Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Protein Film infrarød elektrokjemi demonstrert for studier av H2 oksidasjon av en [NiFe] Hydrogenase

doi: 10.3791/55858 Published: December 4, 2017
* These authors contributed equally

Summary

Her beskriver vi en teknikk, protein filmen infrarød elektrokjemi, hvilke innrømmer immobilisert redoks proteiner til studeres tyske under direkte elektrokjemiske føring en karbon elektrode. Infrarød spektra av et enkelt protein utvalg kan registreres på en rekke anvendt potensialer og under en rekke løsning forhold.

Abstract

Forstå kjemi redox proteiner krav metoder som gir presis kontroll over redoks sentre i protein. Teknikken av protein filmen elektrokjemi, der et protein er immobilized på en elektrode underlag slik at elektroden erstatter fysiologiske elektron givere eller acceptors, har gitt funksjonelle innsikt i redoksreaksjoner på en rekke forskjellige proteiner. Kjemikalier forståelse krever elektrokjemiske kontroll kombineres med andre teknikker som kan legge ekstra strukturelle og mekanistisk innsikt. Her viser vi en teknikk, protein filmen infrarød elektrokjemi, som kombinerer protein filmen elektrokjemi med infrarød spektroskopiske utvalg av redoks proteiner. Teknikken bruker en flere-refleksjon dempes totale refleksjon geometri for å undersøke en redoks protein immobilisert på en høy areal sot elektrode. Inkorporering av denne elektroden en flyt celle kan løsningen pH eller stoff konsentrasjoner endres under mål. Dette er spesielt kraftig i adressering redoks enzymer, hvor rask katalytisk omsetning kan vedvarende og kontrollert på elektroden tillater spektroskopiske observasjon av varige mellomliggende arter i katalytisk mekanismen. Vi demonstrere teknikken med eksperimenter på E. coli hydrogenase 1 under omsetning (H2 oksidasjon) og ikke-omsetning forhold.

Introduction

En viktig utfordring i studiet av protein funksjonen innebærer utvikling av i situ metodene som tillater direkte observasjon av proteiner utføre sine fysiologiske roller, enten i vivo eller bruke isolert protein prøver. Dette krever integrering av kontroll eller utløse prosesser i eksperimentell prosedyrer og bruk av kombinerte teknikker som tillater både den reaktivitet skal vurderes, og kjemiske enkelttrinn under protein funksjonen skal måles, samtidig. I tilfelle av redoks proteiner at dette ofte tilsvarer kombinere elektrokjemiske teknikker, som nøyaktig kontroll anvendt potensial, men gir ingen direkte kjemiske informasjon, med spektroskopiske teknikker som kjemisk-spesifikke endre forbundet med protein-funksjonen. 1 , 2 , 3 Spectroelectrochemistry er en generell term for en rekke kombinert elektrokjemiske og spektroskopiske metoder som omfatter en rekke spektroskopiske teknikker og elektrokjemiske kontrollnivåene. Mange proteiner kan utveksle elektroner med kunstige, løselig elektron givere og acceptors og dette har blitt utnyttet i studier som bruker små molekyler for å megle elektron overføring, inkludert kobling med UV-synlig,4,5 , 6 , 7 magnetiske sirkulære dichroism8 og infrarød5,9,10,11,12,13,14 (IR) spectroscopies. I noen tilfeller har det vist mulig å utnytte unmediated, diffusjon-kontrollert elektron utveksling mellom proteiner og elektroder. 15 , 16

For katalytisk reaksjoner utført av redoks enzymer, løsning elektrokjemi tilnærminger finnes en klar ulempe. Diffusjon-kontrollerte elektron overføring via redoks meklarar i løsningen er trolig bli begrense frekvensen. Informasjon om enzymet Kinetic og mekanistisk kan gå tapt, eller minst bli vanskelig å deconvolute fra diffusjon gjenstander fra experimental metoden. Direkte, unmediated elektrokjemiske kontroll er derfor et viktig verktøy for studiet av redoks proteiner og enzymer. Teknikken av protein filmen elektrokjemi (PFE) benytter elektrode-immobilisert redoks proteiner, slik at elektroner overføres direkte til eller fra redoks kofaktorer i protein som elektroden er polarisert på en rekke potensialer. 17 , 18 , 19 PFE er av spesiell verdi for studiet av oksidasjon eller reduksjon reaksjoner katalysert av redoks enzymer, som interfacial elektron overføring kan oppnås med en svært høy hastighet. For eksempel ble electrocatalytic omløpshastighet av nikkel-jern ([NiFe]) hydrogenase fra Allochromatium vinosum målt ved PFE som ca 1000-10.000 s−1 for H2 oksidering. 20 elektroden potensielle fungerer som en utløser for katalyse "på" eller "off" og electrocatalytic gjeldende rapporter om enzym aktivitet. PFE er derfor en nyttig metode for å analysere reaktivitet av komplekse enzymer som nært potensial, som reaksjoner av di-jern aktiv stedet for [FeFe]-hydrogenases med CO og O221 eller potensial-indusert inaktivering reaksjoner på hydrogenases,22 karbonmonoksid dehydrogenase,23 og andre komplekse redoks enzymer. 24

Det viktigste hinderet for kombinere spektroskopiske teknikker med direkte elektrokjemiske kontroll by av PFE oppstår i lav dekning av redoks enzymer, på 1-2 pmol cm-2 for [NiFe] hydrogenase fra A. vinosum, 20 i forhold til i situ overflaten vitenskap studier av små molekyl adsorbates på bulk metall elektroder. Dette utgjør en utfordring for følsomhet for spektroskopiske målingen. Flere spectroelectrochemical metoder er rapportert for å studere immobilisert redoks proteiner på en rekke forskjellige elektroder: UV-synlig spektroskopi på gjennomsiktig metalloksid elektroder; 25 , 26 , 27 fluorescens spektroskopi på gull elektroder; 28 , 29 overflaten forbedret infrarød absorpsjon (SEIRA) spektroskopi på gull elektroder; 30 , 31 , 32 , 33 og overflaten forbedret Raman spektroskopiske teknikker, hovedsakelig på sølv elektroder. 34 , 35

Her beskriver vi en metode for kopling PFE med IR spektroskopi, i en teknikk kjent som protein filmen infrarød elektrokjemi (PFIRE). 36 the PFIRE metoden studier redoks enzymer immobilisert på en høy areal karbon arbeider elektrode sammen med en dempes totale refleksjon IR (ATR-IR) geometri, utnytte enkel opptak av en rekke proteiner til karbon overflater. IR spektroskopi er nyttig i studier av redoks enzymer og proteiner som mange små molekyler, ligander og kofaktorer har diagnostiske absorbances som kan brukes til å vurdere reaktivitet, binding, hemming og redox. Eksempler binding av nei til jern-svovel sentre,37 studiet av flavoproteins,38,39,40 små molekyl binding til måltema sentre etc. 41 the ATR-IR geometri tillater bygging av en optimalisert tre elektrode (spectro) elektrokjemiske cellen42 og derfor gir utmerket elektrokjemiske kontroll. Løsning motstand og potensielle drift minimeres ved å plassere en referanse elektrode nær arbeider elektroden. Høy overflate telleren elektrodene brukes som er kompatible med høy electrocatalytic strøm produsert av rask enzym omsetning på arbeider elektroden. Flyten av løsning gjennom spectroelectrochemical cellen gir lettvinte kontroll over konsentrasjonen av underlag, hemmere og pH. 36 , 43 , 44 the PFIRE metoden kan derfor IR spectra å være registrert i situ under vedvarende enzymet electrocatalysis. 36 , 44 PFIRE er likeledes dugelig av kjemiske informasjon i fravær av katalytisk oppdatert43 i motsetning til PFE hvor det kan være vanskelig å trekke ut informasjon fra ikke-katalytiske prosesser i redoks enzymer. 45 , 46

Vi har vist PFIRE metoden for studiet av electrocatalytic H2 oksidasjon av [NiFe] hydrogenases, som inneholder innebygde CO og CN ligander koordinert til Fe hos en bimetall aktiv. 36 , 43 , 44 [NiFe] hydrogenases er derfor spesielt godt egnet til å studere ved PFIRE. Metoden PFIRE gir informasjon om arter som er under stabil omsetning, og derfor gir avgjørende mekanistisk innsikt i tillegg til mengde litteratur på IR spektroskopi av hydrogenases uten eksperimentelle kontroll over omsetning. 47 , 48 Dyer og medarbeidere har ansatt tid-løst IR metoder å studere av NiFe hydrogenases,49,50,51 bruker en lett utløse enten bruke et lite negative potensielle skritt (via bruk løsning meglere og en "bur" elektron kilde) eller photolyse en bundet hydrid. Selv om metoden PFIRE kan foreløpig gi tid løsning å matche disse målingene,40 det tillate studie av både reductive og oksidativt katalytiske prosesser, på en rekke veldefinerte potensialer og fri fra masse transport begrensninger.

Metoden PFIRE er forskjellig fra SEIRA studier av redoks proteiner, som også bruker en ATR-IR geometri og ansette en nanoskala-sklifri metall elektrode å forbedre IR absorbansen molekyler adsorbert på elektroden overflaten. 30 SEIRA er en svært verdifull teknikk for å studere membran proteiner, særlig adsorbert på eller innenfor mimetic membran arkitekturer,32 men behovet for en metall elektrode kan begrense det underlag og hemmer omfanget på grunn av reaktivitet av elektroden støtte mot små molekyler som CO, CN-, CO2 osv. Proton reduksjon og selv montert monolayer desorpsjon kan være problematisk på metallflater på svært negativt potensialene, er1,52 selv om enzymet electrocatalysis på ubeskyttet metal elektrodene rapportert. 53 , 54 en ulempe av PFIRE i forhold til SEIRA er relativ vanskeligheten med å innlemme membran proteiner i native eller mimetic membran arkitekturer. Men gjør den relative kjemiske inertness av karbon elektrodene til konkurrerende små molekyl aktivisering reaksjoner PFIRE en glimrende teknikk for å studere enzymet electrocatalysis, spesielt i lav potensial domenet relevant for biologiske redoks prosesser som proton reduksjon av hydrogenases. 1 , 43

Målet med denne artikkelen er å innføre metoden PFIRE som en teknikk for å studere elektrode-immobilisert redoks proteiner, bruke NiFe hydrogenase 1 (Hyd1) fra Escherichia coli som et eksempel. Betraktninger av prøven forberedelse, behovet for god substrat flyt og data håndtering drøftes. PFIRE er en bredt aktuelt teknikk, velegnet til studere noen redoks protein (med karakteristiske IR absorbances) som kan være adsorbert på karbon elektroder, enten direkte eller ved hjelp av overflaten endring, slik at det kan utveksle elektroner med den elektroden.

Protocol

1. gjenskape den interne eksempel kupé av en FTIR Spectrometer inne en anaerob, tørr Glovebox og generelle eksperimentelle krav

  1. Bruk en kommersiell FTIR spectrometer utstyrt med eksterne kvikksølv kadmium telluride (MCT) detektor og ATR tilbehør. Tømme kroppen av spectrometer med tørr luft eller dinitrogen, eller alternativt bruke en spectrometer med en evakuert optisk benk.
  2. Plasser spectrometer på en stabil, vibrasjonsfritt tabell på samme høyde som en anaerob (< 1 ppm O2), tørke (duggpunkt <-75 ° C) glovebox. Viderekoble IR stråle av spectrometer i glovebox'en, gjennom en IR-gjennomsiktig vindu som er stor nok til defocused strålen.
    Merk: Det er viktig at avstanden mellom glovebox og spectrometer også renset eller evakuert, spesielt hvis en hygroskopisk vinduet materiale, for eksempel NaCl eller KBr for eksempel brukes.
  3. Replikere interne eksempel kupé av spectrometer inne en glovebox.
    1. Direkte strålen i en glovebox på en off-aksen ellipsoidisk speil, helst med samme brennvidde som intern fokus speilet av spectrometer.
      Merk: Det er nyttig å ha to ekstra flyet speil plassert foran denne fokus speil, slik at både høyden og retningen på IR strålen justeres innenfor en glovebox; Dette vil oppveie noen unøyaktighet i første plassering i spectrometer.
    2. Plasser en ekstern MCT-detektor, komplett med en fokusere optikk (som en kort brennvidde ZnSe linsen, eller off-aksen parabolske speil, samt en kort brennvidde) inne en glovebox, plassert som for å kopiere dimensjonene av interne prøven rommet spectrometer.
    3. Justere "fokus" av IR strålen å være omtrent like langt mellom fokus speilet og MCT detektoren.
  4. Avkjøle dewar av eksterne MCT detektor med flytende nitrogen.
  5. Montere ATR tilbehøret til glovebox eksempel batterirommet. Juster input og produksjon fokusere optikk og ATR tilbehør for å oppnå maksimal gjennomstrømming til MCT detektoren. Om nødvendig, bruk en blender eller andre passende signaltap (for eksempel en wire rutenett) å hindre oversaturation detektor signalet.
    Merk: Hvis dataene presenteres her, en fem-refleksjon ATR tilbehør med alle reflekterende optikk og en flyttbar trapesformet Si interne refleksjon elementet (irsk) brukes (Crystal GmbH, dimensjoner ca 5 × 8 × 1 mm3, ansikt vinkel 39.5 °). GÅ er montert i en flyttbar sokkelen maskinert polyether Eter keton (kikk).
  6. Bruke en glovebox å huse gjenskapt eksempel rommet med egnet feedthroughs til at et eksternt plassert potentiostat (gass stramt BNC-kontakter er nyttig for dette formålet), gass tilgang og kabelen til å overføre signalet fra MCT detektoren. Det er viktig å beholde noen skjerming på detektoren kabelen for å unngå å introdusere støy eller forstyrrelser med målene.
  7. Plass en peristaltiske pumpe, i stand til strømningsrater større enn 60 mL/min i en glovebox. Skjematisk vise spektrometer, ATR tilbehør, peristaltiske pumpe og potentiostat oppsett er vist i figur 1.
  8. Konstruere en spectroelectrochemical celle, som vist skjematisk i figur 2, som sel på ATR tilbehør. Cellen må inneholde en høy overflate telleren elektrode (Pt wire eller gasbind), en tilkobling for arbeider elektroden (karbon stav) og en miniatyr referanse elektrode. Cellen må inneholde minst to ytterligere porter som innløp og utløp for rask flyt av løsninger gjennom cellen.
    Merk: En miniatyr mettet calomel referanse elektrode er ideelt for dette formålet. 36

2. forberedelse av sot partikler endret med E. coli Hydrogenase 1

  1. I et 'våte' anaerob hanskerom, bland 20 mg av høy areal sot partikler (> 1000 m3/g) med 1 mL av beryllium renhet vann (resistivitet > 18 MΩ cm) i et microcentrifuge rør. Spre partikler av lav-effekt sonication (< 100 W) i minst 15 minutter, eller til spredning uniform og ikke ikke sediment innen 1 h, for å gi en sot spredning med en lasting av ca 20 mg/mL.
  2. Ta en aliquot av E. coli hydrogenase 1 (Hyd1, ca 50 µL, utarbeidet etter en publisert prosedyren55) i en konsentrasjon av ~ 7 mg protein/mL og bytte den inn i en lav ioniske styrke buffer ved pH nær isoelectric punktet (for eksempel kalium fosfat, 15 mM, pH 5.8, ingen ekstra salt). For å oppnå best resultat, bruk et enzym forberedelse som er så aktiv som mulig. Utføre buffer utveksling av konsentrasjon og fortynning, i en sentrifugal filter enhet med en passende molekylvekt cutoff (50 kDa fungerer godt for for Hyd1).
    1. Legg til Hyd1 til filter enheten.
    2. Fortynn med ca 450 µL exchange bufferen.
    3. Reconcentrate til et volum på 50 µL med mild sentrifugering (< ~ 2700 × g) å hindre irreversibel nedbør.
    4. Gjenta trinn 2.2.2 og 2.2.3 til buffer exchange er fullført (vanligvis innen ~ 5 sykluser).
  3. Bland et 5 µL volum på 20 mg/mL sot spredning (forberedt i 2.1) med 50 µL aliquot av buffer-byttet Hyd1. Lagre enzym-partikkel blandingen i kjøleskap (ved 0 ° C) over natten slik at enzymet til adsorberes. Det kan være nødvendig å riste blanding innimellom for å sikre partiklene er spredt.
  4. Vask Hyd1-modifisert partikler med lav ioniske styrke buffer (kalium fosfat, 15 mM, pH 5.8, ingen ekstra salt) av påfølgende sedimentering og re spredning sykluser i en microcentrifuge (~ 2700 × g). Gjenta denne prosessen 3 - 5 ganger å fjerne ikke-adsorbert enzym.
    Merk: Før første vask nedbryting skal nesten fargeløs, indikerer god adsorpsjon av enzym.
  5. Konsentrere seg partikler til et endelig antall ~ 5 µL, for å gi en endelig lasting av ~ 20 mg/mL av enzymet endret partikler.
    Merk: Hyd1-modifisert partikler kan lagres på 4 ° C i opptil to uker hvis hydrated; Dette er best oppnås ved å lagre partikler fortynnet med ~ 50 µL av beryllium renhet vann.

3. forberedelse til PFIRE målene på E. coli Hydrogenase 1

  1. Rengjør Si IRE ved lav-drevne sonication (< 100 W), først i H24 (< 90% w/w) for ~ 15 minutter, og deretter i HNO3 (70% w/w) for opptil 1 time. Denne klargjøringsprosedyren bør føre til en hydrofile IRE overflate. Hvis ytterligere rengjøring er nødvendig IRE kan plasseres i piranha løsning (1:3 forholdet H2O2: H2SO4) å oksidere gjenværende organisk materiale.
    Merk: Harde surt rensemetoder kan ikke være egnet for bruk med alle IRE materialer. Piranha løsningen er svært etsende og en sterk oksiderende, overflater bør være rimelig rent før bruk av piranha løsning og omsorg bør tas under forberedelse og bruk av piranha løsningen grunn eksoterm prosessen - alltid legge til H2O 2 sakte til H2SO4 og henviser til de aktuelle sikkerhetsrutiner for forberedelse, bruk og disponering.
  2. Skyll ren IRE i av beryllium renhet vann, og tørk under en strøm av tørr nitrogen gass. Utføre alle prisme håndtering ved hjelp av ren pinsett for å unngå forurensning.
  3. Forsegle IRE i ATR tilbehør platen med en tynn stripe av elektrisk-silikon fugemasse. Pass på å begrense tetningsmasse til kantene av IRE. Tillate tetningsmasse tørke helt.
  4. Overføre ATR tilbehør sokkelen til spectrometer glovebox'en og montere den på ATR tilbehøret. Måle en referanse (bakgrunn) spektrum mellom 4000-1000 cm-1 med 4 cm-1 oppløsning, bruker den standard raske scan modus for spectrometer og 1024 gjennomsnitt interferograms (måling tid ~ 3-5 minutter). Bruk dette spekteret som inndata for å tillate beregning av absorbansen spectra senere i eksperimentet.
    Merk: På grunn av liten absorbansen forventet for det Hyd1 aktive området er det nødvendig å samle spectra med høy signal til støy forhold.
  5. Overføre ATR tilbehør sokkelen til 'våte' glovebox'en som inneholder ferdig Hyd1 endret partikkel spredning (inndeling 2). Slipp-cast en 1 µL aliquot av partikkel spredningen på store ansiktet av IRE, og spre dem jevnt over overflaten. Merk: Ikke la partikler å bli helt tørt på gå.
  6. Cut et stykke karbonpapir, som brukes som gass diffusjon lag materiale i brenselceller, til en størrelse ~0.1 mm mindre enn overflaten IRE (dvs. ca. 8.2 × 4,9 mm2). Arealet av karbon papiret bør være store nok til å dekke slipp-cast Hyd1 endret partikler, men ikke så stor som overlapper silikon tetningsmasse brukes til å sikre IRE. Nyt karbonpapir i vannet og forsiktig plassere den over toppen av partikkel filmen. Carbon papiret vil gi god elektrisk tilkobling over hele partikkel filmen.
    Merk: Det er fordelaktig å forberede flere biter av karbonpapir på forhånd, og lagre dem pre dynket i av beryllium renhet vann inne 'våte' anaerob glovebox'en.
  7. Montere spectroelectrochemical cellen (beskrevet i 1,7 og vist skjematisk i figur 2) over IRE, sikre det til sokkelen med skruer. Legg ~ 200 µL av eksperimentelle bufferen å holde enzymet hydrert. En blandet buffer system, i stand til bufring over et bredt pH-område, er nyttig for studier av NiFe hydrogenases:56 natrium acetat, 2-[N'-morpholino] etan-sulfonic syre (MES), N'-[2-hydroxyethyl] piperazin -N' -[2-etan-sulfonic syre] (HEPES), N'-tris [hydroxymethyl] metyl-3-amino-propan-sulfonic syre (KRANER), og 2-[N'-cyclohexylamino] etan-sulfonic syre (oppgaver), med hver komponent i en siste konsentrasjon av 15 mM og inneholder 0.1 M konsentrert NaCl som støtter elektrolytt, med pH justert til pH 6 bruke NaOH og HCl.
    Merk: Arbeider elektrode tilkoblingen skal stikker litt under flyet spectroelectrochemical cellen øverst (~0.1 mm) å sikre god elektronisk tilkobling til karbon papiret (figur 2).
  8. Koble løsning innløp og utløp i spectroelectrochemical cellen til flyt inneholder peristaltiske pumpe rør og ampuller med eksperimentelle bufferen. Overføre montert cellen til "tørre" glovebox'en som inneholder spectrometer.
  9. Montere samlingen spectroelectrochemical celle på ATR tilbehøret. Koble arbeider, teller og referanse elektroder til potentiostat. Koble peristaltiske pumpe slangen på pumpen.
  10. Registrere en absorbansen spektrum med 1024 gjennomsnitt interferograms 4 cm-1 oppløsning over en spektral rekke 4000-1000 cm-1, bruker spekteret samlet i 3.4 som referanse/bakgrunn. På dette punktet spekteret skal inneholde betydelig (> 100 mO.D.) amid II band på ~ 1,540 cm-1 og aktive området band av Hyd1 bør være tydelig i de spektrale regionen 1,850-2150 cm-1, hovedsakelig i oksidert, inaktiv statene (Figur 3 ).

4. aktivering av E. coli Hydrogenase 1 og Testing Spectroelectrochemical cellen

  1. Bruke et redusert potensial (−0.8 V vs SCE) Hyd1 endret partikkel filmen. Mette eksperimentelle bufferen med H2 og flyt buffer sakte gjennom spectroelectrochemical cellen. La prøven overnatting fullt aktivere Hyd1.
    Merk: Det er viktig å bruke anaerob H2N2 etc.og så alle anaerob gasser bør sendes gjennom en O2 .
  2. Registrere en absorbansen spekteret av prøven etter aktivering. ΝCO og vCN band av det aktive området viser nå en fordeling av redusert, "aktiv" stater. Dette er mest lett observert ved hjelp av en forskjell spektrum, i forhold til spekteret i 3.10 (Figur 4).
  3. Teste tilkoblingen til spectroelectrochemical-cellen. Dette gjør mette eksperimentelle bufferen med N2 gass. Bruk en sekvens av oksiderende (0 V vs SCE) og redusere (−0.8 V vs SCE) potensialer (av ca 30 min varighet) til Hyd1-modifisert partikkel filmen og registrere en absorbansen spektrum på hver. Hyd1 bør bli raskt oksideres og redusert, og hvis partikkel filmen er godt forbundet 100% av utvalget skal svare anvendt potensial.
  4. Angi en passende strømningshastighet på eksperimentell bufferen. Dette gjelder et redusert potensial (−0.8 V vs SCE) for prøven, og Mette eksperimentelle bufferen med H2. Ta opp en serie av syklisk voltammograms mellom-0.707 - 0.039 V vs SCE frekvensen skanning av 10 mV/s. gradvis øke inntakets H2-mettet buffer mellom voltammograms til den katalytiske waveshape ligner det på en plan roterende plate elektrode55 og den maksimale strømmen er uavhengig av flow rate (figur 5).
    Merk: Løselighet grensen på H2 i vann er ~0.8 mM på 293 K og 1 bar.
  5. Prøven er nå klar for PFIRE mål, samle spectra på en rekke potensialene, under en rekke løsning forhold (pH, temperatur, H2 konsentrasjon etc.). Registrere alle elektrokjemiske data ved hjelp av potentiostat programvare som det er viktig å kunne koordinere spektroskopiske og elektrokjemiske data, spesielt når studere electrocatalytic prosesser som H2 oksidasjon av Hyd1.

5. spektroskopiske håndtering

  1. Bekreft at det aktive området ikke er permanent endret i løpet av målinger ved spectra på 0 V og −0.8 V vs SCE på slutten av eksperimentet. Disse skal være identisk til spectra registrert 4,3, og uten tap av aktive området bør være observert under målingen (figur 6).
  2. Eksportere absolutt absorbansen spectra fra spectrometer programvaren i et egnet format (CSV, ASCII 'matlab', Jcamp etc.) for behandling benytter programvare som opprinnelse eller Matlab.
  3. Planlagte retter dataene, bruke illustrert i figur 7.
    1. Ta den andre deriverte av hver absorbansen spekteret i området 1800-2150 cm-1, for å identifisere liten (< 1 mO.D.) aktive området band på svært buede vann bakgrunn.
    2. Plasser planlagte markør poeng på opprinnelige absorbansen spekteret, og angi poengene festes til eksperimentelle spekteret.
    3. Passe opprinnelig plan gjennom de bruker en interpolert kubikk spline-funksjonen eller en polynom. Trekk fra denne opprinnelige funksjonen fra eksperimentelle data.

Representative Results

Figur 1 viser en skjematisk fremstilling av eksperimentelle ordningen av spektrometer, glovebox, ATR tilbehør, potentiostat og gass flyt systemet brukes for PFIRE-målinger. Figur 2 viser en representant tegning av spectroelectrochemical cellen.

Figur 3 viser absorbansen spektra av drop-cast Hyd1 endret partikler, med den eksperimentelle bufferen (et blandet buffer system, beskrevet i 3.7, pH 6.0) gjennom spectroelectrochemical cellen. Dekningen av Hyd1 er spesielt høy i eksemplet i Figur 3, med en amid II bandet intensitet av ~ 235 mO.D. og minimal "bulk" som dokumentert av omfanget av O-H strekker regionen (~ 3000-3600 cm-1) i forhold til bandet på ~ 1,640 cm-1, som er en convolution av amid jeg band av Hyd1 og vann H-O-H svingen. Flere band på grunn av protein kan sees i C-H strekker regionen (ca 2900 cm-1). Bred bandet sentrert rundt 2100 cm-1 er en kombinasjon gjeng H-O-H bøying vibrasjoner med en lavere energi libration band, som er begrenset rotasjoner H2O molekyler på grunn av hydrogen bonding nettverket i flytende vann. ΝCO bandet delstaten oksidert, inaktiv, Ni-B det aktive området er tydelig på 1,943 cm-1, selv uten baseline korreksjon, og νCN funksjoner er tydelig mellom 2,050-2.100 cm-1 . Mye av mikroporøs karbon svart film57 blir blokkert av enzymet høy Hyd1 dekning, og derfor "bulk" vann konsentrasjonen senkes under PFIRE målinger.

Spectra i Figur 3 viser at tidligere aktivisering, Hyd1 filmer inneholder Hyd1 i oksidert, inaktiv statene. Aktivisering overnatting på −0.8 V vs SCE under en H2 atmosfære fører til dannelsen av redusert, katalytisk aktive stater som vist i Figur 4 som viser en aktivert (redusert) minus som forberedt (oksidert) forskjellen av Hyd1. Forskjellen spektra av Hyd1 kan tolkes klarest bruker νCO regionen. Hver unike stat av det aktive området har bare ett CO band sammenlignet med to CN band og derfor νCN regionen er egentlig mer kompliserte, med mange overlappende band. Forskjellen spekteret i Figur 4 viser at aktivering fører til tap (negativ absorpsjon band) av oksidert, inaktiv Ni-B og en liten mengde Ni-SI (den mest oksidert "aktiv" tilstanden) som var tilstede i som forberedt Hyd1 filmen. Disse er erstattet av 'aktiv' landene i Hyd1; Ni-C, Ni-R og Ni-L. oppmerksom på at det er to former for både Ni-R og Ni-L stater, som dokumentert av to νCO bandene observert etter disse artene i Figur 4. Observasjon av flere Ni-R og Ni-L stater er overensstemmelse med andre NiFe hydrogenases. 48 , 58 , 59

En kontroll av metoden PFIRE er at den sykliske voltammograms registrert av Hyd1 inne spectroelectrochemical flyt celle showet lignende katalytiske waveshapes de spilt inn på en plan roterende plate elektrode. 55 i praksis betyr dette at massen transport av substrat (H2) og produkt (H+) til/fra immobilisert Hyd1 i spectroelectrochemical cellen er effektiv til flyt priser under PFIRE målinger. Effekten av flow rate på den katalytiske waveshape er vist i figur 5, som viser påfølgende voltammograms registrert under en H2 atmosfære (1 bar) som løsning infusjonshastigheten gjennom spectroelectrochemical cellen er økt. I alle tilfeller av overpotential for H2 oksidasjon av Hyd1 er identisk (rød farget rektangel), men omfanget av oksidativt inaktivering (hysteresis mellom gjeldende under oksidativt og reductive feier på potensialer over ca 0 V vs SCE) og maksimal H2 oksidasjon gjeldende er avhengig av løsning flow rate. På strømningsrater over 52 mL/min (lys grå voltammogram) den katalytiske waveshape er ufølsom for ytterligere øker flyt.

Figur 6 sammenligner relative intensiteten av νCO bandet av Ni-B etter første aktivering og anaerob re-oksidasjon på 0 V vs SCE (under en Ar atmosfære, som beskrevet i 4.3) og etter anaerob oksidativt inaktivering under en Ar atmosfære på 0 V vs SCE etter 48 hr kontinuerlig eksperimenter (som beskrevet i 5.1). Ingen tap av aktive området bandet er observert under målingen, og alle Hyd1 prøven reagerer på anvendt potensial.

Figur 7 viser planlagte korreksjon prosedyren brukes i dette arbeidet. Absolutt spekteret av Hyd1 prøven i aktive området regionen (figur 7en) inneholder betydelige kurven på grunn av vann. Kravet om å bruke vann som et løsemiddel er faktisk et problem for de fleste anvendelser av IR spektroskopi i biovitenskap. Den andre deriverte av absolutt spekteret (figur 7b), beregnet med opprinnelse programvare med Savitsky-Golay glatting over et 9-punkts vindu, kan brukes til å identifisere skarpe band av Hyd1 aktive området på buede bakgrunn. Identifikasjon av omtrentlig peak posisjoner med en andre avledede spekteret tillater planlagte ankerpunkt plasseres i områder av absolutt spekteret som er aktive området band (sirkler i figur 7en). En kubikk spline funksjon er da utstyrt gjennom disse forankringspunkt opprette en planlagt funksjon som kan deretter trekkes fra absolutt spekteret å gi et planlagt-korrigert spekter som inneholder bare topper som følge av det Hyd1 aktive området (figur 7 c).

Figur 8 viser resultatene av en PFIRE måling på Hyd1, under både ikke-omsetning (Ar atmosfære) og omsetning (H2 atmosfære) forholdene på et utvalg av potensialer. 36 gjeldende tidspunkt spor (Figur 8en) rapporten på katalytisk gjeldende på hver brukt potensial og null gjeldende vilkår ikke-omsetning (Ar atmosfære) er fremdeles på. Delvis spectroelectrochemical redoks titrering i Figur 8b derfor rapporter om likevekt redoks virkemåten for det aktive området, viser fordelingen av stater forventes på hver potensial i fravær av katalytisk omsetning. Spectra i Figur 8c ble registrert under omsetning forhold (under en H2 atmosfære) og representerer derfor stabil fordelingen av aktive området stater under katalytisk H2 oksidasjon av Hyd1. At stabil betingelsene er oppnådd er bekreftet av det faktum at katalytisk H2 oksidasjon gjeldende (Figur 8en, H2) forblir konstant som en funksjon av tid på −0.199 V og −0.074 V vs hun; monotoniske forfallet i gjeldende på +0.356 V vs hun er den velkjente anaerob oksidativt inaktivering av Hyd1. 55 fordelingen av aktive området stater er helt klart annerledes under Ar og H2 på alle potensialene der Hyd1 utfører katalyse (Figur 8b, spectra på −0.199, −0.074 og +0.356 V vs hun). Til spectra registrert under Ar og H2 er tilnærmet identiske på −0.594 V vs hun, men, og dette representerer en viktig test av eksperimentelle konsistens, Hyd1 reduserer ikke H+ i en betydelig hastighet ved pH 6.0 (strømmen i Figur 8en under både Ar og H2 er nær null), og til spectra på −0.594 V forventes derfor å være den samme.

Figur 9 demonstrerer det anaerob oksidativt inaktivering av Hyd1 via dannelsen av Ni-B fra Ni-SI under H2 oksidasjon på +0.356 V.36 Spectra ble innspilt under grå tidsintervallene som er angitt på gjeldende tidspunkt spor i figur 9en. −0.074 V Hyd1 gjennomgår oksidativt inaktivering og distribusjon av aktive området forblir konstant gjennom hele potensielle trinnet. Dette er demonstrert av spectra i figur 9bjeg, som rapporterer absolutte baseline-korrigert spekteret fra begynnelsen av −0.074 potensielle trinn og figur 9bii som ble registrert senere tid under det potensielle steget og rapporteres som et forskjellen spekter i forhold til figur 9bjeg. Spectra i figur 9biii og biv rapporteres også som forskjellen spectra i forhold til figur 9bjegog viser gradvis konvertering av Ni-SI til Ni-B under høyt potensial inaktivering, konsekvent med monotoniske nedgang i aktuell vist på +0.356 V i figur 9en.

Spectra spilt inn på en rekke løsningen pH gi innsikt i proton overføring trinnene under Hyd1 katalytisk syklus. 43 Figur 10 en viser PFIRE spectra registrert på samme Hyd1 filmen på pH 3.0 og pH 9.0, bruker løsning flyt i spectroelectrochemical cellen til å utveksle eksperimentelle bufferen. Relativ konsentrasjonen av landene i Ni-C og Ni-L er klart forskjellig i disse to spectra. Ved å variere anvendt potensial under ikke-omsetning forhold angir den potensielle avhengigheten av NiC og Ni-L bestemmes raskt ved en rekke pH-verdier (Figur 10b), og både stater er funnet for å være isopotential over et bredt pH-område. (Merk at de høyeste absorbances i Figur 10b viser bare Ni-C og Ni-L stater for klarhet, full redoks titrations av Hyd1 har rapportert Hidalgo et al.) 36 en pH titrering av konsentrasjonen av Ni-C og Ni-L kan deretter hentes, tar toppen absorbansen ved potensialer hvor totalt Ni-C og Ni-L konsentrasjonen er på sitt maksimum ved hver pH (Figur 10c). På denne måten, og sammen med EPR data, ble det identifisert en pH likevekt mellom Ni-C og Ni-L stater. 43

Figure 1
Figur 1: Skjematisk av ordningen med IR spektrometer, anaerob glovebox, ATR tilbehør, MCT-detektor, gass med system og potentiostat brukes for PFIRE målinger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Skjematisk diagram til spectroelectrochemical-cellen brukes for PFIRE mål, viser ordningen med elektroder og løsning inn-/ utløp tilkoblinger. Celle- og sokkelen er maskinert fra polyether Eter keton (kikk) med skruehullene for karbon stang elektrode tilkobling, Pt wire counter elektrode, mettet calomel referanse elektrode, og løsningen innløp og utløp. Mettet calomel referanse elektrode konstruksjonen er som tidligere rapportert. 36 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Absorbance spekteret av Hyd1 endret karbon svart partikler, avsatt på IRE og utvannet med buffer. Stillingene av amid jeg band, amid II bandet og Hyd1 aktive området regionen vises, sammen med tilleggsfunksjoner C-H strekker vibrasjoner og løsemiddel vann. Rammemargen viser en forstørret visning av aktive området regionen, for vCO og vCN bandene merket. 'Som-ferdig' partikler inneholder Hyd1 hovedsakelig i oksidert, inaktiv Ni-B staten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4 : Aktivering av Hyd1 på −0.8 V vs SCE under en H2 atmosfære, presentert som et redusert minus oksidert forskjellen spekter. Ved lav potensielle aktivering oksidert, konverterer inaktiv Ni-B (og en liten konsentrasjon av Ni-SI) til flere redusert, aktiv stater Ni-C, Ni-R og Ni-L. Merk at Hyd1 har to distinkte deltilstandene Ni-L og Ni-R. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5 : Effekten av løsning flow rate på waveshape av katalytisk syklisk voltammograms registrert i cellen spectroelectrochemical. Voltammograms ble registrert på å øke flyt priser H2-mettet bufferen som angitt. På en flow rate på 20 mL/min (rød) viser til voltammogram betydelig inaktivering over 0 V vs hun på søk fremover. Gjeldende er uavhengig av flow rate på alle potensialene i flow priser over 52 mL/min omfanget av inaktivering er vesentlig lavere. Andre parametere: 1 bar H210 mV/s avsøkingshastigheten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6 : Baseline korrigert IR spectra i regionen aktive området νCO i oksidert, inaktiv Ni-B tilstand på 0 V vs SCE. Det er ikke målbar tap av aktive området under 48 timer med kontinuerlig PFIRE mål, og derfor Hyd1 er adsorbert robust på sot partikler. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: Detaljer om planlagte synskorreksjon prosedyrer brukes til håndtering. Planlagte ankerpunkt er plassert på absolutt absorbansen spekteret i aktive området regionen (en), ta vare for å unngå alle νCO og νCN topper identifisert av en andre avledede analyse (b). Resulterende planlagte korrigert spekteret vises i (c). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: PFIRE målene på Hyd1 under ikke-omsetning (Ar) og omsetning (H2) forhold. (en) gjeldende tidspunkt spor av Hyd1 i den spectroelectrochemical cellen i Ar-mettet (grå) og H2-mettet (svart) buffer; (b), (c) PFIRE spectra viser regionen νCO på hver potensial under Ar (b) og H2 (c). Potensialer sitert i V vs hun. Gjengitt med tillatelse fra Hidalgo et al. 35 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 9
Figur 9: Anaerob inaktivering av Hyd1 via dannelsen av Ni-B fra Ni-SI. (en) gjeldende tidspunkt spor under en H2 atmosfære, viser en stabil electrocatalytic gjeldende −0.074 V og langsom anaerob inaktivering (monotoniske nedgang i aktuell) på +0.356 V vs hun. (b) Spectra registrert under de grå skyggelagte områdene i (a). Spekteret bjeg er en planlagt korrigert spekteret i begynnelsen av −0.074 V potensielle trinnet. Spekteret bii, spilt inn på et senere tidspunkt under −0.074 V trinn, rapporteres som et forskjellen spekter i forhold til bjeg og viser at oppstår ingen endring i distribusjon av aktive området stater, konsekvent med stabiliteten av potensialet på −0.074 V. Spectra biii og biv rapporteres også som forskjellen spectra i forhold til bjeg og viser gradvis konvertering av Ni-SI til Ni-B under anaerob inaktivering på +0.356 V vs hun. Gjengitt med tillatelse fra Hidalgo et al. 35 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 10
Figur 10 : Spectra spilt inn på en rekke løsningen pH gi innsikt i proton overføring trinnene under Hyd1 katalytisk syklus. (en) IR spectra viser νCO regionen Hyd1, innspilt på pH 3.0 (-54 mV vs hun) og pH 9.0 (-334 mV vs hun). (b) Spectroelectrochemical titrations ble gjennomført for å fastslå potensialet som de Ni-C og Ni-L konsentrasjonene er maksimalt en rekke løsningen pH-verdier. Bare de Ni-C og Ni-L konsentrasjonene vises klarhet, en full spectroelectrochemical Serine Hyd1 se Hidalgo et al. 36 (c) pH avhengighet av den relative konsentrasjonen av Ni-C og Ni-L, som bestemmes av en rekke eksperimenter som de vises i (b). Spectra ble innspilt på 20 ° C. Tilpasset med tillatelse fra Murphy et al. 42 Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

PFIRE er en bredt aktuelt IR spektroskopiske teknikk for adressering elektrode-immobilisert redoks proteiner. Spesielt kan electrocatalytic reaksjoner av redoks enzymer bli undersøkt under rask omsetning forhold. Metoden PFIRE bygger på direkte elektrokjemiske kontroll av teknikken av PFE, som gir ikke direkte strukturelle informasjon, og par det til IR spektroskopi på en karbon elektrode. PFIRE tilnærmingen dermed legger kjemiske innsikt til informasjonen tilgjengelig fra elektrokjemi alene og er svært egnet til å studere redoks proteiner og enzymer som er involvert i små molekyl bindende og aktivisering. I tillegg kan PFIRE gi informasjon om potensial-avhengige strukturelle endringer i proteiner i fravær av katalytisk omsetning. Slike ikke-omsetning elektron overføre hendelser er ofte vanskelig å oppdage med 'standard' programmer av PFE, men utvidelsen av PFE til Fourier-forvandlet AC voltammetry har blitt brukt med stor suksess. 45 , 46

Metoden PFIRE er, i prinsippet, til studiet av noen redoks protein som kan studeres ved hjelp av PFE. Derfor, som med PFE, protein adsorpsjon er et kritisk punkt for en vellykket PFIRE-eksperiment. Vi beskriver en anvendelse av PFIRE teknikken bruker E. coli Hyd1 som en casestudie i denne protokollen. 36 , 43 men vi har også brukt PFIRE teknikken de cytoplasmatiske regulatoriske hydrogenase fra R. eutropha,44 og flavin mononucleotide adsorbert på karbon svart. 40 i alle disse tilfellene, enkle fysiske adsorpsjon uforandret høy areal karbon svart (som beskrevet i denne protokollen) gir en dekning av protein som er høy nok til å spille god kvalitet IR spectra med en høy signal-til-støy-forhold. I tilfeller der slike høye nivåer av adsorpsjon ikke kan oppnås kan det være nødvendig å endre overflaten av karbon partikler, for eksempel kovalente vedlegg protein til elektroden overflaten. 60 , 61 , 62 bruken av en glovebox for PFIRE mål er bare strengt nødvendig når studere eksempler som må håndteres anaerob. Men i praksis det ekstremt konstant og lav (< 80 ° C duggpunkt) nivåer av vanndamp som glovebox atmosfæren gir høye signal-til-støy-nivåer at utvinning av svært små absorbances. 44 i mange tilfeller en anaerob miljø, for eksempel fra en glovebox er også ønskelig for elektrokjemiske måling (integrert med PFIRE teknikken) for å unngå gjeldende på grunn av O2 reduksjon på arbeider elektroden.

IR absorbances bulk vann, eksperimentelle buffere og karbon partikler som utvalget er adsorbert bidrar betydelig til de eksperimentelle spectra og kan overlappe band av interesse, spesielt i amid I, II og III regionene den spekteret. 63 amid regionen inneholder også informasjon fra organiske arter som flavins eller nikotinamid kofaktorer, som underlag og produkter av mange oksidering og reduksjon reaksjoner. Ved NiFe hydrogenases, νCO og νCN band av det aktive området faller i en relativt klar region av spekteret og så PFIRE teknikken er godt egnet til studiet av disse enzymene. I andre tilfeller, men kan forskjellen spectra kombinert med isotopanrikning merking tilnærminger være nødvendig å isolere endringer på grunn av immobilisert protein. Lignende tilnærminger har blitt brukt til å identifisere, for eksempel protonation endres, strukturelle rearrangements og studere Michaelis-Menten komplekser bruker IR spektroskopi. 64 , 65 , 66 PFIRE er derfor, ikke begrenset til studiet av hydrogenases men kan brukes på alle redoks protein som inneholder (eller som underlag, produkter eller hemmere inneholder) grupper med diagnostiske IR-aktiv vibrasjoner; karbonmonoksid dehydrogeanses,67 nitrogenases,68,14 flavoproteins,40 og formiat dehydrogenases, for eksempel.

Relaterte teknikken, SEIRA, er godt egnet til studiet av membran-assosiert proteiner i biomimetic omgivelser. 32 SEIRA er en tilpasning av IR spektroskopi som også bruker en ATR-IR-konfigurasjon, og gjør bruk av en overflate ekstrautstyr effekt som forsterker IR absorbansen molekyler ligger nær (noen nm) overflaten av ATR prisme (irsk). SEIRA er derfor utsøkt sensitive til spectral endringer som oppstår innen adsorbert protein og membran arkitekturen og er relativt fri for konkurrerende signaler fra løsemiddel og underlag/hemmere finnes i løsningen. Dette er noe i kontrast til PFIRE teknikken beskrevet her som er avhengig av en betydelig større gjennomtrenging dyp over overflaten av IRE (~ 1 µm), betyr at PFIRE er mer følsomme for underlag, produkter eller hemmere finnes i løsningen. Dette økt følsomhet for "bulk" løsemiddel kan være fordelaktig; Hvis den substrat eller produktet kan observeres direkte av IR, rapport PFIRE spectra om begge steady state kinetics varige aktiv arter og tilknyttet produktet formasjon under electrocatalysis. 69 muligheten til å observere steady state konsentrasjoner av underlaget og produktet vil være spesielt verdifull for enzymer som karbonmonoksid dehydrogenase (som gir reversibel oksidasjon av CO til CO2, en sterk IR absorber) eller formiat dehydrogenase (som gir reversibel oksidasjon av formiat CO2).

I dag er PFIRE begrenset til stabil kinetic studier av enzymet electrocatalysis på grunn av makroskopisk karbon elektrodene pleide konsentrere enzymet på overflaten av en IRE for datainnsamling i og ATR-IR geometri. I denne forbindelse er PFIRE studier av NiFe hydrogenases komplementære til arbeidet med Dyer og kolleger,49,50 som bruker lys-utløst forbigående absorpsjon IR spektroskopi for å studere sub omsetning kinetics. Arbeides å miniaturize spectroelectrochemical cellen,40 og med bruk av microelectrodes tid oppløsning på mikrosekunder bør være oppnåelig. Dette vil aktivere studie av sub omsetning kinetics for enzymer med omsetning frekvenser opp til ca 100-500 s-1og gjør studiet av både reductive og kjemiske prosesser.

Samlet er PFIRE en spektroskopiske teknikk som lar kjemisk karakterisering av electrocatalytic reaksjoner av redoks enzymer under steady state forhold. PFIRE tilnærming kan flere kjemiske og elektrokjemiske titrations utføres på samme enzym prøven, som høy areal elektrodene brukes gir en robust adsorpsjon protein og ATR-IR geometri gjør lettvinte løsning utveksling. Muligheten til å samle slik strukturinformasjon i situ under enzym funksjonen er et uvurderlig verktøy for bioelectrochemistry samfunnet.

Disclosures

Forfatterne erklære noen konkurrerende økonomisk interesse.

Acknowledgments

K.A.V. og P.A.A. ble støttet av den europeiske Research Council (EnergyBioCatalysis-ERC-2010-StG-258600), Engineering og Physical Sciences Research Council IB katalysator prisen EP/N013514/1, og bioteknologi og biologisk vitenskap forskning Rådet (BB/L009722/1 og BB/N006321/1). R.H. ble støttet av Ministerio de Ciencia y Tecnologìa, Universidad de Costa Rica, og Lincoln College, Oxford. Forfatterne bekrefter Mr. Charlie Jones, Mr. Charlie Evans og stab av mekaniske verksted (Institutt for kjemi) for hjelp i design og produksjon av spectroelectrochemical celler brukes i dette arbeidet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Spectrometer Agilent 680-IR with an external MCT detector
ATR accessory Pike Technologies GladiATR Customised for use with a 5-reflection Si IRE
Glovebox Glove Box Technology Ltd. N/A Custom designed 'wet' and 'dry' box for anaerobic sample handling and measurement
KBr window Crystran Custom To allow coupling of the glovebox with the external beam of the FTIR spectrometer
Additional optics Agilent N/A Components from a PM-IRRAS accessory
Silicon IRE Crystal GmbH Custom Trapezoidal: 8.4 mm x 5 mm (large face), 1 mm thickness, ca 39 degree face angle
Potentiostat Metrohm Autolab PGSTAT 128N
Nova 10.1 Metrohm Software for controlling the potentiostat
Peristaltic pump Williamson Manufacturing Company Ltd QL-1000-024-300
Pt wire Surepure Chemetals 3272 99.95% Pure Platinum Wire, 0.014 inch Diameter
Carbon rod WH Smith 30729209 0.7 mm HB pencil lead
Carbon black Cabot Corporation Black Pearls 2000
Ultrasonic bath Ultrawave U100 35 W
Centrifugal filter Merck Millipore UFC5050BK Amicon Ultra, 50 KDa MW cutoff
Microcentrifuge Eppendorf 5452000018 MiniSpin
NaCl Sigma 71376
H2SO4 Fisher S/9240/PB17
HNO3 Fisher N/2300/PB17
silicone sealant Cow Corning Toray Co., Ltd. SE 4486
Carbon paper Toray TGP-H-030
H2 gas BOC
N2 gas BOC
OriginPro 2015 OriginLab Data analysis/graphing software
Resolutions Pro 4.0 Varian Software for controlling FTIR spectrometer

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ash, P. A., Vincent, K. A. Spectroscopic analysis of immobilised redox enzymes under direct electrochemical control. Chem. Commun. 48, (10), 1400-1409 (2012).
  2. Sezer, M., Millo, D., Weidinger, I. M., Zebger, I., Hildebrandt, P. Analyzing the catalytic processes of immobilized redox enzymes by vibrational spectroscopies. IUBMB Life. 64, (6), 455-464 (2012).
  3. Melin, F., Hellwig, P. Recent advances in the electrochemistry and spectroelectrochemistry of membrane proteins. Biol. Chem. 394, (5), 593-609 (2013).
  4. Dong, S., Niu, J., Cotton, T. M. Ultraviolet/visible spectroelectrochemistry of redox proteins. Methods Enzymol. 246, 701-732 (1995).
  5. Hellwig, P., et al. Electrochemical and Ultraviolet/Visible/Infrared Spectroscopic Analysis of Heme a and a3 Redox Reactions in the Cytochrome c Oxidase from Paracoccus denitrificans Separation of Heme a and a3 Contributions and Assignment of Vibrational Modes. Biochemistry. 38, (6), 1685-1694 (1999).
  6. Wu, S., et al. Redox chemistry of the Schizosaccharomyces pombe ferredoxin electron-transfer domain and influence of Cys to Ser substitutions. J. Inorg. Biochem. 105, (6), 806-811 (2011).
  7. Whitehouse, C. J. C., et al. A Highly Active Single-Mutation Variant of P450BM3 (CYP102A1). ChemBioChem. 10, (10), 1654-1656 (2009).
  8. Marritt, S. J., van Wonderen, J. H., Cheesman, M. R., Butt, J. N. Magnetic circular dichroism of hemoproteins with in situ control of electrochemical potential: "MOTTLE". Anal. Biochem. 359, (1), 79-83 (2006).
  9. Moss, D., Nabedryk, E., Breton, J., Mäntele, W. Redox-linked conformational changes in proteins detected by a combination of infrared spectroscopy and protein electrochemistry. Eur. J. Biochem. 187, (3), 565-572 (1990).
  10. Iwaki, M., et al. Direct Observation of Redox-Linked Histidine Protonation Changes in the Iron-Sulfur Protein of the Cytochrome bc1 Complex by ATR-FTIR Spectroscopy. Biochemistry. 44, (11), 4230-4237 (2005).
  11. Marshall, D., et al. ATR-FTIR Redox Difference Spectroscopy of Yarrowia lipolytica and Bovine Complex I. Biochemistry. 45, (17), 5458-5467 (2006).
  12. Lacey, A. L. D., Gutiérrez-Sánchez, C., Fernández, V. M., Pacheco, I., Pereira, I. A. C. FTIR spectroelectrochemical characterization of the Ni-Fe-Se hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris Hildenborough. J. Biol. Inorg. Chem. 13, (8), 1315-1320 (2008).
  13. Millo, D., et al. Spectroelectrochemical Study of the [NiFe] Hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris Miyazaki F in Solution and Immobilized on Biocompatible Gold Surfaces. J. Phys. Chem. B. 113, (46), 15344-15351 (2009).
  14. Paengnakorn, P., et al. Infrared spectroscopy of the nitrogenase MoFe protein under electrochemical control: potential-triggered CO binding. Chem. Sci. 8, (2), 1500-1505 (2017).
  15. Male, L., et al. Protein voltammetry and spectroscopy: integrating approaches. Theor. Chem. Acc. 119, (1-3), 107-111 (2008).
  16. Healy, A. J., Ash, P. A., Lenz, O., Vincent, K. A. Attenuated total reflectance infrared spectroelectrochemistry at a carbon particle electrode; unmediated redox control of a [NiFe]-hydrogenase solution. Phys. Chem. Chem. Phys. 15, (19), 7055-7059 (2013).
  17. Léger, C., Bertrand, P. Direct Electrochemistry of Redox Enzymes as a Tool for Mechanistic Studies. Chem. Rev. 108, (7), 2379-2438 (2008).
  18. Armstrong, F. A., Hirst, J. Reversibility and efficiency in electrocatalytic energy conversion and lessons from enzymes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, (34), 14049-14054 (2011).
  19. Gates, A. J., et al. The relationship between redox enzyme activity and electrochemical potential-cellular and mechanistic implications from protein film electrochemistry. Phys. Chem. Chem. Phys. 13, (17), 7720-7731 (2011).
  20. Pershad, H. R., et al. Catalytic Electron Transport in Chromatium vinosum [NiFe]-Hydrogenase: Application of Voltammetry in Detecting Redox-Active Centers and Establishing That Hydrogen Oxidation Is Very Fast Even at Potentials Close to the Reversible H+/H2 Value. Biochemistry. 38, (28), 8992-8999 (1999).
  21. Goldet, G., et al. Electrochemical Kinetic Investigations of the Reactions of [FeFe]-Hydrogenases with Carbon Monoxide and Oxygen: Comparing the Importance of Gas Tunnels and Active-Site Electronic/Redox Effects. J. Am. Chem. Soc. 131, (41), 14979-14989 (2009).
  22. Vincent, K. A., Parkin, A., Armstrong, F. A. Investigating and Exploiting the Electrocatalytic Properties of Hydrogenases. Chem. Rev. 107, (10), 4366-4413 (2007).
  23. Parkin, A., Seravalli, J., Vincent, K. A., Ragsdale, S. W., Armstrong, F. A. Rapid and Efficient Electrocatalytic CO2/CO Interconversions by Carboxydothermus hydrogenoformans CO Dehydrogenase I on an Electrode. J. Am. Chem. Soc. 129, (34), 10328-10329 (2007).
  24. van Wonderen, J. H., Burlat, B., Richardson, D. J., Cheesman, M. R., Butt, J. N. The Nitric Oxide Reductase Activity of Cytochrome c Nitrite Reductase from Escherichia coli. J. Biol. Chem. 283, (15), 9587-9594 (2008).
  25. Schaming, D., et al. Spectroelectrochemical Characterization of Small Hemoproteins Adsorbed within Nanostructured Mesoporous ITO Electrodes. Langmuir. 28, (39), 14065-14072 (2012).
  26. Kemp, G. L., et al. Opportunities for mesoporous nanocrystalline SnO2 electrodes in kinetic and catalytic analyses of redox proteins. Biochem. Soc. Trans. 37, (2), 368-372 (2009).
  27. Renault, C., et al. Unraveling the Mechanism of Catalytic Reduction of O2 by Microperoxidase-11 Adsorbed within a Transparent 3D-Nanoporous ITO Film. J. Am. Chem. Soc. 134, (15), 6834-6845 (2012).
  28. Krzemiński, Ł, et al. Spectroelectrochemical Investigation of Intramolecular and Interfacial Electron-Transfer Rates Reveals Differences Between Nitrite Reductase at Rest and During Turnover. J. Am. Chem. Soc. 133, (38), 15085-15093 (2011).
  29. Akkilic, N., Kamran, M., Stan, R., Sanghamitra, N. J. M. Voltage-controlled fluorescence switching of a single redox protein. Biosens. Bioelectron. 67, 747-751 (2015).
  30. Ataka, K., Heberle, J. Electrochemically Induced Surface-Enhanced Infrared Difference Absorption (SEIDA) Spectroscopy of a Protein Monolayer. J. Am. Chem. Soc. 125, (17), 4986-4987 (2003).
  31. Millo, D., Hildebrandt, P., Pandelia, M. -E., Lubitz, W., Zebger, I. SEIRA Spectroscopy of the Electrochemical Activation of an Immobilized [NiFe] Hydrogenase under Turnover and Non-Turnover Conditions. Angew. Chem. Int. Ed. 50, (11), 2632-2634 (2011).
  32. Ataka, K., Stripp, S. T., Heberle, J. Surface-enhanced infrared absorption spectroscopy (SEIRAS) to probe monolayers of membrane proteins. Biochim. Biophys. Acta, Biomembr. 1828, (10), 2283-2293 (2013).
  33. Kozuch, J., et al. Voltage-dependent structural changes of the membrane-bound anion channel hVDAC1 probed by SEIRA and electrochemical impedance spectroscopy. Phys. Chem. Chem. Phys. 16, (20), 9546-9555 (2014).
  34. Silveira, C. M., et al. SERR Spectroelectrochemical Study of Cytochrome cd1 Nitrite Reductase Co-Immobilized with Physiological Redox Partner Cytochrome c552 on Biocompatible Metal Electrodes. PLoS One. 10, (6), 0129940 (2015).
  35. Todorovic, S., Hildebrandt, P., Martins, L. Surface enhanced resonance Raman detection of a catalytic intermediate of DyP-type peroxidase. Phys. Chem. Chem. Phys. 17, (18), 11954-11957 (2015).
  36. Hidalgo, R., Ash, P. A., Healy, A. J., Vincent, K. A. Infrared Spectroscopy During Electrocatalytic Turnover Reveals the Ni-L Active Site State During H2 Oxidation by a NiFe Hydrogenase. Angew. Chem. Int. Ed. 54, (24), 7110-7113 (2015).
  37. Grabarczyk, D. B., Ash, P. A., Vincent, K. A. Infrared Spectroscopy Provides Insight into the Role of Dioxygen in the Nitrosylation Pathway of a [2Fe2S] Cluster Iron-Sulfur Protein. J. Am. Chem. Soc. 136, (32), 11236-11239 (2014).
  38. Kriegel, S., Uchida, T., Osawa, M., Friedrich, T., Hellwig, P. Biomimetic Environment to Study E. coli Complex I through Surface-Enhanced IR Absorption Spectroscopy. Biochemistry. 53, (40), 6340-6347 (2014).
  39. El Khoury, Y., Van Wilderen, L. J. G. W., Bredenbeck, J. Ultrafast 2D-IR spectroelectrochemistry of flavin mononucleotide. J. Chem. Phys. 142, (21), 212416 (2015).
  40. Ash, P. A., et al. Synchrotron-Based Infrared Microanalysis of Biological Redox Processes under Electrochemical Control. Anal. Chem. 88, (13), 6666-6671 (2016).
  41. Nakamoto, K. Infrared and Raman Spectra of Inorganic and Coordination Compounds. Part B. John Wiley & Sons, inc. (2009).
  42. Bard, A., Faulkner, L. R. Electrochemical Methods: Fundamentals and Applications. John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  43. Murphy, B. J., et al. Discovery of Dark pH-Dependent H+ Migration in a [NiFe]-Hydrogenase and Its Mechanistic Relevance: Mobilizing the Hydrido Ligand of the Ni-C Intermediate. J. Am. Chem. Soc. 137, (26), 8484-8489 (2015).
  44. Ash, P. A., et al. Electrochemical and Infrared Spectroscopic Studies Provide Insight into Reactions of the NiFe Regulatory Hydrogenase from Ralstonia eutropha with O2 and CO. J. Phys. Chem. B. 119, (43), 13807-13815 (2015).
  45. Lee, C. -Y., et al. Theoretical and experimental investigation of surface-confined two-center metalloproteins by large-amplitude Fourier transformed ac voltammetry. J. Electroanal. Chem. 656, (1-2), 293-303 (2011).
  46. Adamson, H., et al. Electrochemical evidence that pyranopterin redox chemistry controls the catalysis of YedY, a mononuclear Mo enzyme. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112, (47), 14506-14511 (2015).
  47. De Lacey, A. L., Fernández, V. M., Rousset, M., Cammack, R. Activation and Inactivation of Hydrogenase Function and the Catalytic Cycle: Spectroelectrochemical Studies. Chem. Rev. 107, (10), 4304-4330 (2007).
  48. Lubitz, W., Ogata, H., Rüdiger, O., Reijerse, E. Hydrogenases. Chem Rev. 114, (8), 4081-4148 (2014).
  49. Greene, B. L., Wu, C. -H., McTernan, P. M., Adams, M. W. W., Dyer, R. B. Proton-Coupled Electron Transfer Dynamics in the Catalytic Mechanism of a [NiFe]-Hydrogenase. J. Am. Chem. Soc. 137, (13), 4558-4566 (2015).
  50. Greene, B. L., Wu, C. -H., Vansuch, G. E., Adams, M. W. W., Dyer, R. B. Proton Inventory and Dynamics in the Nia-S to Nia-C Transition of a [NiFe] Hydrogenase. Biochemistry. 55, (12), 1813-1825 (2016).
  51. Greene, B. L., Vansuch, G. E., Wu, C. -H., Adams, M. W. W., Dyer, R. B. Glutamate Gated Proton-Coupled Electron Transfer Activity of a [NiFe]-Hydrogenase. J. Am. Chem. Soc. 138, (39), 13013-13021 (2016).
  52. Sezer, M., et al. Role of the HoxZ Subunit in the Electron Transfer Pathway of the Membrane-Bound [NiFe]-Hydrogenase from Ralstonia eutropha Immobilized on Electrodes. J. Phys. Chem. B. 115, (34), 10368-10374 (2011).
  53. Heering, H. A., Wiertz, F. G. M., Dekker, C., de Vries, S. Direct Immobilization of Native Yeast Iso-1 Cytochrome c on Bare Gold: Fast Electron Relay to Redox Enzymes and Zeptomole Protein-Film Voltammetry. J. Am. Chem. Soc. 126, (35), 11103-11112 (2004).
  54. dos Santos, L., Climent, V., Blanford, C. F., Armstrong, F. A. Mechanistic studies of the "blue" Cu enzyme, bilirubin oxidase, as a highly efficient electrocatalyst for the oxygen reduction reaction. Phys. Chem. Chem. Phys. 12, (42), 13962-13974 (2010).
  55. Lukey, M. J., et al. How Escherichia coli Is Equipped to Oxidize Hydrogen under Different Redox Conditions. J. Biol. Chem. 285, (6), 3928-3938 (2010).
  56. Jones, A. K., et al. Enzyme Electrokinetics: Electrochemical Studies of the Anaerobic Interconversions between Active and Inactive States of Allochromatium vinosum [NiFe]-hydrogenase. J. Am. Chem. Soc. 125, (28), 8505-8514 (2003).
  57. Quinson, J., et al. Comparison of carbon materials as electrodes for enzyme electrocatalysis: hydrogenase as a case study. Faraday Trans. 172, (0), 473-496 (2014).
  58. Shafaat, H. S., Rüdiger, O., Ogata, H., Lubitz, W. [NiFe] hydrogenases: A common active site for hydrogen metabolism under diverse conditions. Biochim. Biophys. Acta, Bioenerg. 1827, (8-9), 986-1002 (2013).
  59. Ash, P. A., Hidalgo, R., Vincent, K. A. Proton transfer in the catalytic cycle of NiFe hydrogenases: insight from vibrational spectroscopy. ACS Catalysis. (2017).
  60. Krishnan, S., Armstrong, F. A. Order-of-magnitude enhancement of an enzymatic hydrogen-air fuel cell based on pyrenyl carbon nanostructures. Chem. Sci. 3, (4), 1015-1023 (2012).
  61. Baffert, C., et al. Covalent Attachment of FeFe Hydrogenases to Carbon Electrodes for Direct Electron Transfer. Anal. Chem. 84, (18), 7999-8005 (2012).
  62. Rüdiger, O., et al. Enzymatic Anodes for Hydrogen Fuel Cells based on Covalent Attachment of Ni-Fe Hydrogenases and Direct Electron Transfer to SAM-Modified Gold Electrodes. Electroanal. 22, (7-8), 776-783 (2010).
  63. Barth, A., Zscherp, C. What vibrations tell about proteins. Q. Rev. Biophys. 35, (4), 369-430 (2002).
  64. Jiang, X., et al. Resolving voltage-dependent structural changes of a membrane photoreceptor by surface-enhanced IR difference spectroscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, (34), 12113-12117 (2008).
  65. Kottke, T., Lòrenz-Fonfrìa, V. A., Heberle, J. The Grateful Infrared: Sequential Protein Structural Changes Resolved by Infrared Difference Spectroscopy. J. Phys. Chem. B. 121, (2), 335-350 (2017).
  66. Callender, R., Dyer, R. B. The Dynamical Nature of Enzymatic Catalysis. Acc. Chem. Res. 48, (2), 407-413 (2015).
  67. Ciaccafava, A., et al. When the inhibitor tells more than the substrate: the cyanide-bound state of a carbon monoxide dehydrogenase. Chem. Sci. 7, (5), 3162-3171 (2016).
  68. George, S. J., Ashby, G. A., Wharton, C. W., Thorneley, R. N. F. Time-Resolved Binding of Carbon Monoxide to Nitrogenase Monitored by Stopped-Flow Infrared Spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 119, (27), 6450-6451 (1997).
  69. McPherson, I. J., Ash, P. A., Jacobs, R. M. J., Vincent, K. A. Formate adsorption on Pt nanoparticles during formic acid electro-oxidation: insights from in situ infrared spectroscopy. Chem Commun. 52, (85), 12665-12668 (2016).
Protein Film infrarød elektrokjemi demonstrert for studier av H<sub>2</sub> oksidasjon av en [NiFe] Hydrogenase
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ash, P. A., Hidalgo, R., Vincent, K. A. Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase. J. Vis. Exp. (130), e55858, doi:10.3791/55858 (2017).More

Ash, P. A., Hidalgo, R., Vincent, K. A. Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase. J. Vis. Exp. (130), e55858, doi:10.3791/55858 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter