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Neuroscience

Quantificando a dinâmica infra-lenta do poder espectral e da freqüência cardíaca em ratos dormindo

Published: August 2, 2017 doi: 10.3791/55863
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1Department of Fundamental Neurosciences, University of Lausanne

Summary

Aqui, apresentamos procedimentos experimentais e analíticos para descrever a dinâmica temporal das variáveis ​​neurais e cardíacas do sono não REM em camundongos, que modulam a capacidade de resposta do sono aos estímulos acústicos.

Abstract

Três estados de vigilância dominam a vida dos mamíferos: a vigília, o movimento do olho não-rápido (não REM) e o sono REM. À medida que mais correlatos neurais de comportamento são identificados em animais que se movem livremente, essa subdivisão tripla torna-se muito simplista. Durante a vigília, conjuntos de atividades corticais globais e locais, juntamente com parâmetros periféricos como diâmetro pupilar e equilíbrio simpatizante, definem vários graus de excitação. Ainda não está claro até que ponto o sono também forma um continuum de estados cerebrais - dentro do qual o grau de resiliência aos estímulos e despertar sensoriais, e talvez outras funções do sono, variam gradualmente - e como os estados fisiológicos periféricos co-variam. A pesquisa que avança nos métodos para monitorar vários parâmetros durante o sono, além de atribuir constelações desses atributos funcionais, é fundamental para refinar nossa compreensão do sono como um processo multifuncional durante o qual muitos efeitos benéficos devem ser exEcuted. Identificar novos parâmetros que caracterizam os estados do sono abrirá oportunidades para novas vias de diagnóstico em distúrbios do sono.

Apresentamos um procedimento para descrever as variações dinâmicas dos estados de sono não-REM do mouse através dos sinais combinados de monitoramento e análise de eletroencefalograma (EEG) / eletrocorticograma (ECoG), eletromiograma (EMG) e eletrocardiograma (ECG) usando técnicas padrão de gravação polissonográfica. Ao usar essa abordagem, descobrimos que o sono não-REM do mouse é organizado em ciclos de oscilações neurais e cardíacas coordenadas que geram intervalos sucessivos de 25 segundos de alta e baixa fragilidade para estímulos externos. Portanto, os sistemas nervoso central e autônomo são coordenados para formar estados de sono comportamentalmente distintos durante o sono consolidado não-REM. Apresentamos manipulações cirúrgicas para o monitoramento polissonográfico ( isto é, EEG / EMG combinado com ECG) para rastrear esses ciclos no mouse livremente dormindo, a análise para quantiPor sua dinâmica e os protocolos de estimulação acústica para avaliar seu papel na probabilidade de acordar. Nossa abordagem já foi estendida ao sono humano e promete desvendar princípios organizacionais comuns dos estados do sono não-REM em mamíferos.

Introduction

O sono dos mamíferos é um estado de repouso comportamental e de resiliência aos estímulos ambientais. Apesar desta aparente uniformidade, os parâmetros polissonográficos e autonômicos indicam que o sono se move entre estados nervosos e somáticos qualitativos e quantitativamente diferentes em várias escalas temporais e espaciais 1 . Durante minutos a dez minutos, ocorre a mudança entre o sono não-REM e o REM. O sono não REM é acompanhado por atividade de grande amplitude e baixa frequência no EEG, com um pico espectral em torno de ~ 0,5 - 4 Hz, enquanto o sono REM mostra atividade regular de EEG na banda theta (6-10 Hz), juntamente com Atonia muscular 2 . Dentro do sono não REM, os seres humanos atravessam a luz (S2) e o sono de onda lenta profunda (SWS). Como indica a sua nomeação, estes dois estágios apresentam limites de excitação inferiores e superiores 3 , 4 , respectivamente, e diferem principalmente na densidade de baixa freqüênciaPotência EEG cortical, referida como atividade de onda lenta (SWA, 0,75 - 4 Hz). A não-uniformidade persiste em cada episódios individuais de S2 e SWS na escala de minutos a sub-segundos, como documentado extensivamente pela presença variável de SWA ao longo de um ataque de 5 , 6 , mas também por ritmos de potencial EEG e campo em Freqüências mais altas, incluindo ondas de fuso na banda sigma (10-15 Hz) e ritmos gama (80 - 120 Hz) (para uma revisão, ver 7 , 8 , 9 , 10 ).

Em vez de serem sutis, essas variações alteram o estado cortical dormindo em seres humanos para os extremos do espectro. Para o sono não REM, estes variam de uma predominância de SWA para estados que se aproximam da atividade de despertar porque eles contêm uma proporção substancial de componentes de alta freqüência 11 12 . Em roedores e gatos, embora o sono não-REM não seja subdividido em estágios, um breve período chamado sono intermediário (IS) emerge antes do início do sono REM 13 . Durante IS, as características do sono REM, como a atividade da teta do hipocampo e as ondas ponto-geniculo-occipitais, enquanto as assinaturas do sono não-REM, como as ondas do fuso e a SWA, ainda estão presentes, indicando uma mistura entre os dois estados de sono 14 , 15 . No entanto, IS pode ser funcionalmente distinto porque é modulado por antidepressivos 16 e através de uma nova apresentação de objeto durante a vigília anterior 17 , e contribui para a configuração do limiar de excitação 18 . Além disso, as parcelas espaciais do EEG e os parâmetros de EMG de ratos de movimento livre mostram um conjunto de pontos 14 que é contínuo entre o sono não REM, o sono REM e a vigília. Também há declínios esporádicos na SWA, sem entrar na vigília ou no sono REM, o que leva a flutuações substanciais na presença relativa dos componentes de baixa e alta freqüência durante um período de duração consolidado não-REM 14 , 19 , 20 . Finalmente, as proporções variáveis ​​de SWA e os ritmos de freqüência mais altos durante o sono não-REM ocorrem não apenas no tempo, mas também mostram diferenças regionais em amplitude e sincronização entre as áreas corticais 19 .

O sono não-REM de mamífero está longe de ser uniforme. No entanto, se tal não-uniformidade leva a estados que diferem em função e atributos comportamentais não é claro. Em vários tipos de distúrbios do sono, o sono contínuo é interrompido por despertares espontâneos e comportamento motor inapropriado. Além disso, as análises espectrais mostram alterações na presença relativa de freqüências mais altas no EEG 21E em parâmetros autonômicos, como taxas de respiração e batimento cardíaco 22 . A sequência ordenada dos estados de sono estáveis ​​é, portanto, perturbada, e elementos da excitação cortical e / ou autonômica entram de maneira descontrolada. Portanto, a compreensão do continuum dos estados do sono é de possível relevância para a doença. Além disso, a perturbação do sono pelo ruído ambiental em ambientes urbanos está associada a riscos gerais para a saúde, tornando crucial identificar momentos de maior vulnerabilidade durante o sono 23 .

As experiências de excitação comportamental em seres humanos adormecidos indicam que é mais difícil acordar do sono não-REM dominado por SWA (estágio S3), enquanto que o sono leve não REM (estágio S2) e o sono REM mostram níveis de excitação comparáveis ​​e inferiores 4 . O processamento cortical de estímulos sonoros curtos varia substancialmente entre o sono REM, S2 e S3 24 ,25 , indicando que os padrões de atividade cortical específicos do estado modulam os primeiros estágios do processamento sensorial. Para o sono não REM em humanos, a propensão a despertar em resposta ao ruído varia com a presença de ondas de fuso e ritmos alfa no EEG 26 , 27 , 28 . A ritmicidade talalocortical durante os eixos é acompanhada por inibição sináptica melhorada nos níveis talâmico e cortical, o que é pensado para contribuir para a atenuação do processamento sensorial 7 .

Como os períodos de sono resistentes ao ruído e vulneráveis ​​são organizados no tempo e quais são seus determinantes? Tanto em ratos como em humanos, identificamos recentemente uma oscilação infra-lenta de 0,02 Hz nos ritmos neurais. Dependendo da fase desta oscilação de 0,02 Hz, os ratos mostraram reatividade variável a estímulos externos, seja acordando ou durmecendoGh o barulho. Curiosamente, essa oscilação foi correlacionada com a taxa de batimentos cardíacos, indicando que o sistema nervoso autônomo participa da modulação da vulnerabilidade do sono aos estímulos externos 1 . Os ritmos do hipocampo relacionados à memória também foram organizados nesse ritmo e, de forma mais marcante, sua força correlacionada com a qualidade da consolidação da memória em humanos. A oscilação de 0,02 Hz parece ser um princípio organizador de roedores e sono humano não-REM que modula a sensibilidade ao meio ambiente e o processamento da memória interna. Isso ressalta a necessidade de avaliações multiparamétricas e contínuas de estados do sono para reconhecer suas funcionalidades e identificar sites de potencial vulnerabilidade.

Aqui, apresentamos um procedimento para extrair a forma de onda dessas dinâmicas, incluindo a implantação cirúrgica de camundongos para medições combinadas EEG / ECoG e EMG-ECG, exposição a estímulos sensoriais, umaNd rotinas de análise. Este procedimento fornece uma base para ver o sono como um estado de vigilância continuamente variável, porém altamente organizado, durante o qual diferentes funções de sono fundamentais são executadas sequencialmente. De um modo mais geral, o procedimento é aplicável a abordagens que visam extrair as características espectrais e autonômicas que precedem um resultado comportamental durante o sono tanto na saúde como nos estados de doença.

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Protocol

Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com o Comitê de Cuidados com Animais da Universidade de Lausanne e com o Serviço de Consommação e os Negócios Veterinários do Cantão de Vaud.

1. Cirurgia para gravações EEG / EMG-ECG

  1. Alojamento e seleção de animais.
    1. Manter animais (C57Bl / 6J, 7-9 semanas, 25 a 30 g) em um ciclo escuro / leve de 12: 12 horas, alojado individualmente e em condições padrão (40% de umidade, 22 ° C), com alimentos e água Disponível ad libitum .
    2. Use somente indivíduos do sexo masculino para evitar todas as influências do ciclo hormonal no sono.
  2. Preparação de eletrodos.
    1. Construa eletrodos de EEG / ECoG (usados ​​na etapa 1.3.11) usando peças de ouro de 0,5 cm de comprimento (75% de Au, 13% de Ag e 12% de diâmetro de Cu: 0,2 mm), cada um soldado em cima de um ouro Parafuso de aço inoxidável (3 mm de comprimento, 1,1 mm de diâmetro na base, FigurE 1). Prepare 2 eletrodos EEG por animal e limpe-os em etanol a 70%.
    2. Prepare eletrodos EMG-ECG com fios de ouro de 3 a 4 cm de comprimento (75% de Au, 13% de Ag e 12% de diâmetro de Cu: 0,2 mm). Dobre os fios a um ângulo de 90 ° a 1 cm de uma extremidade e prepare uma bobina (1 - 2 mm ø) na outra extremidade ( Figura 1 ). Entre as duas extremidades, dobre o fio para criar uma pequena curvatura que corresponde ao perfil de superfície do osso entre o cerebelo e lambda.
      1. Prepare 2 eletrodos EMG-ECG por animal.
    3. Prepare um conector de cabeça fêmea de 6 canais (raster: 2,54 mm x 2,54 mm, tamanho: 5 mm x 8 mm x 9 mm, tamanho do pino: 5 mm, veja a Figura 1 ).
      1. Cubra o conector na base de pinos macho e fêmea com fita adesiva.
      2. Adicione uma pequena quantidade de fio de solda às pontas de 4 dos 6 pinos machos para ajudar na soldagem dos eletrodos EEG e EMG-ECG durante a cirurgia(Veja o passo 1.3.16).

figura 1
Figura 1 . Exibição esquemática dos sites para implantação de eletrodo EEG e EMG no crânio do mouse.
Craniotomies # 1 e # 2 estão localizados ~ 2 mm lateralmente à linha média e ~ 2 mm rostral a bregma. Craniotomies # 3 e # 4 estão localizados ~ 2 mm rostral para lambda e são, respectivamente, 4 e 2 mm laterais à linha média. Os dois eletrodos de EEG, feitos de soldar um fio de ouro na parte superior de um parafuso de aço banhado a ouro (# 2 e # 4) estão no hemisfério direito. Os 2 parafusos esquerdos (# 1 e # 3) servem como suporte. Observe que os eletrodos EMG-ECG não devem estar em contato com estes 2 parafusos de suporte. Os eletrodos EMG-ECG são fios de ouro de 3 a 4 cm de comprimento, dobrados a ângulos de 90 ° em 1 cm nas extremidades rostrales e enrolados (1 - 2 mm ø) nas extremidades caudais. O eletrodo 2 EEG e 2 EMGS estão conectados ao conector de cabeça de 2 x 3 canais soldando um fio a um pino encurralado, como mostrado pelas linhas tracejadas. Mais informações detalhadas sobre esses eletrodos e sua implantação podem ser encontradas Em 29 . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Cirurgia de implantação.
    1. Anestesiar o animal numa câmara de isoflurano indução (4-5% de isoflurano + O 2 a 1 - 2 L / min ao longo de 3-4 min). Injetar 5 μg / g de carprofen por via intraperitoneal (ip) ao remover o mouse da câmara, antes da fixação estereotáxica.
    2. Siga os procedimentos padrão para corrigir o mouse no aparelho estereotáxico. Manter a anestesia isoflurano através de uma máscara de gás (3% de isoflurano + O2 durante a fixação em 1 L / min). Manter a temperatura corporal durante toda a cirurgia a 37 ° C usinPAC de aquecimento.
      1. Proteja os olhos da secagem aplicando uma pomada de vitamina A. Verifique o nível de tolerância cirúrgica do animal testando o reflexo de retirada da pata.
    3. Corrija a cabeça colocando as barras de orelha no crânio com suas extremidades contundentes e reversas em vez de suas dicas (sem entrar nos canais das orelhas) 29 . Posicione a barra da boca (como de costume) para garantir a horizontalidade da cabeça.
      NOTA: A fixação minimiza os danos nas orelhas, o que é importante para as experiências de excitação acústica (ver a seção 4 deste procedimento).
    4. Monitore a respiração do animal durante o procedimento, que deve permanecer em ~ 2 - 3 respirações / 2 s. Ajustar a concentração de isoflurano no dispensador de gás, se necessário; Deve diminuir pouco a pouco durante a cirurgia, de 3% durante a fixação para 1,0 - 1,5% no final do procedimento.
    5. Injetar 100 μL de NaCl ip 0,9% uma vez por hora usando um insuli ultra-finoN seringa para manter o animal hidratado.
    6. Certifique-se de que a cabeça do animal esteja iluminada por uma fonte de luz brilhante.
    7. Limpe a área com 70% de EtOH e desinfetante à base de iodo (a pele molhada evita que o cabelo entre na janela cirúrgica).
    8. Levante a pele no centro do crânio com fórceps Adson e corte suavemente a porção levantada da pele ao longo da linha média, da parte superior do pescoço até o nível dos olhos, usando uma tesoura fina. Remova o couro cabeludo (~ 1 cm anteroposterior, ~ 0,5 - 0,8 cm lateral).
      1. Certifique-se de que a janela é grande o suficiente (para ambos os lados) para ver claramente as fendas bregma e lambda do crânio. Corrija a pele em ambos os lados com serrilhas de bulldog para garantir o acesso ao osso.
    9. Remova o tecido conjuntivo (periosteum) esfregando com cuidado um bisturi. Limpe a área com desinfetante à base de iodo e abaixe o crânio com um cotonete anti-séptico.
    10. Usando uma lâmina de bisturi afiada (tamanho 15), arranhe a sKull para obter uma superfície de osso limpa e matriculada. Usando apenas a ponta do bisturi, arranhe uma grade de camadas de sulcos, com uma distância de ~ 1 - 2 mm entre os sulcos.
      NOTA: Isso melhora a fixação da cola de epoxi de dois componentes no crânio no passo 1.3.15.
    11. Use uma microdrill com um tamanho de broca 1/005 para realizar 4 craniotomias (~ 0,7 mm ø) no crânio em locais específicos ( Figura 1 , veja também a etapa 1.3.11.3.). Afundar a poeira dos ossos usando uma pipeta Pasteur e limpar qualquer sangramento com cotonete anti-séptico.
      1. Se houver sangramento, assegure-se de que ele seja parado completamente antes de retomar o processo. Use uma esponja hemostática para acelerar a hemostasia.
      2. Use as duas craniotomias no hemisfério direito para inserir os eletrodos de parafuso (craniotomias # 2 e # 4).
      3. Use as duas craniotomias no hemisfério esquerdo para inserir parafusos de ancoragem que estabilizarão o implante (craniotomias # 1 e # 3).
        NOTA: Para aumentarEstabilidade, até 4 parafusos de ancoragem foram utilizados 29 .
        NOTA: As coordenadas estereotáxicas precisas são: 2 mm da linha média em ambos os hemisférios e 2 mm rostral de bregma (craniotomias # 1 e # 2), 2 mm rostral de lambda e 4 mm lateral-esquerda da linha média (craniotomia # 3), 2 mm rostral de lambda e 2 mm lateral-direita da linha média (craniotomia # 4). Veja a Figura 1 .
    12. No hemisfério esquerdo, aparafuse dois parafusos banhados a ouro através das craniotomias para suporte.
      1. Fixar o parafuso em uma braçadeira hemostática e mantê-lo verticalmente acima da craniotomia. Aproxime-se cuidadosamente da parte inferior do parafuso em cima da craniotomia. Gire-o enquanto não se desvia da posição vertical.
        NOTA: Apenas 1,5 rotações são suficientes para obter boa estabilidade mecânica e sinais de alta qualidade, minimizando a pressão sobre o tecido subjacente 25 .
      2. À direita, aperte o préEléctrodos preparadamente preparados (descritos no passo 1.2.1.) Através das craniotomias.
    13. Com a ajuda da pinça, levante cuidadosamente a borda da pele dos músculos do pescoço. Insira os fios EMG-ECG, com as extremidades enroladas dentro dos músculos (esquerda e direita). Cola as partes do meio no crânio, de modo que o EMG-ECG esquerdo sai ao lado do parafuso de ancoragem posterior esquerdo, enquanto o EMG-ECG direito é posicionado ao lado do parafuso de ancoragem anterior esquerdo.
    14. Para detectar sinais de ECG do coração durante o sono, assegure-se de que os fios EMG-ECG sejam inseridos no músculo até uma profundidade de ~ 0,8 a 1 cm, com o loop fechado o mais distante possível.
    15. Use uma espátula coberta com cola de epoxi de dois componentes para aplicar a cola no crânio entre e em torno dos parafusos. Deixe secar na luz, mas proteja os olhos do animal contra raios excessivos.
      NOTA: As bases dos parafusos devem ser cobertas, e apenas os fios devem estar acessíveis, emergentesOm a cola.
    16. Certifique-se de que a cola preenche o espaço entre os dois eletrodos EMG-ECG que se estendem da superfície, de modo que não haja contato elétrico entre eles e os parafusos de suporte. Preste cuidados meticulosos para não colar a pele no crânio; A pele deve permanecer livre para mover a cola.
    17. Corte os fios EEG e EMG-ECG de modo que alcançem 0,5 mm da cola. Solde os quatro pinos no canto do conector preparado no passo 1.2.3. Para os quatro fios que emergem da cola ( Figura 1 ).
      1. Tente colocar os pinos do conector o mais próximo possível para minimizar a altura do implante; Use um pequeno grampo de crocodilo ligado ao suporte estereotáxico que mantenha a posição do conector. Minimize o tempo de contato com a ponta de solda, pois isso acende rapidamente os parafusos.
    18. Preencha o espaço entre a cola e o conector com cimento dental para cobrir as peças soldadas. Criar smooAs faces e as bordas afiadas podem prejudicar o animal. Além disso, evite tocar a pele, pois isso leva a coceira.
    19. Remova os serrefines do bulldog. Se necessário, feche a ferida usando um fio de sutura estéril (fibra de sutura absorvível) na frente e atrás do conector, criando padrões de fechamento simples e interrompidos e dois nós quadrados (agulha FS-3 de 5-0, filamento de 45 cm).
    20. Monitore o animal até que esteja completamente acordado. Pesar o animal após a cirurgia e devolvê-lo à sua gaiola doméstica para recuperação.
  2. Cuidados pós-operatórios e conexão ao sistema.
    1. Monitore o animal todos os dias por uma semana. Procure por perda de peso, atividade reduzida ou anormal e sinais de infecção. Siga o procedimento de pontuação estabelecido pelas suas autoridades veterinárias.
    2. 5-6 dias após a cirurgia, conecte o cabo de gravação ao conector de cabeça no animal, deixando-o em sua gaiola de casa. Aguarde 4 a 5 dias adicionais antes do início do recorDing para que o animal esteja habituado à condição e dorme naturalmente.

2. Pontuação básica dos dados EEG / EMG-ECG para a determinação do estado de vigilância

  1. Registre dados EEG e EMG-ECG durante 48 h com um software comercial polissonográfico ( por exemplo, Somnologica, SleepSign ou Sirenia). Use configurações típicas, como o ganho de 2.000x; Uma taxa de amostragem de 2.000 Hz na aquisição, avaliada para 200 Hz após a aquisição; E um filtro de passagem alta de 0,7 Hz para EEG e um filtro passa-alta de 10 Hz para EMG-ECG.
  2. Exporte os dados no formato de arquivo ".edf".
  3. Abra os arquivos ".edf" com um software personalizado ( por exemplo, em Matlab) que classifica semi-automaticamente a cada 4 s época como sono acordado, não-REM, sono REM e artefatos correspondentes.
    NOTA: Alternativamente, existem vários softwares de pontuação semi-automatizados disponíveis. Este procedimento descreve algumas das etapas básicas que devem ser feitas para configurar a pontuação wCom o software de pontuação usado aqui; Outros sistemas de pontuação semi-automática podem ser baseados em outros parâmetros.
  4. Usando o software, separe os arquivos ".edf" em 4 vezes e 12 h de gravações.
    1. Remova os artefatos que surgem da atividade EMG -ECG presente no sinal EEG ou de um estado comportamental não atribuível 1 , 29 .
    2. Calcule a média dos valores absolutos EEG (EEG mean ) e EMG (EMG mean ) durante as 12 h de gravações do EEG e os traços EMG-ECG, respectivamente.
    3. Identifique os valores médios EEG / EMG de cada época de 4 s (EEG Epoch / EMG Epoch ).
    4. Classifique as épocas como "Wake" quando EEG Epoch <EEG significa e EMG Epoch > EMG significa e como "Non-REM sleep" quando EEG Epoch > EEG significa e EMG Epoch <EMG significa.
    5. Classifique as épocas que não são Satisfaz estes critérios com um algoritmo de correção baseado em épocas anteriores e subseqüentes.
    6. Classifique as épocas como sono REM quando EEG Epoch <EEG significa e EMG Epoch <EMG significa .
    7. Refine os pontos críticos, tais como transições do sono não-REM para o despertar, épocas de sono REM e micro-excitação durante o sono não REM. Inspecione visualmente a pontuação para garantir uma determinação adequada do estado de vigilância 29 , 30 .
      NOTA: realize sempre uma inspeção visual final e validação da pontuação.

3. Análise da Oscilação Infra-lenta para EEG e batimentos cardíacos

  1. Para esta análise, selecione apenas lances de sono não-REM com ≥ 96 s ( ou seja, pelo menos 24 épocas de 4 s); Veja a Figura 2 .
    NOTA: rotinas personalizadas estão disponíveis mediante solicitação 1 .
Ve_content "> Figura 2
Figura 2 . Determinando a dinâmica da energia Sigma durante o sono não-perturbado sem REM.
( A ) Top, EEG (preto) e EMG-ECG (cinza) traços durante os primeiros 100 minutos da fase de luz em um único mouse. Os estados de vigilância são indicados pela barra colorida em cima dos traçados crus. Médio, exemplo típico de um ataque de sono contínuo (> 96-s) não-REM. No fundo, um intervalo de 16 segundos, aleatoriamente escolhido, que ilustra a subdivisão em épocas de 4 s. O seguinte passo da análise é mostrado apenas para estas quatro épocas, mas é válido para todas as épocas contidas na luta. ( B ) Topo, quatro FFTs sucessivas geradas a partir das épocas de 4 s mostradas no painel inferior de A. A faixa sigma (10-15 Hz) está sombreada em vermelho. Superior direito, inserção de 1 da última época mostrando as ondas R presentes no sinal de EMG-ECG ao quadrado. Parte inferior, tempo do curso Poder sigma extraído do espectro correspondente acima. As linhas pontilhadas ilustram a continuação dos valores de potência antes e após os quatro lances não REM selecionados para exibição. ( C ) Curma sigma normalizado (vermelho) e batimentos cardíacos (em BPM) (cinza), com a parcela ilustrada em (B) localizada entre as linhas tracejadas verticais. Abaixo está o correspondente sinal EEG filtrado na banda sigma (10-15 Hz). ( D ) Resultado do FFT calculado no curso de tempo de potência sigma mostrado em (C), demonstrando um pico dominante a 0,016 Hz. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

  1. Extraia os valores de potência para a frequência sigma (10-15 Hz) de potência espectral em compartimentos de 4 s ( Figura 2 A e B ) usando cálculos de transformadas rápidas de Fourier (FFT)"> 1.
  2. Calcule a potência espectral de linha de base para o sono não REM ao calcular a média dos valores em cada compartimento de freqüência para todas as épocas de sono não REM (os artefatos e as épocas de transição entre os estados de vigilância são excluídos dessa média). Normalize os valores de potência sigma de cada época para a potência média da banda sigma durante o sono não REM durante o período de interesse. Lote contra o tempo ( Figura 2 C ).
  3. Calcule a FFT do curso de tempo de potência sigma com janela Hamming para revelar os componentes de freqüência oscilante da dinâmica de potência ( Figura 2 D ) 1 .
  4. Tenha em atenção que, uma vez que as lutas de sono não-REM têm durações diferentes, as FFT resultantes têm diferentes resoluções de frequência. Interpolar para ajustar a resolução ao mais alto obtido a partir do maior período de duração do sono não-REM e a média dos FFTs de todos os ataques.
  5. Continue este analistaEs para descrever as relações de fase entre a dinâmica dos sinais EEG e ECG.
  6. Extraia os dados do batimento cardíaco do sinal de EMG-ECG ao quadrado após a filtragem de passagem alta de 30 Hz, usando rotinas apropriadas para a detecção de pico da onda R.
    NOTA: restringir o intervalo de tempo mínimo entre duas ondas R sucessivas a 80 ms ajuda a evitar a inclusão de picos artefactuais ocasionais devido a espasmos musculares 1 .
  7. Meça os intervalos RR e calcule a frequência cardíaca média em batimentos por minuto (BPM) a cada 4-s bin ( Figura 2 B e C ).

4. Exposição ao ruído

  1. Gerar ruídos (ou seja, ruído branco) através de um software personalizado. Defina a duração para 20 s e a intensidade para 90 dB SPL (medida dentro da gaiola). Reproduza os ruídos através de alto-falantes ativos padrão 1 .
  2. Após a cirurgia, durante a habituação ao recorCondição do ding, reproduzir aleatoriamente o ruído experimental, várias vezes ao longo do dia e em momentos diferentes 1 .
  3. Na condição experimental (ao gravar dados EEG / EMG / ECG), reproduza o ruído pseudo-aleatoriamente durante os primeiros 100 minutos no início da luz (ZT0). Para tocar o ruído, preencha as seguintes condições 1 :
    1. Certifique-se de que o mouse permaneceu sem REM durante> 40 s.
    2. Certifique-se de que a exposição anterior tenha ocorrido mais de 4 minutos antes.
      NOTA: Isso resulta em ~ 15 exposições por sessão.
  4. Marque o início do tempo de gravação e o início de cada exposição de ruído. Mantenha o experimentador cego para a composição espectral do sono não REM durante o procedimento.
  5. Adquira todos os dados com o software polissonográfico 1 , 29 .

5. Análise retrospectiva do sono com base no resultado comportamental duranteExposição ao ruído

  1. Registre manualmente traços EEG / EMG -ECG em uma resolução de 4 s, sem conhecimento dos tempos de exposição ao ruído 1 .
  2. Use um script personalizado para extrair os dados de exposição EEG / EMG -ECG / ruído 1 .
  3. Ponha-se em posição de suspenso quando os sinais EEG e EMG permanecerem inalterados durante a exposição ao ruído ( Figura 3A ). Considere um despertar quando a amplitude EEG diminui e a freqüência EEG aumenta, em combinação com a atividade muscular detectada no eletrodo EMG-ECG ( Figura 3B ).
  4. Descarte os ensaios em que os animais acordaram durante o período pré-estímulo ou nas primeiras 4 s de exposição ao ruído ( Figura 3D ).
  5. Defina a taxa de sucesso de excitação como a proporção dos testes de despertar em todos os ensaios incluídos ("Wake-up" e "Sleep-through").
  6. Em todos os ensaios incluídos, examine a dinâmica do poder sigma durante o períodoE período pré-estímulo ( Figura 3 E ) 1 .

Figura 3
Figura 3 . Resultados comportamentais em resposta ao início do ruído: resultados representativos que foram retidos ou excluídos da análise.
( AD ) Traços brutos do EEG (preto) e correspondentes sinais EMG-ECG (cinza) durante 40 s antes do início do ruído e durante os 20 s de ruído, representados pela área azul-sombreada. Os estados de vigilância são indicados no código de cores. Para ilustrar dados que foram incluídos na análise, os eventos representativos "Sleep-through" ( A ) e "Wake-up" ( B ) são mostrados. Os resultados que foram descartados continham transições para o sono REM ( C ) e uma resposta precoce "Wake-up" ( D ). A inserção mostra uma extensãoParte dos traços EEG e EMG-ECG característicos do sono REM. ( E ) Exemplos típicos de dinâmica de potência sigma na janela de 40 s antes do início do ruído durante um evento "Sleep-through" (esquerda) e "Wake-up" (direita). O rastreamento de banda EEG bruta filtrada para a banda sigma é mostrado acima. A área azul representa o início do ruído. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Representative Results

Figura 2 A (painel superior) mostra trechos de 100 minutos de comportamento espontâneo do sono-vigília, registrados através de eletrodos polissonográficos implantados conforme descrito (ver Figura 1 ). Os aumentos e diminuições da amplitude EEG e EMG no início do sono não-REM são claramente visíveis. O sono REM intermitente é marcado por uma diminuição da amplitude EEG e uma diminuição adicional no tom EMG que não é visível nessa escala de tempo comprimida. O zoom em um ataque de sono não-REM revela as ondas lentas de alta amplitude no EEG e, no traço EMG-ECG, a baixa atividade muscular, na qual os intervalos RR da freqüência cardíaca se sobrepõem como deflexões verticais ( Figura 2 A , Painéis médios e inferiores). Uma FFT revela o domínio da SWA em todas as épocas de 4 s ( Figura 2 B ). Traçando o sigma médioUma potência (10 - 15 Hz, barra sombreada vermelha) para cada uma dessas épocas revela seu curso de tempo variável, juntamente com variações na freqüência cardíaca com a direção oposta. Realizar esta análise sobre a totalidade das lutas não-REM e normalizar para significar valores de poder desvenda as variações regulares no poder sigma em torno da média ( Figura 2 C ). A análise de Fourier sobre este curso de tempo de potência mostra um pico importante em torno de 0,02 Hz, refletindo o aumento periódico da potência sigma em intervalos de 50 s ( Figura 2D ).

Para sondar a função da oscilação de 0,02 Hz na capacidade de ativação, os camundongos foram expostos a pulsos de 20 segundos de 90 dB ao dormir, de acordo com as condições descritas. A Figura 3 mostra alguns dos resultados experimentais de tais exposições de ruído. Quando os ratos não acordaram durante o barulho, e as formas de onda EEG e EMG-ECG permaneceram inalteradas, o resultado foi a classeComo "Sleep-through" ( Figura 3 A ). Quando a amplitude de EEG diminuiu e a atividade de EMG foi observada, o resultado foi classificado como "Wake-up" ( Figura 3 B ). Ocasionalmente, os ratos passaram para o sono REM durante um teste ( Figura 3 C ) ou acordaram no intervalo de 40 segundos antes do início do ruído ( Figura 3 D ). Esses eventos foram excluídos da análise, porque nosso interesse era especificamente identificar as características do sono consolidado não-REM que precedem o resultado da exposição ao ruído ("Sleep-through" ou "Wake-up"). O cálculo da potência de sigma no período de 40 segundos antes da estimulação de ruído mostrou que a oscilação de 0,02 Hz estava na sua calha quando ocorreu um "Sleep-through" ( Figura 3 E , painel esquerdo), enquanto ele atingiu o ponto de "Wake- acima&#34; Evento ( Figura 3 E , painel direito). Portanto, marcando o sono não-REM de um mouse retrospectivamente, com base em um resultado comportamental variável para a estimulação acústica, identifica a fase da oscilação de 0.02 Hz na sigma como uma marca registrada para estados de sono com resiliência variável ao ruído.

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Discussion

Aqui, mostramos como estabelecer um perfil temporal contínuo do sono não-REM que integra as variáveis ​​EEG, EMG e ECG. Este é um primeiro passo para o desenvolvimento de uma descrição integrativa do sono do mouse, o que pode ajudar a identificar a escala de tempo anteriormente não reconhecida sobre a qual alta e baixa resiliência ao ruído são organizadas durante o sono não REM 1 . Uma estrutura temporal semelhante também foi descrita no sono humano não-REM ao longo de uma análise análoga 1 .

O procedimento apresentado aqui cumpre dois objetivos. Em primeiro lugar, chamamos a atenção de que as técnicas polissonográficas podem fornecer sinais EEG e EMG-ECG de forma confiável durante a totalidade dos períodos de sono não-REM em camundongos. O batimento cardíaco é mais evidente nos vestígios de EMG durante o sono REM devido a atonia muscular e torna-se mais escondido no sono não-REM devido ao aumento do tônus ​​muscular e às contrações musculares ocasionais. Inserindo eletrodos EMG-ECG maisProfundamente no músculo e mantendo-os o mais distante possível aumenta a amplitude das ondas R do coração, de modo que emergem claramente do tônus ​​muscular do fundo. As rotinas para a detecção de pico, em seguida, extraem a frequência cardíaca a partir do sinal EMG-ECG do sono não REM e permitem a quantificação da sua variabilidade.

As tecnologias baseadas em telemetria para monitorar simultaneamente EEG / EMG e ECG são cada vez mais usadas, mas a qualidade dos sinais necessários para uma análise espectral completa permanece inferior em termos de largura de banda e estabilidade. Além disso, mesmo os transmissores de canal único são de tamanho considerável, e sua implantação na região subcutânea cervical ou na cavidade do corpo pode afetar o bem-estar do animal e perturbar o sono. No entanto, o desenvolvimento de tais dispositivos é necessário para expandir a gama de parâmetros centrais e autonômicos que podem ser acompanhados simultaneamente durante o sono não perturbado em camundongos, que é o modelo animal de cHoice para estudos de sono. Em combinação com técnicas como a restrição de cabeça, que permite a coleta de dados de sono não REM e REM em camundongos com perfis espectrais inalterados 1 , 19 , as medidas multiparamétricas durante o sono agora podem ser combinadas com testes comportamentais controlados.

Em segundo lugar, a abordagem analítica que apresentamos aqui também pode ser aplicada aos potenciais de campo locais para definir a área cerebral envolvida na geração da marca registrada de interesse 1 . Além disso, é aplicável às técnicas de imagem suficientemente rápidas para relatar o comportamento espectral das populações neuronais e as variáveis ​​contínuas ( por exemplo, bandas espectrais) e discretas ( por exemplo, frequência cardíaca ou respiração). Sua resolução de tempo é limitada apenas pela duração da época escolhida para marcar o estado de vigilância. Essencialmente, análises espectrales padrão dos sinais derivados de não REMAs lutas de leep são seguidas por um alinhamento dos valores de densidade de potência dos sinais individuais para cada época. Então, uma análise espectral dessas dinâmicas de poder é usada para quantificar periodicidades na estrutura. Tanto em ratos quanto em humanos, nossa abordagem produziu uma oscilação de 0,02 Hz, com propriedades comparáveis 1 , que o qualificou como uma marca unificadora para a estrutura do sono de mamíferos.

Um passo crítico foi a validação funcional da periodicidade observada ao anotar o sono não-REM retrospectivamente com base na reatividade comportamental do som do mouse ao ruído. Aqui, a escolha de um estímulo de ruído que levou a um resultado comportamental variável, causando despertar ou dormir, foi decisiva. Os fortes estímulos sensoriais que causam o despertar na maioria das exposições não desviam a oscilação de 0,02 Hz, porque o despertar seria aplicado a todas as suas fases. Em contraste, um estímulo muito fraco não revelaria consistentemente a relação de fase com o osc de 0,02 Hzilação. Da mesma forma, qualquer periodicidade observada em um conjunto de parâmetros medidos precisaria acompanhar o resultado variável. Por exemplo, no caso apresentado aqui, apenas distinguimos entre os eventos de despertar ou de suspensão, sem considerar o momento exato de despertar durante a exposição ao ruído ou a duração do estado de vigília subseqüente (no entanto, veja 1 ) . O uso de estímulos curtos em várias intensidades 24 , 25 , 28 poderia ajudar a delinear as relações de fase exatas entre a oscilação de 0,02 Hz e o despertar. Além disso, a variação da composição da frequência dos sons pode modular a capacidade de ativação em função da história recente do comportamento sono-vigília, do gênero, da presença de ninhada ou de outras formas de experiência recente. Outra possibilidade poderia ser investigar se a prevalência de microarousals ou excitação total depende de um determinado estado de sono momentâneo. A pontuação do sono com base em um resultado comportamental variável poderia iluminar a microarquitetura funcional do sono em geral. Enquanto nós e outros testávamos reatividade à exposição ao ruído 1 , 28 , o despertar em resposta a outras modalidades sensoriais, as transições de estado de vigilância 14 ou os relatórios dos sonhos poderiam ser avaliados para extrair os correspondentes correlatos do sono anterior. Além disso, será muito interessante testar pacientes com transtorno do sono em relação à sua sensibilidade ao distúrbio externo e a uma potencial ruptura da oscilação de 0.02 Hz. Os distúrbios do sono podem levar a distúrbios cardiovasculares, enquanto o risco cardiovascular pode levar à desregulação do sono 31 , 32 , realizando investigações sobre a coordenação cérebro-coração durante a oscilação de 0,02 Hz potencialmente relevante para entender esta bidireccionalL dependência.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Agradecemos a todos os membros do laboratório por sua contribuição para a escrita e leitura cuidadosa deste manuscrito. Agradecemos a Paul Franken pelas discussões estimulantes, a Dra. Gisèle Ferrand, por comentários úteis sobre o protocolo cirúrgico, e pelo Dr. Jean-Yves Chatton por fornecer os arquivos executáveis ​​Labview originais para a exposição ao ruído. O financiamento foi fornecido pela Fundação Nacional de Ciências da Suíça (Grants 31003A_146244 e 31003A_166318) e pelo Estado de Vaud.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-components epoxy glue Henkel Loctite EA 3450
Absorbable Suturing Fiber (Prolene) Ethicon 5-0 FS-3
Adson Forceps FST 11006-12
Antiseptic swab VWR 149-0332
Attane Isoflurane Piramal Isoflurane 250mL
Connectors 3 x 2-channels ENA AG 2.316 Raster 2.54 x 2.54 mm; size 5 x 8 x 9 mm; pin size 5 mm; http://www.ena.ch/
Dragonfly commutator Dragonfly Model #SL-10
EMBLA amplifier EMBLA A10 amplifier
Fine scissors FST 14108-09
Flat Head Gold-plated steel screw J.I. Morris FF00CE125 https://jimorrisco.com/
Gold wire CMSA T.69 5gr http://www.cmsa.ch/en/
Hemostatic sponge Pfizer Gelfoam
iodine-based disinfectant (Betadine) Mundipharma standart solution 60mL
Komet drill steel 1/005PM104 UNOR AG 22310
Matlab Analysis Software MathWorks R2016b https://ch.mathworks.com/products/matlab.html
Microdrill Fine Science Tools 96758
Mouse Gas Anesthesia Head Holder Kopf Instruments Model 923-B http://kopfinstruments.com/product/model-923-b-mouse-gas-anesthesia-head-holder/
Ophtalmic ointment Pharmamedica VITA-POS
Paladur (liquid) UNOR AG 2260215 for dental cement
Palavit (powder) UNOR AG 5410929 for dental cement
Small Animal Stereotaxic Frame Kopf Instruments Model 930 http://kopfinstruments.com/product/model-930-small-animal-stereotaxic-frame-assembly/
Soldering wire Stannol 593072
Temperature controller - Mini rectal probe Phymep 4090502 http://www.phymep.com/produit/dc-temperature-controller/
Temperature controller- heating pad Phymep 4090205 http://www.phymep.com/produit/dc-temperature-controller/

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References

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