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Neuroscience

교양된 Hippocampal 신경에 시 냅 스 소포 Endocytosis를 측정

doi: 10.3791/55862 Published: September 4, 2017

Summary

시 냅 스 소포 endocytosis pHluorin 시 냅 스 소포 단백질 융합의 가벼운 현미경에 의해 및 소포 통풍 관의 전자 현미경 검사 법에 의해 검출 된다.

Abstract

Endocytosis, 동안 융합된 시 냅 스 소포는 신경 단자, 소포 재활용 및 따라서 반복적인 신경 발생 중 시 냅 시스 전송의 유지 보수에 대 한 허용에서 검색 됩니다. 병 적인 조건에서 장애인된 endocytosis 시 냅 스 강도 및 뇌 기능 감소에 지도 한다. 여기, 우리 포유류 hippocampal 신경 문화에서 시 냅 스에서 시 냅 스 소포 endocytosis를 측정 하는 데 사용 하는 방법을 설명 합니다. 우리는 등 synaptophysin VAMP2/synaptobrevin, pHluorin, 증가 하는 pH에 민감한 녹색 형광 성 단백질으로 기공을 lumenal 측면에서 시 냅 스 기공을 막 단백질을 융합 하 여 시 냅 스 소포 단백질 endocytosis를 모니터링의 형광 강도 pH로 증가합니다. Exocytosis, 동안 기공을 루멘 pH 증가, endocytosis 기공을 루멘 동안 pH는 다시 acidified. 따라서, pHluorin 형광 강도의 증가 나타냅니다 퓨전, 반면 감소의 이라는 시 냅 스 소포 단백질 endocytosis를 나타냅니다. 기록 endocytosis를 pHluorin 이미징 메서드를 사용 하 여, 우리 소포에 의해 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP) 통풍 관의 전자 현미경 (EM) 측정 하 여 기공을 막 endocytosis 모니터링. 마지막으로, 우리는 높은 칼륨 유도 도발은 후 다양 한 시간에 신경 터미널 막 구 덩이의 형성을 모니터링합니다. HRP 통풍 관 및 막 구 덩이 형성의 시간 과정 endocytosis의 시간 과정을 나타냅니다.

Introduction

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신경 전달 물질 시 냅 스 소포에 저장 되며 exocytosis 발표. 시 냅 스 소포 막과 단백질은 endocytosis에 의해 내 면 그리고 exocytosis의 다음 라운드에서 다시. 시 냅 스 소포 endocytosis 시 냅 스 소포 풀을 유지 관리 하는 것이 중요 하다 고 플라즈마 막에서 튀어나온 소포를 제거 합니다. Endocytosis 시간 과정에 라이브 셀1,,23측정 하는 신랄 한 상황에서 침묵 중립 pH에 dequenched, pH에 민감한 녹색 형광 단백질 pHluorin 사용 되었습니다. PHluorin 단백질 시 냅 스 소포 단백질, synaptophysin 등 VAMP2/synaptobrevin의 lumenal 측에 일반적으로 붙어 있다. 휴식, pHluorin 시 냅 스 소포의 5.5 pH 루멘에 침묵 이다. 원형질 막에 소포 융해 노출 pH가 7.3 ~ extracellular 해결책에 기공을 루멘 pHluorin 형광에 있는 증가 결과로. Exocytosis, 뒤에 그 복구 된 소포 내 기 다시 산성화 시 냅 스 소포 단백질 endocytosis 인해 증가 형광 자연 붕괴 후 감퇴 반영 endocytosis 기공을 다시 산성화, 비록 그것은 대부분 반영 한다 endocytosis, 다시 산성화 endocytosis 대부분 조건1,4보다 빠릅니다 때문에. 다시 산성화의 시간 상수는 3-4 s 또는 더 적은5,6일반적으로 10 보다 더는 s 이상의 소포 endocytosis4,5에 필요한. 실험 다시 산성화 endocytosis를 구별 하기 위하여 필요한 경우 4-Morpholineethanesulfonic 산 (MES) 솔루션 (25 mM)를 사용 하 여 ph 5.5의 산 성 냉각 실험 시 냅 스 소포 단백질 검색할지 여부를 결정 하 사용할 수 있습니다. endocytosis1,,34를 통해 원형질 막. 따라서, pHluorin 형광 강도 증가 및 endocytosis, 균형을 반영 하 고 신경 자극 후 감소는 endocytosis에 구체적으로 반영 한다.

