Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Kvantifisering av infra-langsom dynamikk av spektral kraft og hjertefrekvens i sovende mus

Published: August 2, 2017 doi: 10.3791/55863
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Fundamental Neurosciences, University of Lausanne

Summary

Her presenterer vi eksperimentelle og analytiske prosedyrer for å beskrive den temporale dynamikken til de neurale og kardiale variablene av ikke-REM søvn hos mus, som modulerer søvnresponsivitet til akustiske stimuli.

Abstract

Tre årvåkenstater dominerer pattedyrslivet: våkenhet, ikke-rask øyebevegelse (ikke-REM) søvn og REM søvn. Ettersom flere nevrale korrelater av atferd er identifisert i frittflyttende dyr, blir denne trefoldsdelingen for forenklet. I løpet av våkenhet definerer ensembler av globale og lokale kortikale aktiviteter sammen med perifere parametere som pupildiameter og sympathovagalbalanse ulike grader av opphisselse. Det er fortsatt uklart i hvilken grad søvn også danner et kontinuum av hjernestater - hvor grad av motstandskraft mot sensoriske stimuli og oppløselighet, og kanskje andre søvnfunksjoner, varierer gradvis - og hvordan perifere fysiologiske tilstander varierer. Forskning som fremmer metodene for å overvåke flere parametere under søvn, samt tilskrivning av konstellasjoner av disse funksjonsegenskapene, er sentral for å forfinne vår forståelse av søvn som en multifunksjonell prosess hvor mange gunstige effekter må være executed. Å identifisere nye parametere som karakteriserer søvntilstander, vil åpne muligheter for nye diagnostiske veier i søvnforstyrrelser.

Vi presenterer en prosedyre for å beskrive dynamiske variasjoner av mus-ikke-REM søvntilstander via den kombinerte overvåking og analyse av elektroencefalogram (EEG) / elektrokortikogram (ECoG), elektromyogram (EMG) og elektrokardiogram (EKG) signaler ved hjelp av standardpolysomnografiske opptaksteknikker. Ved å bruke denne tilnærmingen fant vi at mus-ikke-REM-søvn er organisert i sykluser av koordinerte nevrale og hjerte-svingninger som genererer suksessive 25-s intervaller med høy og lav sårbarhet til ytre stimuli. Derfor er sentrale og autonome nervesystemer koordinert for å danne adferdsmessig forskjellige søvntilstander under konsolidert ikke-REM-søvn. Vi presenterer kirurgiske manipulasjoner for polysomnografisk ( dvs. EEG / EMG kombinert med EKG) overvåkning for å spore disse syklusene i fritt sovende mus, analysen til quantiFy deres dynamikk, og de akustiske stimuleringsprotokollene for å vurdere sin rolle i sannsynligheten for å våkne opp. Vår tilnærming har allerede blitt utvidet til menneskelig søvnløshet og løfter å løse vanlige organiseringsprinsipper for ikke-REM søvntilstander hos pattedyr.

Introduction

Mammalssøvn er en atferdsrelatert hvilestilstand og motstandsdyktighet overfor miljøstimuli. Til tross for denne tilsynelatende ensartethet, indikerer polysomnografiske og autonome parametre at søvn beveger seg mellom kvalitativt og kvantitativt forskjellige nevrale og somatiske tilstander på ulike tidsmessige og romlige skalaer 1 . I løpet av minutter til tiotre minutter skjer bryteren mellom ikke-REM og REM søvn. Ikke-REM-søvn er ledsaget av stor amplitude, lavfrekvent aktivitet i EEG, med en spektral topp rundt ~ 0,5-4 Hz, mens REM-søvn viser vanlig EEG-aktivitet i theta-båndet (6 - 10 Hz), sammen med Muskel atonia 2 . Innenfor ikke-REM-søvn, sykler mennesker gjennom lys (S2) og dyp, langsom bølge søvn (SWS). Som deres navngivning indikerer, viser disse to stadiene lavere og høyere opphissetærskler 3 , 4 , og de avviker primært i tettheten av lavfrekvensEncy cortical EEG power, referert til som slow-wave aktivitet (SWA; 0,75 - 4 Hz). Ujevnhet vedvarer i løpet av individuelle runder av S2 og SWS i minutt- til sekundær-tidsskala, så omfattende dokumentert av den variable tilstedeværelsen av SWA i løpet av en bout 5 , 6 , men også ved EEG og feltpotensialer ved Høyere frekvenser, inkludert spindelbølger i sigma-båndet (10-15 Hz) og gamma-rytmer (80-120 Hz) (for en gjennomgang, se 7 , 8 , 9 , 10 ).

I stedet for å være subtile, forskyver disse variasjonene den sovende kortikale tilstanden hos mennesker til ekstremer av spektret. For ikke-REM-søvn, spenner disse seg fra en overvekt av SWA til stater som omtrentlig våkneraktivitet fordi de inneholder en betydelig andel av høyfrekvente komponenter 11 12 . Hos gnagere og katter, selv om ikke-REM-søvn ikke er delt inn i trinn, oppstår en kort periode som kalles mellomliggende søvn (IS) før REM-søvninngang 13 . Under IS opptrer REM søvnfunksjoner som hippocampal theta aktivitet og ponto-geniculo-occipitale bølger, mens ikke-REM søvn signaturer, som spindelbølger og SWA, fremdeles er tilstede, hvilket indikerer en blanding mellom de to søvntilstandene 14 , 15 . Ikke desto mindre kan IS være funksjonelt distinkt fordi det moduleres av antidepressiva midler 16 og gjennom ny objektpresentasjon under tidligere våkne 17 , og det bidrar til å sette opp oppusningsgrensen 18 . Videre viser statlige tomter av EEG og EMG parametere for fritt bevegelige rotter en klynge av punkter 14 som er kontinuerlig mellom ikke-REM søvn, REM søvn og våkenhet. Det er også sporadiske nedgang i SWA uten å gå inn i våkenhet eller REM søvn, noe som fører til store svingninger i den relative forekomsten av lav- og høyfrekvente komponenter under en konsolidert ikke-REM-søvn kl 14 , 19 , 20 . Endelig forekommer variable variabler av SWA og høyere frekvensrytmer under ikke-REM-søvn ikke bare i tid, men viser også regionale forskjeller i amplitude og synkronisering mellom kortikale områder 19 .

Mammalian non-REM søvn er langt fra uniform. Imidlertid er det ikke klart om en slik ujevnhet fører til stater som er forskjellig i funksjon og atferdsmessige egenskaper. I flere typer søvnforstyrrelser blir kontinuerlig søvn forstyrret av spontane oppvåkninger og upassende motorisk adferd. Videre viser spektralanalyser endringer i den relative forekomsten av høyere frekvenser i EEG 21Og i autonome parametere, for eksempel pustehastigheter og hjerteslag 22 . Den ordnede sekvensen av stabile søvntilstander blir således forstyrret, og elementer av kortikal og / eller autonom opphisselse inntrer på en ukontrollert måte. Derfor er forståelse av kontinuum i søvntilstandene mulig for sykdom. I tillegg er forstyrrelsen av søvn ved miljøstøy i urbane omgivelser forbundet med generelle helserisiko, noe som gjør det avgjørende å identifisere øyeblikk av økt sårbarhet i søvn 23 .

Behavioral arousalforsøk hos sovende mennesker indikerer at det er vanskeligst å våkne opp fra SWA-dominert ikke-REM-søvn (stadium S3), mens lys ikke-REM-søvn (stadium S2) og REM-søvn viser sammenlignbare og lavere opphissetærskler 4 . Den kortikale behandlingen av korte lydstimuli varierer vesentlig mellom REM-søvn, S2 og S3 24 ,25 , som indikerer at statsspesifikke kortikale aktivitetsmønstre modulerer de første stadier av sensorisk behandling. For ikke-REM søvn hos mennesker varierer tilbøyelighet til å våkne opp som følge av støy med tilstedeværelsen av spindelbølger og alfa-rytmer i EEG 26 , 27 , 28 . Thalamocortical rytmicitet under spindler ledsages av forbedret synaptisk inhibering ved både thalamid og kortikale nivåer, som antas å bidra til demping av sensorisk behandling 7 .

Hvordan er støyresistente og sårbare søvnperioder organisert i tide, og hva er deres determinanter? I både mus og menneske identifiserte vi nylig en infra-langsom, 0,02-Hz oscillasjon i nevrale rytmer. Avhengig av fasen av denne 0,02-Hz-oscillasjonen viste musene variabel reaktivitet mot ytre stimuli, enten å våkne opp eller sove tråGh støyen. Interessant nok var denne svingningen korrelert med hjerteslagets hastighet, noe som indikerer at det autonome nervesystemet deltar i moduleringen av søvn sårbarhet for ytre stimuli 1 . Hjerte-relaterte hippocampale rytmer ble også organisert innenfor denne rytmen, og mest påfallende styrket sin styrke sammen med kvaliteten på minnekonsolidering hos mennesker. Den 0,02 Hz-svingning ser således ut til å være et organiserende prinsipp for gnagere og human ikke-REM-søvn som modulerer både følsomhet for miljøet og internminnebehandling. Dette fremhever igjen behovet for multiparametriske og kontinuerlige vurderinger av søvntilstander for å gjenkjenne deres funksjonalitet og å identifisere steder med potensielt sårbarhet.

Her presenterer vi en prosedyre for å trekke ut bølgeformen til disse dynamikkene, inkludert kirurgisk implantasjon av mus for kombinert EEG / ECoG og EMG-EKG-målinger, eksponering for sensoriske stimuli, enNd analyse rutiner. Denne prosedyren gir grunnlag for visning av søvn som en kontinuerlig varierende, men høyt organisert årvåken tilstand under hvilken forskjellige fundamentale søvnfunksjoner utføres i rekkefølge. Mer generelt er prosedyren anvendelig for tilnærminger som tar sikte på å trekke ut spektrale og autonome trekk som går utover et atferdsutfall under søvn i både helse og sykdomstilstander.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført i samsvar med dyrepleieutvalget for Lausanne og Tjenesten de la Consommation et des Affaires Vétérinaires av Canton de Vaud.

1. Kirurgi for EEG / EMG-EKG-opptak

  1. Dyrehus og utvalg.
    1. Oppbevar dyr (C57Bl / 6J, 7 - 9 uker, 25 - 30 g) i en 12: 12-h mørk / lys syklus, enkelt innkapslet, og under standardbetingelser (40% fuktighet, 22 ° C) med mat og vann Tilgjengelig ad libitum .
    2. Bruk bare mannlige emner for å unngå all påvirkning av hormonell syklus i søvn.
  2. Fremstilling av elektroder.
    1. Bygg EEG / ECoG-elektroder (brukt i trinn 1.3.11) ved hjelp av 0,5 cm lange stykker gulltråd (75% Au, 13% Ag og 12% Cu, Diameter: 0,2 mm), hver loddet på toppen av et gull -platert stålskrue (3 mm lengde, 1,1 mm diameter ved foten, se FigurE 1). Forbered 2 EEG-elektroder per dyr og rengjør dem i 70% etanol.
    2. Forbered EMG-EKG-elektroder med 3 - 4 cm lange gullledninger (75% Au, 13% Ag og 12% Cu, Diameter: 0,2 mm). Bøy ledningene 90 ° vinkel 1 cm fra den ene enden og lag en spole (1 - 2 mm ø) i den andre enden ( Figur 1 ). Mellom de to ender, bøy ledningen for å lage en liten krumning som tilsvarer overflateprofilen til beinet mellom cerebellum og lambda.
      1. Klargjør 2 EMG-EKG-elektroder per dyr.
    3. Forbered en 6-kanals hunnkontakt til mannlig hodet (raster: 2,54 mm x 2,54 mm, størrelse: 5 mm x 8 mm x 9 mm, stiftstørrelse: 5 mm, se figur 1 ).
      1. Dekk stikkontakten på bunnen av både kvinnelige og mannlige pinner med tape.
      2. Legg til en liten mengde loddingstråd til spissene på 4 av de 6 hanpinnene for å hjelpe til med lodding av EEG- og EMG-EKG-elektrodene under operasjonen(Se trinn 1.3.16).

Figur 1
Figur 1 . Skjematisk visning av områdene for EEG- og EMG-elektrodeimplantasjon på musens skalle.
Craniotomier # 1 og # 2 er plassert ~ 2 mm lateral til midtlinjen og ~ 2 mm rostral til bregma. Craniotomier # 3 og # 4 er plassert ~ 2 mm rostral til lambda og er henholdsvis 4 og 2 mm laterale til midtlinjen. De to EEG-elektrodene, laget av lodding en gulltråd til toppen av en gullbelagt stålskrue (# 2 og # 4), er på høyre halvkule. De 2 venstre skruene (# 1 og # 3) fungerer som støtter. Merk at EMG-EKG-elektroder ikke skal komme i kontakt med disse 2 støtteskruene. EMG-EKG-elektroder er 3 - 4 cm lange gullledninger, bøyde 90 ° vinkler over 1 cm på deres rostre ender og viklet (1 - 2 mm ø) på de kaudale ender. 2 EEG og 2 EMG elektrodeneS er koblet til 2 x 3-kanals hodetelefonkontakt ved lodding av en ledning til en hjørnetap, som vist med strekte linjer. Ytterligere detaljert informasjon om disse elektrodene og deres implantasjon kan bli funnet I 29 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Implantasjon kirurgi.
    1. Bedøve dyret i en isofluran induserende kammer (4. - 5.% isofluran + O 2 til 1 - 2 l / min i løpet av 3-4 minutter). Injiser 5 μg / g karprofen intraperitonealt (ip) ved fjerning av musen fra kammeret, før stereotaksisk fiksering.
    2. Følg standard prosedyrer for å fikse musen på stereotaksisk apparat. Opprettholde isoflurananestesi gjennom en gassmaske (3% isofluran + O 2 under fiksering ved 1 liter / min). Oppretthold kroppstemperaturen gjennom operasjonen ved 37 ° C usinGa varmepute.
      1. Beskytt øynene fra å tørke ut ved å bruke vitamin A-salve. Kontroller nivået på kirurgisk toleranse av dyret ved å teste paw-tilbaketrekningsrefleksen.
    3. Fest hodet ved å plassere ørebjelkene på skallen med de stumpe, bakre endene i stedet for deres tips (uten å komme inn i ørekanalerne) 29 . Plasser munnstangen (som vanlig) for å sikre hodehøyhet.
      MERK: Fiksering minimerer skade på ørene, noe som er viktig for de akustiske opphissingsforsøkene (se avsnitt 4 i denne prosedyren).
    4. Overvåk dyrets respirasjon under prosedyren, som skal forbli på ~ 2 - 3 puste / 2 s. Juster isoflurankonsentrasjonen i gassdispenseren om nødvendig; Det bør reduseres litt etter litt under operasjonen, fra 3% under fiksering til 1,0 - 1,5% mot slutten av prosedyren.
    5. Injiser 100 μl 0,9% NaCl ip en gang per time ved hjelp av en ultrafint insulinN sprøyte for å holde dyret hydrert.
    6. Sørg for at dyrets hode lyser med en lys lyskilde.
    7. Rengjør området med 70% EtOH og jodbasert desinfeksjonsmiddel (våt pels hindrer at håret kommer inn i kirurgisk vindu).
    8. Løft huden i midten av skallen med Adson pincet og kutt forsiktig den løftede delen av huden langs midterlinjen, fra toppen av nakken til øynene, ved hjelp av fin saks. Fjern hodebunnen (~ 1 cm anteroposterior, ~ 0,5 - 0,8 cm lateral).
      1. Sørg for at vinduet er stort nok (mot begge sider) for å se bregmaen og lambdafissurene på skallen. Fest huden på begge sider med bulldog serrefiner for å sikre tilgang til beinet.
    9. Fjern konjunktivvevet (periosteum) ved å forsiktig skrape med en skalpell. Rengjør området med jodbasert desinfeksjonsmiddel og tørk skallen med en antiseptisk vattpinne.
    10. Bruk et skarpt skalpelsblad (størrelse 15), skrap sKull for å oppnå en renset og mattifisert beinoverflate. Ved å bruke bare skalpespissen, skrape et rutenett-lignende nettverk av spor, med en avstand på ~ 1 - 2 mm mellom sporene.
      MERK: Dette forbedrer vedlegget av to-komponent epoksy lim til skallen i trinn 1.3.15.
    11. Bruk en mikrodrill med en 1/005 borestørrelse for å utføre 4 craniotomier (~ 0,7 mm ø) i skallen på bestemte steder ( Figur 1 , se også punkt 1.3.11.3.). Blås bort benstøv med en Pasteur pipette og rengjør blødning med antiseptiske vattpinner.
      1. Hvis det oppstår blødning, må du sørge for at den stoppes helt før prosessen gjenopptas. Bruk en hemostatisk svamp for å akselerere hemostase.
      2. Bruk de to craniotomiene på høyre halvkule for å sette inn skruelektroder (craniotomies # 2 og # 4).
      3. Bruk de to craniotomiene på venstre halvkule for å sette inn forankringsskruer som stabiliserer implantatet (craniotomies # 1 og # 3).
        MERK: For å økeSe stabilitet, har det vært brukt inntil 4 forankringsskruer 29 .
        MERK: De nøyaktige stereotaksiske koordinatene er: 2 mm fra midtlinjen på begge halvkule og 2 mm rostral fra bregma (kraniotomier nr. 1 og nr. 2), 2 mm rostral fra lambda og 4 mm lateral venstre fra midtlinjen (kraniotomi nr. 3) 2 mm rostral fra lambda og 2 mm lateral-rett fra midtlinjen (kraniotomi # 4). Se figur 1 .
    12. På venstre halvkule, skru to gullbelagte skruer gjennom craniotomier for støtte.
      1. Fest skruen i en hemostatisk klemme og hold den vertikalt over craniotomi. Forsiktig nærmer bunnen av skruen på toppen av craniotomi. Roter det mens det ikke avviker fra vertikal stilling.
        MERK: Bare 1,5 rotasjoner er tilstrekkelige for å oppnå god mekanisk stabilitet og signaler av høy kvalitet samtidig som trykk på underliggende vev 25 minimeres.
      2. Til høyre, skru av formenViously prepared electrodes (beskrevet i trinn 1.2.1) gjennom craniotomies.
    13. Ved hjelp av tanger, løft forsiktig hudens kant fra nakke muskler. Sett inn EMG-EKG-ledningene, med spolene i musklene (venstre og høyre). Lim middelene til skallen slik at venstre EMG-EKG kommer ut ved siden av den bakre venstre forankringsskruen, mens høyre EMG-EKG er plassert ved siden av den forreste venstre forankringsskruen.
    14. For å oppdage EKG-signaler fra hjertet under søvnen, sørg for at EMG-EKG-ledningene settes inn i muskelen til en dybde på ~ 0,8 - 1 cm, med sløyfenes ende så langt fra hverandre som mulig.
    15. Bruk en spatel som er dekket med to-komponent epoksy lim for å påføre limet på skallen mellom og rundt skruene. La det tørke i lyset, men beskyt dyrets øyne mot for mye lyn.
      MERK: Skruens baser skal være dekket, og bare ledningene skal være tilgjengelige, fremvoksende frOm limet.
    16. Pass på at limet fyller mellomrom mellom de to EMG-EKG-elektrodene som strekker seg fra overflaten, slik at det ikke er elektrisk kontakt mellom dem og støtteskruene. Betal forsiktig å ikke lim huden til skallen; Huden bør forbli fri for å bevege seg rundt limen.
    17. Klipp EEG- og EMG-EKG-ledningene slik at de når ~ 0,5 mm ut av limen. Løs de fire pinnene på hjørnet av kontakten utarbeidet i trinn 1.2.3. Til de fire ledningene som kommer fra limet ( figur 1 ).
      1. Prøv å plassere kontaktstiftene så tett som mulig for å minimere implantatets høyde; Bruk en liten krokodilklemme festet til stereotaktisk holderen som opprettholder kontakten. Minimer tiden som er i kontakt med loddespissen, da dette raskt oppvarmer skruene.
    18. Fyll mellomrommet mellom limet og kontakten med dental sement for å dekke de loddede delene. Lag smooAnsikter og unngå skarpe kanter som kan skade dyret. Videre unngå å berøre huden, da dette fører til kløe.
    19. Fjern bulldog serrefiner. Hvis nødvendig, lukk såret ved hjelp av en steril suturtråd (absorberbar suturfiber) foran og bak kontakten, og opprett enkle, avbrutt lukkemønster og to firkantede knuter (5-0 FS-3 nål, 45 cm filament).
    20. Overvåk dyret til det er helt våken. Veie dyret etter operasjonen og returner det til sitt hjem bur for gjenoppretting.
  2. Postoperativ omsorg og tilkobling til systemet.
    1. Overvåk dyret hver dag i en uke. Se etter vekttap, redusert eller unormal aktivitet, og tegn på infeksjoner. Følg scoring prosedyren fastsatt av veterinærmyndighetene.
    2. 5-6 dager etter operasjonen, koble opptakskabelen til hodetelefonkontakten på dyret, og la det være i hjemmet. Vent en ekstra 4 - 5 dager før begynnelsen av recorDing slik at dyret er vant til tilstanden og sover naturlig.

