Summary
Synaptic vesikel endocytose opdages ved lysmikroskopi af pHluorin sammenvokset med synaptic vesikel protein og ved elektronmikroskopi vesikel optagelse.
Abstract
Under endocytose hentes sammenvoksede synaptiske vesikler på nerve terminaler, giver mulighed for vesikel genanvendelse og dermed fastholdelsen af synaptisk transmission under gentagne nerve fyring. Nedsat endocytose i patologiske betingelser fører til fald i synaptisk styrke og hjernens funktioner. Her, beskriver vi metoder, der anvendes til at måle synaptic vesikel endocytose på pattedyr hippocampus synapse i neuronal kultur. Vi overvågede synaptic vesikel protein endocytose af fusing en synaptic vesikulære membran proteiner, herunder synaptophysin og VAMP2/synaptobrevin, på den vesikulære lumenal side, med pHluorin, en pH-følsom grøn fluorescerende proteiner, der øger sin Fluorescens intensiteten som pH stiger. Under exocytose, vesikulær lumen pH stiger, mens under endocytose vesikulære lumen pH er re syrnet. Således, en stigning på pHluorin fluorescens intensitet angiver fusion, mens et fald angiver endocytose af mærket synaptic vesikel protein. Ud over at bruge metoden pHluorin billeddannelse til at registrere endocytose, overvåges vi vesikulære membran endocytose ved elektronmikroskopi (EM) målinger af peberrod peberrodsperoxidase (HRP) optagelse af vesikler. Endelig, vi overvåges dannelsen af nerve terminal membran pitten på forskellige tidspunkter efter høj kalium-induceret depolarisering. Tidsforløb for HRP optagelse og membran pit dannelse angiver tidsforløb af endocytose.
Introduction
Neurotransmittere er gemt i synaptiske vesikler og udgivet ved exocytose. Synaptic vesikel membran og protein er derefter internaliseret ved endocytose, og genbruges i den næste runde af exocytose. Endocytose af synaptiske vesikler er vigtige for opretholdelse af synaptic vesikel pools og fjerner fremspringende vesikler fra plasmamembran. PH-følsom grøn fluorescerende proteiner-pHluorin, som er slukket under sure forhold og dequenched i neutral pH, er blevet brugt til at måle endocytose tid kurser i levende celler1,2,3. PHluorin protein er typisk knyttet til den lumenal side af synaptic vesikel proteiner, såsom synaptophysin eller VAMP2/synaptobrevin. I hvile, er pHluorin bratkølet i 5,5 pH lumen af synaptiske vesikler. Vesikel fusion til plasmamembran udsætter vesikulære lumen til den ekstracellulære løsning, hvor pH er ~ 7.3, hvilket resulterer i en stigning i pHluorin fluorescens. Efter exocytose henfalder den øgede fluorescens på grund af endocytose af synaptic vesikel proteiner efterfulgt af vesikel re forsuring inden for de gendannede vesikler. Selvom henfald afspejler både endocytose og vesikulære re forsuring, afspejler det meste endocytose, fordi re forsuring er hurtigere end endocytose i de fleste forhold1,4. Tid konstanten re forsuring er 3-4 s eller mindre5,6, som er generelt hurtigere end 10 s eller mere kræves for vesikel endocytose4,5. Hvis eksperimenter er nødvendige for at skelne mellem endocytose re forsuring, kan syre quenching eksperimenter ved hjælp af 4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) løsning (25 mM) med en pH på 5,5 bruges til at bestemme, om synaptic vesikel proteiner er hentet fra plasmamembran via endocytose1,3,4. Således pHluorin fluorescens intensitet stigningen afspejler en balance af exo- og endocytose, og faldet efter nervestimulation specifikt afspejler endocytose.
pHluorin imaging kan bruges ikke kun til at måle tid løbet af endocytose, men også størrelsen af synaptic vesikel pools7,8, og sandsynligheden af evoked frigivelse og spontane frigive9. Mange faktorer og proteiner involveret i regulering af endocytose, såsom calcium, opløselige NSF-attachment protein receptor (SNARE) proteiner, hjerne-afledte neurotrope factor(BDNF) og calcineurin er blevet identificeret ved hjælp af pHluorin billeddannelse1 , 2 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16. Derudover frigivelse af neurotransmitter kunne påvises i ikke kun primære neuroner, men i neuroblastoma celler med TIRFM17. For nylig, pHluorin varianter, dsRed, mOrange og pHTomato blev udviklet til overvågning af samtidig optagelser af flere faktorer i en enkelt synapse18,19. For eksempel er pHTomato sammenvokset med synaptophysin og bruges med en genetisk kodet calcium indikator (GCaMP5K) til at overvåge præsynaptiske vesikel fusion og Ca2 + tilstrømning i den postsynaptiske rum20. Derfor giver pHluorin knyttet til synaptic proteiner en nyttig metode til at analysere forholdet mellem endocytose og exocytose.
EM er en anden metode normalt bruges til at studere endocytose, på grund af den høje rumlige opløsning, der viser ultrastrukturelle ændringer under endocytose. To generelle områder er evnen til at visualisere patologiske ændringer inden for neuronale celler21 og spore vesikel proteiner22. Især observation af synaptic vesikel optagelse, membran krumning belagt af clathrin i periactive zonen, og endosomal strukturer er muligt med EM3,23,24,25 ,26,27,28. Mens EM indebærer potentielle artefakter, som fiksativ-induceret misdannelser, der kan påvirke endocytose, og dataanalyse er arbejdsintensive, beslutningen giver en attraktiv mulighed for at visualisere cellestruktur. Potentielle Fikseringsvæske problemer og begrænsning i EM tidsmæssige opløsning kan overvindes ved højt tryk frysning, der giver en hurtig og ikke-kemisk metode for at stabilisere de sarte strukturer under endocytose27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOTE: følgende protokol beskriver pHluorin Billeddannende metoder og EM metoder anvendes i kulturperler hippocampus neuroner. pHluorin skærme synaptic vesikel protein optagelse i levende celler og EM registrerer udbredelsen af synaptic vesikel og ultrastrukturelle ændringer.
dyrs pleje og procedure fulgte NIH retningslinjer og blev godkendt af NIH dyrs pleje og brug udvalget.
1. pHluorin Imaging
- hippocampus neuron kultur
- Forbered Hippocampus Buffer (HB) ved at kombinere 4 NaHCO 3 og 5 mM HEPES og justeres til pH 7.3 med 5 M NaOH. Lav dyrkningsmediet ved at blande neurobasal medium, 2% B27, 0,5 mM L-glutamin og 1% penicillin-streptomycin. Derudover forberede en blanding af HB buffer med 20% føtal bovint Serum (HB/20% FBS).
Bemærk: Denne dyrkningsbaserede protokol er baseret på Karen, et al. 29 og Wu et al. 24 - halshugge mus hvalpe mellem postnatal dag 0 til dag 2 i substratet, og udtrække hjernen til 4 ° C HB/20% FBS. Fjerne hjernestammen og thalamus at afsløre hippocampi. Dissekere ud hippocampi, efter at udsætte det ved fjernelse af hjernestammen og thalamus, og overføre til frisk 4 ° C HB/20% FBS.
Bemærk: Udbytte er typisk omkring 4 x 10 5 celler/mL til én hvalp (to hippocampi). Ren off vedhængende membraner med pincet eller saks og derefter overføre til frisk 4 ° C HB/20% FBS. Rul den dentate gyrus og isolere subiculum ved at skære med saks og derefter overføre til frisk 4 ° C HB/20% FBS. - Opdeler hver hippocampus, ved at skære fra ende til anden, i ca. 10 skiver og overføre dem til en 15 mL polypropylen koniske rør.
- Efter at tillade væv til at bosætte sig, skylles med 10 mL af HB/20% FBS og derefter vaskes tre gange med 10 mL af HB.
- Forbereder fordøjelsen løsning af 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 7 mM Na2HPO 4 og 25 mM HEPES og justeres til pH 7,2 med 5 M NaOH. Fjern supernatanten fra hippocampi. Tilføje 10 af trypsin og 1 mg af DNase til 2 mL af fordøjelsen løsning, og filtreres gennem et sterilt 0,22 µm membran direkte på prøve pellet.
- Inkuberes hippocampi i 5 min ved 37 ° C, og derefter vaskes to gange med 10 mL af HB/20% FBS, og derefter vaske en gang med 10 mL af HB.
- Afstand celler med 6 mg af MgSO 4 ∙ 7 H 2 O og 1 mg DNase til 2 mL HB og sterile filter på hippocampi pellet gennem en steril 0,22 µm filter. Forsigtigt adskille cellerne ved omhyggelig triturating, samtidig undgå at indføre luftbobler. Tillad væv partikler til at nøjes med 2 min, og derefter langsomt overføre supernatanten til et andet rør.
- Tilføj 3 mL HB/20% FBS cellesuspension, og der centrifugeres eller 10 min. ved 4 ° C og 1000 rpm. Supernatanten og resuspend i dyrkningsmediet.
- Plade 60.000 celler suspenderet i 150 µL kultur medium på en Poly-D-lysin belagt 25-mm diameter coverslip, uden spild off coverslip. Der tilsættes 2 mL af pre varmede næringssubstratet 2 h efter plating. Coverslips vedligeholdes i 6-godt dyrkningsbaserede plader eller sterile petriskåle.
- Vedligehold celler ved 37 ° C i en 5% CO 2 fugtet inkubator dyrkningsmedium i 14-21 dage forud for optagelsen. Under kultur væksten, ændre den øverste halvdel af medium to gange om ugen.
- Forbered Hippocampus Buffer (HB) ved at kombinere 4 NaHCO 3 og 5 mM HEPES og justeres til pH 7.3 med 5 M NaOH. Lav dyrkningsmediet ved at blande neurobasal medium, 2% B27, 0,5 mM L-glutamin og 1% penicillin-streptomycin. Derudover forberede en blanding af HB buffer med 20% føtal bovint Serum (HB/20% FBS).
- Transfektion
- 6-7 dage efter plating, transfect synaptophysin-pHluorin 2 X (SpH) eller VAMP2-pHluorin til hippocampus neuroner. SpH, bruge en Cytomegalovirus (CMV) promotor, indsat i en pcDNA3 vektor 30. For VAMP2-pHluorin, bruge en CMV promotor indsat i en pCI vektor 31.
- Transfect enten vektor af lipid luftfartsselskab i target-cellerne bruger 1 µg af plasmidet. Bruge næringssubstratet fra protokollen trin 1.1.1, som mangler serum, for Transfektion. Ændre medium 2 h efter Transfektion til at reducere toksicitet.
Bemærk: I tilfælde af lav udtryk for SpH i boutons, øge DNA koncentration til 2 µg eller inkubationstiden lipid-luftfartsselskab, medmindre cellerne er usundt. Typisk, 4-10 celler (0,006-0,008%) af neuroner var transfekteret.
