Summary
Synaptiskt vesikelprotein endocytos upptäcks genom ljusmikroskop av pHluorin smält med synaptiskt vesikelprotein protein och elektronmikroskopi av vesikler upptag.
Abstract
Under endocytos hämtas smält synaptiska vesikler på nerv terminaler, möjliggör vesikler återvinning och därmed underhållet av synaptisk transmission under repetitiva nerv bränning. Nedsatt endocytos i patologiska förhållanden leder till minskningar i synaptisk styrka och hjärnans funktioner. Här, beskriver vi metoder som används för att mäta synaptiskt vesikelprotein endocytos på däggdjur Hippocampus synapsen i neuronala kultur. Vi övervakas synaptiskt vesikelprotein protein endocytos av fusing en synaptisk vesikulär membranprotein, inklusive synaptophysin och VAMP2/synaptobrevin, på vesikulär lumenal sida, med pHluorin, en pH-känsliga grönt fluorescerande protein som ökar dess fluorescensintensiteten som pH ökar. Under exocytos, vesikulär lumen pH ökar, medan under endocytos vesikulär lumen pH är åter försurade. Således visar en ökning med pHluorin fluorescensintensiteten fusion, medan en minskning visar endocytos av proteinet märkta synaptiskt vesikelprotein. Förutom att använda metoden pHluorin imaging för att registrera endocytos, övervakas vi vesikulär membran endocytos av elektronmikroskopi (EM) mätningar av pepparrotperoxidas (HRP) upptag av blåsor. Slutligen, vi övervakas bildandet av nerv terminal membran gropar vid olika tidpunkter efter höga kalium-inducerad depolarisation. Tidsförloppet för HRP upptag och membran grop bildas anger tidsförloppet för endocytos.
Introduction
Neurotransmittorer lagras i synaptiska vesikler och släppt genom exocytos. Den synaptiska vesikler membran protein är sedan internaliseras genom endocytos och återanvändas i nästa omgång av exocytos. Endocytos av synaptiska vesikler är viktiga för att upprätthålla synaptiskt vesikelprotein pooler och tar bort utskjutande blåsor plasmamembranet. Den pH-känsliga grönt fluorescerande protein pHluorin, som härdas under sura förhållanden och dequenched i neutralt pH, har använts för att mäta endocytos tid kurser i levande celler1,2,3. Proteinet pHluorin är normalt kopplad till den lumenal sidan av synaptiska vesikelproteinet proteiner, såsom synaptophysin eller VAMP2/synaptobrevin. I vila, är pHluorin härdas i 5,5 pH lumen av synaptiska vesikler. Vesikler fusion till plasmamembranet exponerar vesikulär lumen till extracellulära lösningen där pH är ~ 7.3, vilket resulterar i en ökning pHluorin fluorescens. Efter exocytos, ökad fluorescensen sönderfaller, på grund av endocytos av synaptiska vesikelproteinet proteiner följt av vesikler re försurning inom dessa återvunna blåsor. Även om sönderfallet återspeglar både endocytos och vesikulär re försurning, återspeglar det mestadels endocytos, eftersom förnyad försurning är snabbare än endocytos i de flesta villkor1,4. Tidskonstanten re försurning är 3-4 s eller mindre5,6, som är i allmänhet snabbare än 10 s eller mer krävs för vesikler endocytos4,5. Om experiment behövs för att särskilja endocytos från Re försurning, kan sura släcka experiment med hjälp av 4-Morpholineethanesulfonic acid (MES) lösning (25 mM) med ett pH på 5,5 användas att avgöra huruvida synaptiskt vesikelprotein proteiner är Hämtad från plasmamembranet via endocytos1,3,4. Således pHluorin fluorescens intensitet ökningen speglar en balans av exo- och endocytos, och minskningen efter nervstimulering specifikt återspeglar endocytos.
pHluorin imaging kan användas inte bara för att mäta tid kursen av endocytos, men även storleken på synaptiskt vesikelprotein pool7,8, och sannolikheten för evoked release och spontana släppa9. Många faktorer och proteiner involverade i regleringen av endocytos, såsom kalcium, lösliga NSF-attachment protein receptor (SNARA) proteiner, hjärnan som härrör neurotrofa factor(BDNF) och kalcineurinhämmare har identifierats med hjälp av pHluorin imaging1 , 2 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16. Dessutom frisättning av signalsubstansen kunde detekteras i inte bara primära nervceller men i neuroblastomceller med TIRFM17. Nyligen, pHluorin varianter, dsRed, mOrange och pHTomato har utvecklats för att övervaka samtidiga inspelningar av flera faktorer i en enda synaps18,19. Exempelvis har pHTomato smält med synaptophysin och används med en genetiskt kodade kalcium indikator (GCaMP5K) för att övervaka presynaptiska vesikler fusion och Ca2 + tillströmning i postsynaptiska fack20. PHluorin bifogas synaptic proteiner ger därför en användbar metod för att analysera förhållandet mellan endocytos och exocytos.
EM är en annan metod som vanligen används för att studera endocytos, på grund av den hög rumslig upplösning som visar ultrastrukturella ändringar under endocytos. Två allmänna områden är förmågan att visualisera patologiska förändringar inom neuronala celler21 och spåra vesikler proteiner22. I synnerhet observationen av synaptiska vesikelproteinet upptag, membran krökning belagd med clathrin i den periactive zonen, och endosomal strukturer är möjligt med EM3,23,24,25 ,26,27,28. Även EM innebär potentiella artefakter som fixativ-inducerad missbildningar, som kan påverka endocytos och dataanalys är arbetsintensivt, resolutionen ger en attraktiv möjlighet att visualisera cellstruktur. Potentiella fixativ problem och begränsningar i EM temporal upplösning kan övervinnas genom högt tryck frysning, vilket ger en snabb och icke-kemiska metod att stabilisera de känsliga strukturerna som är närvarande under endocytos27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Obs: följande protokoll beskriver pHluorin avbildningsmetoder och EM-metoder som används i odlade Hippocampus neuroner. pHluorin bildskärmar synaptiskt vesikelprotein protein upptag i levande celler och EM upptäcker upptag av synaptiska vesikelproteinet och ultrastrukturella förändringar.
djurvård och förfarande följs NIH riktlinjer och godkändes av NIH djur vård och användning kommittén.
1. pHluorin Imaging
- Hippocampus neuron kultur
- Förbered Hippocampus buffert (HB) genom att kombinera 4 mM NaHCO 3 och 5 mM HEPES och justera till pH 7,3 med 5 M NaOH. Gör odlingsmediet genom att blanda neurobasal medium, 2% B27, 0,5 mM L-glutamin och 1% penicillin-streptomycin. Dessutom, förbereda en blandning av HB buffert med 20% fetalt bovint Serum (HB/20% FBS).
Obs: Denna culturing protokollet är baserat på Jessica, o.a. 29 och Wu o.a. 24 - halshugga musungar mellan postnatal dag 0 till dag 2 i odlingsmedium och extrahera hjärnan till 4 ° C HB/20% FBS. Ta bort hjärnstammen och thalamus att exponera hippocampi. Dissekera ut hippocampi, efter utsätta det genom avlägsnande av hjärnstammen och thalamus, och överföra till färska 4 ° C HB/20% FBS.
Obs: Avkastning är vanligtvis cirka 4 x 10 5 celler/mL för en pup (två hippocampi). Rensa bort de vidhängande membran med hjälp av pincett eller sax, sedan överföra till färska 4 ° C HB/20% FBS. Rulla den dentate gyrus och isolera subiculum genom att skära med sax och sedan överföra till färska 4 ° C HB/20% FBS. - Dela upp varje hippocampus, genom att skära från början till slut, i ca 10 skivor och överföra dem till en 15 mL polypropylen koniska rör.
- Efter att vävnaden att bosätta sig, tvätta med 10 mL HB/20% FBS och sedan tvätta tre gånger med 10 mL HB.
- Förbereda matsmältningen lösning av 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 7 mM Na2HPO 4 och 25 mM HEPES och justera till pH 7,2 med 5 M NaOH. Ta bort supernatanten från hippocampi. Lägg 10 mg av trypsin och 1 mg av DNAS 2 ml av matsmältningen lösning och filtrera genom ett sterilt 0,22 µm membran direkt på prov pelleten.
- Inkubera i hippocampi under 5 minuter vid 37 ° C, och sedan tvätta två gånger med 10 mL HB/20% FBS och tvätta sedan en gång med 10 mL HB.
- Dissociera cellerna med 6 mg MgSO 4 ∙ 7 H 2 O och 1 mg av DNAS till 2 mL HB och sterila filter på hippocampi pellet genom en steril 0,22 µm filter. Försiktigt separera celler genom försiktig triturating, samtidigt som att undvika att införa luftbubblor. Tillåta vävnad partiklar sedimentera i 2 min och sedan långsamt överför supernatanten till en annan tube.
- Add 3 mL HB/20% FBS cellsuspension, och centrifugera eller 10 min vid 4 ° C och 1 000 rpm. Avlägsna supernatanten och återsuspendera i odlingsmedium.
- Plattan 60.000 celler upphängd i 150 µL odlingsmedium på ett Poly-D-lysin belagda 25 mm diameter täckglas, utan spill utanför täckglaset. Tillsätt 2 mL av pre värmde odlingsmedium 2 h efter bordläggningen. COVERSLIPS underhålls i 6-väl odla plattor eller steril petriskålar.
- Underhåll celler vid 37 ° C i en 5% CO 2 tilluften inkubator i odlingsmedium för 14-21 dagar före inspelning. Under tillväxten av kultur, ändra den övre halvan av medium två gånger i veckan.
- Förbered Hippocampus buffert (HB) genom att kombinera 4 mM NaHCO 3 och 5 mM HEPES och justera till pH 7,3 med 5 M NaOH. Gör odlingsmediet genom att blanda neurobasal medium, 2% B27, 0,5 mM L-glutamin och 1% penicillin-streptomycin. Dessutom, förbereda en blandning av HB buffert med 20% fetalt bovint Serum (HB/20% FBS).
- Transfektionsprotokoll
- 6-7 dagar efter plätering, transfect synaptophysin-pHluorin 2 X (SpH) eller VAMP2-pHluorin till Hippocampus nervceller. För SpH, använda en Cytomegalovirus (CMV) arrangören, infogas en pcDNA3 vector 30. För VAMP2-pHluorin, använda en CMV promotor infogas en pCI vektor 31.
- Transfect antingen vektor av lipid carrier in målceller, använda 1 µg av plasmid. Använda odlingsmedium från protokollet steg 1.1.1, som saknar serum, för transfection. Ändra mediet 2 h efter transfection att minska toxicitet.
Obs: Vid låg uttryck för SpH i knappar, öka DNA koncentrationen till 2 µg eller inkubationstiden med lipid transportören, om inte cellerna är ohälsosam. Normalt 4-10 celler (0,006-0,008%) av nervceller var transfekterade.
- Ljusmikroskop
- Förbered normal koksaltlösning består av 119 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 2,5 mM KCl, 25 mM HEPES (pH 7,4), 30 mM glukos, 2 mM MgCl 2, 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione () 0,01 mM CNQX), och 0,05 mM DL-2-amino-5-phosphonovaleric acid (AP5). Ta ett täckglas från odlingssubstratet plattan och plats på en tänkbar kammare som tillåter fält stimulering, med smörjmedel och tätningsmedel för att undvika läckage. Undvika att låta glaset torr under överföringen av ett täckglas från plattan till kammaren genom att omedelbart lägga 750 µL normal koksaltlösning.
Obs: CNQX och AP5 användes att blockera postsynaptiska aktivitet, som har potential för återkommande aktivitet. Innan du placerar en kammare på en inverterad fluorescens Mikroskop, Använd rengöring vävnad för att bekräfta att kammaren inte läcker. Långsam läcker orsakar fokus förändringar under inspelningen av blandning av normal koksaltlösning och nedsänkning olja, vilket resulterar i förändringar i brytningsindex. - Stimulering och inspelning
- bild på en inverterad widefield Mikroskop med en 60 X (1,4 numerisk bländare) oljeimmersion lins med en metallhalidlampor lampa. Visualisera pHluorin med ett filter för en magnetisering topp 480 nm, en 490 nm lång pass spegel, en 500-550 nm utsläpp filter och en manuell flip slutare. Fånga bilder varje 100 ms, med 2 x 2 binning, använda en elektron att multiplicera kostnad kopplad enhet (elektrisk) kamera.
Obs: Flera funktioner bör anses uppnå rätt förutsättningar för att undvika fotoblekning, inklusive bild fånga intervallet, och filtrera och binning, som är beroende av utrustning. När det gäller confocal imaging övervägas laser effekt och exponering tid att undvika fotoblekning. Setup bestämdes efter inspelningen minst 3 min utan stimulans och inspelningen utfördes minst 10 s utan stimulans kontrollera för fotoblekning. - Välja ett område med hög täthet av knappar för enkel analys i varje experiment. Identifiera transfekterade celler genom deras grön fluorescens signal, med betoning på runda eller ovala uttrycksmönster bouton och kontinuerlig uttryck mellan knappar.
- Framkalla endocytos av fält stimulering med en 1 ms puls, 20 mA aktionspotential (AP) levereras från en puls stimulator och levereras via en platina elektrod inom stimulans isolering enhet. Bild fluorescens aktivitet under loppet av stimulering och under cell återhämtning.
Obs: När det gäller döda celler, uttryck var starkare än levande knappar och visade ett ojämnt mönster mellan knappar.
- bild på en inverterad widefield Mikroskop med en 60 X (1,4 numerisk bländare) oljeimmersion lins med en metallhalidlampor lampa. Visualisera pHluorin med ett filter för en magnetisering topp 480 nm, en 490 nm lång pass spegel, en 500-550 nm utsläpp filter och en manuell flip slutare. Fånga bilder varje 100 ms, med 2 x 2 binning, använda en elektron att multiplicera kostnad kopplad enhet (elektrisk) kamera.
- Förbered normal koksaltlösning består av 119 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 2,5 mM KCl, 25 mM HEPES (pH 7,4), 30 mM glukos, 2 mM MgCl 2, 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione () 0,01 mM CNQX), och 0,05 mM DL-2-amino-5-phosphonovaleric acid (AP5). Ta ett täckglas från odlingssubstratet plattan och plats på en tänkbar kammare som tillåter fält stimulering, med smörjmedel och tätningsmedel för att undvika läckage. Undvika att låta glaset torr under överföringen av ett täckglas från plattan till kammaren genom att omedelbart lägga 750 µL normal koksaltlösning.
- Bildanalys
- För att analysera fluorescensintensiteten i en enda bouton, ställa upp en Region av intresse (ROI) som en 1,5 x 1,5 µm kvadrat; storleken på en bouton är inom ca 1,5 µm. användning spår innan stimulering till check för fotoblekning och subtrahera som bakgrund.
- Normalisera fluorescens ändra (ΔF) med ekvationen:
där F max och F 0 hänvisar till maximal ökning efter stimulering och baslinjen fluorescens, respektive. Mäta endocytos priser som graden av förfall under första 4-10 s efter den högsta punkten av pHluorin fluorescens. Erhålla tidskonstanten (τ) av endocytos av passande pHluorin fluorescens förfalla från peak ökningen till baslinjen med en mono-exponentialfunktionen.
2. Elektronmikroskopi
- Förbered en Poly-D-lysin belagda 6-väl plattan genom att tillämpa 1,5 mL 0,01% steril-filtrerad Poly-D-lysin lösning till varje brunn för 1 h i rumstemperatur och sedan tvätta tre gånger med steriliserat vatten. Dissekera, kultur och underhålla Hippocampus nervceller som i steg 1.1.1, 1.1.2 och 1.1.3, respektive.
- Förbered en hög K + stimulering lösning med HRP som 31,5 mM NaCl, 2 mM CaCl 2, 90 mM KCl, 25 mM HEPES (pH 7,4), 30 mM glukos, 2 mM MgCl 2, 0,01 mM CNQX, 0,05 mM AP5 och 5 mg/mL HRP, sedan justera till pH 7,4 med 5 M NaOH.
- Stimulera Hippocampus neuron kulturen med 1,5 mL hög K + stimulering lösning vid rumstemperatur (kallad K +) genom tillsats av 1,5 mL till varje brunn för 90 s. I vilande tillstånd (kallad R), gäller samma koncentration på 5 mg/mL HRP för 90 s, men med normal saltlösning. För återhämtning provet, tillämpa hög K + stimulering lösning som med K + provet, sedan snabbt tvätta och ersätta med fysiologisk koksaltlösning och inkubera i 10 min.
- Fixering och färgning
- förbereda 0,1 M Na cacodylate buffert med 21,4 g/L Na cacodylate vid pH 7,4. Fixa celler med 4% glutaraldehyd i 0,1 M Na cacodylate buffert för minst 1 tim i rumstemperatur. Tvätta tre gånger med 0,1 M Na cacodylate buffert för 7 min varje.
- Förbereda Diaminobenzidin (DAB) lösning, består av 0,5 mg/mL badda med 0,3% H 2 O 2 i ddH 2 O och filter med 0,22 µm filter. Tillämpa 1,5 mL DAB lösning under 30 minuter vid 37 ° C. Tvätta tre gånger med 0,1 M Na cacodylate buffert för 7 min varje.
FÖRSIKTIGHET: DAB är giftiga och misstänkt cancerframkallande. Använd gärna handskar och lab rockar.
Obs: Märkning med DAB uppstår på grund av dess oxidation av H 2 O 2, som katalyseras av HRP. Små ökningar i komponenter resulterar i en ökad signal i provet. Öka koncentrationen av HRP snabbar upp effekten av katalysatorn. Tillräckligt stora koncentrationer av H 2 O 2 möjliggöra försvagande sidoreaktioner med HRP, att hämma effekten av märkning 32. I detta arbete, koncentrationerna av denna märkning system valdes utifrån tillgängliga forskning 33 , 34. - Inkubera nervceller med 1,5 mL 1% OsO 4 i 0,1 M Na cacodylate buffert för 1 h vid 4 ° C som post fixering. Tvätta tre gånger med 1,5 mL 0,1 M Na cacodylate buffert för 7 min varje.
Varning: På grund av toxicitet och reaktivitet OsO 4, hålla provet på is i en kemisk huva är att föredra i många fall till att använda ett kylskåp för ruvning. - Förbered 0,1 M natrium acetatbuffert med 13.61 HB natrium acetat och 11,43 mL/L isättika vid pH 5,0. Tvätta tre gånger med 1,5 mL 0,1 M acetatbuffert vid pH 5,0 för 7 min varje och inkubera med 1,5 mL 1% uranyl acetat i 0,1 M acetatbuffert vid pH 5,0 för 1 h vid 4 ° C. Wash tre gånger med 1,5 mL 0,1 M acetatbuffert för 7 min varje.
- Epoxi inbäddning
- torkar neuron kulturen med enda 1,5 mL tvättar av 50%, 70% och 90% etanol, för 7 min i varje och sedan 3 tvättar 1,5 mL 100% etanol för 7 min varje i ett dragskåp.
- Mix 485 mL/L bisphenol-A-(epichlorhydrin) epoxiharts, 160 mL/L dodecenyl succinic anhydride (DDSA), 340 mL/L metyl-5-norbornen-2,3-Dicarboxylic bauxit (NMA) och 15 mL/L 2,4,6-tris (Dimetylaminometyl) fenol (DMP-30) för att skapa epoxi harts. Blanda ordentligt och sedan lagra under vakuum för att avlägsna luftbubblor.
Obs: Det är viktigt att avlägsna luftbubblor i kådan, särskilt de som är mindre än synliga för blotta ögat, eftersom de kan orsaka karies i kådan under snittning. - Infiltrera provet genom att ersätta etanol med 50% epoxi harts i etanol i 30 min i rumstemperatur på en shaker, och sedan 70% epoxiharts i etanol i 30 min i rumstemperatur på en skakapparat.
- Switch epoxi harts lösning med 100% epoxiharts och inkubera i 10 min vid 50 ° C. utför två utbyten av färska 100% epoxiharts med inkubationer för 1 h vid 50 ° C. Lägg färska 100% epoxi harts och låt den härda vid 50 ° C över natten och sedan på 60 & #17 6. C för över 36 h härda.
- Bort varje prov från muti-väl plattan med en juvelerare ' s handsåg. Välj områden av intresse, täta koncentrationer av celler, med hjälp av ett inverterat ljusmikroskop, och sedan klippa 70 till 80 nm block för snittning av mikrotomen. Montera regionen skär i mikrotomen chucken och ladda mikrotomen. Placera chucken i mikrotomen och montera en diamant kniv med eggen parallell med ytan av blocket. Samla delar av 70-80 nm tjocklek direkt på enskilda nät.
- Lös uranyl acetat till vatten för en 1% lösning av vikt och lös separat bly citrat till vatten för en 3% lösning av vikt. Counterstain avsnitten genom nedsänkning med 1% vattenlösning uranyl acetat för 15 min och sedan 3% vattenlösning bly citrat för 5 min att förbättra kontrasten av proverna.
- EM imaging
- undersöka avsnitten med ett transmissionselektronmikroskop och spela in bilder med en digital CCD-kamera vid 10.000-20, 000 X 3 primära förstoring.