pHluorin 이미징 뿐만 아니라 endocytosis, 시간 과정 뿐만 아니라 시 냅 스 소포 풀7,8의 크기를 측정 하는 데 사용할 수 있습니다 그리고 갖는 릴리스 자발적인 가능성이 릴리스9. 많은 요인과 단백질 endocytosis, 칼슘, 수용 성 NSF 부착 단백질 수용 체 (올 무) 단백질, 두뇌 파생 된 neurotrophic factor(BDNF) calcineurin 등 규제에 관련 된 확인 된 pHluorin 이미징1 를 사용 하 여 , 2 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16.만 주 신경에서 하지만 TIRFM17신경 세포에서 신경 전달 물질의 릴리스를 검출 될 수 또한. 최근, pHTomato, mOrange, dsRed, pHluorin 변종 단일 시 냅 스18,19에서 여러 요인의 동시 녹음을 모니터링 하기 위한 개발 되었다. 예를 들어 pHTomato 되어 synaptophysin 융합과 연 접 소포 융해와 Ca2 + 유입 postsynaptic 구획20에서 유전자 인코딩된 칼슘 표시기 (GCaMP5K)와 함께 사용. 따라서, pHluorin 시 냅 스 단백질에 부착 된 endocytosis 및 exocytosis 사이의 관계를 분석 하는 유용한 방법을 제공 합니다.

그들은 일반적으로 endocytosis endocytosis 동안 ultrastructural 변화를 보여주는 높은 공간 해상도 인해 공부 하는 데 사용 하는 또 다른 방법은. 2 개의 일반적인 신경 세포21 내 병 적인 변화를 시각화 하 고 소포 단백질22를 추적 하는 기능입니다. 특히, 시 냅 스 소포 통풍 관, 막 곡률의 관찰 periactive 영역에서 clathrin으로 코팅 하 고 endosomal 구조는 그들3,,2324,25 가능 ,26,,2728. EM 정착 액 유도 기형 등의 잠재적인 아티팩트를 포함 하는 동안 endocytosis, 영향을 줄 수 있는 그리고 데이터 분석은 노동 집약, 세포의 구조를 시각화 하는 매력적인 기회를 제공 하는 해상도. 통 문제 및 EM 시간적 해상도 제한 동결, endocytosis27중 섬세 한 구조를 안정화의 빠르고 비 화학 제품 방법을 제공 하는 높은 압력에 의해 극복할 수 있습니다.

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Protocol

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참고: 다음 프로토콜 pHluorin 이미징 방법 및 교양 hippocampal 신경. pHluorin 모니터 시 냅 스 소포 단백질 통풍 관에 살아있는 세포에 사용 되는 EM 방법에 설명 하 고 그들 시 냅 스 소포의 감지 및 ultrastructural 변경.

동물 보호 및 절차 NIH 지침을 따라와 NIH 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 했다.

1. pHluorin 이미징

  1. Hippocampal 신경 문화
    1. 준비 해 마 버퍼 (HB) 4mm NaHCO 3 및 5 mM HEPES 결합 하 여 5 M NaOH로 pH 7.3에 조정. 보통 2 %B27, 0.5 m m L-글루타민 및 1% 페니실린 스 neurobasal를 혼합 하 여 문화 매체를 확인 합니다. 또한, HB 버퍼 20%의 혼합물 준비 소 태아 혈 청 (HB/20% FBS).
      참고:이 자란 프로토콜 기반 Sankaranarayanan, 외. 29 고 우 외. 24
    2. 출생 후 0 하루에 하루 2 문화 매체로 사이 마우스 강아지 목을 벨 및 4 ° C HB/20% FBS에 두뇌를 추출. 노출은 된 시상 및 brainstem를 제거 합니다. 후, 시상 및 brainstem의 제거에 의해 노출 된, 밖으로 해 부 고 신선한 4 ° c HB/20% FBS.
      참고: 일반적으로, 비중은 약 4 x 10 1 강아지 (두 된) 5 셀/mL입니다. 핀셋 이나가 위를 사용 하 여 접착 막 떨어져 청소 그 후에 신선한 4 ° C HB/20% FBS 전송 가 이랑 풀가 위, 절단 하 여는 subiculum 분리 그리고 신선한 4 ° c HB/20% FBS 전송.
    3. 끝에 약 10 조각으로 절단 하 여 각 해 마를 분할 하 고 폴 리 프로필 렌 15 mL 원뿔 튜브에 그들을 전송.
    4. 허용한 후에 정착 조직, HB/20% FBS의 10 mL로 씻어 하 고 다음 세 번의 HB 10 mL로 씻어.
    5. 137 mM NaCl, KCl 5mm, 7mm Na2HPO 4, 25mm HEPES의 소화 솔루션을 준비 하 고 5 M NaOH로 pH 7.2에 조정. 상쾌한 고 된에서 제거. 소화 솔루션의 2 개 mL를 trypsin의 10 mg와 DNase의 1 밀리 그램을 추가 하 고 샘플 펠 릿에 직접 살 균 0.22 μ m 멤브레인 통해 필터링.
    6. 된 37 ° C에서 5 분 동안 품 어 다음 HB/20% FBS의 10 mL로 두 번 세척 하 고 다음 한 번 HB의 10 mL로 씻어.
    7. 해리 MgSO 4의 6 mg와 셀 ∙ 7 H 2 O 및 2 mL HB에는 된 살 균 필터를 1mg DNase의 메 마른 0.22 μ m 필터를 통해 작은. 부드럽게 주의 분쇄 하 여 세포를 분리, 돌보는 동안 공기 도입 방지 하기 거품. 2 분 동안 정착 조직 입자를 허용 하 고 다음 천천히 다른 튜브에는 상쾌한 전송.
    8. 추가 3 mL HB/20% FBS 세포 현 탁 액, 그리고 원심 분리기 또는 4 ° C에서와 1000 rpm 10 분. 삭제는 상쾌한 고 문화 매체에서 resuspend.
    9. 플레이트 60000 세포는 coverslip에서 유출 없이 폴 리-D-리 코팅 25 m m 직경 coverslip에 150 µ L 문화 매체에. 도금 후 미리 데워 진된 문화 매체 2 h의 2 개 mL를 추가 합니다. Coverslips 6-잘 자란 또는 멸 균 페 트리 디쉬에 유지 됩니다.
    10. 5%에서 37 ° C에서 유지 세포 CO 2 14-21 일 녹화 전에 대 한 문화 매체에 인큐베이터 습도. 동안 문화 성장 매체의 상반신 일주일에 두 번 변경.
  2. Transfection
    1. 도금, 후 6-7 일 synaptophysin-pHluorin 2 X transfect (SpH) 또는 hippocampal 신경으로 VAMP2-pHluorin. SpH, 세포 (CMV) 발기인, 30 pcDNA3 벡터 삽입을 사용 합니다. VAMP2-pHluorin를 사용 하 여 pCI 벡터 31에 삽입 CMV 발기인.
    2. 1 µ g의 플라스 미드를 사용 하 여 대상 세포에 지질 여 두 벡터 transfect. 혈 청 부족, 프로토콜 단계 1.1.1에서 문화 매체를 사용 하 여 있는 transfection에 대 한. 독성을 줄이기 위해 transfection 후 매체 2 h 변경.
      참고: 낮은 표현의 SpH는 boutons에서,의 경우 증가 지질 캐리어와 2 µ g 또는 보육 시간 DNA 농도 세포 건강 하지 않는. 일반적으로, 4-10 셀 (0.006 0.008%)의 transfected 했다.
  3. 가벼운 현미경
    1. 119 mM NaCl, 2mm CaCl 2, 2.5 m m KCl, 25mm HEPES (pH 7.4), 포도 당 30 m m, 2 m m MgCl 2, 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione (0.01 m m의 준비 정상적인 염 분 솔루션 구성 CNQX), 그리고 0.05 mM DL-2-아미노-5-phosphonovaleric 산 (AP5). 배양 접시와 장소에서 coverslip 필드 자극, 윤활제 및 실 란 트를 사용 하 여 누수를 피하기 위해 허용 하는 이미징 챔버를 가져가 라. 유리 접시에서 챔버는 coverslip의 전송 중 즉시 750 µ L 정상적인 염 분 솔루션을 추가 하 여 건조 시키는 피하십시오.
      참고: CNQX와 AP5 재발 활동에 대 한 잠재력이 postsynaptic 활동을 차단 하 사용 되었다. 거꾸로 형광 현미경에는 챔버를 배치 하기 전에 청소 티슈를 사용 하 여 챔버 누설 하지 않는 것인지. 굴절 인덱스에 변화 귀착되는 일반 식 염 수와 침수 오일의 혼합 하 여 녹음 하는 동안 포커스 변경 하면 느린 새.
    2. 금속 할로겐 램프와 자극 및 기록
        60 X 거꾸로 widefield 현미경에
      1. 이미지 (1.4 숫자 조리개) 기름 침수 렌즈. 480의 여기 피크에 대 한 설정 필터 pHluorin 시각화 nm, 490 nm 긴 패스 거울, 500-550 nm 방출 필터와 수동 플립 셔터. 이미지 마다 100 ms, 2 x 2 비 닝와 전자 멀티 충전 결합 장치 (EMCCD) 카메라를 사용 하 여 캡처.
        참고: 여러 기능 고려해 야 이미지 캡처 간격을 포함 하 여 photobleaching을 피하기 위해 적절 한 상태를 달성 하 고 필터링 하 고 범주화는 장비에 의존. 공초점 이미지의 경우 레이저 전원 및 노출 시간을 photobleaching을 피하기 위해 고려해 야 합니다. 자극 없이 3 분 이상 녹화 후 설치 결정 했다 고 녹음 적어도 10 수행한 photobleaching를 확인 하는 자극 없이 s.
      2. 각 실험에 분석의 용이성을 위해 boutons의 높은 밀도와 영역을 선택합니다. Bouton과 boutons 사이 연속 식에 원형 또는 타원형 식 패턴에 중점을 두고 그들의 녹색 형광 신호에 의해 transfected 세포를 식별.
      3. 1를 사용 하 여 필드 자극에 의해 유발 endocytosis ms 펄스, 20 mA 활동 전위 (AP) 펄스 자극에서 공급 하 고 자극 격리 단위 내의 백 금 전극을 통해 전달. 자극의 및 셀 복구 하는 동안에 걸쳐 형광 활동 이미지.
        참고: 죽은 세포의 경우 식 생활 boutons 보다 강한와 boutons 사이 누 덕 누 덕 패턴을 보였다.
  4. 이미지 분석
    1. 단일 bouton의 형광 강도 분석, 설정까지 한 지역의 관심 (ROI) 1.5 x 1.5 µ m 평방; bouton는 크기가 약 1.5 µ m. 사용 흔적 자극 photobleaching에 대 한 확인을 배경으로 빼기 전에 내.
    2. Normalize 형광 변화 (δ) 방정식: Equation
      어디 최대 F와 F 0 참조 최대한 증가 자극 후 그리고 초기 형광, 각각. 측정 endocytosis 요금 감퇴의 속도으로 첫 번째 동안 4-10 s pHluorin 형광의 최대 시점 이후. 모노 지 수 기능으로 기준선에 피크 증가에서 pHluorin 형광 붕괴를 피팅 하 여 endocytosis의 시간 상수 (τ)를 취득.

2. 전자 현미경

  1. 준비 폴 리 D Lysine을 실 온에서 1 h에 대 한 각 영역 0.01% 살 균 필터링 폴 리-D-리 솔루션의 1.5 mL를 적용 다음 소독된 물으로 세 번 세척 하 여 6 잘 플레이트 코팅. 해 부, 문화, 및 각각 1.1.1, 1.1.2, 1.1.3, 단계에서 hippocampal 신경 유지.
  2. 준비 HRP 31.5 m NaCl, 2mm CaCl 2, 90 m KCl, 25mm HEPES (pH 7.4), 포도 당 30 m m, m m로 높은 K + 자극 솔루션 2 mM MgCl 2, 0.01 m CNQX m, 0.05 m m AP5, 및 5 mg/mL HRP, pH 7.4 5 m에 조정 NaOH. 90 (라고도 K +) 각 음을 1.5 mL의 추가 의해 실 온에서
    1. Stimulate 1.5 mL 높은 hippocampal 신경 문화권 K + 자극 솔루션 s. 휴식 상태 (R 라고도 함)에 적용 5 mg/mL HRP 90의 동일한 농도 s, 하지만 정상적인 염 분 해결책. 복구 샘플 K + 예제와 마찬가지로 높은 K + 자극 솔루션 적용 다음 빠르게 세척 및 정상적인 염 분 고 10 분에 대 한 품 어
  3. 고정 및 얼룩
    1. pH 7.4에서 21.4 g/L Na cacodylate를 사용 하 여 0.1 m M 나 cacodylate 버퍼를 준비. 0.1 m M 나 cacodylate 버퍼 실내 온도에 적어도 1 시간에에서 4%도 함께 셀을 수정 합니다. 3 시간 7 분 0.1 m M 나 cacodylate 버퍼와 세척.
    2. 준비 Diaminobenzidine (한 덩어리) 솔루션, 0.5 mg/mL의 구성 0.3% H 2 O 2 ddH 2 O, 및 0.22 μ m 필터와 필터를 줘 봐. 3 시간 7 분 0.1 m M 나 cacodylate 버퍼와 37 ° C. 세척에서 30 분 동안 1.5 mL DAB 솔루션 적용.
      주의: 소량 의심과 독성 발암 물질 이다. 장갑 및 실험실 외 투를 사용 하시기 바랍니다.
      참고: DAB로 의해 발생 합니다 그것의 산화로 인해 H 2 O 2, HRP에 의해 촉매로. 샘플에서 증가 신호 구성 결과의 작은 증가 합니다. HRP의 농도 증가 속도 촉매의 효과. H 2 O 2의 큰 농도 허용 측 반응, HRP와 쇠 약 32 라벨의 효과 억제 합니다. 이 작품에서는,이 라벨 시스템의 농도 현재 사용할 수 있는 연구 33 , 34에 따라 선정 됐다.
    3. 1.5 mL의 0.1 m M 나 cacodylate 버퍼 고정 게시물 4 ° C에서 1 시간에에서 1% OsO 4와 뉴런을 품 어. 7 분 0.1 m M 나 cacodylate 버퍼의 1.5 mL로 세 번 세척.
      주의: 독성 및 OsO 4의 반응성 화학 후드에 얼음 샘플을 유지 보다는 많은 경우에는 보육에 대 한 냉장고를 사용 하 여.
    4. 준비 0.1 M 나트륨 아세테이트 버퍼 13.61 g/L 나트륨 아세테이트와 11.43 mL/L 빙 초 산 pH 5.0에서 함께. 1.5 mL 0.1 M 아세테이트 버퍼 pH 7 분 5.0로 세 번 세척 및 pH 5.0 4에서 1 h에서 0.1 M 아세테이트 버퍼에 1.5 mL 1 %uranyl 아세테이트와 품 어 ° C. 씻어 3 시간 7 분 1.5 mL 0.1 M 아세테이트 버퍼.
  4. 에폭시 포함
    1. 각 7 분 50%, 70% 및 90% 에탄올의 단일 1.5 mL 세척으로 신경 문화 탈수 하 고 다음 3 1.5 mL 100% 에탄올 증기 두건에서 각각 7 분의 세척.
    2. 믹스 485 mL/L bisphenol-A-(epichlorhydrin) 만들 에폭시 에폭시 수 지, 160 mL/L dodecenyl 호박 무수 물 (DDSA), 우리 모두의 340 mL/L 메 틸-5-Norbornene-2, 3-Dicarboxylic 무수 물 (NMA), 그리고 15 mL/L 2,4,6-트리 스 (dimethylaminomethyl) 페 놀 (DMP-30) 수 지입니다. 믹스 철저 하 게, 공기 방울을 제거 하는 진공에서 다음 저장.
      참고: 그것은 특히 그 보다는 육안에 보이는 작은 수 지에서 기포를 제거 하는 중요 한 그들은 단면 중 수 지에 구멍을 일으킬 수 있기 때문.
    3. 70% 에폭시 수 지 통에 실 온에서 30 분 동안 에탄올에 다음 50% 에폭시와 에탄올을 대체 하 여 샘플 통에 실 온에서 30 분 동안 에탄올에 수 지 침투.
    4. 스위치 에폭시 솔루션 100% 에폭시 수 지와 수 지와 1 h 50 ° C. 추가 신선한 100% 에폭시에 대 한 외피와 신선한 100% 에폭시 수 지의 50 ° C. 수행 2 교류에서 10 분 동안 품 어 수 지 고 50 ° C 하룻밤 사이에 그리고 60 & # 17에서 보안을 강화 하 6; 보안을 강화 하 여 36 h에 대 한 C.
  5. Muti-잘 접시에서 보석으로 각 샘플을 제거 ' s 톱. 관심, 셀, 거꾸로 가벼운 현미경을 사용 하 여 다음 잘라 톰에 의해 단면에 대 한 70 ~ 80 nm 블록의 조밀한 농도 영역을 선택 합니다. 로드는 톰을 톰 척에 컷된 영역을 탑재 합니다. 톰에 물림 쇠를 놓고 블록의 표면에 평행한 가장자리 다이아몬드 칼을 탑재 합니다. 직접 개별 격자에 70 ~ 80 nm 두께의 섹션을 수집.
  6. 무게, 1%의 솔루션에 대 한 물으로 uranyl 아세테이트를 녹이 고 별도로 무게 3% 솔루션 물으로 리드 시트르산을 디졸브. 15 분 동안 1% 수성 uranyl 아세테이트와 다음 샘플의 명암을 개선 하기 위해 5 분 동안 3% 수성 리드 시트르산 침수에 의해 섹션 counterstain.
  7. EM 이미징
    1. 전송 전자 현미경으로 섹션 및 10000-20, 000 X 3의 기본 확대 CCD 디지털 카메라와 함께 이미지를 기록 검사.
  8. 통계
    1. t 수행-제어 및 실험 샘플 사이의 평균 및 측정 (s.e.m.)의 표준 오차를 비교 하 여 상당한 차이 식별 하기 위해 테스트.

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Representative Results

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지질 캐리어 메서드를 사용 하 여, SpH 표현 hippocampal 신경에 있는 boutons (그림 1a)의 식별에 대 한 허용. 셀의 전기 자극 형광 강도 exocytosis, 그리고 증가 유도 한다. 형광 (δ)의 증가 자극 (그림 1b)를 종료 하 여 중단 됐다. 증가 형광 endocytosis 인해 느린 감소에 선행 되었다. VAMP2-pHluorin, 경우 VAMP2 자극4후는 bouton에서 축 삭을 따라 확산. 원시 데이터는 임의 단위를 사용 하 고 부패와 τ (그림 2a-c)의 속도를 기준으로 정규화 되었는지. 이후 측정 정규화 된 추적에서 만들어진, 감퇴의 속도 (δ/s) 당 피크 δ의 백분율에 있는 형광의 초기 부패를 반영 합니다. 우리의 실험 조건에 endocytosis (보통 10 이상 s) reacidification 보다 훨씬 느리게 했다 (3-4 s)4,5. 따라서, pHluorin의 형광 붕괴는 주로 endocytosis4,5을 반영 한다. 연 접 boutons에 있는 δ bouton 제외 하 고 축 삭 보다 더 큰 이며 시작 시간-의-증가 전기 자극의 개시와 일치 했다. Bouton 제외 하 고 축 삭, δ는 boutons 지역에 비해 낮은 고 전기 자극 (그림 2b)의 개시에 비해 지연 되었다 증가의 시간을 시작. Bouton는 82.9 ± 9.0%를 제외 하 고 δ bouton에 축 삭 유도 (n = 5 실험) 23.2 ± 4.0% (n = 5 실험), 각각 (그림 2b). SpH의 δ 17.7 ± 0.3의 τ와 모노-기 하 급수적으로 부식 (n = 5 실험) 및 20.7 ± 0.2 (n = 4 실험) 50에서 AP와 200 AP, 각각 (그림 1b). 200에서 AP, τ 아니었다 크게 다른 기준선 정상화 전후. VAMP2 pHluorin 페 셀 경우 VAMP2 pHluorin 식 수준 SpH (그림 3a-c) 보다 높았다. VAMP2 pHluorin의 흔적 또한 기준선 (그림 3b) 정상화에 의해 얻은 했다.

EM 배양된 신경 세포에서 수행 되었다와 clathrin 입히는 소포 90 HRP의 5 mg/mL로 incubated 했다 컨트롤 샘플에 비해 시험 되었다 (그림 4a-b) 자극의 부재에서 s. Clathrin 입히는 구 덩이 자극의 부재에서 bouton 당 0.05의 확률에서 관찰 되었다. 높은 k+ 자극 유도 대량 endosome 및 시 냅 스 소포 통풍 관, HRP (그림 5a)를 라벨에 의해 확인 되었다. 시 냅 스 소포는 직경 보다 작은 50 nm 및 대량 endosomes와 소포 80 이상 직경을 가진 것으로 정의 된 대로 정의 된 nm 또는 이상 80의 교차 단면 면적 nm 소포. 유도 대량 endosome 글귀는 일반 식 염 수 (그림 5b)와 복구에 의해 감소 했다.

Figure 1
그림 1: SpH의 이미지 페 신경 및 전기 자극 SpH transfected 세포 응답의 흔적. () A 샘플 이미지 liposome 배달에 의해 SpH와 페 교양된 hippocampal 신경의. SpH 높은 축 삭을 따라 상대적으로 낮은 식으로 원형 또는 타원형의 패턴을 제시 boutons, 표현 했다. 흰색 상자 boutons (1.5 x 1.5 µ m)를 포함 하는 투자 수익을 나타냅니다. 눈금 막대: 20 µ m. (b) 응답의 SpH 50의 전기 자극에 셀 페 20 Hz에서 AP (n = 5 실험) 또는 200 20 Hz에서 AP (n = 4 실험). 각 실험은 20-60 boutons에 근거 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 부패와 타우 endocytosis 값의. 20 Hz에 () 50 응답 AP 정규화 된 흔적을 임의의 단위에서 개조 되었다 (n = 5). 형광 변화는 기준선에 정규화 되었습니다. 이 그림은 우 외., 20163에서 수정 되었습니다. 200 (b) 정규화 응답 boutons 20 Hz에서 AP (검정, n = 4 실험, 왼쪽 패널) 및 축 삭 bouton 제외 하 고 (빨강, n = 4 실험, 왼쪽 패널). 형광 변화는 기준선에 정규화 되었습니다. 점선된 상자 오른쪽 패널에서 확대 됩니다. (c) 사용 하 여 정규화 된 기준선, 부패 또는 τ의 속도 50에서 계산 된 AP (n = 5 실험) 및 200 AP (n = 4 실험) 20 Hz에서. 계산 하기 전에 δ 100% 정상화 되었다. Τ endocytosis의 정규화 된 추적 최대 형광의 시간과 실험의 끝 사이에서 얻은 했다. 50에 의해 유도 된 감퇴 (평균 + s.e.m., 상단 패널)와 τ (평균 + s.e.m., 낮은 패널)의 AP와 200 AP.  이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: VAMP2 pHluorin의 이미지 페 신경 및 추적의 예. 교양된 hippocampal 신경의 샘플 이미지 (a) A liposome 배달에 의해 VAMP2 pHluorin와 페. 흰색 상자 boutons (1.5 x 1.5 µ m)를 포함 하는 투자 수익을 나타냅니다. 눈금 막대: 20 µ m. (b) 200 VAMP2 pHluorin 응답에 대 한 추적 20 Hz에서 AP (n = 4 실험). 형광 변화는 기준선에 정규화 되었습니다. (c) F기본 (거리) (평균 + s.e.m.) VAMP2 pHluorin (n = 4 실험) 및 SpH (n = 7 실험) boutons 페. * *, p < 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 연 접 맨끝에 그들의 이미지. () 시 냅 시스 소포는 EM을 사용 하 여 교양된 hippocampal 신경에 표시 했다. 이 그림은 우 외., 20163에서 수정 되었습니다. 눈금 막대 = 200 nm. (b) 확대 이미지 clathrin 입히는 구 덩이. 눈금 막대: 50 nm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 높은 칼륨과 자극된 신경 연 접 터미널의 이미지. 뉴런의 이미지 () 그들. 셀 (R), 자극 없이 90 90 m m KCl 자극 후 즉시 고정 했다 녹는 HRP (K+)를 포함 하는 s 또는 자극 후 다음 정상적인 염 분에서 10 분 동안 incubated 하 고. 이 그림에서 우 수정 되었습니다.그 외, 20163. 눈금 막대 = 200 nm. (b) 비교 제어, HRP (-) 시 냅 스 소포 감소 했다 고 HRP (+) 소포 KCl. 대량 endosome 글귀 KCl에 의해 유도 되 고 복구에 의해 점차적으로 감소 증가 했다 (평균 + s.e.m., 각 그룹은 40-100 시 냅 스 프로필에서). * p < 0.1; * * p < 0.01, 상당한 휴식; ##p < 0.01, k+중요 한. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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여기 우리는 시 냅 스 소포 endocytosis를 모니터링 하기 위한 두 가지 방법을 보여 줍니다. 첫 번째 방법에서 우리 pHluorin transfected 신경에 시 냅 스 소포 단백질 융합 하 고 그 후 전기 자극을 모니터링. KCl에 의해 유도 된 둘째, 우리 EM 이미징 HRP 통풍 관의 사용. 우리는 두 가지 이유로 다른 자극을 사용. 첫째, 높은 칼륨 응용 문화에 모든 뉴런의 도발은 유도. 이 우리의 EM 방법론은 비 자극과 자극 뉴런을 구분 하지 수 EM 검사 용이. 반면 활동 전위 또는 심지어 단일 작업의 짧은 기차 후 pHluorin 형광 변화를 관찰할 수 있다 두 번째, 초 구조 형태학 변화 보다 안정적으로 높은 칼륨 자극 등 강렬한 자극 후 관찰 되었다 가능성이 있습니다.

가벼운 현미경 pHluorin를 사용 하 여 이미징 살아있는 세포에 시 냅 스 소포 단백질 융합 및 통풍 관 높은 시간 해상도 보여줍니다. 그것은 공부 endocytosis 시간 코스와 시 냅 스 소포 풀의 크기를 조절 하는 메커니즘을 사용할 수 있습니다. pHluorin 이미징 하지만 사용 되었습니다 모니터링 시 냅 스 단백질 endocytosis, 하지만 또한 갖는 또는 자발적인 단일 기 출시, 단기 시 냅 스가 소성, 모니터링 및 릴리스 확률35의 측정. PHluorin를 사용 하 여 출시 되 고 시 냅 스 기공을 단백질 풀은 동일 검색된36,37되 고 하는 것을 보이고 있다. 최근, pHluorin 시 냅 스 단백질 융합 새로 융합된 소포38의 운명을 감지 하 여 endocytosis39대량 사용 되었다. 따라서, pHluorin 시 냅 스 단백질 융합 생활 시 냅 스에 endocytosis 및 exocytosis를 공부 하기 위한 유용한 도구입니다.

이 기술은 한계 endosomes, 뿐만 아니라 나노미터 다시 산성화 반영 하는 형광 강도의 감퇴입니다. 이러한 두 구성 요소 bafilomycin, V ATPase10,40의 억제제로 치료 하 여 잠재적으로 분리 될 수 있습니다. 또한, 전기 자극 중 형광 증가 endocytosis 및 exocytosis의 순 결과 반영합니다. PHluorin 이미징 막 invagination를 감지할 수 없습니다, 하지만 다른 기술을, 특히 그들에 의해이 한계를 극복할 수 있습니다.

그들, 강하게 자극된을 세포 보여주었다 증가 HRP 양성 시 냅 스 소포 및 대량 endosomes. 이러한 대량 endosomes 점차적으로 사라진 다음 재생성 시 냅 스 소포24에. 이 기술은 열 대권 외의 제어 및 자극된을 세포 연 접 맨끝에 공개 하 여 시 냅 스 소포 통풍 관을 보여줍니다. 이 기술의 단점은 고정된 셀 보다는 살아있는 세포에 시 냅 스 소포 이해를 평가 이다. 또한, 통 유발된 유물의 가능성을 제외할 수 없습니다. 막에 영향을 미치는 알려진된 유물 blebbing, 막 침식, 및 단백질 변화41포함 됩니다. 셀의 자연적 상태에서 이러한 차이 머릿속 세포의 모든 방법에는 고유한 관심사와 같은 아티팩트41,42의 가능성을 평가 하 여 EM 데이터에 특정 관심을 지불 했다 ,43. 혼자이 기술은 기능 표시 수 없습니다 동안 endocytosis endocytosis 과정의 라이브 이미지를 제공할 수 있습니다, 가벼운 현미경 검사 법에 그것을 결합 하는 시 냅 스 단백질의이 세포 메커니즘의 더 완전 한 보기를 만듭니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

우리 감사 박사 용 링 Zhu synaptophysin pHluorin2x 구조, 및 박사 제임스 E. 로스 VAMP2 phluorin를 제공 하기 위한 제공. 우리가 그들의 기술 지원 및 도움말에 대 한 박사 수잔 쳉과 버지니아 크 로커 NINDS 전자 현미경 시설의 감사합니다. 이 작품은 신경 성 질환의 국가 학회 및 미국 및 생명 공학 연구소 연구 이니셔티브 프로그램 (한국 생명 과학자 친목 프로그램), 한국 연구 학회에서에서 부여에 선 교내 연구 프로그램에 의해 지원 되었다 생명 과학, 생명 공학, 한국

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Lipofectamine LTX with Plus Thermo Fisher 15338-100 Transfection of plasmid DNA including synaptophysin or VAMP2-pHluorin
neurobasal medium Thermo Fisher 21103-049 Growth medium for neuron, Warm up to 37°C before use
B27 Thermo Fisher 17504-044 Gradient for neuronal differentiation
Glutamax Thermo Fisher 35050-061 Gradient for neuronal culture
Poly-D-Lysine coated coverslip Neuvitro GG-25-pdl Substrate for neuronal growth and imaging of pHluorin
Trypsin XI from bovine pancrease Sigma T1005 Neuronal culture-digest hippocampal tissues
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma D5025 Neuronal culture-inhibits viscous cell suspension
pulse stimulator A-M systems model 2100 Apply electrical stimulation
Slotted bath with field stimulation Warner Instruments RC-21BRFS Apply electrical stimulation
stimulus isolation unit Warner Instruments SIU102 Apply electrical stimulation
lubricant Dow corning 111 pHluorin imaging-seal with coverslip and imaging chamber, avoid leak from chamber
AP5 Tocris 3693 Gradient for normal saline, selective NMDA receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity
CNQX Tocris 190 Gradient for normal saline, competitive AMPA/kainate receptor antagonist, inhibit postsynaptic activity which have potential for recurrent activity
Illuminator Nikon C-HGFI Metal halide light source for pHluorin
EMCCD camera Andor iXon3 pHluorin imaging, detect pHluorin fluorescence intensity
Inverted microscopy Nikon Ti-E Imaging for synaptophysin or VAMP2 pHluorin transfected cells
NIS-Elements AR Nikon NIS-Elements Advanced Research Software for imaging acquisition and analysis
Igor Pro WaveMetrics Igor pro Software for imaging analysis and data presentation
imaging chamber Warner Instruments RC21B pHluorin imaging, apply field stimulation on living cells
poly-l-lysine Sigma P4832 Electron microscopy, substrate for neuronal growth, apply on multiwell plate for 1 h at room temperature then wash with sterilized water 3 times
Horseradish peroxidase(HRP) Sigma P6782 Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by catalyzing DAB in presence hydrogen peroxide, final concentration is 5 mg/mL in normal saline, make fresh before use
Na cacodylate Electron Microscopy Sciences 12300 Electron microscopy, buffer for fixatives and washing, final concentration is 0.1 N
3,3′-Diaminobenzidine(DAB) Sigma D8001 Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles, substrate for HRP, final concentration is 0.5 mg/mL in DDW and filtered, make fresh before use
Hydrogen peroxide solution Sigma H1009 Electron microscopy, labeling of endocytosed synaptic vesicles by inducing HRP-DAB reaction, final concentration is 0.3% in DDW, make fresh before use
glutaraldehyde Electron Microscopy Sciences 16365 Electron microscopy, fixatives, final concentration is 4% in Na-cacodylate buffer, make fresh before use, shake well before to use
TEM JEOL 200CX Electron microscopy, imaging of endocytosed vesicles and ultrastructural changes
CCD digital camera AMT XR-100 Electron microscopy, capturing images
Lead citrate Leica microsystems 16707235 Electron microscopy, grid staining

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References

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교양된 Hippocampal 신경에 시 냅 스 소포 Endocytosis를 측정
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Villarreal, S., Lee, S. H., Wu, L. G. Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (127), e55862, doi:10.3791/55862 (2017).More

Villarreal, S., Lee, S. H., Wu, L. G. Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (127), e55862, doi:10.3791/55862 (2017).

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