Summary
Dette manuskriptet beskriver en protokoll for i vivo avbilding av musen netthinnen med høy oppløsning spectral domene optical coherence tomografi (SD-oktober). Det fokuserer på netthinnen ganglieceller (RGC) i peripapillary-regionen, med flere skanning og kvantifisere tilnærminger beskrevet.
Abstract
Strukturelle endringer i netthinnen er vanlige manifestasjoner av ophthalmica sykdommer. Optical coherence tomografi (OCT) gjør deres identifikasjon i vivo-raskt, full av gjentagelser og høy oppløsning. Denne protokollen beskriver OCT imaging i musen netthinnen som kraftig verktøy å studere fiberoptisk neuropathies (OPN). OCT systemet er et interferometry-basert, ikke-invasiv alternativ til vanlig post mortem histologiske analyser. Det gir en rask og nøyaktig vurdering av netthinnen tykkelse, slik at muligheten til å spore endringer, for eksempel netthinnen thinning eller jevning. Vi presenterer bildebehandling prosessen og analyse med eksempel på Opa1delTTAG mus linjen. Tre typer skanninger blir foreslått, to kvantifisering metoder: standard og hjemmelaget calipers. Sistnevnte er best for bruk på peripapillary netthinnen under radial skanner; å være mer presis, anbefales for å analysere tynnere strukturer. Alle tilnærminger beskrevet her er beregnet på netthinnen ganglieceller (RGC), men kan lett tilpasses andre celle populasjoner. Avslutningsvis OCT er effektiv i mus modell phenotyping og kan brukes for pålitelig evaluering av terapeutisk intervensjon.
Introduction
OCT er et diagnostisk verktøy som forenkler behandlingen av netthinnen strukturer1, inkludert synsnerven hodet (ONH). Gjennom årene har det blitt en pålitelig indikator av sykdomsprogresjon i mennesker2,3og Red4,5. Den bruker interferometry for å lage tverrsnitt bilder av netthinnen lag 2-µm aksial oppløsning. Det innerste laget er netthinnen nerve fiber laget (RNFL), som inneholder RGC axons, som er etterfulgt av ganglion celle laget (GCL), som inneholder hovedsakelig RGC organer. Neste er det indre plexiform laget (IPL), der RGC dendrites møtes bipolar, vannrett og amacrine celle axons. Disse, med vannrette celler, utgjør det indre kjernefysiske laget (INL), og deres utstikkende deler koble med photoreceptor axons i ytre plexiform laget (OPL). Dette etterfølges av ytre kjernefysiske laget (bare), med photoreceptor cellen legemer, og er skilt fra det photoreceptor laget av den ytre begrensende membranen (OLM), også kalt den indre segment/ytre segmentet (er / OS) lag. Endelig er de siste observerbare lagene i musen netthinnen netthinnens pigment epitel (RPE) og akkord (C). RNFL alene er normalt for tynn skal måles i mus; analysere RNFL/GCL er derfor i stedet å foretrekke4,5. En annen mulighet er GC komplekse laget, som inneholder den siste i tillegg til IPL, gjør det tykkere og dermed enklere å måle på OCT skanner4. Følgelig kan OCT gi innsikt i patologisk status på netthinnen, som i OPNs.
Tykkelsen på musen netthinnen analyseres også ofte med post mortem histology. Men ikke kan denne teknikken ansikter begrensninger knyttet til vev samling, fiksering, skjæring, flekker, montering, etc. derfor noen feil, for eksempel subtile tykkelse endringer, registreres. Til slutt, fordi den samme musen ikke kan testes på flere tid poeng, antall dyr per studere sterkt øker, i motsetning til OCT. Alle ikke-invasiveness og høy oppløsning, mulighet for gjentakelse, overvåkning, og brukervennlighet av OCT teknologi gjør det metoden for valg i netthinnen sykdom studier.
Musen modeller brukes til å identifisere genet defekter og belyse molekylære mekanismer underliggende retinopathies6. OPN er en form for retinopati med betydelig skade på den optiske nerven (på), som består av ca 1,2 millioner RGC axons. OPN kan være fokusert på på eller være sekundært til andre lidelser, medfødt eller ikke7, fører til tap av visuelle feltet og senere blindhet. Karakteristiske trekk av OPN er RGC tap på skader, som kan observeres i menneskelig OCT som RNFL og GCL tynning2,3. I mellomtiden i Patofysiologien ved OPN er fremdeles dårlig forstått, og dermed behovet for å teste musen Netthinne fortsatt.
Dette manuskriptet beskriver bildebehandling og kvantifisering av netthinnen lagtykkelse, bruker eksemplet med Opa1delTTAG mus linje8,-9, en modell av dominerende fiberoptisk atrofi (DOA)10. For å vurdere RGC patofysiologi, kvantifisert radial, rektangulære og ringformede skanner. Dette ble gjort med standard calipers fra OCT programvaren eller med en hjemmelaget makro utviklet for en åpen kildekode bildebehandling programmet. De standard calipers er vanskelig å manipulere og ofte tykkere enn RNFL/GCL, mens de hjemmelagde calipers er brukervennlig, reproduserbare og mer presis. Makroen utfører et mål for en automatisk oppdages laget, i 5 poeng og faste posisjoner, på begge sider av ONH i regionen peripapillary. Målet med presentert protokollen er å beskrive OCT skanning oppkjøpet for å angi retinal posisjonering, med fokus på RGCs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
eksperimentell protokollen ble godkjent av Institut national de la santé et de la recherche médicale (Inserm; Montpellier, Frankrike), er i overensstemmelse med den europeiske direktivet, og overholder ARVO erklæringen for bruk av dyr i ophthalmica forskning. Det ble utført under avtalen av Languedoc Roussillon Comity av etikk i dyr eksperimentering (CEEALR, nuCEEA-LR-12123).
1. utstyr oppsett og Pre-tenkelig forberedelse
Merk: her OCT ble utført på mus Netthinne med spektral domain (SD) ophthalmica tenkelig system ( figur 1A). SD-oktober apparatet består av en base og en dyr tenkelig mount (AIM) med en gnager justering scene (RAS) ( figur 1B). Basen inneholder datamaskinen, OCT motoren, SD-oktober sonden og mus-spesifikke objektivet. Sonden er montert på målet, som inkluderer Z-oversetter. RAS brukes til mus posisjonering takket være tabellen med X - og Y-oversetteren, kassetten som kan roteres og svinges, og baren flyttbare bit med nesen bandet. Programvaren leveres av produsenten gir oppkjøp og analyse av OCT filer, selv om sistnevnte kan også gjøres med et åpen kilde bilde-behandlingsprogram.
- Fast plass sonden i sikte.
- Kobler musen-spesifikke objektivet til sonden.
- Justerer referanse arm innstillingene for spesifikke objektivet (her, makt på 086 og posisjon på 964).
- Sørge for at musen-spesifikke objektivet er tilstrekkelig fjernt fra kassetten, legge biter baren med nesen bandet på kassetten.
Merk: Avstanden mellom linsen og kassetten kan justeres med Z-oversetter skruen, plassert bak på målet. Nesen bandet er et kommersielt tilgjengelig elastisk band og dens spenning skal justeres avhengig av størrelsen på musen. - Slår på strømforsyningen (nedre høyre hjørne av vognen) og deretter datamaskinen.
- å starte bildebehandlingsprogrammet, dobbeltklikk på den riktige snarveien på skjermen.
Merk: Dette avhenger av linsen; her, mus netthinnen. - Opprette en ny klinisk studie og legge til ønsket protokollene. Ellers bruker de eksisterende klinisk studie og/eller protokoller.
- Legge til en ny studie ved å velge den " studere NameŔ " IDŔ " behandling Arm spesifikasjoner " (her " Uncategorized "), og forhåndsdefinerte " skanne protokoller ", hvis de finnes.
- Velg en " sensor " i den " klinisk studie " delen.
Merk: For en ny " sensor ", gå til " Setup sensorer & leger " å definere det. - Legg til en ny pasient i pasienten/eksamen delen ved å klikke på Legg til pasienten, inn i " ID ", " navnet ", " etternavn ", " sex ", og " fødselsdato " (valgfritt).
Merk: Gjøre dette rett før testing hver mus, hvis det er mer praktisk. Kontroller at IDen er ikke lenger enn 10 tegn. For musen, den refraktiv feilen på begge øynene er 0 og aksial er 23,0. - Klikk på " legge til eksamen " og " protokollen " ved å legge " forhåndsinnstilling for skanner " fra listen med øyet som skal måles først (her, høyre øye), eller ved å tilpasse skanner.
- å tilpasse en skanning, bruk en eksisterende skanning som mal og redigere den, eller lage den fra grunnen av gjennom det " legge til egendefinert skanning " alternativet. Etter å legge alle skanner i listen, kan du definere en ny protokoll med den " Enter " nye protokollnavnet " alternativet (OS: øye skummel, venstre øyet; OD: øye dexter, høyre øye).
Merk: Her protokollen innebærer tre skanner: (i) en radial skanning, med en 1,4 mm diameter, 0 mm horisontale og vertikale forskyvninger, 1000 linjer med A-skanner/B-scan, 100 B-skanner/volum, 1 ramme/B-scan, 80 linjer av inaktive A-skanner/B-scan og 1 volum; (ii) en rektangulær skanne, med en 1.4 mm lengde og bredde, 0° vinkel, 0 mm horisontale og vertikale forskyvninger, 1000 linjer med A-skanner/B-scan, 100 B-skanner, 1 ramme/B-scan, 80 linjer av inaktive A-skanner/B-scan og 1 volum; og (iii) en ringformede skanning med 0,4 mm minimum og 0.6 mm maksimale diameter, 0 mm horisontale og vertikale forskyvninger, 1000 linjer med A-skanner/B-scan, 3 B-skanner/volum, 48 rammer/B-scan, 80 linjer med inaktive A-skanner/B-scan og 1 volum.
2. Musen forberedelse
- øye dilatasjon og immobiliseringsløsninger
- minst 15 min før datainnsamling, innpode 10% phenylephrine øyedråper inn i musen øynene, fjerne overflødig og innpode 0,5% tropicamide øyedråper.
Merk: Den første dilatasjon kan gjøres på en gang for alle mus som vil bli testet i økten. Kontroller at væske er ved romtemperatur. - Umiddelbart etter inducing generell anestesi (trinn 2.2), administrere 0,4% oxybuprocaine hydroklorid øyedråper, holde dem i stedet for 3 s bedøve og nakkens øynene. Etterpå stryke dråper og gjenta instillasjon på 10% phenylephrine og 0,5% tropicamide å fastslå at øynene er godt dilated.
Merk: Kontroller at væske er ved romtemperatur og at musen ikke svelge oxybuprocaine.
- minst 15 min før datainnsamling, innpode 10% phenylephrine øyedråper inn i musen øynene, fjerne overflødig og innpode 0,5% tropicamide øyedråper.
- Narkose
- forberede en anesthetic løsning av ketamin (20 mg/mL) og xylazine (1,17 mg/mL) i saltvann. Butikken på 4 ° C for maksimalt 2 uker.
- Ca 5 minutter før testing, injisere intraperitoneally 5-10 µL av bedøvende løsning per 1 g kroppsmasseindeks, avhengig av alder og størrelsen på musen.
Merk: Unge og/eller tynne mus trenger mindre anesthetic, ta mindre tid å bedøve, men også vekke raskere. Her, 8 µL/g (160 mg/kg av Ketamin, 9.33 mg/kg av xylazine). - Eventuelt smøre øynene med tyktflytende øyedråper eller en ophthalmica gel å unngå hornhinnen tørrhet.
3. Mus posisjonering
- Lubricate øynene med tyktflytende glykol-baserte eye drops for å gi hornhinnen hydration.
Merk: Hvis øynene tørr under eksamen, nytt gjelder øyedråper. - Pakk musen i et ark med kirurgisk gasbind å holde den varm.
- Bruker en svamp eller bomull wick, Påfør et tynt lag av en ophthalmica gel med 0,3% hypromellose på hvert øye, for å minimere lys brytning, unngå tetthet og sikre hornhinnen hydration. Mens gjøre det, flytter øyevipper og værhår side.
- Plasser musen i kassetten, med hodet rett og peker Videresend.
- Forsiktig åpne bite bar klemmen og plassere baren i munnen, bruk nesen bandet for å sikre stillingen.
Merk: Kontroller at bit baren er i kassetten. - Sted en bomull rulle under høyre (venstre) side hvis høyre (venstre) øye blir testet.
- Samtidig klips sikter spissen på musen-spesifikke objektivet, bringe den mot øyet av roterende Z-oversetter skruen mot klokken.
- Ved å rotere og svingbare kassetten og snu bite baren og X-oversetter skruer, ferdig programerte plasseringen av musen, målet er å ha den høyre øye se direkte inn i objektivet, og dermed justere optisk aksene av øyet og linsen.
Merk: Hvis musen er for høyt eller for lavt, Y-oversetter skruen skal brukes først. - Velge det første søket i den " eksamen ", klikk på " starte sikter ", og foreta ytterligere manuelle justeringer for retinal imaging.
- Bruker Z-oversetter skruen, flytte netthinnen loddrett på venstre panel ( figur 2, horisontal B-skanning justering) og vannrett på rhøyre panel ( figur 2, loddrett B-scan justering).
- Roter kassetten å bringe ONH i panelet til høyre ved å flytte ONH opp eller ned. Bruk bit bar skruen for å rette netthinnen på det høyre panelet. Sving kassetten for å plassere ONH i informasjonsvinduet.
- Bruke X-oversetter skruen til nivå netthinnen på venstre panel. Holde i tankene den store funksjonen av hver modulator, videre justere plasseringen av netthinnen å sentralisere ONH.
Merk: Bruk Y-oversetter skruen flytte ONH opp og ned på høyre panel, om nødvendig. Stillingen kan være raffinert helst mellom skanninger.
4. SD-oktober Imaging ONH og netthinnen
- når innhold med innstillingene, klikk på " starte Snapshot " å SD-oktober skanne.
- Hvis det ikke kreves en 3D-bildebehandling, fjerner alternativet OCU.
- Lagre søket og rapporten.
- Fortsett med neste skanner.
- For å image andre øyet, etter trekke linsen, slå kassetten tilsvarende og Gjenta trinnene 3.6-4.3.
5. Oppkjøpet ferdigstillelse
- når oppkjøpet er fullført, fjerne musen fra kassetten, bruke ophthalmica gel med 0,3% hypromellose til hvert øye, og plassere musen på en oppvarming plate å våkne opp.
- Etter siste oppkjøpet, lukke programmet og slå av datamaskinen og OCT maskinen (forsyning strømknappen).
- Rengjør kassetten med desinfeksjonsmiddel.
6. Analyser
- For retinal lag tykkelse måling, bruke programvaren automatisk segmentering av produsenten.
- Klikk på den " pasienten ", Velg ønskede " eksamen " fra så listen, og klikk på den " vurdering eksamen " alternativet.
- Laste ønsket OCT data på OCT programvaren ved å høyreklikke på mappeikonet i den ønskede skann.
- Høyreklikk på B-skanningen; konfigurere calipers ved å aktivere til 10 måle calipers; og angi deres navn, vinkler og fargene.
- Velge det ønsket tykkelse ved å høyreklikke en B-skanningen, plasserer det tilsvarende på netthinnen for måling.
Merk: For skanner sentrert på ONH, angi 5 calipers på hver side av den, like langt fra hverandre. For peripapillary analyse, sørg for at caliper ikke er plassert for langt fra ONH. For radial skanning, analysere 10 bilder per skanning som ble valgt av OCT. Tallene kan finnes i den " rapporter " mappen. - Lagre resultatene for analyse i et regneark-program ved å høyreklikke på B-skanningen og " lagre resultatene ".
Merk: Resultatene kan finnes i samme mappe som skanning dataene.
- Også bruke makroen hjemmelaget caliper " Mr netthinnen verktøyet ", utviklet for en åpen kilde bilde-behandlingsprogram (se tabell av materialer).
- Sørge for at de " Mr netthinnen verktøyet " og " endre delen polygonverktøyet " makroer er aktive. Belaste bildet. Klikk på knappen m starte målingen.
Merk: Makroen oppretter automatisk en 0.2 mm lange måling kassett på begge sider av ONH. Hver kassett inneholder 5 måling poeng som fungerer som calipers. Deres lateral posisjon er uforanderlig og er tilpasset peripapilla i radial skanner. Den vannrette plasseringen av kassettene er forhåndsdefinert for å måle tykkelsen RNFL/GCL, men det er lett modifiserbare måle GC komplekse laget i stedet. Hvis skannekvaliteten er dårlig, den vannrette plasseringen må justeres, eller trenger å bli ekskludert fra analyse. - For Horisontal justering, klikk på knappen e. I den nyåpnede " ROI Manager " vindu, velge første kassetten.
- Klikk på den blå polygonen-knappen og Juster plasseringen av den første kassetten ved å klikke på grensene til målt laget bildet.
- Gjenta for andre kassett ved første å velge den i den " ROI Manager "-vinduet og deretter klikke på den aktuelle bildet. Klikk på knappen r til å måle. Vis resultatene i den " mål " vinduet.
Merk: Resultatene kan kopieres til et regnearkprogram programvare til enhver tid. De inneholder følgende verdier for høyre kassett (r), venstre kassett (l) og totalt: Intden - integrert tetthet i kassetten; Område: område av måling, i mm 2; Lengde: lengden på caliper i kassetten, i mm; Betyr: mener intensiteten av signalet i kassetten; og Std: standardfeil mener intensiteten av signalet. - Fortsett med neste bildet.
- Ytterligere analysere dataene i et regnearkprogram programvare.
Merk: For å finne betyr tykkelsen på laget, ta ti Len verdier.
- Sørge for at de " Mr netthinnen verktøyet " og " endre delen polygonverktøyet " makroer er aktive. Belaste bildet. Klikk på knappen m starte målingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SD-oktober-teknologi gir retinal forestille og tykkelse analyse som sammenlignes histology, men er raskere og mer (Figur 3). Som presentert med wildtype C57Bl/6 mus, selv om kvaliteten på en SD-oktober skanning (figur 3A, høyre) er ikke så god som for et bilde av en netthinnen tverrsnitt (figur 3A, venstre), det visualiserer flere lag (f.eks OLM). Dessuten, det tar bare ca 40 min, inkludert mus forberedelse, versus dager eller uker for histologiske analyse. Til slutt, det krever ikke behandling og flekker, som haematoxylin, eosin og Safran, som kan skade vev og forårsake innsamling av feilaktige data. Netthinnen lagene lett målbare i OCT omfatter RNFL/GCL, IPL, INL, OPL, bare, er / OS, RPE og C (figur 3B), derfor tillater for en omfattende studie av hele netthinnen. Som sådan, gjenspeiler netthinnen strukturendringer sykdom utvikling. Når det gjelder OPNs gjelder dette RGCs og på, og dermed RNFL/GCL og IPL.
DOA er en av de mest vanlige OPNs og er preget av RGC degenerasjon og tap av RNFL11. På grunn av mutasjoner i de OPA1 gene12fører det til synshemming og blindhet. Bruker Opa1delTTAG musemodell, som bærer menneskelig tilbakevendende c.2708delTTAG mutasjon, ble det oppdaget at Opa1 haplo-insuffisiens hindrer visjon i en sex-avhengige måte8,9. Dette ble bestemt på grunnlag av OCT målinger av netthinnen tykkelse, som viste en progressiv jevning av GC komplekse laget (figur 4A) og peripapillary RNFL (figur 4B, 4 C) i Opa1+/- kvinner. I disse eksperimentene, ble beregninger gjort med de standard calipers for rektangulære skanner og en åpen kildekode bildebehandling programmet for ringformede skanner. For radial skanning, som ofte er en lavere kvalitet og produsere minst 10 bilder per netthinnen for analyse, en hjemmelaget makro ble utviklet. En sammenligning mellom standard og hjemmelaget calipers (Figur 4 d) viste en betydelig lavere tykkelse av RNFL/GCL og GC kompliserte lag målt med sistnevnte. Dette er fordi de standard calipers er mye tykkere og mer vanskelig å plassere på grensen av laget. Derfor er det best å unngå å bruke de standard calipers for tynne lag, spesielt på radial skanninger.
For å oppsummere, gir SD-oktober musen visuell phenotyping som kan gjentas over flere tidspunkt. Men må skanningstypen OCT og måle metoden være tilpasset undersøkte sykdommen, og dermed retinal laget i spørsmålet. Likevel gir OCT tilstrekkelig informasjon til å finne feil i netthinnen struktur. Men må dette videre analyseres med en annen metode for å gi en fullstendig forståelse av de underliggende mekanismene.
Figur 1: SD-oktober ophthalmica Imaging System. (A) oversikt over base og mål-RAS deler av SD-oktober enheten. (B) oversikt over komponentene som AIM-RAS. Sv: datamaskinen, B: strømforsyning, C: OCT motor referanse arm, D: SD-oktober sonde, E: mus-spesifikke objektivet, F: Z-oversetter, G: mål-RAS bord, H: Y-oversetter, I: kassett (rotator), J: bite bar, K-nese bånd, L: kassett svingbare, M: X-oversetter og N: satsing tips. Denne figute er fargekodet som i figur 2, med ikke-modulatorer av netthinnen posisjon i rosa. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: plassering netthinnen. Vannrett (venstre) og vertikal (høyre) visning av B-scan justeringen. Pilene tilsvarer bevegelser av de fargekodede modulatorer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Retinal lag. (A) Wildtype musen netthinnen histology etter haematoxylin, eosin, og Safran flekker (venstre) og SD-oktober (høyre); skala bar: 50 µm. (B) Retinal tykkelsen for 3 måneder gamle wildtype mus; n = 14, mener ± SEM, skala bar: 50 µm. GC: ganglion celle, RNFL/GCL: netthinnen nerve fiber laget/ganglion celle lag, IPL: indre plexiform lag, INL: indre kjernefysiske laget, OPL: ytre plexiform lag, bare: ytre kjernefysiske lag, er / OS: photoreceptor indre segmenter/ytre segmenter, RPE: netthinnens pigment epitel og C: akkord. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: eksemplarisk SD-oktober målinger. (A) GC komplekse lagtykkelse i rektangulære skanner sentrert på ONH, målt med standard calipers; Opa1delTTAG mus linje, n = 4, mener ± SEM, ** p < 0,01 vurdert med Student t-test. (B) Peripapillary RNFL i SD-oktober (C) Peripapillary RNFL tykkelse i ringformede skanner, definert som RNFL arealberegningen per felt; Opa1delTTAG kvinnelige mus, n = 5-11, mener ± SEM, * p < 0,05 vurdert med Student t-test. (D) RNFL/GCL og GC komplekse lagtykkelse i radial skanner, målt med standard eller hjemmelaget calipers for 3 eller 10 skanning, henholdsvis; wildtype mus, n = 8, mener ± SEM, ** p < 0.01, *** p < 0,001 vurdert med Student t-test. RNFL/GCL - netthinnen nerve fiber laget/ganglion celle lag, GC: ganglion cellen. Tall-vekselstrøm tilpasset fra Sarzi et al. 9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
OCT systemet, en ikke-invasiv i vivo imaging metode gir høy oppløsning retinal section-lignende skanner. Således, dens største fordel er dens potensial for detaljert analyse, med den fantastiske muligheten transponere protokoller rutinemessig brukes på mennesker til musen modeller.
I eksemplet Opa1delTTAG mutant mus resultater SD-oktober viste en økning på RNFL og GC komplekse lagtykkelse, som er tillatt for videre utforskning av DOA patofysiologi9. Det ville ikke ha vært mulig kun med histologiske analyse. Sammenligning gir histology ikke muligheten til å visualisere hele netthinnen, i motsetning til ringformede og radiære OCT skanninger. Videre er det mer tidkrevende og kostbare, vurderer økt antall dyr i studier med flere tidspunkt. Faktisk, banet SD-oktober vei å anklage en ny retinal celle type i DOA, Müller celle9. Dette ble gjort til tross for det faktum at verken encellede oppløsning eller bestemt celle IDer er mulig med systemet. Tvert imot, er tykkelse-fokusert og/eller generelle tilstand-fokusert analyse av den peripapillary regionen i stor grad nok å oppdage forverring mobilnettet. Ytterligere undersøkelser med histology kan deretter utføres med en klar idé om hva du skal se etter. Samme metode kan derfor også brukes til evalueringen av terapeutiske tiltak for å forhindre eller bremse retinal degenerasjon.
For ytterligere å forbedre nytten av OCT, hjemmelaget calipers ble utviklet og hadde en mye høyere presisjon enn vanlige. Selv om standarden er tykkere enn RNFL/GCL, bruke noen lag den uansett, men for større lag13. Her fokusert vi komparativ analyse på RGCs i 10 radial skanninger per netthinnen i regionen peripapillary. RNFL alene var ikke målbare på radial skanninger uansett. Dette laget var for tynn og vage; Derfor ble RNFL/GCL og GC komplekse laget målt i stedet. Samtidig lykkes vi i å måle RNFL bruker ringformede skanner, som viste seg gunstig for mus phenotyping. Pålitelighet kan imidlertid være kontroversielt. I alle disse tilnærmingene var det kritiske trinnet Center skanner på ONH og visualisere netthinnen uten skygger og tetthet. Den tidligere kan enkelt justeres ved å følge trinnene av protokollen i plasseringen av netthinnen. Sistnevnte avhenger Transmisjon av hornhinnen og det krystallklart. For eksempel hvis ophthalmica gel er ujevnt fordelt, søket er uklare og/eller netthinnen vises bøyd. For å fikse dette, ville det være nok til å bruke riktig gel på nytt. Hvis den krystallklare er ugjennomsiktig, er skanningen mørke eller ufullstendig. Løsningen her vil være å gjenta søket en annen dag, hvis gjennomsiktighet i krystallinsk returnerer. En annen mulig grunn for en dårlig kvalitet skanning er tilstedeværelsen av hindringer, for eksempel værhår eller øyevipper. Dette kan lett fjernes ved å sette til side og bruke litt av ophthalmica gel å holde dem på plass. Andre analytiske metoder som avviker utstyrstype, avsøke type, vinkel og andre parametere finnes også og ulikt antall analysert bilder. Dette må vurderes hvis resultatet kvaliteten er fortsatt ikke tilfredsstillende. For eksempel tok Liu et al. radial skanner på flere vinkler13, i forhold til våre radiell skanner på bare én, rapportering litt tykkere lag. Likevel er OCT oppkjøp og analytiske metoder foreslått i dette manuskriptet egnet for å analysere RGCs i peripapillary musen netthinnen.
Avslutningsvis er OCT en teknologi med stort potensial. Gjør det mulig påvisning av subtile endringer i netthinnen strukturen, inkludert RGCs, spesielt i forhold til OPNs- og beviser uunnværlig til visjon vitenskap. Derfor er presentert protokollen praktisk for OPN mus modell phenotyping, så vel som for evaluering av romanen terapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Inserm, Université Montpellier, netthinnen Frankrike, Union National des Aveugles et Déficients Visuels (UNADEV), Association syndrom de Wolfram, Fondation pour la Recherche Médicale, Fondation de France, og Laboratory of Excellence EpiGenMed program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Opa1delTTAG mouse | Institute for Neurosciences in Montpellier, INSERM UMR 1051, France | - | Opa1 knock-in mice carrying OPA1 c.2708_2711delTTAG mutation on C57Bl6/J background |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | - | Spectral-Domain Optic Coherence Tomography system |
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | - | Software for OCT acquisition and analysis |
| ImageJ 1.48v | Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA | - | Software for analysis, requires downloading and installing two hommade macros: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool |
| Self-regulating heating plate | Bioseb, France | BIO-062 | Protection against hypothermia |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Nose Band | - | - | Elastic band |
| Gauze pads 3" x 3" | Curad, USA | CUR20434ERB | Protection against hypothermia |
| Dual Ended Cotton tip applicator | Essence of Beauty, CVS Health Corporation, USA | - | Gel application |
| Cotton Twists | CentraVet, France | T.7979C.CS | Mouse positioning |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Drugs | |||
| Néosynéphrine Faure 10% | Laboratoires Europhtha, Monaco | - | Eye dilatation |
| Mydriaticum 0.5% | Laboratoires Théa, France | 3397908 | Eye dilatation |
| Cebesine 0.4% | Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, France | 3192342 | Local anesthesia |
| Imalgene 1000 | Merial, France/CentraVet, France | IMA004 | General anesthesia |
| Rompun | Bayer Healthcare, Germany/CentraVet, France | ROM001 | General anesthesia, analgesia, muscle relaxation |
| NaCl 0.9% | Laboratoire Osalia, France | 103697114 | Physiological serum |
| Systene Ultra | Alcon, Novartis, USA | - | Hydration of eyes |
| GenTeal' | Alcon, Novartis, USA | - | Ophtalmic gel to minimize light refraction and opacities |
| Aniospray Surf 29 | Laboratoires Anios, France | 59844 | Desinfectant |
References
- Drexler, W., Fujimoto, J. G. State-of-the-art retinal optical coherence tomography. Prog Retin Eye Res. 27 (1), 45-88 (2008).
- Grenier, J., et al. WFS1 in Optic Neuropathies: Mutation Findings in Nonsyndromic Optic Atrophy and Assessment of Clinical Severity. Ophthalmology. 123 (9), 1989-1998 (2016).
- Zmyslowska, A., et al. Retinal thinning as a marker of disease progression in patients with Wolfram syndrome. Diabetes Care. 38 (3), e36-e37 (2015).
- Fischer, M. D., et al. Noninvasive, in vivo assessment of mouse retinal structure using optical coherence tomography. PLoS One. 4 (10), e7507 (2009).
- Grieve, K., Thouvenin, O., Sengupta, A., Borderie, V. M., Paques, M. Appearance of the Retina With Full-Field Optical Coherence Tomography. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (9), OCT96-OCT104 (2016).
- Chang, B., et al. Retinal degeneration mutants in the mouse. Vision Res. 42 (4), 517-525 (2002).
- Mustafa, S., Pandit, L. Approach to diagnosis and management of optic neuropathy. Neurol India. 62 (6), 599-605 (2014).
- Sarzi, E., et al. The human OPA1delTTAG mutation induces premature age-related systemic neurodegeneration in mouse. Brain. 135 (Pt 12), 3599-3613 (2012).
- Sarzi, E., et al. Increased steroidogenesis promotes early-onset and severe vision loss in females with OPA1 dominant optic atrophy. Hum Mol Genet. 25 (12), 2539-2551 (2016).
- Delettre-Cribaillet, C., Hamel, C. P., Lenaers, G., et al. Optic Atrophy Type 1. Gene Reviews. Pagon, R. A. 7 (2007), University of Washington. Seattle. (2007).
- Lenaers, G., et al. Dominant optic atrophy. Orphanet J Rare Dis. 7 (46), (2012).
- Delettre, C., et al. Nuclear gene OPA1, encoding a mitochondrial dynamin-related protein, is mutated in dominant optic atrophy. Nat Genet. 26 (2), 207-210 (2000).
- Liu, Y., et al. Monitoring retinal morphologic and functional changes in mice following optic nerve crush. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (6), 3766-3774 (2014).