- Statistik
- utför ett t-test för att identifiera betydande skillnader genom att jämföra det medelvärdet och standardavvikelsen för mätning (s.e.m.) mellan kontroll och experimentprover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Använder metoden lipid carrier uttrycktes SpH i hippocampus nervceller, möjliggör identifiering av knappar (figur 1a). Elektrisk stimulering av cellerna inducerad exocytos, och en motsvarande ökning i fluorescensintensiteten. Ökningen av fluorescens (ΔF) stoppades av slutar stimulansen (figur 1b). Den öka fluorescensen följdes av en långsam minskning, på grund av endocytos. När det gäller VAMP2-pHluorin diffunderar VAMP2 längs axonet från en bouton efter stimulans4. Raw-data används godtyckliga enheter, och var normaliserade till baslinjen att få graden av förfall och τ (figur 2a–c). Eftersom mätningarna gjordes från en normaliserad trace, avspeglar graden av förfall inledande förfalla av fluorescens procentandel av den maximala ΔF per sekund (ΔF/s). I våra experimentella förhållanden, endocytos (oftast längre än 10 s) var mycket långsammare än reacidification (~ 3-4 s)4,5. Fluorescens förfalla av pHluorin återspeglar således primärt endocytos4,5. I presynaptiska knappar, ΔF är större än axon utom bouton och början tid-av-ökningen var matchade med inledandet av elektrisk stimulans. I axon utom bouton, ΔF var lägre jämfört med regioner med knappar och början tid-för-ökning var försenad jämfört med inledningen av elektrisk stimulans (figur 2b). ΔF inducerad i bouton och axon utom bouton var 82,9 ± 9,0% (n = 5 experiment) och 23,2 ± 4,0% (n = 5 experiment) respektive (figur 2b). ΔF av SpH skämda mono-exponentiellt med en τ 17,7 ± 0,3 (n = 5 experiment) och 20,7 ± 0,2 (n = 4 experiment) i 50 AP och 200 AP, respektive (figur 1b). I 200 AP, τ var inte signifikant före eller efter normalisering med baslinjen. När det gäller VAMP2-pHluorin transfekterade celler var uttryck av VAMP2-pHluorin högre än SpH (figur 3a–c). Spår av VAMP2-pHluorin erhölls också av normalisera till baslinjen (figur 3b).
EM var utförs i odlade nervceller och de clathrin belagda blåsor undersöktes i jämförelse med kontrollprover, som inkuberades med 5 mg/mL av HRP för 90 s i avsaknad av stimulans (figur 4a–b). Clathrin belagda gropar observerades vid en sannolikhet för 0.05 per bouton i avsaknad av stimulans. Stimulering med hög K+ inducerad synaptiska vesikler upptag, och bulk endosome som identifierades av HRP märkning (figur 5a). Synaptiska vesikler definierades som blåsor med en diameter mindre än 50 nm och bulk endosomes definierades som att ha en diameter över 80 nm eller med en cross sectional yta på mer än en 80 nm vesikler. Inducerad bulk endosome upptag minskade med återhämtning med fysiologisk koksaltlösning (Figur 5b).
Figur 1: bilder av SpH transfekterade nervceller och spår av SpH transfekterade cell Svaren till elektrisk stimulering. (en) ett prov bild av odlade Hippocampus nervceller transfekterade med SpH genom Liposom leverans. SpH uttrycktes mycket i knappar, presentera cirkel eller oval mönster, med relativt lägre uttrycket längs axonet. Vita rutorna ange ROI som innehåller knappar (1,5 x 1,5 µm). Skalstapeln: 20 µm. (b) svar i SpH transfekterade celler till en elektrisk stimulans av 50 AP vid 20 Hz (n = 5 experiment) eller 200 AP vid 20 Hz (n = 4 experiment). Varje experiment var baserad på 20-60 knappar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: graden av förfall och tau värde för endocytos. (en) Svaren till 50 AP vid 20 Hz konverterades från godtyckliga enheter till normaliserade spår (n = 5). Fluorescens förändring var normaliserade till baslinjen. Denna siffra har ändrats från Wu et al., 20163. (b), Normalized Svaren till 200 AP vid 20 Hz i knappar (svart, n = 4 experiment, vänster panel) och axon utom bouton (röd, n = 4 experiment, vänster panel). Fluorescens förändring var normaliserade till baslinjen. Streckad ruta förstoras i den högra panelen. (c) använda normaliserade baslinjen, andelen av röta eller τ beräknades i 50 AP (n = 5 experiment) och 200 AP (n = 4 experiment) vid 20 Hz. Före beräkning, var ΔF normaliserade till 100%. Τ av endocytos erhölls från normaliserade spår mellan tidpunkten för maximal fluorescens och slutet av experimentet. Graden av förfall (medelvärde + s.e.m., övre panelen) och τ (medelvärde + s.e.m., nedre panelen) induceras av 50 AP och 200 AP. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: bilder av VAMP2-pHluorin transfekterade nervceller och exempel på tracesna. (en) A exempelbild av odlade Hippocampus nervceller transfekterade med VAMP2-pHluorin av Liposom leverans. Vita rutorna ange ROI som innehåller knappar (1,5 x 1,5 µm). Skalstapeln: 20 µm. (b) spår för VAMP2-pHluorin svar till 200 AP vid 20 Hz (n = 4 experiment). Fluorescens förändring var normaliserade till baslinjen. (c), Fbas (a.u.) (medelvärde + s.e.m.) i VAMP2-pHluorin (n = 4 experiment) och SpH (n = 7 experiment) transfekterade knappar. **, p < 0,01. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: bilder av EM i presynaptiska terminal. (en) Synaptic blåsor visades i odlade Hippocampus nervceller med EM. Denna siffra har ändrats från Wu et al., 20163. Skalstapeln = 200 nm. (b) förstorad bild visar clathrin belagd gropar. Skalstapeln: 50 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: bilder av presynaptiska terminal i stimulerad nervceller med hög kalium. (en) EM bilder av nervceller. Cellerna var fast utan stimulans (R), omedelbart efter stimulering med 90 mM KCl för 90 s som innehåller lösliga HRP (K+), eller efter stimulering och sedan inkuberas i 10 min i fysiologisk koksaltlösning. Denna siffra har ändrats från Wuet al., 20163. Skalstapeln = 200 nm. (b) jämfört med att styra, HRP (-) synaptiska vesikler minskade och HRP (+) blåsor höjdes med KCl. Bulk endosome upptag var induceras av KCl och gradvis minskade med återhämtning (medelvärde + s.e.m., varje grupp var från 40-100 synaptic profiler). * p < 0,1; ** p < 0,01, betydande att vila; ##p < 0,01, betydande att K+. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här visar vi två metoder för att övervaka synaptiskt vesikelprotein endocytos. I den första metoden övervakas vi pHluorin smält med ett synaptiskt vesikelprotein protein i transfekterade nervceller och därefter elektriskt stimuleras. För det andra, vi använde EM avbildning av HRP upptag som induceras av KCl. Vi använde olika stimuli för två skäl. Först hög kalium ansökan framkallar depolarisation av alla nervceller i kulturen. Detta underlättar EM undersökning, med tanke på att vår EM-metod inte kan skilja mellan icke-stimulerad och stimulerade neuroner. Andra, Ultra strukturella morfologiska förändringar observerades mer tillförlitligt efter intensiv stimulering, till exempel höga kalium stimulering, medan pHluorin fluorescens förändringar kan observeras efter ett kort tåg av handlingspänningar eller ens en enda åtgärd potentialen.
Ljusmikroskop imaging använder pHluorin visar synaptiskt vesikelprotein protein fusion och upptag med hög temporal upplösning i levande celler. Det kan användas för att studera mekanismer som reglerar endocytos tid kursen och storleken på synaptiskt vesikelprotein pooler. pHluorin imaging har inte bara använts för övervakning synaptic protein endocytos, men också för att övervaka evoked eller spontana enstaka vesikel release, kortsiktiga synaptisk plasticitet, och för mätning av release sannolikhet35. Med pHluorin har visat att synaptic vesikulär protein poolerna släpps inte är desamma som de som Hämtad36,37. Nyligen användes pHluorin smält med synaptic proteiner att upptäcka ödet för nyligen smält blåsor38och bulk endocytos39. PHluorin smält med ett synaptic protein är därför ett värdefullt verktyg för att studera exocytos och endocytos i levande synapser.
Begränsning av denna teknik är att förfalla av fluorescensintensiteten reflekterar inte bara endosomes, men också vesikulär re försurning. Dessa två komponenter kunde potentiellt avskiljas genom behandling med bafilomycin, en hämmare av V-ATPas10,40. Dessutom återspeglar fluorescens ökningen under elektrisk stimulering netto resultatet av exocytos och endocytos. Även om pHluorin imaging inte kunde upptäcka membran invagination, kan denna begränsning övervinnas genom andra metoder, särskilt EM.
I EM, starkt stimuleras cellerna visade ökad HRP-positiv synaptiska vesikler och bulk endosomes. Dessa bulk endosomes försvann gradvis av sedan regenererande i synaptiska vesikler24. Denna teknik visar synaptiskt vesikelprotein upptag genom att avslöja ultrastruktur i den presynaptiska terminalen i både kontroll och stimuleras cellerna. En nackdel med denna teknik är att bedöma synaptiskt vesikelprotein upptag i fasta celler i stället för levande celler. Dessutom möjligheten att ett fixativ inducerad artefakt inte kan uteslutas. Kända artefakter som påverkar membranet inkluderar blebbing, membran erosion och protein ändringar41. Dessa skillnader från naturligt förekommande tillståndet i en cell är en inneboende oro till alla metoder för att visualisera cellerna, och särskild uppmärksamhet ägnades till EM data presenteras för att bedöma möjligheten av sådana artefakter41,42 ,43. Medan denna teknik ensam inte kan visa funktionellt skapar endocytos av synaptic proteiner, att kombinera det med ljusmikroskop, som kan ge levande bilder av endocytos processen, en mer komplett bild av denna cellulära mekanism.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar Dr. Yong-Ling Zhu för att tillhandahålla synaptophysin-pHluorin2x konstruktion och Dr James E. Rothman för att ge VAMP2-phluorin. Vi tackar Dr. Susan Cheng och Virginia Crocker NINDS elektronmikroskopi anläggning för deras teknisk support och hjälp. Detta arbete stöddes av det nationella institutet för neurologiska sjukdomar och Stroke intramurala Research Program i USA och ett bidrag från KRIBB initiativ forskningsprogrammet (koreanska biomedicinsk vetenskapsman Fellowship Program), Korea forskningsinstitut Biovetenskap och bioteknik, Sydkorea.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lipofectamine LTX with Plus | Thermo Fisher | 15338-100 | Transfection of plasmid DNA including synaptophysin or VAMP2-pHluorin |
| neurobasal medium | Thermo Fisher | 21103-049 | Growth medium for neuron, Warm up to 37°C before use |
| B27 | Thermo Fisher | 17504-044 | Gradient for neuronal differentiation |
| Glutamax | Thermo Fisher | 35050-061 | Gradient for neuronal culture |
| Poly-D-Lysine coated coverslip | Neuvitro | GG-25-pdl | Substrate for neuronal growth and imaging of pHluorin |
| Trypsin XI from bovine pancrease | Sigma | T1005 | Neuronal culture-digest hippocampal tissues |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | D5025 | Neuronal culture-inhibits viscous cell suspension |
| pulse stimulator | A-M systems | model 2100 | Apply electrical stimulation |
| Slotted bath with field stimulation | Warner Instruments | RC-21BRFS | Apply electrical stimulation |
| stimulus isolation unit | Warner Instruments | SIU102 | Apply electrical stimulation |
| lubricant | Dow corning | 111 | pHluorin imaging-seal with coverslip and imaging chamber, avoid leak from chamber |
| AP5 | Tocris | 3693 | Gradient for normal saline, selective NMDA receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity |
| CNQX | Tocris | 190 | Gradient for normal saline, competitive AMPA/kainate receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity |
| Illuminator | Nikon | C-HGFI | Metal halide light source for pHluorin |
| EMCCD camera | Andor | iXon3 | pHluorin imaging, detect pHluorin fluorescence intensity |
| Inverted microscopy | Nikon | Ti-E | Imaging for synaptophysin or VAMP2 pHluorin transfected cells |
| NIS-Elements AR | Nikon | NIS-Elements Advanced Research | Software for imaging acquisition and analysis |
| Igor Pro | WaveMetrics | Igor pro | Software for imaging analysis and data presentation |
| imaging chamber | Warner Instruments | RC21B | pHluorin imaging, apply field stimulation on living cells |
| poly-l-lysine | Sigma | P4832 | Electron microscopy, substrate for neuronal growth, apply on multiwell plate for 1 h at room temperature then wash with sterilized water 3 times |
| Horseradish peroxidase(HRP) | Sigma | P6782 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by catalyzing DAB in presence hydrogen peroxide, final concentration is 5 mg/mL in normal saline, make fresh before use |
| Na cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | Electron microscopy, buffer for fixatives and washing, final concentration is 0.1 N |
| 3,3′-Diaminobenzidine(DAB) | Sigma | D8001 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles, substrate for HRP, final concentration is 0.5 mg/mL in DDW and filtered, make fresh before use |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma | H1009 | Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by inducing HRP-DAB reaction, final concentration is 0.3% in DDW, make fresh before use |
| glutaraldehyde | Electron Microscopy Sciences | 16365 | Electron microscopy, fixatives, final concentration is 4% in Na-cacodylate buffer, make fresh before use, shake well before to use |
| TEM | JEOL | 200CX | Electron microscopy, imaging of endocytosed vesicles and ultrastructural changes |
| CCD digital camera | AMT | XR-100 | Electron microscopy, capturing images |
| Lead citrate | Leica microsystems | 16707235 | Electron microscopy, grid staining |
References
- Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Real-time measurements of vesicle-SNARE recycling in synapses of the central nervous system. Nature cell biol. 2 (4), 197-204 (2000).
- Sun, T., Wu, X. S., et al. The role of calcium/calmodulin-activated calcineurin in rapid and slow endocytosis at central synapses. J Neurosci. 30 (35), 11838-11847 (2010).
- Wu, X. -S. S., Lee, S. H., et al. Actin Is Crucial for All Kinetically Distinguishable Forms of Endocytosis at Synapses. Neuron. 92 (5), 1020-1035 (2016).
- Granseth, B., Odermatt, B., Royle, S. J., Lagnado, L. Clathrin-mediated endocytosis is the dominant mechanism of vesicle retrieval at hippocampal synapses. Neuron. 51 (6), 773-786 (2006).
- Atluri, P. P., Ryan, T. A. The kinetics of synaptic vesicle reacidification at hippocampal nerve terminals. J Neurosci. 26 (8), 2313-2320 (2006).
- Royle, S. J., Granseth, B., Odermatt, B., Derevier, A., Lagnado, L. Imaging phluorin-based probes at hippocampal synapses. Methods Mol Biol. 457, 293-303 (2008).
- Moulder, K. L., Mennerick, S. Reluctant vesicles contribute to the total readily releasable pool in glutamatergic hippocampal neurons. J Neurosci. 25 (15), 3842-3850 (2005).
- Li, Z., Burrone, J., Tyler, W. J., Hartman, K. N., Albeanu, D. F., Murthy, V. N. Synaptic vesicle recycling studied in transgenic mice expressing synaptopHluorin. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (17), 6131-6136 (2005).
- Morris, R. G. Elements of a neurobiological theory of hippocampal function: the role of synaptic plasticity, synaptic tagging and schemas. Eur J Neurosci. 23 (11), 2829-2846 (2006).
- Sankaranarayanan, S., Ryan, T. A. Calcium accelerates endocytosis of vSNAREs at hippocampal synapses. Nat Neurosci. 4 (2), 129-136 (2001).
- Balaji, J., Armbruster, M., Ryan, T. A. Calcium control of endocytic capacity at a CNS synapse. J Neurosci. 28 (26), 6742-6749 (2008).
- Ferguson, S. M., Brasnjo, G., et al. A selective activity-dependent requirement for dynamin 1 in synaptic vesicle endocytosis. Science. 316 (5824), 570-574 (2007).
- Baydyuk, M., Wu, X. S., He, L., Wu, L. G. Brain-derived neurotrophic factor inhibits calcium channel activation, exocytosis, and endocytosis at a central nerve terminal. J Neurosci. 35 (11), 4676-4682 (2015).
- Wu, X. S., Zhang, Z., Zhao, W. D., Wang, D., Luo, F., Wu, L. G. Calcineurin is universally involved in vesicle endocytosis at neuronal and nonneuronal secretory cells. Cell Rep. 7 (4), 982-988 (2014).
- Zhang, Z., Wang, D., et al. The SNARE proteins SNAP25 and synaptobrevin are involved in endocytosis at hippocampal synapses. J Neurosci. 33 (21), 9169-9175 (2013).
- Wu, L. -G. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. -C. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annu Rev Physiol. 76 (1), 301-331 (2014).
- Daniele, F., Di Cairano, E. S., Moretti, S., Piccoli, G., Perego, C. TIRFM and pH-sensitive GFP-probes to evaluate neurotransmitter vesicle dynamics in SH-SY5Y neuroblastoma cells: cell imaging and data analysis. J Vis Exp. (95), e52267 (2015).
- Shaner, N. C., Lin, M. Z., et al. Improving the photostability of bright monomeric orange and red fluorescent proteins. Nat Methods. 5 (6), 545-551 (2008).
- Li, Y., Tsien, R. W. pHTomato, a red, genetically encoded indicator that enables multiplex interrogation of synaptic activity. Nat Neurosci. 15 (7), 1047-1053 (2012).
- Leitz, J., Kavalali, E. T. Fast retrieval and autonomous regulation of single spontaneously recycling synaptic vesicles. Elife. 3, e03658 (2014).
- Bisht, K., El Hajj, H., Savage, J. C., Sánchez, M. G., Tremblay, M. -È Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with β-Amyloid Plaques. J Vis Exp. (112), e54060 (2016).
- Schikorski, T. Monitoring Synaptic Vesicle Protein Sorting with Enhanced Horseradish Peroxidase in the Electron Microscope. High-Resolution Imaging of Cellular Proteins: Methods and Protocols. , 327-341 (2016).
- Kononenko, N. L., Puchkov, D., et al. Clathrin/AP-2 mediate synaptic vesicle reformation from endosome-like vacuoles but are not essential for membrane retrieval at central synapses. Neuron. 82 (5), 981-988 (2014).
- Wu, Y., O'Toole, E. T., et al. A dynamin 1-, dynamin 3- and clathrin-independent pathway of synaptic vesicle recycling mediated by bulk endocytosis. eLife. 2014 (3), e01621 (2014).
- Heuser, J. E., Reese, T. S. Evidence for recycling of synaptic vesicle membrane during transmitter release at the frog neuromuscular junction. J Cell Biol. 57 (2), 315-344 (1973).
- Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. Turnover of transmitter and synaptic vesicles at the frog neuromuscular junction. J Cell Biol. 57 (2), 499-524 (1973).
- Watanabe, S., Rost, B. R., et al. Ultrafast endocytosis at mouse hippocampal synapses. Nature. 504 (7479), 242-247 (2013).
- Watanabe, S., Trimbuch, T., et al. Clathrin regenerates synaptic vesicles from endosomes. Nature. 515 (7526), 228-233 (2014).
- Sankaranarayanan, S., Atluri, P. P., Ryan, T. A. Actin has a molecular scaffolding, not propulsive, role in presynaptic function. Nat Neurosci. 6 (2), 127-135 (2003).
- Zhu, Y., Xu, J., Heinemann, S. F. Two pathways of synaptic vesicle retrieval revealed by single-vesicle imaging. Neuron. 61 (3), 397-411 (2009).
- Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
- Arnao, M. B. B., Acosta, M., del Rio, J. A. A., García-Cánovas, F. Inactivation of peroxidase by hydrogen peroxide and its protection by a reductant agent. Biochim Biophys Acta. 1038 (1), 85-89 (1990).
- Deák, F., Schoch, S., et al. Synaptobrevin is essential for fast synaptic-vesicle endocytosis. Nat Cell Biol. 6 (11), 1102-1108 (2004).
- Clayton, E. L., Evans, G. J. O., Cousin, M. A. Bulk synaptic vesicle endocytosis is rapidly triggered during strong stimulation. J Neurosci. 28 (26), 6627-6632 (2008).
- Kavalali, E. T., Jorgensen, E. M. Visualizing presynaptic function. Nat Neurosci. 17 (1), 10-16 (2014).
- Wienisch, M., Klingauf, J. Vesicular proteins exocytosed and subsequently retrieved by compensatory endocytosis are nonidentical. Nat Neurosci. 9 (8), 1019-1027 (2006).
- Fernández-Alfonso, T., Kwan, R., Ryan, T. A. Synaptic vesicles interchange their membrane proteins with a large surface reservoir during recycling. Neuron. 51 (2), 179-186 (2006).
- Gimber, N., Tadeus, G., Maritzen, T., Schmoranzer, J., Haucke, V. Diffusional spread and confinement of newly exocytosed synaptic vesicle proteins. Nat Commun. 6, 8392 (2015).
- Nicholson-Fish, J. C., Smillie, K. J., Cousin, M. A. Monitoring activity-dependent bulk endocytosis with the genetically-encoded reporter VAMP4-pHluorin. J Neurosci Methods. 266, 1-10 (2016).
- Burrone, J., Li, Z., Murthy, V. N. Studying vesicle cycling in presynaptic terminals using the genetically encoded probe synaptopHluorin. Nat Protoc. 1 (6), 2970-2978 (2006).
- Wisse, E., Braet, F., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World journal of gastroenterology. 16 (23), 2851-2866 (2010).
- Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing Photodamage in Live-Cell Microscopy. Methods in Cell Biology. 114, 545-560 (2013).
- Søndergaard, C. R., Garrett, A. E., et al. Structural artifacts in protein-ligand X-ray structures: implications for the development of docking scoring functions. J Med Chem. 52 (18), 5673-5684 (2009).