2. Grunnleggende scoring av EEG / EMG-EKG-data for Vigilance State Determination

  1. Registrer EEG- og EMG-EKG-data over 48 timer med en kommersiell polysomnografisk programvare ( f.eks. Somnologica, SleepSign eller Sirenia). Bruk typiske innstillinger, for eksempel 2.000x gain; En 2000-Hz samplingsfrekvens ved oppkjøp, ned samplet til 200 Hz etter oppkjøpet; Og et 0,7-Hz høypassfilter for EEG og et 10 Hz høypassfilter for EMG-EKG.
  2. Eksporter dataene i filformatet ".edf".
  3. Åpne ".edf" -filene med en skreddersydd (for eksempel i Matlab) programvare som semi-automatisk klassifiserer hver 4-epoke som våken, ikke-REM-søvn, REM-søvn og tilhørende gjenstander.
    MERK: Alternativt finnes det flere semi-automatiserte scoring-programmer. Denne prosedyren beskriver noen av de grunnleggende trinnene som må gjøres for å sette opp scoring wMed scoring programvare brukt her; Andre semi-automatiske scoring-systemer kan være basert på andre parametere.
  4. Ved hjelp av programvaren, skilles ".edf" -filene inn i 4 ganger 12 timer med opptak.
    1. Fjern gjenstander som oppstår fra EMG-ECG-aktivitet som er tilstede i EEG-signalet eller fra en ikke-tilordnet adferdsstatus 1 , 29 .
    2. Beregn gjennomsnittet av absolutt EEG (EEG gjennomsnitt ) og EMG (EMG gjennomsnitt ) verdier over de 12 timers innspillingene fra henholdsvis EEG og EMG-EKG sporene.
    3. Identifiser de gjennomsnittlige EEG / EMG verdiene for hver 4-epoke (EEG epok / EMG epok ).
    4. Klassifiser epoker som "Wake" når EEG epok <EEG middel og EMG epok > EMG betyr og som "Non-REM søvn" når EEG epok > EEG middel og EMG epok <EMG betyr.
    5. Klassifiser epoker som ikke er s Atisfy disse kriteriene med en korrigeringsalgoritme basert på foregående og etterfølgende epoker.
    6. Klassifiser epoker som REM søvn når EEG epok <EEG middel og EMG epok <EMG betyr .
    7. Avgrens de kritiske punktene, for eksempel overganger fra ikke-REM-søvn for å våkne, REM-søvnepoker og mikro-arousaler under ikke-REM-søvn. Visuelt inspiser poengsummen for å sikre riktig årvåkenhetsbestemmelse 29 , 30 .
      MERK: Utfør alltid en endelig visuell inspeksjon og validering av scoring.

3. Analyse av infra-langsom oscillasjon for EEG og hjerteslag

  1. For denne analysen, velg bare ikke-REM søvnmatcher som varer ≥ 96 s ( dvs. minst 24 epoker på 4 s); Se figur 2 .
    MERK: Tilpassede rutiner er tilgjengelig på forespørsel 1 .
ve_content "> Figur 2
Figur 2 . Bestemme Sigma Power Dynamics under uforstyrret, ikke-REM Sleep.
( A ) Top, EEG (svart) og EMG-EKG (grå) spor i løpet av de første 100 min av lysfasen i en mus. Vikilance stater er indikert av den fargede linjen på toppen av de rå sporene. Midt, typisk eksempel på en kontinuerlig (> 96 s) ikke-REM søvnkamp. Bunn, et tilfeldig valgt, 16-s intervall som illustrerer underavsnittet i 4-s epoker. Følgende trinn i analysen er kun vist for disse fire epokene, men det gjelder for hver epoke som finnes i spillet. ( B ) Topp, fire påfølgende FFT generert fra 4-epokene vist i bunnpanelet på A. Sigma-båndet (10-15 Hz) er skygget i rødt. Øverst til høyre, 1-s-innspill fra siste epoke som viser de tilstedeværende R-bølgene i det kvadratiske EMG-EKG-signalet. Bunn, tidskurs av Sigma-kraften hentet fra det tilsvarende spektrum ovenfor. De stiplede linjene illustrerer fortsettelsen av kraftverdiene før og etter de fire ikke-REM-utgangene som er valgt for visning. ( C ) Normalisert sigma kraft (rød) og hjerterytme (i BPM) (grå) tidskurs, med delen vist i (B) plassert mellom de vertikale strekkede linjene. Nedenfor er det tilsvarende filtrerte EEG-signalet i sigmabåndet (10-15 Hz). ( D ) Resultat av FFT beregnet på sigma strømtidsforløpet vist i (C), som demonstrerer en dominerende topp ved 0,016 Hz. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Utdrag kraftverdiene for segma frekvensbåndet (10-15 Hz) spektralkraft i 4-s-bokser ( Figur 2 A og B ) ved hjelp av beregninger av rask Fourier-transformasjoner (FFT)"> 1.
  2. Beregn baseline spektral effekt for ikke-REM søvn ved å gjennomsnittlig verdiene i hver frekvensfelt for alle ikke-REM sove epoker (artefakter og epoker for overgang mellom årvåken stater er utelukket fra denne gjennomsnitt). Normaliser segmakraftverdiene for hver epoke til den gjennomsnittlige effekten av sigma-båndet under ikke-REM-søvn i løpet av interessetiden. Plot mot tid ( figur 2 C ).
  3. Beregn FFT i Sigma Power Time Course med Hamming Windowing for å avsløre oscillatorfrekvenskomponentene i kraftdynamikken ( Figur 2 D ) 1 .
  4. Vær oppmerksom på at siden de ikke-REM søvnmottakene har forskjellige varigheter, har de resulterende FFT'ene forskjellige frekvensoppløsninger. Interpolere for å justere oppløsningen til den høyeste som er oppnådd fra den lengste ikke-REM søvnkampen, og gjennomsnitts FFTs for alle runder.
  5. Fortsett denne analysenEs for å beskrive faseforholdene mellom dynamikken til EEG- og EKG-signaler.
  6. Trekk hjerteslagdata fra det kvadratiske EMG-EKG-signalet etter 30 Hz høypassfiltrering, ved hjelp av passende rutiner for toppdetektering av R-bølgen.
    MERK: Begrensning av minimum tidsintervall mellom to påfølgende R-bølger til 80 ms bidrar til å unngå å inkludere sporadiske artefaktive topper på grunn av muskelforstyrrelser 1 .
  7. Mål RR-intervaller og beregne gjennomsnittlig hjertefrekvens i slag per minutt (BPM) hver 4-s-kasse ( Figur 2 B og C ).

4. Eksponering for støy

  1. Generer lyder (dvs. hvit støy) gjennom en skreddersydd programvare. Still inn varigheten til 20 s og intensiteten til 90 dB SPL (målt inne i buret). Spill lydene gjennom standard aktive høyttalere 1 .
  2. Etter operasjonen, under oppmøtet til recorDing tilstand, spill eksperimentelle lyder tilfeldig, flere ganger i løpet av dagen og på forskjellige øyeblikk 1 .
  3. I eksperimentell tilstand (under innspilling av EEG / EMG / EKG-data), spill støy pseudo-tilfeldig i løpet av de første 100 min ved lysoppstart (ZT0). For å spille av lyden, oppfyll følgende forhold 1 :
    1. Kontroller at musen har vært i ikke-REM-søvn for> 40 s.
    2. Sørg for at den forrige eksponeringen skjedde mer enn 4 minutter før.
      MERK: Dette resulterer i ~ 15 eksponeringer per økt.
  4. Merk starten på opptakstiden og starten på hver støyeksponering. Hold eksperimentet blind til spektral sammensetning av ikke-REM søvn under prosedyren.
  5. Skaff alle data med polysomnografisk programvare 1 , 29 .

5. Retrospektiv analyse av søvn basert på adferdsutfallet underEksponering for støy

  1. Manuell score EEG / EMG-ECG spor i en 4-s oppløsning, uten kjennskap til støy eksponeringstider 1 .
  2. Bruk et skreddersydd skript for å trekke ut EEG / EMG-ECG / støyeksponeringsdataene 1 .
  3. Score som gjennomløp når både EEG- og EMG-signalene forblir uendret under støyeksponering ( Figur 3A ). Tenk på en våkne når EEG-amplitude avtar og EEG-frekvensen øker, i kombinasjon med detektert muskelaktivitet på EMG-EKG-elektroden ( figur 3B ).
  4. Kast forsøk der dyr våknet opp i pre-stimulusperioden eller i de første 4 s med støyeksponering ( Figur 3D ).
  5. Definer suksessfrekvensen som andel av våkneforsøk i alle inkluderte forsøk ("Wake-up" og "Sleep-through").
  6. I alle inkluderte forsøk, undersøk dynamikken til sigmakraften under denE pre-stimulus periode ( Figur 3 E ) 1 .

Figur 3
Figur 3 . Atferdsmessige resultater som svar på støybegynn: Representative resultater som ble beholdt eller utelatt fra analyse.
( AD ) Råspor av EEG (svart) og tilsvarende EMG-EKG (grå) signaler i 40 s før støynivået og i løpet av 20 s av støy, representert ved det blåskjermede området. Vikilance-statene er angitt i fargekoden. For å illustrere data som ble inkludert i analysen, vises representative "Sleep-through" ( A ) og "Wake-up" ( B ) hendelser. Resultatene som ble kassert inneholdt overganger til REM-søvn ( C ) og et tidligere "Wake-up" -svar ( D ). Innlegget viser en ekspansjonDed del av EEG og EMG-EKG spor som er karakteristisk for REM søvn. ( E ) Typiske eksempler på sigma-effektdynamikk i 40-tallet vinduet før støyutbrudd under "Sleep-through" (venstre) og en "Wake-up" (høyre) hendelse. Det raske EEG-sporbåndspassfilteret for segma-båndet er vist ovenfor. Det blå området representerer støynivået. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 2 A (topppanel) viser 100 minutters strekk av spontan sleep-wake-oppførsel, registrert gjennom polysomnografiske elektroder implantert som beskrevet (se figur 1 ). Økningen og reduksjonen av EEG og EMG amplitude ved ikke-REM søvnbetennelse er tydelig synlig. Intermitterende REM søvn er preget av en reduksjon i EEG amplitude og en ytterligere reduksjon i EMG tone som ikke er synlig på denne komprimerte tidsskalaen. Zooming inn på en ikke-REM-søvnkamp avslører de langsomme bølgene med høy amplitud i EEG og i EMG-EKG-sporet den lave muskelaktiviteten som RR-intervaller på hjertefrekvensen overfører som vertikale avbøyninger ( figur 2 A , Mellom og nedre paneler). En FFT avslører dominans av SWA gjennom alle 4-s epoker ( figur 2 B ). Plotting the mean sigmEn kraft (10-15 Hz, rød skyggebøyle) for hver av disse epoker viser sin varierende tidskurs, sammen med variasjoner i hjertefrekvens med motsatt retning. Gjennomføring av denne analysen over hele ikke-REM-utløpet og normalisering for å bety effektverdier unravels de vanlige variasjonene i sigmakraft rundt gjennomsnittet ( figur 2 C ). Fourier-analyse over dette strømtidsforløpet viser en stor topp rundt 0,02 Hz, noe som reflekterer den periodiske økningen av sigmakraft i 50-s intervaller ( figur 2D ).

For å undersøke funksjonen av 0,02 Hz-svingning i arousability ble mus utsatt for 20 s pulser på 90 dB når de sov, i henhold til de beskrevne forhold. Figur 3 viser noen av de eksperimentelle resultatene av slike støyeksponeringer. Når musene ikke våknet opp under støyen, og EEG og EMG-EKG-bølgeformer forblir uendret, var utfallet klassenIfied som "Sleep-through" ( Figur 3 A ). Når EEG-amplituden ble redusert og EMG-aktivitet ble observert, ble resultatet utført som en "Wake-up" ( figur 3B ). Av og til byttet musene seg til REM-søvn under en prøveperiode ( Figur 3C ) eller våknet i 40-s-intervallet før støynivået ( Figur 3 D ). Disse hendelsene ble utelukket fra analysen, fordi vår interesse var spesielt å identifisere kjennetegnene for konsolidert ikke-REM-søvn som går ut av resultatet av støyeksponering ("Sleep-through" eller "Wake-up"). Beregning av sigmakraften i 40-tallet før støystimulering viste at 0,02 Hz-svingningen var i sin trough når det var "Sleep-through" ( Figur 3 E , venstre panel), mens det toppet for en "Wake- opp&#34; Hendelse ( figur 3 E , høyre panel). Derfor identifiserer fasen av 0,02 Hz-svingningen i sigmakraft som et kjennemerke for søvntilstander med variabel motstandsdyktighet overfor støy, ved å markere en muses ikke-REM-søvn i ettertid, basert på et variabelt atferdsutfall til akustisk stimulering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her viser vi hvordan man etablerer en kontinuerlig tidsmessig profil for ikke-REM-søvn som integrerer EEG-, EMG- og EKG-variabler. Dette er et første skritt mot å utvikle en integrert beskrivelse av musesøvn, noe som kan bidra til å identifisere den tidligere ukjente tidsskala over hvilken høy og lav motstandsdyktighet til støy er organisert under ikke-REM-søvn 1 . En lignende tidsstruktur ble også beskrevet i human ikke-REM søvn gjennom en analog analyse 1 .

Prosedyren som presenteres her oppfyller to mål. Først tar vi oppmerksomhet på at polysomnografiske teknikker på pålitelig måte kan gi både EEG- og EMG-EKG-signaler i løpet av hele ikke-REM-søvnperioder i mus. Hjertefrekvensen er mest tydelig i EMG-spor under REM-søvn på grunn av muskelatonien, og det blir mer skjult i ikke-REM-søvn på grunn av økt muskelton og sporadiske muskeltrakt. Innsetting av EMG-EKG-elektroder merDypt inn i muskelen og holde dem så fjernt som mulig, øker amplituden til hjertets R-bølger, slik at de kommer tydelig ut fra bakgrunnsmuskeltonusen. Rutiner for toppdeteksjon trekker deretter hjertefrekvensen fra EMG-EKG-signalet fra ikke-REM-søvn og tillater kvantifisering av dets variabilitet.

Telemetribaserte teknologier for samtidig monitorering av EEG / EMG og EKG brukes i økende grad, men kvaliteten på signaler som kreves for grundig spektralanalyse, forblir dårligere når det gjelder båndbredde og stabilitet. Videre er selv enkeltkanal-sendere av betydelig størrelse, og deres implantasjon i den cervicale subkutane regionen eller i kroppshulen kan påvirke dyrets velvære og forstyrre søvnen. Ikke desto mindre er det nødvendig å videreutvikle slike anordninger for å utvide rekkevidden av sentrale og autonome parametere som samtidig kan følges under uforstyrret søvn hos mus, som er dyrmodellen av cHoice for søvnstudier. I kombinasjon med teknikker som nakkestøtter, som muliggjør innsamling av data fra både ikke-REM og REM søvn hos mus med uendrede spektralprofiler 1 , 19 , kan multiparametriske målinger i søvn nå kombineres med kontrollert atferdstesting.

For det andre kan den analytiske tilnærmingen vi presenterer her også brukes til lokale feltpotensialer for å definere hjernen som er involvert i å generere kjennemerket av interesse 1 . Videre gjelder det for imaging teknikker raskt nok til å rapportere om spektral oppførsel av nevronpopulasjoner og for både kontinuerlige ( f.eks. Spektrale bånd) og diskrete ( f.eks. Puls eller respirasjon) variabler. Tidsoppløsningen er bare begrenset av varigheten av epoken som er valgt for å score årvåken. I hovedsak er standard spektralanalyser av signaler avledet fra ikke-REM sLeep bouts blir fulgt av en justering av effekt tetthet verdier av individuelle signaler for hver epoke. Deretter brukes en spektralanalyse av disse kraftdynamikkene til å kvantifisere periodiciteter i strukturen. I både mus og mennesker ga vår tilnærming en 0,02 Hz-svingning, med sammenlignbare egenskaper 1 , som kvalifiserte det som et samlende kjennemerke for søvnstrukturen i pattedyr.

Et kritisk trinn var den funksjonelle valideringen av den observerte periodiciteten ved å scorer ikke-REM-søvn i ettertid basert på den adferdsmessige reaktiviteten til den sovende musen til støy. Her var valget av støystimulering som førte til en variabel atferdsmessig utfall, som forårsaket wake up eller sleep-through, avgjørende. Sterke sensoriske stimuli som forårsaker oppvåkning i de fleste eksponeringer, ville ikke unravele 0,02 Hz-svingningen, fordi wake-up ville bli håndhevet fra alle faser. I motsetning til dette ville en for svak stimulus ikke konsekvent avsløre faseforholdet til 0,02-Hz oscillation. På samme måte vil enhver observert periodicitet i et målt parameter sett måtte gå sammen med det variable utfallet. For eksempel, i tilfellet som presenteres her, har vi bare skilt mellom våkne- eller sovende hendelser, ikke i betraktning det eksakte øyeblikket av oppvåkning under støyeksponeringen eller varigheten av den påfølgende våkne tilstanden (se imidlertid 1 ) . Ved hjelp av korte stimuli ved forskjellige intensiteter 24 , 25 , 28 kan det bidra til å avgrense nøyaktige faseforhold mellom 0,02 Hz-svingning og vekking. Videre kan variasjon av lydsammensetningen av lydene modulere arousability som en funksjon av den siste historien om søvnvåkningsadferd, kjønn, tilstedeværelse av nestlinger eller andre former for nyere erfaring. En annen mulighet kan være å undersøke hvorvidt forekomsten av mikroarousaler eller fulle opphisselser avhenger av en gitt øyeblikkelig søvntilstand. Scoring av søvn basert på en variabel atferdsmessig utfall kunne belyse den funksjonelle mikroarkitekturen av søvn mer generelt. Mens vi og andre har testet reaktivitet overfor støyeksponering 1 , 28 , våkne opp som svar på andre sensoriske modaliteter, overvåkningstilstandsoverganger 14 eller drøftsrapporter kan vurderes for å trekke ut de tilsvarende korrelatene til foregående søvn. Videre vil det være veldig interessant å teste søvnforstyrrelser med hensyn til deres følsomhet overfor ekstern forstyrrelse og potensiell forstyrrelse av 0,02 Hz-svingningen. Søvnforstyrrelser kan føre til kardiovaskulær forstyrrelse, mens kardiovaskulær risiko kan føre til søvndysregulering 31 , 32 , som gjengir undersøkelser på hjernekoordinasjonen under 0,02 Hz-svingning som er potensielt relevant for å forstå denne bidireksjonenJeg er avhengighet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi takker alle laboratoriemedlemmer for deres bidrag til å skrive og omhyggelig lese av dette manuskriptet. Vi er takknemlige for Paul Franken for å stimulere diskusjoner, Dr. Gisèle Ferrand for nyttige kommentarer om den kirurgiske protokollen, og Dr. Jean-Yves Chatton for å levere de opprinnelige Labview-kjørbare filene for støyeksponeringen. Finansiering ble gitt av Swiss National Science Foundation (Grants 31003A_146244 og 31003A_166318) og Etat de Vaud.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-components epoxy glue Henkel Loctite EA 3450
Absorbable Suturing Fiber (Prolene) Ethicon 5-0 FS-3
Adson Forceps FST 11006-12
Antiseptic swab VWR 149-0332
Attane Isoflurane Piramal Isoflurane 250mL
Connectors 3 x 2-channels ENA AG 2.316 Raster 2.54 x 2.54 mm; size 5 x 8 x 9 mm; pin size 5 mm; http://www.ena.ch/
Dragonfly commutator Dragonfly Model #SL-10
EMBLA amplifier EMBLA A10 amplifier
Fine scissors FST 14108-09
Flat Head Gold-plated steel screw J.I. Morris FF00CE125 https://jimorrisco.com/
Gold wire CMSA T.69 5gr http://www.cmsa.ch/en/
Hemostatic sponge Pfizer Gelfoam
iodine-based disinfectant (Betadine) Mundipharma standart solution 60mL
Komet drill steel 1/005PM104 UNOR AG 22310
Matlab Analysis Software MathWorks R2016b https://ch.mathworks.com/products/matlab.html
Microdrill Fine Science Tools 96758
Mouse Gas Anesthesia Head Holder Kopf Instruments Model 923-B http://kopfinstruments.com/product/model-923-b-mouse-gas-anesthesia-head-holder/
Ophtalmic ointment Pharmamedica VITA-POS
Paladur (liquid) UNOR AG 2260215 for dental cement
Palavit (powder) UNOR AG 5410929 for dental cement
Small Animal Stereotaxic Frame Kopf Instruments Model 930 http://kopfinstruments.com/product/model-930-small-animal-stereotaxic-frame-assembly/
Soldering wire Stannol 593072
Temperature controller - Mini rectal probe Phymep 4090502 http://www.phymep.com/produit/dc-temperature-controller/
Temperature controller- heating pad Phymep 4090205 http://www.phymep.com/produit/dc-temperature-controller/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lecci, S., et al. Coordinated infra-slow neural and cardiac oscillations mark fragility and offline periods in mammalian sleep. Sci Adv. 3 (2), 1602026 (2017).
  2. Rechtschaffen, A., Kales, A. A manual of standardized terminology, techniques and scoring system for sleep of human subjects. U.S. Department of Health, Education, and Welfare. , Washington, DC. (1968).
  3. Blake, H., Gerard, R. W. Brain potentials during sleep. Am J Physiol. 119, 692-703 (1937).
  4. Rechtschaffen, A., Hauri, P., Zeitlin, M. Auditory awakening threshold in REM and NREM sleep stages. Percept Mot Skills. 22 (3), 927-942 (1966).
  5. Achermann, P., Borbély, A. A. Low-frequency (< 1 Hz) oscillations in the human sleep electroencephalogram. Neuroscience. 81 (1), 213-222 (1997).
  6. Aeschbach, D., Borbély, A. A. All-night dynamics of the human sleep EEG. J. Sleep Res. 2 (2), 70-81 (1993).
  7. Astori, S., Wimmer, R. D., Lüthi, A. Manipulating sleep spindles--expanding views on sleep, memory, and disease. Trends Neurosci. 36 (12), 738-748 (2013).
  8. Brown, R. E., Basheer, R., McKenna, J. T., Strecker, R. E., McCarley, R. W. Control of sleep and wakefulness. Physiol Rev. 92 (3), 1087-1187 (2012).
  9. Buzsáki, G., Wang, X. J. Mechanisms of gamma oscillations. Annu Rev Neurosci. 35, 203-225 (2012).
  10. Rasch, B., Born, J. About sleep's role in memory. Physiol Rev. 93 (2), 681-766 (2013).
  11. Halász, P., Bòdizs, R. Dynamic structure of NREM sleep. , Springer. (2013).
  12. Terzano, M. G., Parrino, L., Spaggiari, M. C. The cyclic alternating pattern sequences in the dynamic organization of sleep. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 69 (5), 437-447 (1988).
  13. Gottesmann, C. Detection of seven sleep-waking stages in the rat. Neurosci Biobehav Rev. 16 (1), 31-38 (1992).
  14. Benington, J. H., Kodali, S. K., Heller, H. C. Scoring transitions to REM sleep in rats based on the EEG phenomena of pre-REM sleep: an improved analysis of sleep structure. Sleep. 17 (1), 28-36 (1994).
  15. Sullivan, D., Mizuseki, K., Sorgi, A., Buzsáki, G. Comparison of sleep spindles and theta oscillations in the hippocampus. J Neurosci. 34 (2), 662-674 (2014).
  16. Vas, S., et al. Differential adaptation of REM sleep latency, intermediate stage and theta power effects of escitalopram after chronic treatment. J Neural Transm (Vienna). 120 (1), 169-176 (2013).
  17. Schiffelholz, T., Aldenhoff, J. B. Novel object presentation affects sleep-wake behavior in rats. Neurosci Lett. 328 (1), 41-44 (2002).
  18. Wimmer, R. D., et al. Sustaining sleep spindles through enhanced SK2-channel activity consolidates sleep and elevates arousal threshold. J Neurosci. 32 (40), 13917-13928 (2012).
  19. Fernandez, L. M. J., et al. Highly dynamic spatiotemporal organization of low-frequency activities during behavioral states in the mouse cerebral cortex. Cereb Cortex. , (2016).
  20. Franken, P. Long-term vs. short-term processes regulating REM sleep. J Sleep Res. 11 (1), 17-28 (2002).
  21. Feige, B., et al. The microstructure of sleep in primary insomnia: an overview and extension. Int J Psychophysiol. 89 (2), 171-180 (2013).
  22. Parrino, L., Halasz, P., Tassinari, C. A., Terzano, M. G. CAP, epilepsy and motor events during sleep: the unifying role of arousal. Sleep Med Rev. 10 (4), 267-285 (2006).
  23. Akinseye, O. A., et al. Sleep as a mediator in the pathway linking environmental factors to hypertension: a review of the literature. Int J Hypertens. 2015, 926414 (2015).
  24. Campbell, K., Muller-Gass, A. The extent of processing of near-hearing threshold stimuli during natural sleep. Sleep. 34 (9), 1243-1249 (2011).
  25. Nir, Y., Vyazovskiy, V. V., Cirelli, C., Banks, M. I., Tononi, G. Auditory responses and stimulus-specific adaptation in rat auditory cortex are preserved across NREM and REM sleep. Cereb Cortex. 25 (5), 1362-1378 (2015).
  26. Dang-Vu, T. T., et al. Interplay between spontaneous and induced brain activity during human non-rapid eye movement sleep. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (37), 15438-15443 (2011).
  27. Elton, M., et al. Event-related potentials to tones in the absence and presence of sleep spindles. J Sleep Res. 6 (2), 78-83 (1997).
  28. McKinney, S. M., Dang-Vu, T. T., Buxton, O. M., Solet, J. M., Ellenbogen, J. M. Covert waking brain activity reveals instantaneous sleep depth. PLoS One. 6 (3), 17351 (2011).
  29. Mang, G. M., Franken, P. Sleep and EEG phenotyping in mice. Curr Protoc Mouse Biol. 2 (1), 55-74 (2012).
  30. Borbély, A. A., Tobler, I., Hanagasioglu, M. Effect of sleep deprivation on sleep and EEG power spectra in the rat. Behav Brain Res. 14 (3), 171-182 (1984).
  31. Jurysta, F., et al. The impact of chronic primary insomnia on the heart rate--EEG variability link. Clin Neurophysiol. 120 (6), 1054-1060 (2009).
  32. Silvani, A., Calandra-Buonaura, G., Benarroch, E. E., Dampney, R. A. L., Cortelli, P. Bidirectional interactions between the baroreceptor reflex and arousal: an update. Sleep Med. , (2015).

Tags

Neurovitenskap utgave 126 Neurovitenskap søvn oppførsel polysomnografi EEG EMG EKG arousability søvnspindel effektspektrum
Kvantifisering av infra-langsom dynamikk av spektral kraft og hjertefrekvens i sovende mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fernandez, L. M. J., Lecci, S.,… More

Fernandez, L. M. J., Lecci, S., Cardis, R., Vantomme, G., Béard, E., Lüthi, A. Quantifying Infra-slow Dynamics of Spectral Power and Heart Rate in Sleeping Mice. J. Vis. Exp. (126), e55863, doi:10.3791/55863 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter