Summary
Här presenterar vi experimentella och analytiska förfaranden för att beskriva den temporala dynamiken hos neurala och hjärtvariablerna av icke-REM-sömn hos möss, vilket modulerar sömnlöshet mot akustiska stimuli.
Abstract
Tre vaksamhetsstater dominerar däggdjurslivet: vakenhet, icke-snabb ögonrörelse (icke-REM) sömn och REM-sömn. Eftersom fler neurala korrelerade beteenden identifieras i fritt rörliga djur blir denna trefaldiga underavdelning för enkel. Under våldsamhet definierar ensembler av globala och lokala kortikala aktiviteter, tillsammans med perifera parametrar såsom pupildiameter och sympatovagbalans, olika grader av upphetsning. Det är fortfarande oklart i vilken utsträckning sömn också utgör ett kontinuum av hjärnstater - inom vilka graden av motståndskraft mot sensoriska stimuli och upphetsning och kanske andra sömnfunktioner varierar gradvis - och hur perifera fysiologiska tillstånd varierar. Forskning som främjar metoderna för att övervaka flera parametrar under sömnen, samt att tillskriva konstellationer av dessa funktionella attribut är central för att förfina vår förståelse för sömn som en multifunktionell process under vilken många fördelaktiga effekter måste executed. Att identifiera nya parametrar som karakteriserar sömnstater öppnar möjligheter för nya diagnostiska vägar i sömnstörningar.
Vi presenterar ett förfarande för att beskriva dynamiska variationer av mus-icke-REM-sömnstater via den kombinerade övervakningen och analysen av elektroencefalogram (EEG) / elektrokortikogram (ECoG), elektromyogram (EMG) och elektrokardiogram (EKG) signaler med hjälp av standardpolysomografiska inspelningstekniker. Med hjälp av detta tillvägagångssätt fann vi att mus-icke-REM-sömn är organiserad i cykler av koordinerade neurala och hjärtoscillationer som genererar successiva 25 s intervaller av hög och låg sårbarhet mot yttre stimuli. Därför samordnas centrala och autonoma nervsystem för att bilda beteendemässigt distinkta sömnstater under konsoliderad icke-REM-sömn. Vi presenterar kirurgiska manipulationer för polysomnografisk ( dvs EEG / EMG kombinerad med EKG) övervakning för att spåra dessa cykler i fritt sovande musen, analysen till quantiFy deras dynamik och de akustiska stimulansprotokollen för att bedöma sin roll i sannolikheten för att vakna upp. Vårt tillvägagångssätt har redan utökats till mänsklig sömn och lovar att riva upp gemensamma organisationsprinciper för icke-REM-sömnstater i däggdjur.
Introduction
Mammalss sömn är ett beteendemässigt viloläge och motståndskraft mot miljöstimuli. Trots denna uppenbara enhetlighet indikerar polysomnografiska och autonoma parametrar att sömn rör sig mellan kvalitativt och kvantitativt olika neurala och somatiska tillstånd på olika temporala och rumsliga skalor 1 . Om några minuter till tiotals minuter inträffar växeln mellan icke-REM och REM-sömn. Icke-REM-sömn åtföljs av stor amplitud, lågfrekvent aktivitet i EEG, med en spektral topp omkring ~ 0,5-4 Hz, medan REM-sömn visar regelbunden EEG-aktivitet i theta-bandet (6 - 10 Hz) tillsammans med Muskelatoni 2 . Inom icke-REM-sömn cyklar människor genom ljus (S2) och djup långvågssova (SWS). Som namnet indikerar visar dessa två steg lägre och högre upphetsningströsklar 3 , 4 , och de skiljer sig främst i lågfrekvensens densitetEncy kortisk EEG-kraft, kallad slow-wave-aktivitet (SWA; 0,75-4 Hz). Icke-likformighet kvarstår genom individuella anfall av S2 och SWS i minut- till sub-sekundär-tidsskala, så omfattande dokumenterad av den variabla närvaron av SWA under en bout 5 , 6 men också av EEG och fältpotential rytmer vid Högre frekvenser, inklusive spindelvågor i sigma-bandet (10-15 Hz) och gamma-rytmer (80-120 Hz) (för en översikt, se 7 , 8 , 9 , 10 ).
I stället för att vara subtila, förskjuter dessa variationer det sovande kortikala tillståndet hos människor till spektrumets ytterligheter. För icke-REM-sömn sträcker sig dessa från en övervägande av SWA till stater som approximerar vakna-liknande aktivitet eftersom de innehåller en betydande andel av högfrekventa komponenter 11
Mammalisk icke-REM-sömn är långt ifrån uniform. Huruvida en sådan ojämnhet leder till stater som skiljer sig åt funktionella och beteendemässiga attribut är inte tydligt. Vid flera typer av sömnstörningar är kontinuerlig sömn störd av spontana uppvakningar och olämpligt motoriskt beteende. Vidare visar spektralanalyser förändringar i den relativa närvaron av högre frekvenser i EEG 21Och i autonoma parametrar, såsom andningshastigheter och hjärtklingning 22 . Den ordnade sekvensen av stabila sömnstater störs sålunda, och element av kortikal och / eller autonom arousal inträder på ett okontrollerat sätt. Därför är det möjligt att förstå kontinuiteten i sömnstaterna vara relevant för sjukdom. Dessutom är störningen av sömn med miljöbuller i stadsmiljöer förenat med allmänna hälsorisker, vilket gör det avgörande att identifiera stunder av ökad sårbarhet under sömn 23 .
Behavioral upphetsningsexperiment hos sovande människor indikerar att det är svårast att vakna upp från SWA-dominerad icke-REM-sömn (stadium S3), medan lätt icke-REM-sömn (stadium S2) och REM-sömn visar jämförbara och lägre upphetsningströsklar 4 . Den kortikala behandlingen av korta ljudstimuli varierar väsentligt mellan REM-sömn, S2 och S3 24 ,25 , vilket indikerar att statsspecifika kortikala aktivitetsmönster modulerar de första stadierna av sensorisk behandling. För icke-REM-sömn hos människor varierar benägenheten att vakna som svar på buller med närvaron av spindelvågor och alfrytmer i EEG 26 , 27 , 28 . Thalamokortisk rytmicitet under spindlarna åtföljs av förbättrad synaptisk inhibering vid både thalamid- och kortikala nivåer, vilket anses ha bidragit till dämpningen av sensorisk behandling 7 .
Hur organiseras bullerbeständiga och sårbara sömnperioder i tid, och vad är deras determinanter? I både möss och människa identifierade vi nyligen en infångad, 0,02-Hz oscillation i neurala rytmer. Beroende på fasen av denna 0,02-Hz-oscillation visade möss variabel reaktivitet mot yttre stimuli, antingen vakna eller sova throuGh bullret. Intressant var denna oscillation korrelerad med hjärtfrekvensen, vilket indikerar att det autonoma nervsystemet deltar i moduleringen av sömns sårbarhet mot yttre stimuli 1 . Minnesrelaterade hippocampala rytmer organiserades också inom denna rytm, och mest slående var dess styrka korrelerad med kvaliteten på minneskonsolidering hos människor. 0,02-Hz-oscillationen verkar således vara en organiserande princip för gnagare och mänsklig icke-REM-sömn som modulerar både känslighet för miljön och internminnesbehandling. Detta lyfter igen behovet av multiparametriska och kontinuerliga bedömningar av sömnstater för att känna igen deras funktionalitet och för att identifiera platser med potentiell sårbarhet.
Här presenterar vi ett förfarande för att extrahera vågformen för dessa dynamik, inklusive kirurgisk implantering av möss för kombinerade EEG / ECoG- och EMG-EKG-mätningar, exponering för sensoriska stimuli, enNd analysrutiner. Denna procedur utgör en grund för att betrakta sömn som ett kontinuerligt varierande men högorganiserat vaksamhetstillstånd under vilket olika grundläggande sömnfunktioner utförs i följd. Mer allmänt är proceduren tillämplig på metoder som syftar till att extrahera spektrala och autonoma särdrag som föregår ett beteendemässigt resultat under sömnen i både hälso- och sjukdomstillstånd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla försöksförfaranden utfördes i enlighet med djurhälsovårdsuniversitetet Lausanne och Service de la Consommation et des Affaires Vétérinaires av Canton de Vaud.
1. Kirurgi för EEG / EMG-EKG-inspelningar
- Djurhus och urval.
- Förvara djur (C57Bl / 6J, 7 - 9 veckor, 25-30 g) i en 12: 12-h mörk / lätt cykel, enbart inrymd och under normala förhållanden (40% fuktighet, 22 ° C) med mat och vatten Tillgänglig ad libitum .
- Använd endast manliga ämnen för att undvika all påverkan av hormoncykeln i sömnen.
- Framställning av elektroder.
- Bygga EEG / ECoG-elektroder (används i steg 1.3.11) med 0,5 cm långa bitar guldtråd (75% Au, 13% Ag och 12% Cu, Diameter: 0,2 mm), vardera lödda ovanpå ett guld Pläterad stålskruv (3 mm längd, 1,1 mm diameter vid basen, se FigurE 1). Förbered 2 EEG elektroder per djur och rengör dem i 70% etanol.
- Förbered EMG-EKG-elektroder med 3 - 4 cm långa guldtrådar (75% Au, 13% Ag och 12% Cu, Diameter: 0,2 mm). Böj trådarna 90 ° vinkel 1 cm från ena änden och förbered en spole (1 - 2 mm ø) i andra änden ( Figur 1 ). Mellan de två ändarna böjer du tråden för att skapa en liten krökning som motsvarar benets ytprofil mellan cerebellum och lambda.
- Förbered 2 EMG-EKG-elektroder per djur.
- Förbered en 6-kanals hankontaktdon (raster: 2,54 mm x 2,54 mm, storlek: 5 mm x 8 mm x 9 mm, stiftstorlek: 5 mm, se figur 1 ).
- Täck kontaktdonet på basen av både kvinnliga och manliga stiften med tejp.
- Lägg en liten mängd lödtråd på spetsarna på 4 av de 6 manstiften för att hjälpa till med lödningen av EEG- och EMG-EKG-elektroderna under operationen(Se steg 1.3.16).
Figur 1 . Schematisk visning av platserna för EEG- och EMG-elektrodimplantation på musens skalle.
Craniotomierna # 1 och # 2 är placerade ~ 2 mm laterala till mittlinjen och ~ 2 mm rostral till bregma. Craniotomies # 3 och # 4 är placerade ~ 2 mm rostral till lambda och är respektive 4 och 2 mm laterala till mittlinjen. De två EEG-elektroderna, gjorda av lödning av en guldtråd på toppen av en guldpläterad stålskruv (# 2 och # 4) finns på högra halvklotet. De 2 vänstra skruvarna (# 1 och # 3) fungerar som stöd. Observera att EMG-EKG-elektroder inte ska komma i kontakt med dessa 2 stödjande skruvar. EMG-EKG-elektroderna är 3 - 4 cm långa guldtrådar, böjda i 90 ° vinklar över 1 cm på sina rostrala ändar och lindade (1 - 2 mm ø) på de kaudala ändarna. 2 EEG och 2 EMG elektroderS är anslutna till 2 x 3-kanalars huvudkontakt genom lödning av en tråd till en hörn, enligt de streckade linjerna. Ytterligare detaljerad information om dessa elektroder och deras implantation kan hittas I 29 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
- Implantation kirurgi.
- Söva djuret i en isofluran inducerande kammare (4-5% isofluran + O 2 till 1 - 2 L / min under 3-4 min). Injicera 5 μg / g karprofen intraperitonealt (ip) när musen avlägsnas från kammaren före stereotaxisk fixering.
- Följ standardprocedurer för att fixa musen på den stereotaxiska apparaten. Upprätthålla isoflurananestesi genom en gasmask (3% isofluran + O 2 under fixering vid ett L / min). Behålla kroppstemperaturen under operationen vid 37 ° C usinGa värmepanna.
- Skydda ögonen från att torka ut genom att applicera A-salva. Kontrollera nivån på kirurgisk tolerans hos djuret genom att testa reflektionen på tassuttaget.
- Fix huvudet genom att placera öronstavarna på skallen med sina trubbiga, bakre ändar i stället för sina spetsar (utan att komma in i hörselgångarna) 29 . Placera munstycket (som vanligt) för att säkerställa huvudets horisontalitet.
OBS: Fixering minimerar skador på öronen, vilket är viktigt för de akustiska upphetsningsexperimenten (se avsnitt 4 i detta förfarande). - Övervaka djurets andning under proceduren, som ska förbli vid ~ 2 - 3 andetag / 2 s. Justera isoflurankoncentrationen i gasdispensern vid behov; Det bör minska små och litet under operationen, från 3% under fixering till 1,0-1,5% mot slutet av proceduren.
- Injicera 100 | il 0,9% NaCl ip en gång per timme med hjälp av en ultrafin insulinN-spruta för att hålla djuret hydratiserade.
- Se till att djurets huvud tänds av en ljus ljuskälla.
- Rengör området med 70% EtOH och jodbaserad desinfektionsmedel (våt päls hindrar hår från att komma in i operationsfönstret).
- Lyft huden i mitten av skallen med Adson pincett och skär försiktigt upp den lyftta delen av huden längs mittlinjen, från nacken till nivån med en fin sax. Ta bort hårbotten (~ 1 cm anteroposterior, ~ 0,5 - 0,8 cm lateral).
- Se till att fönstret är tillräckligt stort (mot båda sidor) för att tydligt se skelets bregma och lambdafissurer. Fixera huden på båda sidor med bulldogg serrefiner för att säkerställa tillgång till benet.
- Ta bort konjunktivvävnaden (periosteum) genom att försiktigt skrapa med en skalpell. Rengör området med jodbaserat desinfektionsmedel och torka skallen med en antiseptisk swab.
- Använd ett vass skalpblad (storlek 15), repa sKull för att erhålla en rengjord och mattifierad benyta. Använd endast skalpspetsen, repa ett gallerliknande nät av spår med ett avstånd av ~ 1 - 2 mm mellan spåren.
OBS: Detta förbättrar fastsättningen av tvåkomponent epoxilimet till skallen i steg 1.3.15. - Använd en mikrodrill med en 1/005 borrstorlek för att utföra 4 kraniotomier (~ 0,7 mm ø) i skallen på specifika platser ( Figur 1 , se även steg 1.3.11.3.). Blås bort benstoft med en Pasteur pipette och rengör eventuell blödning med antiseptiska swabs.
- Om blödning inträffar, se till att den är stoppad helt innan processen återupptas. Använd en hemostatisk svamp för att accelerera hemostasen.
- Använd de två craniotomierna på höger halvklot för att sätta in skruvelektroderna (kraniotomier # 2 och # 4).
- Använd de två craniotomierna på vänstra halvklotet för att införa förankringsskruvar som stabiliserar implantatet (kraniotomier # 1 och # 3).
OBS: För att ökaSe stabilitet har upp till 4 förankringsskruvar använts 29 .
OBSERVERA: De exakta stereotaxiska koordinaterna är: 2 mm från mittlinjen på båda hemisfärerna och 2 mm rostral från bregma (kraniotomier nr 1 och nr 2), 2 mm rostral från lambda och 4 mm lateral vänster från mittlinjen (kraniotomi # 3) 2 mm rostral från lambda och 2 mm lateral-höger från mittlinjen (kraniotomi # 4). Se figur 1 .
- På vänstra halvklotet, skruva två guldpläterade skruvar genom craniotomierna för stöd.
- Fixa skruven i en hemostatisk klämma och håll den vertikalt ovanför kraniotomin. Försiktigt närma sig skruvens botten ovanpå kraniotomi. Rotera det medan det inte avviker från vertikalt läge.
OBS! Endast 1,5 rotationer är tillräckliga för att uppnå god mekanisk stabilitet och högkvalitativa signaler samtidigt som trycket på underliggande vävnad minimeras 25 . - Till höger, skruva på fördelenOmsorgsfullt framställda elektroder (beskrivna i steg 1.2.1) genom craniotomierna.
- Fixa skruven i en hemostatisk klämma och håll den vertikalt ovanför kraniotomin. Försiktigt närma sig skruvens botten ovanpå kraniotomi. Rotera det medan det inte avviker från vertikalt läge.
- Med hjälp av pincett lyfter du försiktigt upp gränsen på huden från nackmusklerna. Sätt i EMG-EKG-ledningarna, med de spiralformade ändarna inuti musklerna (vänster och höger). Lim mellandelen till skallen, så att vänster EMG-EKG kommer ut bredvid den bakre vänstra förankringsskruven, medan den högra EMG-EKG är placerad bredvid den främre vänstra förankringsskruven.
- För att upptäcka EKG-signaler från hjärtat under sömnen, se till att EMG-EKG-kablarna sätts in i muskeln till ett djup av ~ 0,8 - 1 cm, med sina loopändar så långt ifrån varandra som möjligt.
- Använd en spatel täckt med tvåkomponent epoxilim för att applicera limet på skallen mellan och runt skruvarna. Låt det torka i ljuset, men skydda ögonen på djuret från alltför stor blixt.
OBS: Skruvarnas baser måste vara täckta, och endast ledningarna ska vara tillgängliga, framåt frOm limet. - Se till att limet fyller mellanrummet mellan de två EMG-EKG-elektroderna som sträcker sig från ytan, så att det inte finns någon elektrisk kontakt mellan dem och stödskruvarna. Betala noggrann vård för att inte limma huden mot skallen; Huden bör förbli fri att flytta runt limet.
- Skär EEG och EMG-EKG-ledningarna så att de når upp till 0,5 mm från limet. Löd de fyra stiften i hörnet av kopplingsdonet som lagts fram i steg 1.2.3. Till de fyra trådarna som kommer fram från limet ( Figur 1 ).
- Försök att placera kontaktstift så nära som möjligt för att minimera implantatets höjd; Använd en liten krokodilklämma fast i stereotaktisk hållare som håller kontakten på plats. Minimera tiden i kontakt med lödspetsen, eftersom det snabbt värmer skruvarna.
- Fyll ut mellanslaget mellan limet och kontakten med dentalcement för att täcka de lödda delarna. Skapa smooAnsikten och undvika skarpa kanter som kan skada djuret. Undvik att röra på huden, eftersom det leder till klåda.
- Ta bort bulldog serrefinerna. Om så är nödvändigt, stäng såret med en steril suturgänga (absorberbar sutureringsfiber) framför och bakom kontakten, skapa enkla avbrutna stängningsmönster och två kvadratknutar (5-0 FS-3 nål, 45 cm filament).
- Övervaka djuret tills det är helt vaknat. Väg djuret efter operationen och returnera det till sitt hem bur för återhämtning.
- Postoperativ vård och anslutning till systemet.
- Övervaka djuret varje dag i en vecka. Leta efter viktminskning, minskad eller onormal aktivitet och tecken på infektioner. Följ poängbedömningen som fastställts av dina veterinärmyndigheter.
- 5-6 dagar efter operationen, anslut inspelningskabeln till huvudkontakten på djuret och lämna den i sitt hembur. Vänta ytterligare 4 - 5 dagar före start av recorDing så att djuret är habituated till villkoret och sover naturligt.
2. Grundläggande poängering av EEG / EMG-EKG-data för Vigilance State Determination
- Registrera EEG- och EMG-EKG-data under 48 timmar med en kommersiell polysomnografisk programvara ( t.ex. Somnologica, SleepSign eller Sirenia). Använd typiska inställningar, till exempel 2.000x gain; En samplinghastighet på 2000 Hz vid förvärv, nedproverad till 200 Hz efter förvärv; Och ett 0,7-Hz högpassfilter för EEG och ett 10 Hz högpassfilter för EMG-EKG.
- Exportera data i filformatet ".edf".
- Öppna ".edf" -filerna med en skräddarsydd ( t.ex. i Matlab) programvara som klassificerar semi-automatiskt varje 4-epoke som vaken, icke-REM-sömn, REM-sömn och motsvarande artefakter.
OBS! Alternativt finns det flera semi-automatiserade scoringsprogram. Denna procedur beskriver några av de grundläggande stegen som måste göras för att ställa in scoring wMed den scoringsprogramvara som används här; Andra halvautomatiska poängsystem kan vara baserade på andra parametrar. - Använda programvaran, skilda ".edf" -filerna i 4 gånger 12 h inspelningar.
- Ta bort artefakter som härrör från EMG-ECG-aktivitet som finns i EEG-signalen eller från ett otillåtet beteendestatus 1 , 29 .
- Beräkna medelvärdet av EEG- medelvärdena (EEG- medelvärdet ) och EMG (EMG- medelvärdet ) under 12 h av inspelningar från EEG respektive EMG-ECG-spåren.
- Identifiera de genomsnittliga EEG / EMG-värdena för varje 4-epok (EEG- epok / EMG- epok ).
- Klassificera epokerna som "Wake" när EEG- epoken <EEG- medel och EMG- epok > EMG betyder och som "Non-REM Sleep" när EEG- epoken > EEG- medelvärdet och EMG- epoken <EMG betyder.
- Klassificera de epoker som inte är s Åtgärda dessa kriterier med en korrigeringsalgoritm baserad på tidigare och efterföljande epoker.
- Klassificera epokerna som REM-sömn när EEG- epoken <EEG- medelvärdet och EMG- epoken <EMG betyder .
- Förbättra de kritiska punkterna, till exempel övergångar från icke-REM-sömn för att vakna, REM-sömnepoker och mikro-arousaler under icke-REM-sömn. Visuellt inspektera poängen för att säkerställa korrekt vaksamhetstillstånd 29 , 30 .
OBS! Gör alltid en slutlig visuell inspektion och validering av poängen.
3. Analys av den långsamma oscillationen för EEG och hjärtslag
- För den här analysen, välj endast icke-REM-sömnstopp som varar ≥ 96 s ( dvs. minst 24 epoker av 4 s); Se figur 2 .
OBS! Anpassade rutiner finns tillgängliga på begäran 1 .
Figur 2 . Bestämning av Sigma Power Dynamics under ostörd icke-REM Sleep.
( A ) Top, EEG (svart) och EMG-EKG (grå) spår under de första 100 minuterna av ljusfasen i en mus. Vigilance-staterna indikeras av den färgade stapeln ovanpå de råa spåren. Mellersta, typiskt exempel på en kontinuerlig (> 96 s) icke-REM sova bout. Bottom, ett slumpmässigt valt 16-s intervall som illustrerar underavdelningen i 4-s epok. Följande steg i analysen visas endast för dessa fyra epoker, men den gäller för varje epok som finns i boten. ( B ) Top, fyra på varandra följande FFT genererade från 4-talens epoker som visas i bottenpanelen av A. Sigma-bandet (10-15 Hz) är skuggat i rött. Överst till höger, 1 s inset från den sista epoken som visar de R-vågor som finns i den kvadrerade EMG-EKG-signalen. Bottom, tidskurs på Sigmakraft extraherad från motsvarande spektrum ovan. De streckade linjerna illustrerar fortsättningen av effektvärden före och efter de fyra icke-REM-träffarna som valts för visning. ( C ) Normaliserad sigmaffekt (röd) och hjärtslag (i BPM) (grå) tidskurser, med den del som visas i (B) belägen mellan de vertikala streckade linjerna. Nedan visas den motsvarande filtrerade EEG-signalen i sigma-bandet (10-15 Hz). ( D ) Resultat av FFT beräknat på sigma-effektkursen som visas i (C), vilket visar en dominerande topp vid 0,016 Hz. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
- Extrakt effektvärdena för sigma frekvensbandet (10-15 Hz) spektralkraft i 4-s-flaskor ( Figur 2 A och B ) med hjälp av beräkningar av snabb Fourier-transformer (FFT)"> 1.
- Beräkna baslinjespektralstyrkan för icke-REM-sömn genom att medelvärdena värdena i varje frekvensfack för alla icke-REM-sömnperioder (artefakter och övergångsperioder mellan vaksamhetstillstånd exkluderas från denna medelvärde). Normalisera sigmakraftvärdena för varje epok till den genomsnittliga effekten av sigma-bandet under icke-REM-sömn under tidsperioden av intresse. Plot mot tiden ( Figur 2 C ).
- Beräkna FFT i Sigma Power Time Course med Hamming Windowing för att avslöja oscillatorfrekvenskomponenterna i effektdynamiken ( Figur 2 D ) 1 .
- Observera att eftersom de icke-REM-sömnmottagningarna har olika varaktighet, har de resulterande FFT: erna olika frekvensupplösningar. Interpolera för att justera upplösningen till den högsta som erhållits från det längsta icke-REM-sova och genomsnittliga FFT-värdena för alla anfall.
- Fortsätt denna analysEs för att beskriva fasförhållandena mellan dynamiken hos EEG- och EKG-signaler.
- Extrahera hjärtslagsdata från den kvadrerade EMG-EKG-signalen efter 30 Hz högpassfiltrering med hjälp av lämpliga rutiner för toppavkänningen av R-vågan.
ANMÄRKNING: Att begränsa det minsta tidsintervallet mellan två på varandra följande R-vågor till 80 ms bidrar till att undvika införande av tillfälliga artefaktuella toppar på grund av muskeltraktning 1 . - Mät RR-intervallen och beräkna medelhastigheten i slag per minut (BPM) varje 4-s-fack ( Figur 2 B och C ).
4. Exponering för buller
- Generera ljud (dvs. vitt brus) genom en skräddarsydd programvara. Ställ in varaktigheten till 20 s och intensiteten till 90 dB SPL (mätt inuti buret). Spela upp ljudet via standard aktiva högtalare 1 .
- Efter operationen, under uppflyttningen till rekordetDing tillstånd, spela experimentella ljud slumpmässigt, flera gånger under hela dagen och vid olika stunder 1 .
- I det experimentella tillståndet (under inspelning av EEG / EMG / EKG-data) spelar du pseudo-slumpmässigt under de första 100 min vid ljusstart (ZT0). För att spela ljudet, uppfyll följande villkor 1 :
- Kontrollera att musen har varit i icke-REM-sömn för> 40 s.
- Se till att föregående exponering inträffade mer än 4 minuter före.
OBS: Detta resulterar i ~ 15 exponeringar per session.
- Markera början på inspelningstiden och början på varje ljudexponering. Håll försökspersonen blind för spektral sammansättning av icke-REM-sömn under proceduren.
- Förvärva all data med polysomnografisk programvara 1 , 29 .
5. Retrospectiv analys av sömn baserat på beteendeutfallet underExponering för buller
- Spår manuellt EEG / EMG-ECG spår i en 4-s upplösning, utan kännedom om buller exponeringstiderna 1 .
- Använd ett skräddarsytt skript för att extrahera EEG / EMG-ECG / bullerexponeringsdata 1 .
- Betygsätt som sömn genom att både EEG- och EMG-signalerna förblir oförändrade under ljudexponering ( Figur 3A ). Tänk på en vakna när EEG-amplituden minskar och EEG-frekvensen ökar, i kombination med detekterad muskelaktivitet på EMG-EKG-elektroden ( Figur 3B ).
- Förkasta försök där djur vaknade under pre-stimulusperioden eller i de första 4 s av bullerexponering ( Figur 3D ).
- Definiera upphetsningshastighetsgraden som andelen vakna-försök inom alla inkluderade försök ("Vakna" och "Sömn").
- I alla inkluderade prövningar, undersök dynamiken i sigmakraften under thE pre-stimulusperiod ( Figur 3 E ) 1 .
Figur 3 . Beteendemässiga utfall som svar på bullerbeteende: Representativa resultat som behölls eller uteslutits från analys.
( AD ) Råspår av EEG (svart) och motsvarande EMG-EKG (grå) signaler i 40 s före brusstart och under 20 s av ljud, representerat av det blåskuggade området. Vigilance-tillstånd anges i färgkoden. För att illustrera data som inkluderades i analysen visas representativa "Sleep-through" ( A ) och "Wake-up" ( B ) händelser. Resultat som slängdes innehöll övergångar till REM-sömn ( C ) och ett precocious "Wake-up" -svar ( D ). Inlägget visar en expanDed-delen av EEG- och EMG-EKG-spår som är karakteristiska för REM-sömn. ( E ) Typiska exempel på sigmakraftdynamik i 40-talets fönster före brusstart under en "Sleep-through" (vänster) och en "Wake-up" (höger) händelse. Den råa EEG-spårbandpassfiltret för sigma-bandet visas ovan. Det blå området representerar ljudet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 A (övre panelen) visar 100-minuters sträckor av spontant sömnvaktbeteende, inspelat genom polysomnografiska elektroder implanterade enligt beskrivningen (se figur 1 ). Ökningarna och minskningarna av EEG- och EMG-amplituden vid icke-REM-sömnstart är tydligt synliga. Intermittent REM-sömn är markerad av en minskning av EEG-amplituden och en ytterligare minskning av EMG-tonen som inte är synlig på denna komprimerade tidsskala. Inzoomning på ett icke-REM-sömnblock avslöjar de långsamma vågorna i EEG och i EMG-ECG-spåret den låga muskelaktiviteten, på vilken RR-intervallet för hjärtfrekvensen överstiger som vertikala avböjningar ( Figur 2 A , Mitten och nedre paneler). En FFT avslöjar SWA: s dominans genom alla 4-s epok ( Figur 2 B ). Plottar den genomsnittliga sigmenEn kraft (10-15 Hz, röd skuggad bar) för var och en av dessa epoker avslöjar sin varierande tidskurs, tillsammans med variationer i hjärtfrekvensen med motsatt riktning. Genom att utföra denna analys över helheten av de icke-REM-sträckningarna och normaliseringen för att medge effektvärden, elimineras de vanliga variationerna i sigmakraften kring medelvärdet ( Figur 2 C ). Fourieranalys över denna effekttidskurs visar en stor topp omkring 0,02 Hz, vilket återspeglar den periodiska ökningen av sigmakraften i 50-s intervaller ( Figur 2D ).
För att undersöka funktionen av 0,02-Hz-oscillationen vid upphetsning utsattes möss för 20 s pulser på 90 dB vid sömn, enligt de beskrivna förhållandena. Figur 3 visar några av de experimentella resultaten av sådana bullerexponeringar. När möss inte vaknade under bruset, och EEG och EMG-EKG-vågformer förblev oförändrade, var resultatet klassIfied som en "Sleep-Through" ( Figur 3 A ). När EEG-amplituden minskade och EMG-aktivitet observerades, blev utfallet poängat som en "Wake-up" ( Figur 3 B ). Ibland bytte möss till REM-sömn under en försök ( Figur 3 C ) eller vaknade i 40-talets intervall före brusstart ( Figur 3 D ). Dessa händelser var uteslutna från analysen, eftersom vårt intresse specifikt var att identifiera kännetecknen för konsoliderad icke-REM-sömn som föregår resultatet av bullerexponering ("Sleep-through" eller "Wake-up"). Beräkningen av sigmakraften under 40-talet före brusstimuleringen visade att 0,02 Hz-oscillationen var vid dess tråg när en "Sleep-through" inträffade ( Figur 3 E , vänstra panelen), medan den nådde en "Wake- upp" Händelse ( Figur 3 E , höger panel). Därför identifierar fasen av 0,02-Hz-oscillationen i sigmakraft som ett kännetecken för sömnstater med varierbar motståndskraft mot brus, vilket gör det möjligt att retroaktivt räkna musens icke-REM-sömn, baserat på ett variabelt beteendeutfall till akustisk stimulering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här visar vi hur man etablerar en kontinuerlig tidsmässig profil för icke-REM-sömn som integrerar EEG-, EMG- och EKG-variabler. Detta är ett första steg mot att utveckla en integrerad beskrivning av mussömn, vilket kan hjälpa till att identifiera den tidigare okända tidsskala över vilken hög och låg motståndskraft mot brus som organiseras under icke-REM-sömn 1 . En liknande tidsmässig struktur beskrevs också i human icke-REM-sömn genom en analog analys 1 .
Förfarandet som presenteras här uppfyller två mål. Först uppmärksammar vi att polysomnografiska tekniker på ett tillförlitligt sätt kan ge både EEG- och EMG-EKG-signaler under hela icke-REM-sömnperioderna hos möss. Hjärtslaget är mest uppenbart i EMG-spår under REM-sömn på grund av muskelatoni, och det blir mer dolt i icke-REM-sömn på grund av ökad muskelton och tillfälliga muskeltraktioner. Infoga EMG-EKG-elektroder merDjupt in i muskeln och hålla dem så avlägsna som möjligt ökar amplituden för hjärtets R-vågor, så att de dyker upp tydligt från bakgrundsmuskeltonusen. Rutiner för toppdetektering extraherar sedan hjärtfrekvensen från EMG-ECG-signalen med icke-REM-sömn och tillåter kvantifiering av dess variabilitet.
Telemetribaserade tekniker för att samtidigt övervaka EEG / EMG och EKG används i allt högre grad, men kvaliteten på signalerna som krävs för grundlig spektralanalys är fortfarande sämre vad gäller bandbredd och stabilitet. Dessutom är även enkanalsändare av stor storlek, och deras implantering i den cervikala subkutan regionen eller i kroppshålan kan påverka djurets välbefinnande och störa sömn. Det är emellertid nödvändigt att vidareutveckla sådana anordningar för att utöka intervallet av centrala och autonoma parametrar som samtidigt kan följas under ostörd sömn hos möss, vilket är djurmodellen av cHoice för sömnstudier. I kombination med tekniker som huvudstöd, som möjliggör insamling av data från både icke-REM och REM-sömn hos möss med oförändrade spektralprofiler 1 , 19 , kan multiparametriska mätningar under sömn nu kombineras med kontrollerad beteendestestning.
För det andra kan det analytiska tillvägagångssättet vi presenterar här också tillämpas på lokala fältpotentialer för att definiera hjärnans område som är inblandat i att generera intressantmärket 1 . Dessutom är den tillämplig på bildteknik som är tillräckligt snabb för att rapportera om spektralbeteendet hos neuronpopulationer och för både kontinuerliga ( t.ex. spektralband) och diskreta ( t.ex. hjärtfrekvens eller andning) variabler. Dess tidsupplösning begränsas endast av den tid som epoken valts för att göra vaktläget. I huvudsak är standard spektralanalyser av signalerna härledda från icke-REM sLutningsstopp följs av en inriktning av effektdensitetsvärdena för enskilda signaler för varje epok. Därefter används en spektralanalys av dessa effektdynamik för att kvantifiera periodiciteter i strukturen. I både möss och människor gav vårt tillvägagångssätt en oscillation på 0,02 Hz, med jämförbara egenskaper 1 , som kvalificerade den som ett förenande kännetecken för däggdjurssömstrukturen.
Ett kritiskt steg var den funktionella valideringen av den observerade periodiciteten genom att poängsätta icke-REM-sömn retroaktivt baserat på den sovande musens beteendereaktivitet till brus. Här var valet av en bullerstimulering som ledde till ett varierande beteendemässigt resultat, vilket orsakade väckande eller sömn genom, avgörande. Starka sensoriska stimuli som orsakar vaken i de flesta exponeringar skulle inte riva upp 0,02 Hz-oscillationen, eftersom väckningen skulle ske i alla faser. I motsats till detta skulle en alltför svag stimulans inte konsekvent avslöja fasförhållandet till 0,02 Hz-oscSLUTSATS. På liknande sätt skulle varje observerad periodicitet i en uppmätt parameteruppsättning behöva överensstämma med det rörliga resultatet. I det fall som presenteras här har vi till exempel bara särskiljat mellan väckning eller genomgångshändelser, utan att ta hänsyn till det exakta ögonblicket av vaken under bullerexponeringen eller varaktigheten av den efterföljande vakningstillståndet (se dock 1 ) . Användning av korta stimuli vid olika intensiteter 24 , 25 , 28 kan hjälpa till att avgränsa de exakta fasförhållandena mellan 0,02 Hz oscillation och wake-up. Vidare kan variationen i ljudkompositionen av ljudet modulera arousabilitet som en funktion av den senaste historien om sömnvaktbeteende, kön, närvaro av näsdjur eller andra former av ny erfarenhet. En annan möjlighet kan vara att undersöka huruvida förekomsten av mikroarousaler eller fullständiga upphetsningar beror på ett givet momentant sömnstatus. Sömning av sömn baserat på ett varierande beteendemässigt utfall skulle kunna belysa den funktionella mikroarkitekturen av sömn mer allmänt. Medan vi och andra har testat reaktivitet mot bullerexponering 1 , 28 , väckning som svar på andra sensoriska modaliteter, vaksamhetstillståndsövergångar 14 eller drömrapporter kan utvärderas för att extrahera motsvarande korrelater för föregående sömn. Vidare är det mycket intressant att testa sömnstörningspatienter med avseende på deras känslighet mot yttre störningar och till en potentiell störning av 0,02-Hz-oscillationen. Sömnstörningar kan leda till kardiovaskulär störning, medan kardiovaskulär risk kan leda till sömnstyregulering 31 , 32 , vilket gör undersökningar på hjärnhjärtskoordinationen under 0,02 Hz-oscillation som är potentiellt relevant för att förstå denna bidirektionJag är beroende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har något konkurrerande ekonomiskt intresse.
Acknowledgments
Vi tackar alla labmedlemmar för deras bidrag till skrivandet och noggrann läsning av detta manuskript. Vi är tacksamma för Paul Franken för att stimulera diskussioner, Dr. Gisèle Ferrand för användbara kommentarer om det kirurgiska protokollet och Dr Jean-Yves Chatton för att tillhandahålla de ursprungliga Labview-körbara filerna för bullerexponeringen. Finansiering skedde av den schweiziska National Science Foundation (Grants 31003A_146244 och 31003A_166318) och Etat de Vaud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-components epoxy glue | Henkel | Loctite EA 3450 | |
| Absorbable Suturing Fiber (Prolene) | Ethicon | 5-0 FS-3 | |
| Adson Forceps | FST | 11006-12 | |
| Antiseptic swab | VWR | 149-0332 | |
| Attane Isoflurane | Piramal | Isoflurane 250mL | |
| Connectors 3 x 2-channels | ENA AG | 2.316 | Raster 2.54 x 2.54 mm; size 5 x 8 x 9 mm; pin size 5 mm; http://www.ena.ch/ |
| Dragonfly commutator | Dragonfly | Model #SL-10 | |
| EMBLA amplifier | EMBLA | A10 amplifier | |
| Fine scissors | FST | 14108-09 | |
| Flat Head Gold-plated steel screw | J.I. Morris | FF00CE125 | https://jimorrisco.com/ |
| Gold wire | CMSA | T.69 5gr | http://www.cmsa.ch/en/ |
| Hemostatic sponge | Pfizer | Gelfoam | |
| iodine-based disinfectant (Betadine) | Mundipharma | standart solution 60mL | |
| Komet drill steel 1/005PM104 | UNOR AG | 22310 | |
| Matlab Analysis Software | MathWorks | R2016b | https://ch.mathworks.com/products/matlab.html |
| Microdrill | Fine Science Tools | 96758 | |
| Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf Instruments | Model 923-B | http://kopfinstruments.com/product/model-923-b-mouse-gas-anesthesia-head-holder/ |
| Ophtalmic ointment | Pharmamedica | VITA-POS | |
| Paladur (liquid) | UNOR AG | 2260215 | for dental cement |
| Palavit (powder) | UNOR AG | 5410929 | for dental cement |
| Small Animal Stereotaxic Frame | Kopf Instruments | Model 930 | http://kopfinstruments.com/product/model-930-small-animal-stereotaxic-frame-assembly/ |
| Soldering wire | Stannol | 593072 | |
| Temperature controller - Mini rectal probe | Phymep | 4090502 | http://www.phymep.com/produit/dc-temperature-controller/ |
| Temperature controller- heating pad | Phymep | 4090205 | http://www.phymep.com/produit/dc-temperature-controller/ |
References
- Lecci, S., et al. Coordinated infra-slow neural and cardiac oscillations mark fragility and offline periods in mammalian sleep. Sci Adv. 3 (2), 1602026 (2017).
- Rechtschaffen, A., Kales, A. A manual of standardized terminology, techniques and scoring system for sleep of human subjects. U.S. Department of Health, Education, and Welfare. , Washington, DC. (1968).
- Blake, H., Gerard, R. W. Brain potentials during sleep. Am J Physiol. 119, 692-703 (1937).
- Rechtschaffen, A., Hauri, P., Zeitlin, M. Auditory awakening threshold in REM and NREM sleep stages. Percept Mot Skills. 22 (3), 927-942 (1966).
- Achermann, P., Borbély, A. A. Low-frequency (< 1 Hz) oscillations in the human sleep electroencephalogram. Neuroscience. 81 (1), 213-222 (1997).
- Aeschbach, D., Borbély, A. A. All-night dynamics of the human sleep EEG. J. Sleep Res. 2 (2), 70-81 (1993).
- Astori, S., Wimmer, R. D., Lüthi, A. Manipulating sleep spindles--expanding views on sleep, memory, and disease. Trends Neurosci. 36 (12), 738-748 (2013).
- Brown, R. E., Basheer, R., McKenna, J. T., Strecker, R. E., McCarley, R. W. Control of sleep and wakefulness. Physiol Rev. 92 (3), 1087-1187 (2012).
- Buzsáki, G., Wang, X. J. Mechanisms of gamma oscillations. Annu Rev Neurosci. 35, 203-225 (2012).
- Rasch, B., Born, J. About sleep's role in memory. Physiol Rev. 93 (2), 681-766 (2013).
- Halász, P., Bòdizs, R. Dynamic structure of NREM sleep. , Springer. (2013).
- Terzano, M. G., Parrino, L., Spaggiari, M. C. The cyclic alternating pattern sequences in the dynamic organization of sleep. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 69 (5), 437-447 (1988).
- Gottesmann, C. Detection of seven sleep-waking stages in the rat. Neurosci Biobehav Rev. 16 (1), 31-38 (1992).
- Benington, J. H., Kodali, S. K., Heller, H. C. Scoring transitions to REM sleep in rats based on the EEG phenomena of pre-REM sleep: an improved analysis of sleep structure. Sleep. 17 (1), 28-36 (1994).
- Sullivan, D., Mizuseki, K., Sorgi, A., Buzsáki, G. Comparison of sleep spindles and theta oscillations in the hippocampus. J Neurosci. 34 (2), 662-674 (2014).
- Vas, S., et al. Differential adaptation of REM sleep latency, intermediate stage and theta power effects of escitalopram after chronic treatment. J Neural Transm (Vienna). 120 (1), 169-176 (2013).
- Schiffelholz, T., Aldenhoff, J. B. Novel object presentation affects sleep-wake behavior in rats. Neurosci Lett. 328 (1), 41-44 (2002).
- Wimmer, R. D., et al. Sustaining sleep spindles through enhanced SK2-channel activity consolidates sleep and elevates arousal threshold. J Neurosci. 32 (40), 13917-13928 (2012).
- Fernandez, L. M. J., et al. Highly dynamic spatiotemporal organization of low-frequency activities during behavioral states in the mouse cerebral cortex. Cereb Cortex. , (2016).
- Franken, P. Long-term vs. short-term processes regulating REM sleep. J Sleep Res. 11 (1), 17-28 (2002).
- Feige, B., et al. The microstructure of sleep in primary insomnia: an overview and extension. Int J Psychophysiol. 89 (2), 171-180 (2013).
- Parrino, L., Halasz, P., Tassinari, C. A., Terzano, M. G. CAP, epilepsy and motor events during sleep: the unifying role of arousal. Sleep Med Rev. 10 (4), 267-285 (2006).
- Akinseye, O. A., et al. Sleep as a mediator in the pathway linking environmental factors to hypertension: a review of the literature. Int J Hypertens. 2015, 926414 (2015).
- Campbell, K., Muller-Gass, A. The extent of processing of near-hearing threshold stimuli during natural sleep. Sleep. 34 (9), 1243-1249 (2011).
- Nir, Y., Vyazovskiy, V. V., Cirelli, C., Banks, M. I., Tononi, G. Auditory responses and stimulus-specific adaptation in rat auditory cortex are preserved across NREM and REM sleep. Cereb Cortex. 25 (5), 1362-1378 (2015).
- Dang-Vu, T. T., et al. Interplay between spontaneous and induced brain activity during human non-rapid eye movement sleep. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (37), 15438-15443 (2011).
- Elton, M., et al. Event-related potentials to tones in the absence and presence of sleep spindles. J Sleep Res. 6 (2), 78-83 (1997).
- McKinney, S. M., Dang-Vu, T. T., Buxton, O. M., Solet, J. M., Ellenbogen, J. M. Covert waking brain activity reveals instantaneous sleep depth. PLoS One. 6 (3), 17351 (2011).
- Mang, G. M., Franken, P. Sleep and EEG phenotyping in mice. Curr Protoc Mouse Biol. 2 (1), 55-74 (2012).
- Borbély, A. A., Tobler, I., Hanagasioglu, M. Effect of sleep deprivation on sleep and EEG power spectra in the rat. Behav Brain Res. 14 (3), 171-182 (1984).
- Jurysta, F., et al. The impact of chronic primary insomnia on the heart rate--EEG variability link. Clin Neurophysiol. 120 (6), 1054-1060 (2009).
- Silvani, A., Calandra-Buonaura, G., Benarroch, E. E., Dampney, R. A. L., Cortelli, P. Bidirectional interactions between the baroreceptor reflex and arousal: an update. Sleep Med. , (2015).