- Lysmikroskopi
- Forbered normale saltopløsning bestående af 119 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 2,5 mM KCl, 25 mM HEPES (pH 7,4), 30 mM glukose, 2 mM MgCl 2, 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione () 0,01 mM CNQX), og 0,05 mM DL-2-amino-5-phosphonovaleric syre (AP5). Tage en coverslip fra næringssubstratet plade og sted på en billeddannelse kammer, der giver mulighed for feltet stimulation, ved hjælp af smøremiddel og fugemasse til at undgå utætheder. Undgå at lade glasset tørre under overførslen af en coverslip fra pladen til kammeret ved straks tilføje 750 µL normale saltopløsning.
Bemærk: CNQX og AP5 blev brugt til at blokere postsynaptiske aktivitet, som har potentiale for tilbagevendende aktivitet. Før du placerer en afdeling på en inverteret fluorescens mikroskop, skal du bruge rengøring væv til at bekræfte, at salen ikke lække. Sen siver forårsager fokus ændringer under optagelsen af en blanding af normale saltvand og nedsænkning olie, hvilket resulterer i ændringer i brydningsindekset. - Stimulation og optage
- billedet på en inverteret widefield mikroskop med en 60 X (1,4 numerisk blænde) immersionsolie linse med en metalhalogen lampe. Visualisere pHluorin med filter sat en excitation top på 480 nm, en 490 nm lang pass spejl, et 500-550 nm emission filter og en manuel klappen lukker. Capture billeder hver 100 ms, med 2 x 2 binning, ved hjælp af en elektron at multiplicere afgift kombineret enhed (EMCCD) kamera.
Bemærk: Flere funktioner bør overvejes at opnå de rette betingelser til at undgå photobleaching, herunder image capture interval, og filtrere og udsmidningen, som er afhængige af udstyr. I tilfælde af Konfokal imaging, bør laser power og eksponering tid overvejes at undgå photobleaching. Opsætningen var fastlagt efter optagelse mindst 3 min. uden stimulus og optagelsen blev udført for mindst 10 s uden incitament til at kontrollere for photobleaching. - Vælge et område med en høj tæthed af boutons til analyseformål i hvert forsøg. Identificere transfekteret celler ved deres grønne fluorescens signal, med vægt på runde eller ovale udtryk mønstre i bouton og kontinuerlig udtryk mellem boutons.
- Inducere endocytose af feltet stimulation ved hjælp af en 1 ms puls, 20 mA aktionspotentialet (AP) leveres fra en puls stimulator og leveres gennem en platin elektrode i stimulus isoleret enhed. Billede fluorescens aktivitet i løbet af stimulation og under celle opsving.
Bemærk: I tilfælde af døde celler, udtryk var stærkere end levende boutons og viste en fragmentarisk mønster mellem boutons.
- billedet på en inverteret widefield mikroskop med en 60 X (1,4 numerisk blænde) immersionsolie linse med en metalhalogen lampe. Visualisere pHluorin med filter sat en excitation top på 480 nm, en 490 nm lang pass spejl, et 500-550 nm emission filter og en manuel klappen lukker. Capture billeder hver 100 ms, med 2 x 2 binning, ved hjælp af en elektron at multiplicere afgift kombineret enhed (EMCCD) kamera.
- Forbered normale saltopløsning bestående af 119 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 2,5 mM KCl, 25 mM HEPES (pH 7,4), 30 mM glukose, 2 mM MgCl 2, 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione () 0,01 mM CNQX), og 0,05 mM DL-2-amino-5-phosphonovaleric syre (AP5). Tage en coverslip fra næringssubstratet plade og sted på en billeddannelse kammer, der giver mulighed for feltet stimulation, ved hjælp af smøremiddel og fugemasse til at undgå utætheder. Undgå at lade glasset tørre under overførslen af en coverslip fra pladen til kammeret ved straks tilføje 750 µL normale saltopløsning.
- Billedanalyse
- Til at analysere fluorescens-intensiteten i et enkelt bouton, sat op en Region af interesse (ROI) som en 1,5 x 1,5 µm firkantede; størrelsen af en bouton ligger omkring 1,5 µm. Brug spor før stimulation til at kontrollere, om photobleaching og trække som baggrund.
- Normalisér fluorescens ændre (ΔF) med ligningen:
hvor F max og F 0 henvise til maksimal stigning efter stimulation og baseline fluorescens, henholdsvis. Måle endocytose satser som satsen for forfald i løbet af først 4-10 s efter det maksimale punkt af pHluorin fluorescens. Få tidsvejning (τ) af endocytose ved at montere pHluorin fluorescens forfald fra peak stigning til baseline med en mono-eksponentiel funktion.
2. Elektronmikroskopi
- Forbered en Poly-D-lysin belagt 6-godt pladen ved at anvende 1,5 mL 0,01% steril-filtreret Poly-D-lysin løsning til hver brønd i 1 time ved stuetemperatur og derefter vasket tre gange med steriliseret vand. Dissekere, kultur og vedligeholde hippocampus neuroner som i trin 1.1.1, 1.1.2 og 1.1.3, hhv.
- Forbered en høj K + stimulation løsning med HRP som 31,5 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 90 mM KCl, 25 mM HEPES (pH 7,4), 30 mM glukose, 2 mM MgCl 2, 0,01 mM CNQX, 0.05 mM AP5 og 5 mg/mL HRP, derefter justeres til pH 7,4 med 5 M NaOH.
- Stimulate hippocampus neuron kultur med 1,5 mL høj K + stimulation løsning ved stuetemperatur (refereret til som K +) ved tilsætning af 1,5 mL til hver brønd for 90 s. I den hvilende tilstand (benævnt Rasmussen), gælder de samme koncentration på 5 mg/mL HRP for 90 s, men med normale saltopløsning. For eksemplet recovery anvender høj K + stimulation løsning som med eksemplet K + og derefter hurtigt vaske og udskifte med normale saltvand og inkuberes i 10 min.
- Fiksering og farvning
- forberede 0,1 M Na cacodylate buffer ved hjælp af 21.4 g/L Na cacodylate ved pH 7,4. Fix celler med 4% glutaraldehyd i 0,1 M Na cacodylate buffer i mindst 1 time ved stuetemperatur. Vaskes tre gange med 0,1 M Na cacodylate buffer i 7 min..
- Udarbejde Diaminobenzidine (DAB) løsning, består af 0,5 mg/mL ISING med 0,3% H 2 O 2 i ddH 2 O og filter med 0,22 µm filter. Anvende 1,5 mL DAB løsning for 30 minutter ved 37 ° C. vaskes tre gange med 0,1 M Na cacodylate buffer i 7 min..
Forsigtig: DAB er giftige og formodede kræftfremkaldende. Brug handsker og lab frakker.
Bemærk: Mærkning med DAB opstår på grund af dets oxidation af H 2 O 2, som katalyseres af HRP. Små stigninger i komponenter resulterer i en øget signal i prøven. Øger koncentrationen af HRP fremskynder effekten af katalysatoren. Tilstrækkeligt store koncentrationer af H 2 O 2 mulighed for invaliderende side reaktioner med HRP, hæmmende virkning af mærkning 32. I dette arbejde, koncentrationen af denne mærkning system blev valgt på grundlag af foreliggende forskning 33 , 34. - Ruger neuroner med 1,5 mL 1% OsO 4 i 0,1 M Na cacodylate buffer i 1 time ved 4 ° C som post fiksering. Vaskes tre gange med 1,5 mL af 0,1 M Na cacodylate buffer i 7 min..
Advarsel: På grund af toksicitet og reaktivitet af OsO 4, holde prøve på ice i en kemisk hætte er at foretrække i mange tilfælde at bruge et køleskab til inkubation. - Forbered 0,1 M natrium acetat buffer med 13.61 g/L natrium acetat og 11,43 mL/L iseddike ved pH 5,0. Vaskes tre gange med 1,5 mL 0,1 M acetat buffer på pH 5,0 i 7 min og inkuberes med 1,5 mL 1% uranyl acetat i 0,1 M acetat buffer på pH 5,0 for 1 h på 4 ° C. Wash tre gange med 1,5 mL 0,1 M acetat buffer i 7 min..
- Epoxy indlejring
- dehydrere neuron kultur med enkelt 1,5 mL vasker 50%, 70% og 90% ethanol, for 7 min på hver og derefter 3 vasker 1,5 mL 100% ethanol i 7 min. i et stinkskab.
- Mix 485 mL/L bisphenol-A-(epichlorhydrin) epoxy harpiks, 160 mL/L dodecenyl ravsyre anhydrid (DDSA), 340 mL/L Methyl-5-Norbornene-2,3-dicarboxylsyrer eddikesyreanhydrid (NMA) og 15 mL/L 2,4,6-tris (dimethylaminomethyl) phenol (DMP-30) til at oprette epoxyen harpiks. Bland grundigt og derefter gemme under vakuum for at fjerne luftbobler.
Bemærk: Det er afgørende for at fjerne luftbobler i harpiks, især de mindre end synlige for det blotte øje, fordi de kan forårsage hulrum i harpiksen ved skæring. - Infiltrere prøven ved at erstatte ethanol med 50% epoxy harpiks i ethanol i 30 min. ved stuetemperatur på en shaker, derefter 70% epoxy harpiks i ethanol i 30 min. ved stuetemperatur på en shaker.
- Switch epoxy harpiks løsning med 100% epoxy-harpiks og inkuberes i 10 min. ved 50 ° C. Udfør to udvekslinger af frisk 100% epoxyharpiks med inkubationer for 1 h ved 50 ° C. Tilføj frisk 100% epoxy harpiks og lad det hærde ved 50 ° C natten over og derefter på 60 & #17 6; C for over 36 h til at hærde.
- Fjerne hver prøve fra muti-godt plade med en guldsmed ' s håndsav. Vælg regioner af interesse, tætte koncentrationer af celler, ved hjælp af en omvendt lysmikroskop, og derefter skære 70 til 80 nm blokke til skæring af mikrotomen. Montere regionen snit i mikrotomen chuck og indlæse mikrotomen. Placer chuck i mikrotomen og montere en diamantkniven med kanten parallelt med overfladen af blokken. Indsamle dele af 70 til 80 nm tykkelse direkte på individuelle gitre.
- Opløses uranyl acetat i vand til en 1% opløsning af vægt og opløses separat bly citrat i vand til en 3% opløsning af vægt. Counterstain i afsnit ved neddykning med 1% vandig uranyl acetat i 15 min og derefter 3% vandig bly citrat i 5 min at forbedre kontrasten i prøverne.
- EM imaging
- undersøge sektioner med et transmissions-elektronmikroskop og optage billeder med en CCD digitale kamera på en primær forstørrelse af 10.000-20, 000 X 3.
- Statistik
- udfører en t-test til at identificere væsentlige forskelle ved at sammenligne den middelværdi og standardafvigelse af måling (s.e.m.) mellem kontrol og eksperimentelle prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af metoden lipid carrier, blev SpH udtrykt i hippocampus neuroner, giver mulighed for identificering af boutons (figur 1a). Elektrisk stimulation af celler inducerede exocytose, og en tilsvarende stigning i fluorescens intensitet. Stigningen i fluorescens (ΔF) blev stoppet af slutter stimulus (figur 1b). Den øgede fluorescens blev efterfulgt af en langsom nedgang, på grund af endocytose. I tilfælde af VAMP2-pHluorin diffunderer VAMP2 langs axon fra en bouton efter stimulus4. De rå data anvendes arbitrære enheder, og var normaliseret til baseline til at opnå satsen af forfald og τ (figur 2a-c). Da målingerne blev foretaget fra en normaliseret spor, afspejler sats af forfald den oprindelige henfald af fluorescens i procentdelen af den maksimale ΔF pr. sekund (ΔF/s). I vores forsøgsbetingelser, endocytose (normalt længere end 10 s) var meget langsommere end reacidification (~ 3-4 s)4,5. Fluorescens henfald af pHluorin afspejler således, primært endocytose4,5. I præsynaptiske boutons, ΔF er større end axon undtagen bouton og begyndelsen tid-af-stigningen blev matchet med indledning af elektrisk stimulering. I axon undtagen bouton, ΔF var lavere i forhold til regioner med boutons og begynder gang af stigning blev forsinket i forhold til indledningen af elektriske stimulus (figur 2b). ΔF induceret i bouton og axon bortset fra bouton var 82,9 ± 9,0% (n = 5 forsøg) og 23,2 ± 4,0% (n = 5 forsøg), henholdsvis (figur 2b). ΔF af SpH henfaldet mono-eksponentielt med en τ 17,7 ± 0,3 (n = 5 forsøg) og 20.7 ± 0,2 (n = 4 eksperimenter) i 50 AP og 200 AP, henholdsvis (figur 1b). I 200 AP, τ var ikke signifikant forskellig, før eller efter normalisering med grundlinjen. I tilfælde af VAMP2-pHluorin transfekteret celler var udtryk af VAMP2-pHluorin højere end SpH (figur 3a-c). Spor af VAMP2-pHluorin blev også fremstillet ved normalisering til baseline (figur 3b).
EM blev udført i kulturperler neuroner og clathrin belagt vesikler blev undersøgt i forhold til kontrolprøver, som blev inkuberet med 5 mg/mL HRP for 90 s i mangel af stimulus (figur 4a-b). Clathrin belagt pitten blev observeret på en sandsynlighed på 0,05 pr. bouton i mangel af stimulus. Stimulation med høj K+ induceret bulk endosome og synaptiske vesikler optagelse, der blev identificeret ved HRP mærkning (figur 5a). Synaptiske vesikler blev defineret som blærer med en diameter mindre end 50 nm og bulk endosomes blev defineret som havende en diameter over 80 nm eller med en integrationskugle med mere end en 80 nm vesikel. Induceret bulk endosome udbredelse var faldet med opsving med normal saltvand (figur 5b).
Figur 1: billeder af SpH transfekteret neuroner og spor af SpH transfekteret celle svar til elektrisk stimulation. (en) en prøve billede af kulturperler hippocampus neuroner transfekteret med SpH af Liposom levering. SpH var stærkt udtrykt i boutons, præsenterer cirkel eller oval mønstre, med relativt lavere udtryk langs axon. Hvide felter viser ROI indeholdende boutons (1,5 x 1,5 µm). Skalalinjen: 20 µm. (b) svar af SpH transfekteret celler til et elektrisk stimulering af 50 AP på 20 Hz (n = 5 forsøg) eller 200 AP på 20 Hz (n = 4 eksperimenter). Hvert eksperiment blev baseret på 20-60 boutons. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: sats på tænderne og tau værdi for endocytose. (en) svar til 50 AP på 20 Hz blev konverteret fra arbitrære enheder til normaliseret spor (n = 5). Fluorescens ændring var normaliseret til grundlinjen. Dette tal er blevet ændret fra Wu et al., 20163. (b) normaliseret svar til 200 AP på 20 Hz i boutons (sort, n = 4 eksperimenter, venstre panel) og axon undtagen bouton (rød, n = 4 eksperimenter, venstre panel). Fluorescens ændring var normaliseret til grundlinjen. Stiplet boks er forstørret i højre panel. (c) brug af normaliserede baseline, henfald eller τ blev beregnet i 50 AP (n = 5 forsøg) og 200 AP (n = 4 eksperimenter) på 20 Hz. Før beregning, var ΔF normaliseret til 100%. Τ af endocytose blev indhentet fra normaliserede spor mellem tidspunktet for maksimal fluorescens og slutningen af eksperiment. Sats på tænderne (mean + s.e.m., øverste panel) og τ (mean + s.e.m., nederste panel) induceret af 50 AP og 200 AP. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: billeder af VAMP2-pHluorin transfekteret neuroner og eksempler på spor. (en) A prøve billede af kulturperler hippocampus neuroner transfekteret med VAMP2-pHluorin af Liposom levering. Hvide felter viser ROI indeholdende boutons (1,5 x 1,5 µm). Skalalinjen: 20 µm. (b) spor for VAMP2-pHluorin svar på 200 AP på 20 Hz (n = 4 eksperimenter). Fluorescens ændring var normaliseret til grundlinjen. (c) Fbase (a.u.) (mean + s.e.m.) i VAMP2-pHluorin (n = 4 eksperimenter) og SpH (n = 7 eksperimenter) transfekteret boutons. **, p < 0,01. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: billeder af EM i præsynaptiske terminal. (en) Synaptic vesikler blev vist i kulturperler hippocampus neuroner ved hjælp af EM. Dette tal er blevet ændret fra Wu et al., 20163. Skalalinjen = 200 nm. (b) Magnified billede viser clathrin belagt pitten. Skalalinjen: 50 nm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: billeder af præsynaptiske terminal i stimuleret neuroner med høj kalium. (en) EM billeder af neuroner. Cellerne blev fastsat uden stimulus (R), umiddelbart efter stimulation med 90 mM KCl for 90 s der indeholder opløselige HRP (K+), eller efter stimulation og derefter inkuberes i 10 min i normal saltvand. Dette tal er blevet ændret fra Wuet al., 20163. Skalalinjen = 200 nm. (b) i forhold til kontrol, HRP (-) synaptiske vesikler var faldet og HRP (+) vesikler blev forhøjet med KCl. Bulk endosome udbredelse var fremkaldt af KCl og gradvist faldt med recovery (mean + s.e.m., hver gruppe var fra 40-100 synaptic profiler). * p < 0,1; ** p < 0,01, væsentligt at hvile; ##p < 0,01, betydelig til K+. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her viser vi to metoder til overvågning af synaptic vesikel endocytose. I den første metode overvåget vi pHluorin sammenvokset med en synaptic vesikel protein i transfekteret neuroner og efterfølgende elektrisk stimuleret. For det andet, vi brugte EM imaging HRP optagelse som induceret af KCl. Vi brugte forskellige stimuli af to grunde. Første, høj kalium ansøgning inducerer depolarisering af alle neuroner i kulturen. Dette letter EM undersøgelse, eftersom at vores EM metode ikke kunne skelne mellem ikke-stimuleret og stimuleret neuroner. Andet, ultra-strukturelle morfologiske ændringer observeret mere pålideligt efter intens stimulering, såsom høj kalium stimulation, hvorimod pHluorin fluorescens ændringer ses efter et kort tog handling potentialer eller endda en enkelt handling potentiale.
Lysmikroskopi imaging ved hjælp af pHluorin viser synaptic vesikel protein fusion og optagelse med høj tidsmæssige opløsning i levende celler. Det kan bruges til at studere mekanismer, der regulerer endocytose tidsforløb og størrelsen af synaptic vesikel swimmingpools. pHluorin imaging er ikke kun blevet brugt til overvågning synaptic protein endocytose, men også for overvågning evoked eller spontan enkelt vesikel frigivelse, kortsigtede synaptisk plasticitet, og til måling af frigivelse sandsynlighed35. Ved hjælp af pHluorin har vist, at synaptic vesikulære protein puljer bliver frigivet ikke er de samme som dem, der bliver hentet36,37. For nylig, pHluorin sammenvokset med synaptic proteiner blev anvendt til at opdage skæbne af nyligt sammenvoksede vesikler38, og bulk endocytose39. Derfor er pHluorin sammenvokset med en synaptic protein et værdifuldt redskab til at studere exocytose og endocytose i levende synapser.
Begrænsning af denne teknik er, at henfald af fluorescens-intensiteten afspejler ikke blot endosomes, men også vesikulære re forsuring. Disse to komponenter kunne potentielt være adskilt af behandling med bafilomycin, en hæmmer af V-ATPase10,40. Derudover afspejler fluorescens stigning i elektrisk stimulation net resultatet af exocytose og endocytose. Selvom pHluorin imaging ikke kunne registrere membran invagination, kan denne begrænsning overvindes ved hjælp af andre teknikker, især EM.
I EM, kraftigt stimuleret celler viste øget HRP-positive synaptiske vesikler og bulk endosomes. Disse bulk endosomes gradvist forsvandt af derefter regenerere i synaptiske vesikler24. Denne teknik viser synaptic vesikel optagelse ved at afsløre ultrastruktur i den præsynaptiske terminal i både kontrol- og stimuleret celler. En ulempe at denne teknik er at vurdere synaptic vesikel optagelse i faste celler i stedet for levende celler. Desuden muligheden for fiksativ induceret artefakt ikke kan udelukkes. Kendte artefakter der påvirker membranen omfatter blebbing, membran erosion og protein ændringer41. Disse forskelle fra de naturligt forekommende tilstand af en celle er en iboende vedrører alle former for visualisering celler, og særlig opmærksomhed til EM data præsenteret for at vurdere muligheden for sådanne artefakter41,42 ,43. Mens denne teknik alene ikke kan vise funktionelle skaber endocytose af synaptic proteiner, kombinerer det med lysmikroskopi, der kan levere live billeder af endocytose proces, et mere fuldstændigt overblik over denne cellulære mekanisme.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi takke Dr. Yong-Ling Zhu for at give synaptophysin-pHluorin2x konstruktion, og Dr. James E. Rothman for at give VAMP2-phluorin. Vi takker Dr. Susan Cheng og Virginia Crocker af NINDS elektronmikroskopi facilitet for deres tekniske support og hjælp. Dette arbejde blev støttet af National Institute for neurologiske forstyrrelser og slagtilfælde murene Research Program i USA og et tilskud fra KRIBB Research initiativ Program (koreansk Biomedical videnskabsmand Fellowship Program), Korea Research Institute af Biovidenskab og bioteknologi, Republikken Korea.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine LTX with Plus | Thermo Fisher | 15338-100 | Transfection of plasmid DNA including synaptophysin or VAMP2-pHluorin |
| neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103-049 | Growth medium for neuron, Warm up to 37°C before use |
| B27 | Thermo Fisher | 17504-044 | Gradient for neuronal differentiation |
| Glutamax | Thermo Fisher | 35050-061 | Gradient for neuronal culture |
| Poly-D-Lysine coated coverslip | Neuvitro | GG-25-pdl | Substrate for neuronal growth and imaging of pHluorin |
| Trypsin XI from bovine pancrease | Sigma | T1005 | Neuronal culture-digest hippocampal tissues |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025 | Neuronal culture-inhibits viscous cell suspension |
| pulse stimulator | A-M systems | model 2100 | Apply electrical stimulation |
| Slotted bath with field stimulation | Warner Instruments | RC-21BRFS | Apply electrical stimulation |
| stimulus isolation unit | Warner Instruments | SIU102 | Apply electrical stimulation |
| lubricant | Dow corning | 111 | pHluorin imaging-seal with coverslip and imaging chamber, avoid leak from chamber |
| AP5 | Tocris | 3693 | Gradient for normal saline, selective NMDA receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity |
| CNQX | Tocris | 190 | Gradient for normal saline, competitive AMPA/kainate receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity |
| Illuminator | Nikon | C-HGFI | Metal halide light source for pHluorin |
| EMCCD camera | Andor | iXon3 | pHluorin imaging, detect pHluorin fluorescence intensity |
| Inverted microscopy | Nikon | Ti-E | Imaging for synaptophysin or VAMP2 pHluorin transfected cells |
| NIS-Elements AR | Nikon | NIS-Elements Advanced Research | Software for imaging acquisition and analysis |
| Igor Pro | WaveMetrics | Igor pro | Software for imaging analysis and data presentation |
| imaging chamber | Warner Instruments | RC21B | pHluorin imaging, apply field stimulation on living cells |
| poly-l-lysine | Sigma | P4832 | Electron microscopy, substrate for neuronal growth, apply on multiwell plate for 1 h at room temperature then wash with sterilized water 3 times |
| Horseradish peroxidase(HRP) | Sigma | P6782 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by catalyzing DAB in presence hydrogen peroxide, final concentration is 5 mg/mL in normal saline, make fresh before use |
| Na cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | Electron microscopy, buffer for fixatives and washing, final concentration is 0.1 N |
| 3,3′-Diaminobenzidine(DAB) | Sigma | D8001 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles, substrate for HRP, final concentration is 0.5 mg/mL in DDW and filtered, make fresh before use |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma | H1009 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by inducing HRP-DAB reaction, final concentration is 0.3% in DDW, make fresh before use |
| glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16365 | Electron microscopy, fixatives, final concentration is 4% in Na-cacodylate buffer, make fresh before use, shake well before to use |
| TEM | JEOL | 200CX | Electron microscopy, imaging of endocytosed vesicles and ultrastructural changes |
| CCD digital camera | AMT | XR-100 | Electron microscopy, capturing images |
| Lead citrate | Leica microsystems | 16707235 | Electron microscopy, grid staining |
References
- Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system. Nature cell biol. 2 (4), 197-204 (2000).
- Sun, T., Wu, X. S., et al. The role of calcium/calmodulin-activated calcineurin in rapid and slow endocytosis at central synapses. J Neurosci. 30 (35), 11838-11847 (2010).
- Wu, X. -S. S., Lee, S. H., et al. Actin Is Crucial for All Kinetically Distinguishable Forms of Endocytosis at Synapses. Neuron. 92 (5), 1020-1035 (2016).
- Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51 (6), 773-786 (2006).
- Atluri, P. P., Ryan, T. A. The kinetics of synaptic vesicle reacidification at hippocampal nerve terminals. J Neurosci. 26 (8), 2313-2320 (2006).
- Royle, S. J., Granseth, B., Odermatt, B., Derevier, A., Lagnado, L. Imaging phluorin-based probes at hippocampal synapses. Methods Mol Biol. 457, 293-303 (2008).
- Moulder, K. L., Mennerick, S. Reluctant vesicles contribute to the total readily releasable pool in glutamatergic hippocampal neurons. J Neurosci. 25 (15), 3842-3850 (2005).
- Li, Z., Burrone, J., Tyler, W. J., Hartman, K. N., Albeanu, D. F., Murthy, V. N. Synaptic vesicle recycling studied in transgenic mice expressing synaptopHluorin. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (17), 6131-6136 (2005).
- Morris, R. G. Elements of a neurobiological theory of hippocampal function: the role of synaptic plasticity, synaptic tagging and schemas. Eur J Neurosci. 23 (11), 2829-2846 (2006).
- Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Calcium accelerates endocytosis of vSNAREs at hippocampal synapses. Nat Neurosci. 4 (2), 129-136 (2001).
- Balaji, J., Armbruster, M., Ryan, T. A. Calcium control of endocytic capacity at a CNS synapse. J Neurosci. 28 (26), 6742-6749 (2008).
- Ferguson, S. M., Brasnjo, G., et al. A selective activity-dependent requirement for dynamin 1 in synaptic vesicle endocytosis. Science. 316 (5824), 570-574 (2007).
- Baydyuk, M., Wu, X. S., He, L., Wu, L. G. Brain-derived neurotrophic factor inhibits calcium channel activation, exocytosis, and endocytosis at a central nerve terminal. J Neurosci. 35 (11), 4676-4682 (2015).
- Wu, X. S., Zhang, Z., Zhao, W. D., Wang, D., Luo, F., Wu, L. G. Calcineurin is universally involved in vesicle endocytosis at neuronal and nonneuronal secretory cells. Cell Rep. 7 (4), 982-988 (2014).
- Zhang, Z., Wang, D., et al. The SNARE proteins SNAP25 and synaptobrevin are involved in endocytosis at hippocampal synapses. J Neurosci. 33 (21), 9169-9175 (2013).
- Wu, L. -G. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -C. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annu Rev Physiol. 76 (1), 301-331 (2014).
- Daniele, F., Di Cairano, E. S., Moretti, S., Piccoli, G., Perego, C. TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to evaluate neurotransmitter vesicle dynamics in SH-SY5Y neuroblastoma cells: cell imaging and data analysis. J Vis Exp. (95), e52267 (2015).
- Shaner, N. C., Lin, M. Z., et al. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nat Methods. 5 (6), 545-551 (2008).
- Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat Neurosci. 15 (7), 1047-1053 (2012).
- Leitz, J., Kavalali, E. T. Fast retrieval and autonomous regulation of single spontaneously recycling synaptic vesicles. Elife. 3, e03658 (2014).
- Bisht, K., El Hajj, H., Savage, J. C., Sánchez, M. G., Tremblay, M. -È Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with β-Amyloid Plaques. J Vis Exp. (112), e54060 (2016).
- Schikorski, T. Monitoring Synaptic Vesicle Protein Sorting with Enhanced Horseradish Peroxidase in the Electron Microscope. High-Resolution Imaging of Cellular Proteins: Methods and Protocols. , 327-341 (2016).
- Kononenko, N. L., Puchkov, D., et al. Clathrin/AP-2 mediate synaptic vesicle reformation from endosome-like vacuoles but are not essential for membrane retrieval at central synapses. Neuron. 82 (5), 981-988 (2014).
- Wu, Y., O'Toole, E. T., et al. A dynamin 1-, dynamin 3- and clathrin-independent pathway of synaptic vesicle recycling mediated by bulk endocytosis. eLife. 2014 (3), e01621 (2014).
- Heuser, J. E., Reese, T. S. Evidence for recycling of synaptic vesicle membrane during transmitter release at the frog neuromuscular junction. J Cell Biol. 57 (2), 315-344 (1973).
- Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. Turnover of transmitter and synaptic vesicles at the frog neuromuscular junction. J Cell Biol. 57 (2), 499-524 (1973).
- Watanabe, S., Rost, B. R., et al. Ultrafast endocytosis at mouse hippocampal synapses. Nature. 504 (7479), 242-247 (2013).
- Watanabe, S., Trimbuch, T., et al. Clathrin regenerates synaptic vesicles from endosomes. Nature. 515 (7526), 228-233 (2014).
- Sankaranarayanan, S., Atluri, P. P., Ryan, T. A. Actin has a molecular scaffolding, not propulsive, role in presynaptic function. Nat Neurosci. 6 (2), 127-135 (2003).
- Zhu, Y., Xu, J., Heinemann, S. F. Two pathways of synaptic vesicle retrieval revealed by single-vesicle imaging. Neuron. 61 (3), 397-411 (2009).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Arnao, M. B. B., Acosta, M., del Rio, J. A. A., García-Cánovas, F. Inactivation of peroxidase by hydrogen peroxide and its protection by a reductant agent. Biochim Biophys Acta. 1038 (1), 85-89 (1990).
- Deák, F., Schoch, S., et al. Synaptobrevin is essential for fast synaptic-vesicle endocytosis. Nat Cell Biol. 6 (11), 1102-1108 (2004).
- Clayton, E. L., Evans, G. J. O., Cousin, M. A. Bulk synaptic vesicle endocytosis is rapidly triggered during strong stimulation. J Neurosci. 28 (26), 6627-6632 (2008).
- Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. Visualizing presynaptic function. Nat Neurosci. 17 (1), 10-16 (2014).
- Wienisch, M., Klingauf, J. Vesicular proteins exocytosed and subsequently retrieved by compensatory endocytosis are nonidentical. Nat Neurosci. 9 (8), 1019-1027 (2006).
- Fernández-Alfonso, T., Kwan, R., Ryan, T. A. Synaptic vesicles interchange their membrane proteins with a large surface reservoir during recycling. Neuron. 51 (2), 179-186 (2006).
- Gimber, N., Tadeus, G., Maritzen, T., Schmoranzer, J., Haucke, V. Diffusional spread and confinement of newly exocytosed synaptic vesicle proteins. Nat Commun. 6, 8392 (2015).
- Nicholson-Fish, J. C., Smillie, K. J., Cousin, M. A. Monitoring activity-dependent bulk endocytosis with the genetically-encoded reporter VAMP4-pHluorin. J Neurosci Methods. 266, 1-10 (2016).
- Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nat Protoc. 1 (6), 2970-2978 (2006).
- Wisse, E., Braet, F., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World journal of gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing Photodamage in Live-Cell Microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
- Søndergaard, C. R., Garrett, A. E., et al. Structural artifacts in protein-ligand X-ray structures: implications for the development of docking scoring functions. J Med Chem. 52 (18), 5673-5684 (2009).
