, (8), 1315-1320 (2008).
  13. Millo, D., et al. Spectroelectrochemical Study of the [NiFe] Hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F in Solution and Immobilized on Biocompatible Gold Surfaces. J. Phys. Chem. B. 113, (46), 15344-15351 (2009).
  14. Paengnakorn, P., et al. Infrared spectroscopy of the nitrogenase MoFe protein under electrochemical control: potential-triggered CO binding. Chem. Sci. 8, (2), 1500-1505 (2017).
  15. Male, L., et al. Protein voltammetry and spectroscopy: integrating approaches. Theor. Chem. Acc. 119, (1-3), 107-111 (2008).
  16. Healy, A. J., Ash, P. A., Lenz, O., Vincent, K. A. Attenuated total reflectance infrared spectroelectrochemistry at a carbon particle electrode; unmediated redox control of a [NiFe]-hydrogenase solution. Phys. Chem. Chem. Phys. 15, (19), 7055-7059 (2013).
  17. Léger, C., Bertrand, P. Direct Electrochemistry of Redox Enzymes as a Tool for Mechanistic Studies. Chem. Rev. 108, (7), 2379-2438 (2008).
  18. Armstrong, F. A., Hirst, J. Reversibility and efficiency in electrocatalytic energy conversion and lessons from enzymes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, (34), 14049-14054 (2011).
  19. Gates, A. J., et al. The relationship between redox enzyme activity and electrochemical potential-cellular and mechanistic implications from protein film electrochemistry. Phys. Chem. Chem. Phys. 13, (17), 7720-7731 (2011).
  20. Pershad, H. R., et al. Catalytic Electron Transport in Chromatium vinosum [NiFe]-Hydrogenase: Application of Voltammetry in Detecting Redox-Active Centers and Establishing That Hydrogen Oxidation Is Very Fast Even at Potentials Close to the Reversible H+/H2 Value. Biochemistry. 38, (28), 8992-8999 (1999).
  21. Goldet, G., et al. Electrochemical Kinetic Investigations of the Reactions of [FeFe]-Hydrogenases with Carbon Monoxide and Oxygen: Comparing the Importance of Gas Tunnels and Active-Site Electronic/Redox Effects. J. Am. Chem. Soc. 131, (41), 14979-14989 (2009).
  22. Vincent, K. A., Parkin, A., Armstrong, F. A. Investigating and Exploiting the Electrocatalytic Properties of Hydrogenases. Chem. Rev. 107, (10), 4366-4413 (2007).
  23. Parkin, A., Seravalli, J., Vincent, K. A., Ragsdale, S. W., Armstrong, F. A. Rapid and Efficient Electrocatalytic CO2/CO Interconversions by Carboxydothermus hydrogenoformans CO Dehydrogenase I on an Electrode. J. Am. Chem. Soc. 129, (34), 10328-10329 (2007).
  24. van Wonderen, J. H., Burlat, B., Richardson, D. J., Cheesman, M. R., Butt, J. N. The Nitric Oxide Reductase Activity of Cytochrome c Nitrite Reductase from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 283, (15), 9587-9594 (2008).
  25. Schaming, D., et al. Spectroelectrochemical Characterization of Small Hemoproteins Adsorbed within Nanostructured Mesoporous ITO Electrodes. Langmuir. 28, (39), 14065-14072 (2012).
  26. Kemp, G. L., et al. Opportunities for mesoporous nanocrystalline SnO2 electrodes in kinetic and catalytic analyses of redox proteins. Biochem. Soc. Trans. 37, (2), 368-372 (2009).
  27. Renault, C., et al. Unraveling the Mechanism of Catalytic Reduction of O2 by Microperoxidase-11 Adsorbed within a Transparent 3D-Nanoporous ITO Film. J. Am. Chem. Soc. 134, (15), 6834-6845 (2012).
  28. Krzemiński, Ł, et al. Spectroelectrochemical Investigation of Intramolecular and Interfacial Electron-Transfer Rates Reveals Differences Between Nitrite Reductase at Rest and During Turnover. J. Am. Chem. Soc. 133, (38), 15085-15093 (2011).
  29. Akkilic, N., Kamran, M., Stan, R., Sanghamitra, N. J. M. Voltage-controlled fluorescence switching of a single redox protein. Biosens. Bioelectron. 67, 747-751 (2015).
  30. Ataka, K., Heberle, J. Electrochemically Induced Surface-Enhanced Infrared Difference Absorption (SEIDA) Spectroscopy of a Protein Monolayer. J. Am. Chem. Soc. 125, (17), 4986-4987 (2003).
  31. Millo, D., Hildebrandt, P., Pandelia, M. -E., Lubitz, W., Zebger, I. SEIRA Spectroscopy of the Electrochemical Activation of an Immobilized [NiFe] Hydrogenase under Turnover and Non-Turnover Conditions. Angew. Chem. Int. Ed. 50, (11), 2632-2634 (2011).
  32. Ataka, K., Stripp, S. T., Heberle, J. Surface-enhanced infrared absorption spectroscopy (SEIRAS) to probe monolayers of membrane proteins. Biochim. Biophys. Acta, Biomembr. 1828, (10), 2283-2293 (2013).
  33. Kozuch, J., et al. Voltage-dependent structural changes of the membrane-bound anion channel hVDAC1 probed by SEIRA and electrochemical impedance spectroscopy. Phys. Chem. Chem. Phys. 16, (20), 9546-9555 (2014).
  34. Silveira, C. M., et al. SERR Spectroelectrochemical Study of Cytochrome cd1 Nitrite Reductase Co-Immobilized with Physiological Redox Partner Cytochrome c552 on Biocompatible Metal Electrodes. PLoS One. 10, (6), 0129940 (2015).
  35. Todorovic, S., Hildebrandt, P., Martins, L. Surface enhanced resonance Raman detection of a catalytic intermediate of DyP-type peroxidase. Phys. Chem. Chem. Phys. 17, (18), 11954-11957 (2015).
  36. Hidalgo, R., Ash, P. A., Healy, A. J., Vincent, K. A. Infrared Spectroscopy During Electrocatalytic Turnover Reveals the Ni-L Active Site State During H2 Oxidation by a NiFe Hydrogenase. Angew. Chem. Int. Ed. 54, (24), 7110-7113 (2015).
  37. Grabarczyk, D. B., Ash, P. A., Vincent, K. A. Infrared Spectroscopy Provides Insight into the Role of Dioxygen in the Nitrosylation Pathway of a [2Fe2S] Cluster Iron-Sulfur Protein. J. Am. Chem. Soc. 136, (32), 11236-11239 (2014).
  38. Kriegel, S., Uchida, T., Osawa, M., Friedrich, T., Hellwig, P. Biomimetic Environment to Study E. coli Complex I through Surface-Enhanced IR Absorption Spectroscopy. Biochemistry. 53, (40), 6340-6347 (2014).
  39. El Khoury, Y., Van Wilderen, L. J. G. W., Bredenbeck, J. Ultrafast 2D-IR spectroelectrochemistry of flavin mononucleotide. J. Chem. Phys. 142, (21), 212416 (2015).
  40. Ash, P. A., et al. Synchrotron-Based Infrared Microanalysis of Biological Redox Processes under Electrochemical Control. Anal. Chem. 88, (13), 6666-6671 (2016).
  41. Nakamoto, K. Infrared and Raman Spectra of Inorganic and Coordination Compounds. Part B. John Wiley & Sons, inc. (2009).
  42. Bard, A., Faulkner, L. R. Electrochemical Methods: Fundamentals and Applications. John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  43. Murphy, B. J., et al. Discovery of Dark pH-Dependent H+ Migration in a [NiFe]-Hydrogenase and Its Mechanistic Relevance: Mobilizing the Hydrido Ligand of the Ni-C Intermediate. J. Am. Chem. Soc. 137, (26), 8484-8489 (2015).
  44. Ash, P. A., et al. Electrochemical and Infrared Spectroscopic Studies Provide Insight into Reactions of the NiFe Regulatory Hydrogenase from Ralstonia eutropha with O2 and CO. J. Phys. Chem. B. 119, (43), 13807-13815 (2015).
  45. Lee, C. -Y., et al. Theoretical and experimental investigation of surface-confined two-center metalloproteins by large-amplitude Fourier transformed ac voltammetry. J. Electroanal. Chem. 656, (1-2), 293-303 (2011).
  46. Adamson, H., et al. Electrochemical evidence that pyranopterin redox chemistry controls the catalysis of YedY, a mononuclear Mo enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, (47), 14506-14511 (2015).
  47. De Lacey, A. L., Fernández, V. M., Rousset, M., Cammack, R. Activation and Inactivation of Hydrogenase Function and the Catalytic Cycle: Spectroelectrochemical Studies. Chem. Rev. 107, (10), 4304-4330 (2007).
  48. Lubitz, W., Ogata, H., Rüdiger, O., Reijerse, E. Hydrogenases. Chem Rev. 114, (8), 4081-4148 (2014).
  49. Greene, B. L., Wu, C. -H., McTernan, P. M., Adams, M. W. W., Dyer, R. B. Proton-Coupled Electron Transfer Dynamics in the Catalytic Mechanism of a [NiFe]-Hydrogenase. J. Am. Chem. Soc. 137, (13), 4558-4566 (2015).
  50. Greene, B. L., Wu, C. -H., Vansuch, G. E., Adams, M. W. W., Dyer, R. B. Proton Inventory and Dynamics in the Nia-S to Nia-C Transition of a [NiFe] Hydrogenase. Biochemistry. 55, (12), 1813-1825 (2016).
  51. Greene, B. L., Vansuch, G. E., Wu, C. -H., Adams, M. W. W., Dyer, R. B. Glutamate Gated Proton-Coupled Electron Transfer Activity of a [NiFe]-Hydrogenase. J. Am. Chem. Soc. 138, (39), 13013-13021 (2016).
  52. Sezer, M., et al. Role of the HoxZ Subunit in the Electron Transfer Pathway of the Membrane-Bound [NiFe]-Hydrogenase from Ralstonia eutropha Immobilized on Electrodes. J. Phys. Chem. B. 115, (34), 10368-10374 (2011).
  53. Heering, H. A., Wiertz, F. G. M., Dekker, C., de Vries, S. Direct Immobilization of Native Yeast Iso-1 Cytochrome c on Bare Gold: Fast Electron Relay to Redox Enzymes and Zeptomole Protein-Film Voltammetry. J. Am. Chem. Soc. 126, (35), 11103-11112 (2004).
  54. dos Santos, L., Climent, V., Blanford, C. F., Armstrong, F. A. Mechanistic studies of the "blue" Cu enzyme, bilirubin oxidase, as a highly efficient electrocatalyst for the oxygen reduction reaction. Phys. Chem. Chem. Phys. 12, (42), 13962-13974 (2010).
  55. Lukey, M. J., et al. How Escherichia coli Is Equipped to Oxidize Hydrogen under Different Redox Conditions. J. Biol. Chem. 285, (6), 3928-3938 (2010).
  56. Jones, A. K., et al. Enzyme Electrokinetics: Electrochemical Studies of the Anaerobic Interconversions between Active and Inactive States of Allochromatium vinosum [NiFe]-hydrogenase. J. Am. Chem. Soc. 125, (28), 8505-8514 (2003).
  57. Quinson, J., et al. Comparison of carbon materials as electrodes for enzyme electrocatalysis: hydrogenase as a case study. Faraday Trans. 172, (0), 473-496 (2014).
  58. Shafaat, H. S., Rüdiger, O., Ogata, H., Lubitz, W. [NiFe] hydrogenases: A common active site for hydrogen metabolism under diverse conditions. Biochim. Biophys. Acta, Bioenerg. 1827, (8-9), 986-1002 (2013).
  59. Ash, P. A., Hidalgo, R., Vincent, K. A. Proton transfer in the catalytic cycle of NiFe hydrogenases: insight from vibrational spectroscopy. ACS Catalysis. (2017).
  60. Krishnan, S., Armstrong, F. A. Order-of-magnitude enhancement of an enzymatic hydrogen-air fuel cell based on pyrenyl carbon nanostructures. Chem. Sci. 3, (4), 1015-1023 (2012).
  61. Baffert, C., et al. Covalent Attachment of FeFe Hydrogenases to Carbon Electrodes for Direct Electron Transfer. Anal. Chem. 84, (18), 7999-8005 (2012).
  62. Rüdiger, O., et al. Enzymatic Anodes for Hydrogen Fuel Cells based on Covalent Attachment of Ni-Fe Hydrogenases and Direct Electron Transfer to SAM-Modified Gold Electrodes. Electroanal. 22, (7-8), 776-783 (2010).
  63. Barth, A., Zscherp, C. What vibrations tell about proteins. Q. Rev. Biophys. 35, (4), 369-430 (2002).
  64. Jiang, X., et al. Resolving voltage-dependent structural changes of a membrane photoreceptor by surface-enhanced IR difference spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, (34), 12113-12117 (2008).
  65. Kottke, T., Lòrenz-Fonfrìa, V. A., Heberle, J. The Grateful Infrared: Sequential Protein Structural Changes Resolved by Infrared Difference Spectroscopy. J. Phys. Chem. B. 121, (2), 335-350 (2017).
  66. Callender, R., Dyer, R. B. The Dynamical Nature of Enzymatic Catalysis. Acc. Chem. Res. 48, (2), 407-413 (2015).
  67. Ciaccafava, A., et al. When the inhibitor tells more than the substrate: the cyanide-bound state of a carbon monoxide dehydrogenase. Chem. Sci. 7, (5), 3162-3171 (2016).
  68. George, S. J., Ashby, G. A., Wharton, C. W., Thorneley, R. N. F. Time-Resolved Binding of Carbon Monoxide to Nitrogenase Monitored by Stopped-Flow Infrared Spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 119, (27), 6450-6451 (1997).
  69. McPherson, I. J., Ash, P. A., Jacobs, R. M. J., Vincent, K. A. Formate adsorption on Pt nanoparticles during formic acid electro-oxidation: insights from in situ infrared spectroscopy. Chem Commun. 52, (85), 12665-12668 (2016).
חלבון הסרט אינפרא-אדום אלקטרוכימיה שהפגינו למחקר של H<sub>2</sub> חמצון Hydrogenase [ניפה]
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ash, P. A., Hidalgo, R., Vincent, K. A. Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase. J. Vis. Exp. (130), e55858, doi:10.3791/55858 (2017).More

Ash, P. A., Hidalgo, R., Vincent, K. A. Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase. J. Vis. Exp. (130), e55858, doi:10.3791/55858 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter