Summary
Hier presenteren we experimentele en analytische procedures om de temporale dynamiek van de neurale en hartvariabelen van niet-REM slaap in muizen te beschrijven, die de respons op slaapresponsen voor akoestische stimuli moduleren.
Abstract
Drie waakzaamheidsstaten domineren zoogdierleven: waakzaamheid, niet-snelle oogbeweging (niet-REM) slaap, en REM slaap. Aangezien meer neurale correlaties van gedrag worden geïdentificeerd in vrij bewegende dieren, wordt deze drievoudige onderverdeling te simplistisch. Tijdens wakefulness definiëren ensembles van wereldwijde en lokale corticale activiteiten, samen met perifere parameters zoals pupillair diameter en sympathovagale balans, verschillende graden van opwinding. Het blijft onduidelijk hoezeer ook slaap een continuum van hersenstaten vormt, waarin de mate van veerkracht tot zintuiglijke stimuli en wakkerheid, en misschien andere slaapfuncties, geleidelijk verschillen - en hoe perifere fysiologische staten elkaar variëren. Onderzoek dat de methoden voor het monitoren van meerdere parameters tijdens de slaap bevordert, evenals de toekenning van constellaties van deze functionele kenmerken, is centraal om ons begrip van slaap als een multifunctioneel proces te verfijnen, waarbij veel gunstige effecten ex zijnecuted. Het identificeren van nieuwe parameters die slaapstanden karakteriseert, zullen mogelijkheden bieden voor nieuwe diagnostische wegen in slaapstoornissen.
Wij presenteren een procedure voor het omschrijven van dynamische variaties van muis-niet-REM slaapstanden via de gecombineerde monitoring en analyse van elektrodenfalogram (EEG) / elektrocorticogram (ECoG), elektromyogram (EMG) en elektrocardiogram (ECG) signalen met behulp van standaard polysomnografische opname technieken. Met behulp van deze aanpak bleek dat muis niet-REM slaap is georganiseerd in cycli van gecoördineerde neurale en cardiale oscillaties die opeenvolgende 25-s intervallen genereren van hoge en lage breekbaarheid naar externe stimuli. Daarom worden centrale en autonome zenuwstelsel gecoördineerd om gedragsmatige slaapstanden te vormen tijdens geconsolideerde niet-REM-slaap. Wij presenteren chirurgische manipulaties voor polysomnografische ( dwz EEG / EMG gecombineerd met ECG) monitoring om deze cycli in de vrije slaapmuis te volgen, de analyse naar quantiHun dynamiek en de akoestische stimulatieprotocollen om hun rol te beoordelen in de kans op wakker worden. Onze aanpak is al uitgebreid tot menselijke slaap en belooft de gemeenschappelijke organisatorische principes van niet-REM slaapstanden bij zoogdieren te ontrafelen.
Introduction
Zoogdier slaap is een gedragsstaat van rust en van veerkracht aan milieu-stimuli. Ondanks deze schijnbare uniformiteit geven polysomnografische en autonome parameters aan dat slaap tussen kwalitatief en kwantitatief verschillende neurale en somatische staten op verschillende temporale en ruimtelijke weegschaal 1 beweegt. Over enkele minuten tot tientallen minuten treedt de schakel tussen niet-REM en REM slaap op. Niet-REM-slaap gaat gepaard met een grote amplitude, lage frequentie activiteit in het EEG, met een spectrale piek rond ~ 0,5 - 4 Hz, terwijl REM slaap de normale EEG-activiteit toont in de theta band (6 - 10 Hz), samen met Spier atonia 2 . Binnen de niet-REM-slaap loopt de mens door het licht (S2) en de deep sleep wave (SWS). Zoals hun benaming aangeeft, tonen deze twee fasen respectievelijk lagere en hogere opwarmingstremmen 3 , 4 en ze verschillen voornamelijk in de dichtheid van de lage frequentieEncycortische EEG-kracht, aangeduid als slow wave activiteit (SWA; 0,75 - 4 Hz). Niet-uniformiteit blijft door de individuele aanval van S2 en SWS op de minuut-tot-tweede-keer-tijdschaal, zo uitgebreid gedocumenteerd door de variabele aanwezigheid van SWA in de loop van een bout 5 , 6 , maar ook door EEG en veldpotentiële ritmes bij Hogere frequenties, waaronder spindelgolven in de sigma-band (10-15 Hz) en gamma ritmes (80 - 120 Hz) (voor een review, zie 7 , 8 , 9 , 10 ).
In plaats van subtiel te verschuiven, verschuiven deze variaties de slaapcorticale toestand bij mensen tot de uitersten van het spectrum. Voor niet-REM slaap, variëren deze van een overheersing van SWA naar staten die de wake-achtige activiteit benaderen omdat ze een aanzienlijk deel van de hoogfrequente componenten bevatten 11
Mammalian non-REM slaap is ver van uniform. Echter, of dergelijke niet-uniformiteit leidt tot staten die verschillen in functie- en gedragskenmerken, is niet duidelijk. Bij verschillende soorten slaapstoornissen wordt doorlopende slaap verstoord door spontane ontwaken en ongepast motorisch gedrag. Bovendien tonen spectrale analyses veranderingen in de relatieve aanwezigheid van hogere frequenties in de EEG 21En in autonome parameters, zoals ademhalingssnelheden en hartverslaan 22 . De ordelijke sequentie van stabiele slaapstanden wordt aldus verstoord, en elementen van corticale en / of autonome opwarming treden onbeheerd in. Daarom is het begrip van het continuum van slaapstanden mogelijk voor ziekte. Bovendien is het verstoren van slaap door milieugeluid in stedelijke omgevingen geassocieerd met algemene gezondheidsrisico's, waardoor het cruciaal is om momenten van verhoogde kwetsbaarheid tijdens slaap te identificeren 23 .
Gedragsopwekkende experimenten bij slapende mensen wijzen erop dat het moeilijkst is om wakker te worden van SWA-gedomineerde niet-REM slaap (stadium S3), terwijl lichte, niet-REM slaap (stadium S2) en REM slaap show vergelijkbare en lagere arousal drempels 4 . De corticale verwerking van korte geluidsstimulaties varieert aanzienlijk tussen REM slaap, S2 en S3 24 ,25 , wat aangeeft dat staatsspecifieke corticale activiteitspatronen de eerste stadia van sensorische verwerking moduleren. Voor niet-REM slaap bij mensen is de neiging om wakker te worden als gevolg van geluid afwijken van de aanwezigheid van spindelgolven en alfa ritmes in de EEG 26 , 27 , 28 . Thalamocortische ritmiciteit tijdens spindels wordt gepaard gegaan met verbeterde synaptische remming bij zowel de thalamische als corticale niveaus, waarvan wordt gedacht dat zij bijdragen aan de verzwakking van de sensorische verwerking 7 .
Hoe zijn geluidsbestendige en kwetsbare slaapperiodes georganiseerd in de tijd, en wat zijn hun determinanten? In beide muizen en mens hebben we recentelijk een infraagge, 0,02-Hz oscillatie in neurale ritmes geïdentificeerd. Afhankelijk van de fase van deze 0,02-Hz-oscillatie, vertoonden muizen variabele reactiviteit tegen externe stimuli, ofwel wakker worden of slapenHet lawaai Interessant genoeg was deze oscillatie gecorreleerd met de hartslagslag, wat aangeeft dat het autonome zenuwstelsel deelneemt aan de modulatie van de kwetsbaarheid van de slaap voor externe stimuli 1 . Geheugen-gerelateerde hippocampale ritmes werden ook georganiseerd binnen dit ritme, en het meest opvallend was dat de kracht ervan in verband was met de kwaliteit van geheugenconsolidatie bij mensen. De 0,02-Hz oscillatie lijkt dus een organiserend principe van knaagdier- en menselijke niet-REM slaap die zowel gevoeligheid voor het milieu als interne geheugenverwerking moduleert. Dit wijst opnieuw op de noodzaak van multiparametrische en continue evaluaties van slaapstaten om hun functionaliteit te herkennen en sites van mogelijke kwetsbaarheid te identificeren.
Hier presenteren we een procedure om de golfvorm van deze dynamiek te extraheren, inclusief de chirurgische implantatie van muizen voor gecombineerde EEG / ECoG en EMG-ECG metingen, blootstelling aan sensorische stimuli, eenNd analyse routines. Deze procedure vormt de basis voor het bekijken van slaap als een voortdurend wisselende, maar zeer georganiseerde waakzaamheidstoestand waarin verschillende fundamentele slaapfuncties achtereenvolgens worden uitgevoerd. Meer in het algemeen is de procedure van toepassing op benaderingen die gericht zijn op het opsporen van de spectrale en autonome kenmerken die een gedragsuitkomst voorafgaan tijdens slaap in zowel gezondheids- als ziektebeelden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de Dierzorgcommissie van de Universiteit van Lausanne en de Dienst van de Consommatie en de Affaires Vétérinaires van de Canton de Vaud.
1. Chirurgie voor EEG / EMG-ECG opnames
- Dierlijke huisvesting en selectie.
- Bewaar dieren (C57Bl / 6J, 7 - 9 weken, 25 - 30 g) in een 12: 12-uur donker / lichte cyclus, alleen in huis en onder normale omstandigheden (40% vochtigheid, 22 ° C), met voedsel en water Beschikbaar ad libitum .
- Gebruik alleen mannelijke onderwerpen om alle invloeden van de hormonale cyclus in slaap te vermijden.
- Bereiding van elektroden.
- Bouwen EEG / ECoG-elektroden (gebruikt in stap 1.3.11) met 0,5 cm lange stukken gouddraad (75% Au, 13% Ag en 12% Cu, Diameter: 0,2 mm), elk opgelost op een goud -platte stalen schroef (3 mm lengte, 1,1 mm diameter aan de basis; zie figuurE 1). Bereid 2 EEG-elektroden per dier op en maak ze schoon in 70% ethanol.
- Bereid EMG-ECG-elektroden met 3 - 4 cm lange gouden draden (75% Au, 13% Ag en 12% Cu, diameter: 0,2 mm). Beweeg de draden bij een hoek van 90 ° 1 cm vanaf het ene uiteinde en maak een spoel (1 - 2 mm ø) aan het andere uiteinde ( Figuur 1 ). Tussen de twee uiteinden buigt u de draad om een kleine kromming te maken die overeenkomt met het oppervlakprofiel van het bot tussen de cerebellum en lambda.
- Bereid 2 EMG-ECG elektroden per dier voor.
- Bereid een 6-kanaals vrouwelijke kopcontact aan (raster: 2,54 mm x 2,54 mm, maat: 5 mm x 8 mm x 9 mm, pinmaat: 5 mm, zie afbeelding 1 ).
- Bedek de connector aan de basis van zowel vrouwelijke als mannelijke pennen met tape.
- Voeg een kleine hoeveelheid soldeerleiding toe aan de tips van 4 van de 6 mannelijke pennen om te helpen bij het solderen van de EEG- en EMG-ECG-elektroden tijdens de operatie(Zie stap 1.3.16).
Figuur 1 . Schematische weergave van de sites voor EEG- en EMG-elektrode-implantatie op de schedel van de muis.
Craniotomies # 1 en # 2 bevinden zich ~ 2 mm lateraal naar de middellijn en ~ 2 mm rostral naar bregma. Craniotomies # 3 en # 4 bevinden zich ~ 2 mm rostral naar lambda en zijn respectievelijk 4 en 2 mm lateraal aan de middellijn. De twee EEG-elektroden, gemaakt van het solderen van een gouden draad aan de bovenzijde van een vergulde stalen schroef (# 2 en # 4), bevinden zich op het rechter halfrond. De 2 linkschroeven (# 1 en # 3) dienen als ondersteuning. Houd er rekening mee dat EMG-ECG-elektroden niet in contact moeten komen met deze 2 ondersteunende schroeven. EMG-ECG-elektroden zijn 3 tot 4 cm lang gouden draden, gebogen op 90 ° hoeken over 1 cm op hun rostraleinden en op de caudale uiteinden gewikkeld (1 - 2 mm ø). De 2 EEG en 2 EMG elektrodenS zijn aangesloten op de 2 x 3-kanaals kopstekker door een draad te solderen naar een hoekige pin, zoals aangegeven door de streeplijnen. Meer gedetailleerde informatie over deze elektroden en hun implantatie kan worden gevonden In 29 . Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Implantatiechirurgie.
- Verdoven het dier per isofluraan stimulerende kamer (4-5% isofluraan + O2 bij 1-2 l / min gedurende 3-4 min). Spuit 5 μg / g carprofen intraperitoneaal (ip) bij het verwijderen van de muis uit de kamer, voorafgaand aan stereotaxische fixatie.
- Volg standaard procedures om de muis op het stereotaxische apparaat op te lossen. Onderhouden isofluraan anesthesie via een gasmasker (3% isofluraan + O2 tijdens fixatie 1 l / min). Bewaar de lichaamstemperatuur gedurende de operatie bij 37 ° C usinGa verwarmingskussen.
- Bescherm de ogen tegen uitdroging door het aanbrengen van vitamine A-zalf. Controleer het niveau van de chirurgische tolerantie van het dier door het terugtrekkingsreflex van de poot te testen.
- Bevestig het hoofd door de oorstaafjes op de schedel te positioneren met hun stompe achteruitgangen, in plaats van hun tips (zonder de oorgangen in te voeren) 29 . Plaats de mondbalk (zoals gebruikelijk) om de horizontaal van het hoofd te waarborgen.
OPMERKING: Bevestiging minimaliseert schade aan de oren, wat belangrijk is voor de akoestische wekproeven (zie sectie 4 van deze procedure). - Monitor de adem van het dier tijdens de procedure, die bij ~ 2 - 3 ademhalingen / 2 s blijft. Pas de isofluraanconcentratie in de gasdispenser indien nodig aan; Het moet een beetje dalen tijdens de operatie, van 3% tijdens fixatie tot 1,0 - 1,5% tegen het einde van de procedure.
- Spuit 100 μL 0,9% NaCl ip een keer per uur in met een ultrafijne insulineN spuit om het dier gehydrateerd te houden.
- Zorg ervoor dat het hoofd van het dier verlicht wordt door een fel lichtbron.
- Maak het gebied schoon met 70% EtOH en op basis van jodium gebaseerde desinfectiemiddel (natte pels voorkomt dat het haar in het chirurgische venster komt).
- Hef de huid in het midden van de schedel met Adson tang en snijd het opgeheven gedeelte van de huid zachtjes langs de middellijn, van de bovenkant van de nek tot het niveau van de ogen, met een fijne schaar. Verwijder de hoofdhuid (~ 1 cm anteroposterior, ~ 0,5 - 0,8 cm lateraal).
- Zorg ervoor dat het raam groot genoeg is (naar beide zijden) om de bregma en de lambda-fissures van de schedel duidelijk te zien. Bevestig de huid aan beide zijden met bulldog serrefines om de toegang tot het bot te waarborgen.
- Verwijder het conjunctieve weefsel (periosteum) door voorzichtig te krabben met een scalpel. Reinig het gebied met een op iodine gebaseerde desinfectiemiddel en droog de schedel met een antiseptische zwabber.
- Gebruik een scherp scalpelblad (maat 15) om de s te krabbenKull om een gereinigd en gematigd botoppervlak te verkrijgen. Gebruik alleen de scalpeltip, kras een rasterachtig netwerk van groeven, met een afstand van ~ 1 - 2 mm tussen de groeven.
OPMERKING: dit verbetert de bevestiging van de epoxy lijm met twee componenten aan de schedel in stap 1.3.15. - Gebruik een microdrill met een 1/005 boormaat om 4 craniotomies (~ 0,7 mm ø) in de schedel op specifieke locaties uit te voeren ( Figuur 1 , zie ook stap 1.3.11.3.). Knip het botstof af met een Pasteur pipette en reinig eventuele bloedingen met antiseptische zwabbetjes.
- Als er bloeding optreedt, moet u ervoor zorgen dat het volledig is gestopt voordat u het proces hervat. Gebruik een hemostatische spons om de hemostase te versnellen.
- Gebruik de twee craniotomies op het rechter hemisfeer om de schroefelektroden (craniotomies # 2 en # 4) in te voegen.
- Gebruik de twee craniotomies op het linker halfrond om verankeringsschroeven te plaatsen die het implantaat stabiliseren (craniotomies # 1 en # 3).
OPMERKING: om te verhogenZie stabiliteit, tot 4 verankeringsschroeven zijn gebruikt 29 .
OPMERKING: De precieze stereotaxische coördinaten zijn: 2 mm van de middellijn op beide hemisfeer en 2 mm rostral van bregma (craniotomies # 1 en # 2), 2 mm rostral van lambda en 4 mm links van de middenlijn (craniotomie # 3) 2 mm rostral van lambda en 2 mm lateraal rechts van middenlijn (craniotomie # 4). Zie figuur 1 .
- Schroef aan de linker halfrond twee vergulde schroeven door de craniotomies voor ondersteuning.
- Bevestig de schroef in een hemostatische klem en houd hem verticaal boven de craniotomie vast. Zet de onderkant van de schroef voorzichtig aan de bovenkant van de craniotomie. Draai het terwijl het niet afwijken van de verticale positie.
OPMERKING: Slechts 1,5 rotaties zijn voldoende om goede mechanische stabiliteit en signalen van hoge kwaliteit te verkrijgen, terwijl de druk op het onderliggende weefsel 25 wordt beperkt. - Rechts schroef de voorkantVies geprepareerde elektroden (beschreven in stap 1.2.1.) Door de craniotomies.
- Bevestig de schroef in een hemostatische klem en houd hem verticaal boven de craniotomie vast. Zet de onderkant van de schroef voorzichtig aan de bovenkant van de craniotomie. Draai het terwijl het niet afwijken van de verticale positie.
- Met de hulp van pincet lig de rand van de huid zorgvuldig op de nekspieren. Steek de EMG-ECG-draden in, met de spiraalvormige uiteinden in de spieren (links en rechts). Plak de middelste delen aan de schedel zodat de linker EMG-ECG naast de achterste linker verankeringsschroef komt, terwijl de rechter EMG-ECG naast de voorste linker verankeringsschroef is geplaatst.
- Om ECG-signalen van het hart tijdens de slaap te detecteren, zorg ervoor dat de EMG-ECG-draden in de spier worden geplaatst tot een diepte van ~ 0,8 - 1 cm, met hun lusjes zo ver mogelijk van elkaar.
- Gebruik een spatel bedekt met twee componenten epoxy lijm om de lijm op de schedel tussen en om de schroeven aan te brengen. Laat het in het licht drogen, maar bescherm de ogen van het dier tegen buitensporige bliksem.
OPMERKING: De bouten van de schroeven moeten bedekt zijn, en alleen de draden moeten toegankelijk zijn, opkomende frOm de lijm. - Zorg ervoor dat de lijm de ruimte tussen de twee EMG-ECG-elektroden uitstrekt, zodat er geen elektrisch contact tussen deze en de steunschroeven is. Betaal zorgvuldige zorg om de huid niet aan de schedel te lijmen; De huid moet vrij blijven om rond de lijm te bewegen.
- Snijd de EEG- en EMG-ECG-draden zodanig dat ze ~ 0,5 mm uit de lijm bereiken. Soldeer de vier pennen aan de hoek van de connector die is voorbereid in stap 1.2.3. Naar de vier draden die voortkomen uit de lijm ( figuur 1 ).
- Probeer de connectorpinnen zo dicht mogelijk te plaatsen om de hoogte van het implantaat te minimaliseren; Gebruik een kleine krokodilklem die is bevestigd aan de stereotactische houder die de positie van de connector vasthoudt. Minimeer de tijd in contact met de soldeerpunt, aangezien dit snel de schroeven verhit.
- Vul de ruimte tussen de lijm en de connector met tandcement om de soldeerdelen te bedekken. Creëer smooDe gezichten en vermijd scherpe randen die het dier kunnen pijn doen. Bovendien vermijdt u de huid, aangezien dit leidt tot jeuk.
- Verwijder de bulldog serrefines. Sluit indien nodig de wond met behulp van een steriele hechtdraad (absorbeerbare hechtende vezel) voor en achter de connector, waarbij eenvoudige, onderbroken sluitingpatronen en twee vierkante knopen worden gemaakt (5-0 FS-3 naald, 45 cm filament).
- Monitor het dier tot het volledig wakker is. Weeg het dier na de operatie en stuur het terug naar zijn huiskooi voor herstel.
- Postoperatieve zorg en verbinding met het systeem.
- Monitor het dier elke dag voor een week. Kijk naar gewichtsverlies, verminderde of abnormale activiteit, en tekenen van infecties. Volg de door u veterinaire autoriteiten vastgestelde scoreprocedure.
- 5-6 dagen na de operatie sluit u de opnamekabel aan op de kopstekker op het dier en laat het in zijn huiskooi liggen. Wacht nog eens 4 tot 5 dagen voor het begin van de recorZo dat het dier op de voorwaarde wordt gewoond en natuurlijk slapen.
2. Basisscore van EEG / EMG-ECG-gegevens voor Vigilance State Determination
- Record EEG en EMG-ECG data over 48 uur met een commerciële polysomnografische software ( bijvoorbeeld Somnologica, SleepSign, of Sirenia). Gebruik typische instellingen, zoals 2.000x gain; Een bemonsteringssnelheid van 2.000 Hz bij de aanschaf, naar beneden gemonsterd naar 200 Hz na de overname; En een 0,7-Hz hoge-pass filter voor EEG en een 10-Hz high-pass filter voor EMG-ECG.
- Exporteer de gegevens in het bestand ".edf".
- Open de ".edf" -bestanden met een op maat geschreven ( bijv. In Matlab) software die elke vierentwintig periode automatisch classificeert als wakker, niet-REM-slaap, REM-slaap en bijbehorende artefacten.
OPMERKING: Alternatief zijn er diverse semi-geautomatiseerde scoringssoftware beschikbaar. Deze procedure beschrijft enkele basisstappen die moeten worden uitgevoerd om scoring w in te stellenMet de hier gebruikte scoringsoftware; Andere semi-automatische scoringsystemen kunnen gebaseerd zijn op andere parameters. - Gebruik de software om de ".edf" bestanden in 4 keer 12 uur opnamen te scheiden.
- Verwijder artefacten die voortvloeien uit EMG-ECG-activiteit die aanwezig is in het EEG-signaal of uit een niet-toegewezen gedragsstatus 1 , 29 .
- Bereken het gemiddelde van de gemiddelde EEG (EEG gemiddelde ) en EMG (EMG gemiddelde ) waarden gedurende de 12 uur opnames van respectievelijk de EEG en de EMG-ECG-sporen.
- Identificeer de gemiddelde EEG / EMG waarden van elke 4-s-epoch (EEG- epoxy / EMG- epoxy ).
- Klassificeer de tijdvakken als "Wake" wanneer de EEG- epoxy <EEG- gemiddelde en EMG- epoxy > EMG betekenen en als "Non-REM sleep" wanneer EEG- epoxy > EEG gemeen en EMG- epoxy <EMG betekent.
- Klassificeer de tijdvakken die niet zijn Bevredig deze criteria met een corrigerende algoritme op basis van voorafgaande en daaropvolgende tijdperken.
- Klassificeer de tijdperken als REM-slaap wanneer EEG- epoxy <EEG gemeen en EMG- epoxy <EMG betekent .
- Verfijn de kritieke punten, zoals overgangen van niet-REM-slaap om te wakkeren, REM-slaapperiodes en micro-arousals tijdens niet-REM-slaap. Visueel inspecteer de scoring om de juiste waakzaamheidstoestand 29 , 30 te waarborgen.
OPMERKING: Voer altijd een laatste visuele inspectie en validatie van de score uit.
3. Analyse van de langzame oscillatie voor EEG en hartslag
- Voor deze analyse selecteert u alleen niet-REM slaapzittingen die ≥ 96 s duren ( dwz minstens 24 epochen van 4 s); Zie figuur 2 .
OPMERKING: Aangepaste routines zijn op aanvraag 1 beschikbaar .
Figuur 2 . Het bepalen van de Sigma Power Dynamics tijdens de onbedorven Non-REM Sleep.
( A ) Top, EEG (zwart) en EMG-ECG (grijs) sporen tijdens de eerste 100 minuten van de lichtfase in één muis. Vigilance staten worden aangegeven door de gekleurde balk boven de rauwe sporen. Midden, typisch voorbeeld van een continue (> 96-s) non-REM sleepbout. Bottom, een willekeurig gekozen, 16-s interval dat de onderverdeling illustreert in 4-s-epochs. De volgende stap van de analyse wordt alleen weergegeven voor deze vier epochen, maar het geldt voor elke periode die in de wedstrijd voorkomt. ( B ) Top, vier opeenvolgende FFT's gegenereerd uit de 4-s-epochs die in het onderste paneel van A. worden getoond. De sigma-band (10-15 Hz) is rood in schaduw. Rechtsboven, 1-s-ingang van de laatste tijd die de aanwezige R-golven toont in het vierkant EMG-ECG-signaal. Bodem, tijdsbestek van de Sigma power geëxtraheerd uit het overeenkomstige spectrum hierboven. De gestippelde lijnen illustreren de voortzetting van de vermogenswaarden vóór en na de vier niet-REM-uitingen die geselecteerd zijn voor weergave. ( C ) Normaliseerde sigma kracht (rood) en hartslag (in BPM) (grijze) tijdcursussen, met het gedeelte dat in (B) wordt weergegeven tussen de verticale streeplijnen. Hieronder ziet u het bijbehorende gefilterde EEG signaal in de sigma band (10 - 15 Hz). ( D ) Resultaat van de FFT berekend op de sigma power-time cursus getoond in (C), waarbij een dominante piek bij 0.016 Hz wordt aangetoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
- Ontleed de krachtwaarden voor de sigma frequentieband (10-15 Hz) spectrale stroom in 4-s-bakken ( Figuur 2 A en B ) met behulp van berekeningen van snelle Fourier-transformaties (FFT)"> 1.
- Bereken de baseline spectrale kracht voor niet-REM slaap door de waarden in elke frequentiebak te berekenen voor alle niet-REM slaapperiodes (artefacten en overgangsovergangen tussen waakzaamheidsstaten worden uitgesloten van deze gemiddelde). Normaliseer de sigma-krachtwaarden van elk tijdperk tot de gemiddelde kracht van de sigma-band tijdens de niet-REM-slaap over de periode van interesse. Plot tegen tijd ( Figuur 2 C ).
- Bereken de FFT van de sigma power-time cursus met Hamming windowing om de oscillatorfrequente componenten van de vermogensdynamiek te onthullen ( Figuur 2 D ) 1 .
- Merk op dat, aangezien de niet-REM slaapzittingen verschillende duraties hebben, hebben de resulterende FFT's verschillende frequentie resoluties. Interpoleren om de resolutie aan te passen aan de hoogste die wordt verkregen uit de langste non-REM sleepbout en gemiddelde de FFTs van alle bouts.
- Ga verder met deze analyseEs om de faseverhoudingen tussen de dynamiek van EEG- en ECG-signalen te omschrijven.
- Ontkoppel de hartslagdata uit het vierkant EMG-ECG-signaal na 30-Hz high-pass filtering met behulp van passende routines voor de piekdetectie van de R-golf.
OPMERKING: Het beperken van het minimale tijdsinterval tussen twee opeenvolgende R-golven tot 80 ms helpt bij het voorkomen van incidentele artefactuele pieken door spiertrekken 1 te voorkomen . - Meet de RR intervallen en bereken de gemiddelde hartslag in beats per minuut (BPM) elke 4-voudige bak ( Figuur 2 B en C ).
4. Belichting op geluid
- Genereer geluiden (dwz wit geluid) via een op maat geschreven software. Stel de duur in op 20 s en de intensiteit tot 90 dB SPL (gemeten in de kooi). Speel de geluiden door middel van standaard actieve luidsprekers 1 .
- Na de operatie, tijdens de wabituation naar de recorVoorwaarde, speel experimenteel geluiden willekeurig, meerdere keren gedurende de dag en op verschillende momenten 1 .
- In de experimentele conditie (tijdens het opnemen van EEG / EMG / ECG data), speel de geluids pseudo-willekeurig gedurende de eerste 100 minuten bij licht aanvang (ZT0). Om het geluid te spelen, voldoet u aan de volgende voorwaarden 1 :
- Zorg ervoor dat de muis in de niet-REM-slaap is voor> 40 s.
- Zorg ervoor dat de vorige blootstelling meer dan 4 minuten voorbij is.
OPMERKING: dit resulteert in ~ 15 blootstellingen per sessie.
- Merk het begin van de opnametijd en het begin van elke geluidsbelasting. Blijf de experimentator blind voor de spectrale samenstelling van niet-REM slaap tijdens de procedure.
- Verkrijg alle gegevens met polysomnografische software 1 , 29 .
5. Retrospectieve analyse van slaap gebaseerd op de gedragsuitkomst tijdensBlootstelling aan geluid
- Evalueer EEG / EMG-ECG-traces handmatig in een resolutie van 4 seconden, zonder kennis van de geluidsbelastingstijden 1 .
- Gebruik een op maat geschreven script om de EEG / EMG-ECG / geluidsbelichtingsgegevens 1 te extraheren.
- Score als sleep-through wanneer zowel EEG- als EMG-signalen ongewijzigd blijven tijdens geluidsbelasting ( Figuur 3A ). Beschouw een wake-up wanneer de EEG-amplitude afneemt en de EEG-frequentie toeneemt, in combinatie met de gedetecteerde spieractiviteit op de EMG-ECG-elektrode ( Figuur 3B ).
- Verwijder proeven waarin dieren wakker werden tijdens de pre-stimulusperiode of in de eerste 4 s van geluidsbelasting ( Figuur 3D ).
- Definieer het wekelijks succespercentage als het percentage wekproeven in alle bijbehorende proeven ("Wake-up" en "Sleep-through").
- In alle bijbehorende proeven onderzoekt u de dynamiek van de sigma kracht tijdens de thE pre-stimulus periode ( Figuur 3 E ) 1 .
Figuur 3 . Gedragsuitkomsten in reactie op geluidsoverlast: representatieve resultaten die werden behouden of uitgesloten van analyse.
( AD ) Rauwe sporen van het EEG (zwart) en bijbehorende EMG-ECG (grijze) signalen gedurende 40 seconden voor het begin van het geluid en tijdens de 20 seconden van geluid, vertegenwoordigd door het blauwschaduwrijke gebied. Vigilance staten worden aangegeven in de kleurcode. Om gegevens te illustreren die in de analyse waren opgenomen, worden representatieve "Sleep-through" ( A ) en "Wake-up" ( B ) gebeurtenissen getoond. Resultaten die werden weggegooid, bevatten overgangen naar REM slaap ( C ) en een vroegtijdige "Wake-up" reactie ( D ). De inzet toont een expanGedeeld EEG- en EMG-ECG-traces kenmerkend voor REM-slaap. ( E ) Typische voorbeelden van sigma-vermogensdynamiek in het 40-s venster voordat geluidsaanvang tijdens een "Sleep-through" (links) en een "Wake-up" (rechts) gebeurtenis. De ruwe EEG trace bandpas gefilterd voor de sigma band is hierboven weergegeven. Het blauwe gebied vertegenwoordigt het geluidssignaal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 2 A (bovenpaneel) toont 100 minuten spontaan slaapwakker gedrag, opgenomen via polysomnografische elektroden geïmplanteerd zoals beschreven (zie figuur 1 ). De verhogingen en afnemingen van de EEG- en EMG-amplitude bij niet-REM slaapziekte zijn duidelijk zichtbaar. Intermitterende REM slaap wordt gekenmerkt door een afname van de EEG amplitude en een verdere afname in EMG toon die niet zichtbaar is op deze compressed time scale. Inzoomen op een niet-REM slaapbout onthult de hoge amplitude trage golven in het EEG en in de EMG-ECG-trace de lage spieractiviteit, waarop de RR-intervallen van de hartslag boven verticale afbuigingen worden omgezet ( Figuur 2 A , Midden en onderpanelen). Een FFT onthult de dominantie van SWA gedurende alle 4-s-epochs ( Figuur 2 B ). De gemiddelde sigm plottenEen kracht (10 - 15 Hz, rode schaduwstaaf) voor elk van deze tijdperken laat zijn wisselende tijdsoort zien, samen met variaties in hartslag met de tegengestelde richting. Uitvoeren van deze analyse over het geheel van de niet-REM-bouts en normalisering om de vermogenswaarden te betekenen, elimineert de reguliere variaties in sigma-kracht rond het gemiddelde ( Figuur 2C ). Fourier analyse over deze power-time cursus toont een grote piek van ongeveer 0,02 Hz, wat de periodieke toename van sigma power in intervallen van 50 s weerspiegelt ( figuur 2D ).
Om de functie van de 0,02 Hz-oscillatie in arousability te onderzoeken, werden muizen blootgesteld aan 20 s pulsen van 90 dB bij het slapen, onder de beschreven omstandigheden. Figuur 3 geeft een aantal van de experimentele uitkomsten van dergelijke geluidsblootstellingen weer. Toen muizen niet wakker werden tijdens het geluid, en de EEG en EMG-ECG golfvormen bleven onveranderd, was het resultaat de lesOmgevormd als een "Sleep-Through" ( Figuur 3A ). Toen de EEG-amplitude daalde en EMG-activiteit werd waargenomen, werd het resultaat als een "Wake-up" ( Figuur 3 B ) gescoord. Af en toe werden muizen overgebracht naar REM-slaap tijdens een proef ( Figuur 3 C ) of wakker geworden in het interval van 40 seconden voordat het geluid begon ( Figuur 3 D ). Deze gebeurtenissen werden uitgesloten van de analyse, omdat onze interesse specifiek was om de kenmerken van geconsolideerde niet-REM-slaap te identificeren die voorafgaan aan het resultaat van geluidsbelasting ("Sleep-through" of "Wake-up"). Het berekenen van de sigma-kracht in de periode van 40 jaar voorafgaand aan de geluidsstimulatie liet zien dat de 0,02 Hz-oscillatie bij de deur was wanneer er een "Sleep-through" plaatsvond ( Figuur 3 E , linker paneel), terwijl het piekte was voor een "Wake- up & #34; Gebeurtenis ( figuur 3 E , rechter paneel). Daarom wordt de fase van de 0,02-Hz-oscillatie in sigma-kracht geïdentificeerd als een kenmerk voor slaapstaten met variabele veerkracht van geluid, waarbij de terugkeer van de niet-REM-slaap van een muis achteraf wordt gebaseerd, gebaseerd op een variabel gedragsuitkomst naar akoestische stimulatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier laten we zien hoe een continu temporaal profiel van niet-REM-slaap wordt vastgesteld die de EEG-, EMG- en ECG-variabelen integreert. Dit is een eerste stap in de richting van het ontwikkelen van een integrale beschrijving van de slaap van de muis, die kan helpen bij het identificeren van de eerder onbekende tijdschaal over welke hoge en lage veerkracht aan geluid wordt georganiseerd tijdens niet-REM slaap 1 . Een soortgelijke tijdelijke structuur werd ook beschreven bij menselijke niet-REM slaap door middel van een analoge analyse 1 .
De hier voorgestelde procedure voldoet aan twee doelen. Ten eerste wijzen we op dat polysomnografische technieken betrouwbaar zowel EEG- als EMG-ECG-signalen kunnen leveren tijdens het geheel van de niet-REM slaapperiodes in muizen. De hartslag is het meest zichtbaar in EMG-sporen tijdens REM-slaap door spieratonia, en het wordt meer verborgen in de niet-REM-slaap door verhoogde spiertonus en af en toe spiertrekkingen. EMG-ECG-elektroden meer inbrengenDiep in de spier en houden ze zo ver mogelijk, verhoogt de amplitude van de R-golven van het hart, zodat ze duidelijk uit de achtergrond spiertonus komen. Routines voor piekdetectie extraheren de hartslag van het EMG-ECG-signaal van niet-REM-slaap en laat de kwantificering van de variabiliteit ervan toe.
Telemetrie gebaseerde technologieën om EEG / EMG en ECG tegelijkertijd te controleren, worden steeds meer gebruikt, maar de kwaliteit van de signalen die nodig zijn voor een grondige spectrale analyse blijft inferior in termen van bandbreedte en stabiliteit. Bovendien zijn zelfs enkele kanalen zenders van aanzienlijke omvang, en hun implantatie in het cervicale subcutane gebied of in de lichaamsholte kan het welzijn van het dier beïnvloeden en slaap verstoren. Niettemin is het verder ontwikkelen van dergelijke apparaten nodig om het bereik van centrale en autonome parameters te verlengen die gelijktijdig kunnen worden gevolgd tijdens ongestoorde slaap in muizen, dat is het diermodel van cHoice voor slaapstudies. In combinatie met technieken zoals hoofdsteun, die het mogelijk maakt om gegevens te verzamelen van zowel niet-REM als REM slaap in muizen met ongewijzigde spectrale profielen 1 , 19 , kunnen multiparametrische metingen tijdens slaap nu gecombineerd worden met gecontroleerd gedragstests.
Ten tweede kan de analytische aanpak die we hier presenteren ook worden toegepast op lokale veldpotenties om het hersengebied te definiëren die betrokken is bij het genereren van het kenmerk van belangstelling 1 . Bovendien is het van toepassing op imaging technieken snel genoeg om te rapporteren over het spectrale gedrag van neuronale populaties en voor zowel continue ( bv. Spectrale bands) en discrete ( bijv. Hartslag of ademhaling) variabelen. De tijdresolutie is beperkt door de duur van het tijdvak dat is gekozen om de waakzaamheidsstaat te scoren. In wezen zijn standaard spectrale analyses van de signalen afgeleid van niet-REM sLeep bouts worden gevolgd door een uitlijning van de stroomdichtheid waarden van individuele signalen voor elk tijdperk. Daarna wordt een spectrale analyse van deze vermogensdynamiek gebruikt om de periodiciteiten in de structuur te kwantificeren. Bij beide muizen en mensen leverde onze aanpak een 0,02 Hz-oscillatie, met vergelijkbare eigenschappen 1 , die het als een verenigend kenmerk voor zoogdier slaapstructuur bekwaamden.
Een kritische stap was de functionele validatie van de waargenomen periodiciteit door de non-REM slaap retrospectief te beoordelen op basis van de gedragsreactiviteit van de slaapmuis naar geluid. Hierbij was de keuze van een geluidsstimulus die leidde tot een variabel gedragsuitkomst, waardoor wakker worden of door de slaap was, beslissend. Sterke zintuiglijke stimuli die in de meeste blootstellingen wakker worden, zouden de 0.02-Hz oscillatie niet ontrafelen, omdat wakker worden uit alle fasen. Daarentegen zou een te zwakke stimulus de fase-relatie met de 0,02-Hz osc niet constant onthullengevolgtrekking. Op dezelfde manier zou elke waargenomen periodiciteit in een gemeten parameterset moeten gaan met het variabele resultaat. Bijvoorbeeld, in het hier gepresenteerde geval hebben we alleen onderscheid gemaakt tussen wake up of sleep-events, waarbij niet rekening wordt gehouden met het exacte moment van wakker tijdens de geluidsbelasting of de duur van de daaropvolgende wake state (zie echter 1 ) . Het gebruik van korte stimuli bij verschillende intensiteiten 24 , 25 , 28 kan helpen om de exacte faseverhoudingen tussen de 0,02 Hz-oscillatie en wekdienst te definiëren. Bovendien kan het variëren van de frequentiesamenstelling van de geluiden de wekbaarheid moduleren als een functie van de recente geschiedenis van slaapwakker gedrag, het geslacht, de aanwezigheid van nestels of andere vormen van recente ervaring. Een andere mogelijkheid zou kunnen zijn om te onderzoeken of de prevalentie van microarousale of volledige opwinding afhankelijk is van een bepaalde momentale slaapstand. De score van slaap gebaseerd op een variabel gedragsuitval zou de functionele microarchitectuur van slaap meer algemeen kunnen verlichten. Terwijl we en andere reactiviteit hebben getroffen op geluidsblootstelling 1 , 28 , wakker worden in reactie op andere zintuiglijke modaliteiten, waakzaamheidsstaatovergangen 14 of droomrapporten kunnen worden beoordeeld om de bijbehorende correlaten van de voorafgaande slaap uit te trekken. Bovendien zal het heel interessant zijn om slaapstoornispatiënten te testen met betrekking tot hun gevoeligheid voor externe storingen en een mogelijke verstoring van de 0,02-Hz-oscillatie. Slaapstoornissen kunnen leiden tot cardiovasculaire stoornissen, terwijl cardiovasculaire risico's kunnen leiden tot slaapdysregulatie 31 , 32 , die onderzoeken op de coördinatie van de hersenhart bij 0,02 Hz-oscillatie die mogelijk relevant zijn voor het begrijpen van deze bidirectionaIk ben afhankelijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen financieel belang hebben.
Acknowledgments
Wij bedanken alle lableden voor hun bijdrage aan het schrijven en voorzichtig lezen van dit manuscript. Wij zijn Paul Franken dankbaar voor het stimuleren van discussies, Dr. Gisèle Ferrand voor nuttige opmerkingen over het chirurgische protocol en Dr. Jean-Yves Chatton voor het leveren van de originele Labview-uitvoerbare bestanden voor de geluidsbelasting. Financiering werd verstrekt door de Zwitserse National Science Foundation (Grants 31003A_146244 en 31003A_166318) en de Etat de Vaud.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-components epoxy glue | Henkel | Loctite EA 3450 | |
| Absorbable Suturing Fiber (Prolene) | Ethicon | 5-0 FS-3 | |
| Adson Forceps | FST | 11006-12 | |
| Antiseptic swab | VWR | 149-0332 | |
| Attane Isoflurane | Piramal | Isoflurane 250mL | |
| Connectors 3 x 2-channels | ENA AG | 2.316 | Raster 2.54 x 2.54 mm; size 5 x 8 x 9 mm; pin size 5 mm; http://www.ena.ch/ |
| Dragonfly commutator | Dragonfly | Model #SL-10 | |
| EMBLA amplifier | EMBLA | A10 amplifier | |
| Fine scissors | FST | 14108-09 | |
| Flat Head Gold-plated steel screw | J.I. Morris | FF00CE125 | https://jimorrisco.com/ |
| Gold wire | CMSA | T.69 5gr | http://www.cmsa.ch/en/ |
| Hemostatic sponge | Pfizer | Gelfoam | |
| iodine-based disinfectant (Betadine) | Mundipharma | standart solution 60mL | |
| Komet drill steel 1/005PM104 | UNOR AG | 22310 | |
| Matlab Analysis Software | MathWorks | R2016b | https://ch.mathworks.com/products/matlab.html |
| Microdrill | Fine Science Tools | 96758 | |
| Mouse Gas Anesthesia Head Holder | Kopf Instruments | Model 923-B | http://kopfinstruments.com/product/model-923-b-mouse-gas-anesthesia-head-holder/ |
| Ophtalmic ointment | Pharmamedica | VITA-POS | |
| Paladur (liquid) | UNOR AG | 2260215 | for dental cement |
| Palavit (powder) | UNOR AG | 5410929 | for dental cement |
| Small Animal Stereotaxic Frame | Kopf Instruments | Model 930 | http://kopfinstruments.com/product/model-930-small-animal-stereotaxic-frame-assembly/ |
| Soldering wire | Stannol | 593072 | |
| Temperature controller - Mini rectal probe | Phymep | 4090502 | http://www.phymep.com/produit/dc-temperature-controller/ |
| Temperature controller- heating pad | Phymep | 4090205 | http://www.phymep.com/produit/dc-temperature-controller/ |
References
- Lecci, S., et al. Coordinated infra-slow neural and cardiac oscillations mark fragility and offline periods in mammalian sleep. Sci Adv. 3 (2), 1602026 (2017).
- Rechtschaffen, A., Kales, A. A manual of standardized terminology, techniques and scoring system for sleep of human subjects. U.S. Department of Health, Education, and Welfare. , Washington, DC. (1968).
- Blake, H., Gerard, R. W. Brain potentials during sleep. Am J Physiol. 119, 692-703 (1937).
- Rechtschaffen, A., Hauri, P., Zeitlin, M. Auditory awakening threshold in REM and NREM sleep stages. Percept Mot Skills. 22 (3), 927-942 (1966).
- Achermann, P., Borbély, A. A. Low-frequency (< 1 Hz) oscillations in the human sleep electroencephalogram. Neuroscience. 81 (1), 213-222 (1997).
- Aeschbach, D., Borbély, A. A. All-night dynamics of the human sleep EEG. J. Sleep Res. 2 (2), 70-81 (1993).
- Astori, S., Wimmer, R. D., Lüthi, A. Manipulating sleep spindles--expanding views on sleep, memory, and disease. Trends Neurosci. 36 (12), 738-748 (2013).
- Brown, R. E., Basheer, R., McKenna, J. T., Strecker, R. E., McCarley, R. W. Control of sleep and wakefulness. Physiol Rev. 92 (3), 1087-1187 (2012).
- Buzsáki, G., Wang, X. J. Mechanisms of gamma oscillations. Annu Rev Neurosci. 35, 203-225 (2012).
- Rasch, B., Born, J. About sleep's role in memory. Physiol Rev. 93 (2), 681-766 (2013).
- Halász, P., Bòdizs, R. Dynamic structure of NREM sleep. , Springer. (2013).
- Terzano, M. G., Parrino, L., Spaggiari, M. C. The cyclic alternating pattern sequences in the dynamic organization of sleep. Electroencephalogr Clin Neurophysiol. 69 (5), 437-447 (1988).
- Gottesmann, C. Detection of seven sleep-waking stages in the rat. Neurosci Biobehav Rev. 16 (1), 31-38 (1992).
- Benington, J. H., Kodali, S. K., Heller, H. C. Scoring transitions to REM sleep in rats based on the EEG phenomena of pre-REM sleep: an improved analysis of sleep structure. Sleep. 17 (1), 28-36 (1994).
- Sullivan, D., Mizuseki, K., Sorgi, A., Buzsáki, G. Comparison of sleep spindles and theta oscillations in the hippocampus. J Neurosci. 34 (2), 662-674 (2014).
- Vas, S., et al. Differential adaptation of REM sleep latency, intermediate stage and theta power effects of escitalopram after chronic treatment. J Neural Transm (Vienna). 120 (1), 169-176 (2013).
- Schiffelholz, T., Aldenhoff, J. B. Novel object presentation affects sleep-wake behavior in rats. Neurosci Lett. 328 (1), 41-44 (2002).
- Wimmer, R. D., et al. Sustaining sleep spindles through enhanced SK2-channel activity consolidates sleep and elevates arousal threshold. J Neurosci. 32 (40), 13917-13928 (2012).
- Fernandez, L. M. J., et al. Highly dynamic spatiotemporal organization of low-frequency activities during behavioral states in the mouse cerebral cortex. Cereb Cortex. , (2016).
- Franken, P. Long-term vs. short-term processes regulating REM sleep. J Sleep Res. 11 (1), 17-28 (2002).
- Feige, B., et al. The microstructure of sleep in primary insomnia: an overview and extension. Int J Psychophysiol. 89 (2), 171-180 (2013).
- Parrino, L., Halasz, P., Tassinari, C. A., Terzano, M. G. CAP, epilepsy and motor events during sleep: the unifying role of arousal. Sleep Med Rev. 10 (4), 267-285 (2006).
- Akinseye, O. A., et al. Sleep as a mediator in the pathway linking environmental factors to hypertension: a review of the literature. Int J Hypertens. 2015, 926414 (2015).
- Campbell, K., Muller-Gass, A. The extent of processing of near-hearing threshold stimuli during natural sleep. Sleep. 34 (9), 1243-1249 (2011).
- Nir, Y., Vyazovskiy, V. V., Cirelli, C., Banks, M. I., Tononi, G. Auditory responses and stimulus-specific adaptation in rat auditory cortex are preserved across NREM and REM sleep. Cereb Cortex. 25 (5), 1362-1378 (2015).
- Dang-Vu, T. T., et al. Interplay between spontaneous and induced brain activity during human non-rapid eye movement sleep. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (37), 15438-15443 (2011).
- Elton, M., et al. Event-related potentials to tones in the absence and presence of sleep spindles. J Sleep Res. 6 (2), 78-83 (1997).
- McKinney, S. M., Dang-Vu, T. T., Buxton, O. M., Solet, J. M., Ellenbogen, J. M. Covert waking brain activity reveals instantaneous sleep depth. PLoS One. 6 (3), 17351 (2011).
- Mang, G. M., Franken, P. Sleep and EEG phenotyping in mice. Curr Protoc Mouse Biol. 2 (1), 55-74 (2012).
- Borbély, A. A., Tobler, I., Hanagasioglu, M. Effect of sleep deprivation on sleep and EEG power spectra in the rat. Behav Brain Res. 14 (3), 171-182 (1984).
- Jurysta, F., et al. The impact of chronic primary insomnia on the heart rate--EEG variability link. Clin Neurophysiol. 120 (6), 1054-1060 (2009).
- Silvani, A., Calandra-Buonaura, G., Benarroch, E. E., Dampney, R. A. L., Cortelli, P. Bidirectional interactions between the baroreceptor reflex and arousal: an update. Sleep Med. , (2015).
