Tomografia de coerência óptica: Imagens Mouse ganglionares da retina células In Vivo

Summary

Este manuscrito descreve um protocolo para a imagem no vivo da retina do rato com a tomografia de coerência óptica de domínio espectral de alta resolução (SD-OCT). Centra-se em células ganglionares da retina (RGC) na região de peripapillary, com vários digitalização e quantificar as abordagens descritas.

Abstract

Mudanças estruturais na retina são manifestações comuns de doenças oftálmicas. Tomografia de coerência óptica (OCT) permite a sua identificação no vivo— rapidamente, repetidamente e em alta resolução. Este protocolo descreve imagens OCT na retina do rato como uma poderosa ferramenta para estudar a neuropatia óptica (OPN). O sistema OCT é uma alternativa não-invasiva, baseada em interferometria para comuns ensaios post-mortem histológica. Ele fornece uma avaliação rápida e precisa da espessura da retina, permitindo a possibilidade de controlar alterações, tais como afinamento da retina ou espessamento. Apresentamos o processo e a análise de imagem com o exemplo da linha de rato Opa1^delTTAG . Propõem-se três tipos de exames, com dois métodos de quantificação: pinças padrão e caseiras. O último é melhor para uso na retina peripapillary durante as varreduras radiais; sendo mais preciso, é preferível para a análise de estruturas mais finas. Todas as abordagens descritas aqui são projetadas para células ganglionares da retina (RGC), mas são facilmente adaptáveis para outras populações de células. Em conclusão, OCT é eficiente na fenotipagem de modelo de rato e tem potencial para ser usado para a avaliação confiável de intervenções terapêuticas.

Introduction

OCT é uma ferramenta de diagnóstico que facilita a análise das estruturas da retina¹, incluindo a cabeça do nervo ótico (HNO). Ao longo dos anos tornou-se um indicador confiável de progressão da doença em seres humanos^2,3, assim como em roedores^4,5. Ele usa interferometria para criar imagens transversais das camadas da retina em uma resolução axial de 2 µm. A camada mais interna é a retina da fibra do nervo camada (RNFL), contendo axônios RGC, que é seguida pela camada de células ganglionares (GCL), contendo principalmente RGC corpos. Em seguida é a camada plexiforme interna (IPL), onde se encontram dendrites RGC axônios de células bipolares, horizontais e amacrine. Estes, juntamente com células horizontais, formam a camada nuclear interna (INL), e suas saliências conectar com axônios fotoreceptoras na camada plexiforme externa (OPL). Isto é seguido por camada nuclear externa (ONL), com corpos de células fotorreceptoras e é separado da camada fotoreceptoras pela membrana limitante externa (Proteus), também chamada segmento segmento interior/exterior (IS / OS) camada. Finalmente, as últimas camadas observáveis na retina do rato são o epithelium retinal do pigment (RPE) e a coroide (C). O RNFL sozinho normalmente é fino demais para ser medido em ratos; assim, analisar o GCL/RNFL em vez disso é preferível^4,5. Outra possibilidade é a camada de complexo de GC, que contém o último além do IPL, tornando mais espesso e assim mesmo mais fácil medir na OCT verifica a⁴. Por conseguinte, OCT pode fornecer insights sobre o estado patológico da retina, tais como em OPNs.

Alternativamente, a espessura da retina do rato é frequentemente analisada com post-mortem de histologia. No entanto, esta técnica limitações de rostos relacionados com coleção de tecido, fixação, corte, coloração, montagem, etc. , portanto, alguns defeitos, tais como alterações de espessura sutil, não podem ser detectado. Finalmente, porque o mesmo mouse não pode ser testado no tempo vários pontos, o número de animais por estudar grandemente aumenta, ao contrário de TOC. Apesar de tudo, a não-invasividade, de alta resolução, possibilidade de repetição, monitoramento de tempo em tempo e facilidade de uso da tecnologia OCT fazem o método de escolha em estudos de doenças da retina.

Modelos de mouse são usados para identificar defeitos genéticos e elucidar os mecanismos moleculares subjacentes retinopatias⁶. OPN é uma forma de retinopatia com substanciais danos ao nervo óptico (no), que é composta de aproximadamente 1,2 milhões axônios RGC. OPN pode ser focado em ON ou pode ser secundário a outros transtornos, inatos ou não⁷, levando à perda do campo visual e, mais tarde, cegueira. Traços característicos do OPN são perda RGC e no dano, que pode ser observado em OCT humana como RNFL e GCL desbaste^2,3. Enquanto isso, a fisiopatologia do OPN é ainda mal compreendida, e, portanto, permanece a necessidade de testar as retinas do mouse.

Este manuscrito descreve a imagem e a quantificação da retina de espessura da camada, usando o exemplo do Opa1^delTTAG rato linha^8,9, um modelo de atrofia óptica dominante (DOA)¹⁰. Para avaliar a fisiopatologia RGC, radiais, anulares e retangulares exames foram quantificados. Isso foi feito com pinças padrão fornecidas pelo software OCT ou com uma macro caseira desenvolvido para um programa de processamento de imagem de código-fonte aberto. Os compassos de calibre padrão são difíceis de manipular e muitas vezes mais espessa que a RNFL/GCL, enquanto os calipers caseiros são fáceis de usar, reprodutível e mais precisos. A macro executa uma medição para uma camada automaticamente detectada, em 5 pontos e em posições fixas, nos dois lados do HNO na região peripapillary. O objetivo do protocolo apresentado é descrever a aquisição de varredura OCT para especificar o posicionamento da retina, com foco em RGCs.

Protocol

o protocolo experimental foi aprovado pela Institut national de la santé et de la recherche médicale (Inserm; Montpellier, França), é consistente com as directivas europeias e está em conformidade com a instrução de ARVO para o uso de animais na investigação oftalmológica. Foi realizado no âmbito do acordo do Languedoc Roussillon cortesia de ética em Experimentação Animal (CEEALR; nuCEEA-LR-12123).

1. instalação de equipamentos e preparação de pré-imagem

Nota: aqui, OCT realizou-se na retina do mouse usando o domínio espectral (SD) sistema de imagem oftálmica ( figura 1A). O aparelho SD-OCT consiste de uma base e um monte de imagens animal (AIM) com um palco de alinhamento de roedores (RAS) ( figura 1B). A base inclui o computador, o mecanismo da OCT, a sonda de SD-OCT e a lente do rato específico. A sonda é montada sobre o objectivo, que inclui o Z-tradutor. O RAS é usado para mouse posicionamento graças a tabela com o X - e Y-tradutor, a fita que pode ser girada e girada e o bar de mordida removível com a banda de nariz. O software fornecido pelo fabricante permite a aquisição e análise dos arquivos de OCT, embora este último também pode ser feito com um programa de processamento de imagem de código-fonte aberto.

1. Firmemente Coloque a sonda no objetivo.
2. a lente do rato específicos se conectem a sonda.
3. Ajustar as configurações de braço de referência para a lente específica (aqui, poder no 086 e posição no 964).
4. Certificar-se que o rato específico da lente é suficientemente distante a cassete, fixe a barra de mordida com a banda do nariz para a gaveta.
   Nota: A distância entre a lente e a fita pode ser ajustada com o parafuso de Z-tradutor, situado na parte traseira o objectivo. A banda de nariz é uma faixa elástica comercialmente disponível, e sua tensão deve ser ajustada dependendo do tamanho do mouse.
5. Ligar a fonte de alimentação (canto inferior direito da carreta) e, em seguida, o computador.
6. Para iniciar o programa de imagem, clique duas vezes no atalho apropriado na tela.
   Nota: Isto depende do tipo de lente; aqui, Mouse Retina.
7. Cria um novo estudo clínico e adicione os protocolos desejados. Caso contrário, use o estudo clínico existente e/ou protocolos.
   1. Adicionar um novo estudo, escolhendo o " estudar NameŔ " IDŔ " especificações do braço de tratamento " (aqui, " Uncategorized "); e predefinidos " digitalizar protocolos ", se eles existirem.
8. Escolher um " examinador " no " estudo clínico " seção.
   Nota: para uma nova " examinador ", vá para " Setup examinadores & médicos " para defini-la
9. Adicionar um novo paciente no paciente/exame seção clicando em Adicionar paciente; entrando a " ID ", " nome ", " sobrenome ", " sexo ", e " data de nascimento " (opcional).
   Nota: Fazer isso só antes de testar cada rato, se mais conveniente. Certifique-se de que o ID é não mais de 10 caracteres. Para o mouse, o erro refractivo para ambos os olhos é 0 e o comprimento axial é 23,0.
10. Clique no " adicionar o exame " e selecione o desejado " protocolo " adicionando " Preset Scans " da lista, começando com o olho que será avaliado primeiro (aqui, o olho direito), ou Personalizando os scans.
11. Para personalizar um scan, ou usar uma verificação existente como um modelo e editá-lo ou criá-lo do zero através da " adicionar verificação personalizada " opção. Depois de adicionar todos os exames para a lista, definir um novo protocolo usando o " Enter " novo nome de protocolo " opção (OS: oculus sinistra, esquerdo olho; OD: oculus dexter, certo olho).
    Nota: Aqui, o protocolo envolve três exames: (i) uma varredura radial, com um diâmetro de 1,4 mm, deslocamentos horizontal e vertical de 0 mm, 1.000 linhas de A-exames/B-scan, B-exames/volume 100, quadro 1/B-scan, 80 linhas de inativos A-exames/B-scan e 1 volume; (ii) uma varredura retangular, com um comprimento de 1,4 mm e largura, ângulo de 0°, 0-mm deslocamentos horizontais e verticais, 1.000 linhas de A-exames/B-scan, B 100-scans, quadro 1/B-scan, 80 linhas de inativos A-exames/B-scan e 1 volume; e (iii) um anular digitalização, com 0,4 mm mínimo e 0,6 mm de diâmetro máximo, deslocamentos horizontais e verticais de 0 mm, 1.000 linhas de A-exames/B-scan, B-exames/volume 3, 48 frames/B-scan, 80 linhas de inativos A-exames/B-scan e 1 volume.

2. Preparação de mouse

1. imobilização e dilatação dos olhos
   1. pelo menos 15 minutos antes da aquisição de dados, instilar o colírio de fenilefrina 10% para os olhos de rato, remover o excesso e instilar 0,5% tropicamida colírio.
      Nota: A primeira dilatação pode ser feita de uma só vez para todos os ratos que serão testados na sessão. Certifique-se que os líquidos à temperatura ambiente.
   2. Anestesia induzindo imediatamente após geral (passo 2.2), administrar 0,4% oxybuprocaine cloridrato colírio, mantendo-os no lugar por 3 s para anestesiar e imobilizar os olhos. Depois, limpe as gotas e repita a instilação de tropicamida fenilefrina e 0,5% de 10% para verificar que os olhos são bem dilatados.
      Nota: Certifique-se que os líquidos são em temperatura ambiente e que o mouse não engula o oxybuprocaine.
2. Anestesia geral
   1. preparar uma solução anestésica de cetamina (20 mg/mL) e xilazina (1,17 mg/mL) em solução salina. Loja a 4 ° C por um período máximo de 2 semanas.
   2. Aproximadamente 5 min antes do teste, intraperitonealmente injetar 5-10 µ l da solução anestésica por 1 g de massa corporal, dependendo da idade e tamanho do mouse.
      Nota: Jovens e/ou necessidade de ratos fina menos anestésico, levar menos tempo para anestesiar, mas também despertar mais rápido. Aqui, 8 µ l/g (160 mg/kg de cetamina, 9,33 mg/kg de xilazina).
   3. , Opcionalmente, lubrificar os olhos com colírios viscosos ou um gel oftálmico para evitar o ressecamento da córnea.

3. Posicionamento do mouse

1. lubrificar os olhos com olho viscoso à base de glicol cai para fornecer hidratação corneal.
   Nota: Se os olhos parecem secos durante o exame, re-aplicar o colírio.
2. Embrulhar o mouse em uma folha de gaze cirúrgica para mantê-lo quente.
3. Usando uma esponja ou algodão pavio, aplique uma camada fina de um gel oftálmico com 0,3% hypromellose em cada olho, para minimizar a refração de luz, evitar opacidades e segura hidratação da córnea. Enquanto isso, abram as pestanas e bigodes.
4. Posicione o mouse na gaveta, com a cabeça reta e aponta para a frente.
5. Abra o grampo de barra dentada suavemente e coloque a barra na boca; usar a banda de nariz para fixar a posição.
   Nota: Certifique-se que a barra de mordida é no meio da gaveta.
6. Lugar um algodão roll sob o lado direito (esquerdo), se o olho direito (esquerdo) está sendo testado.
7. , Mantendo a ponta visando com clip na lente do rato específico, trazê-lo para o olho girando o parafuso de Z-tradutor no sentido anti-horário.
8. Girando e girando a gaveta e girando a barra dentada e os parafusos de X-tradutor, pré-ajuste a posição do mouse; o objetivo é ter o olhar olho direito diretamente para a lente e, portanto, para alinhar os eixos óticos dos olhos e a lente.
   Nota: Se o mouse estiver muito alta ou muito baixa, o parafuso de Y-Tradutor deve ser usado de primeiro.
9. Escolher o primeiro scan no " exame ", clique no " começar com o objetivo " e fazer os ajustes manuais ainda mais para a imagem latente retinal.
   1. Utilizando o parafuso de Z-tradutor, mover a retina verticalmente no painel esquerdo ( Figura 2, Alinhamento Horizontal B-scan) e horizontalmente no rpainel de voo ( Figura 2, Alinhamento Vertical B-scan).
   2. Girar a fita para trazer o HNO no meio do painel direito movendo o HNO cima ou para baixo. Utilize o parafuso do bar de mordida para endireitar a retina no painel direito. Girar a fita para posicionar o HNO no meio do painel esquerdo.
   3. Usar o parafuso X-Tradutor ao nível da retina no painel esquerdo. Ainda mais tendo em conta a função principal de cada modulador, ajuste a posição da retina para centralizar o HNO.
      Nota: Utilize o parafuso de Y-Tradutor para mover o HNO acima e para baixo no painel direito, se necessário. A posição pode ser refinada em qualquer momento entre as varreduras.

4. SD-OCT de imagem da Retina e HNO

1. depois de conteúdo com os ajustes, clique no " começar instantâneo " para começar a varredura de SD-OCT.
   1. Se uma imagem em 3D não é necessária, desmarque a opção OCU.
2. Salvar o relatório e a verificação.
3. Prosseguir com os próximos exames.
4. Para o segundo olho de imagem, depois retraindo a lente, vire a fita em conformidade e repita etapas 3.6-4.3.

5. Conclusão da aquisição

1. quando a aquisição estiver concluída, remova o mouse o cassete, aplicar gel oftálmico com hypromellose 0,3% para cada olho e coloque o mouse sobre uma placa de aquecimento para cima de acordo
2. Após a última aquisição, feche o software e desligue o computador e a máquina de OCT (botão de alimentação power).
3. Limpar a gaveta com desinfetante.

6. Análise

1. para a medição de espessura de camada da retina, usar o software de segmentação automatizada fornecido pelo fabricante.
   1. Clique no " paciente ", escolher o desejado " exame " então lista e clique em sobre o " revisão exame " opção.
   2. Carregar os dados desejados da OCT para o software de OCT clicando no ícone de pasta na varredura desejada.
   3. Direita clique sobre o B-scan; configurar os compassos de calibre, permitindo até 10 medindo pinças; e inserir seus nomes, ângulos e cores.
   4. Escolher o compasso de calibre desejado clicando sobre o B-scan; colocá-lo em conformidade para a retina para medição.
      Nota: Para os exames, centrados sobre o HNO, conjunto 5 pinças em ambos os lados, equidistantes uns dos outros. Para a análise de peripapillary, certifique-se que o compasso de calibre é colocado não muito longe do HNO. Para fazer a varredura radial, analise 10 imagens por exame que foram escolhidas pelo software OCT. Seus números podem ser encontrados no " relatórios " pasta.
   5. Salvar os resultados para análise em um programa de software de planilha, clicando sobre o B-scan e clicando em " salvar resultados ".
      Nota: Os resultados podem ser encontrados na mesma pasta como a digitalização de dados.
2. Como alternativa, use a macro de maxila caseiro, " MRI Retina ferramenta ", desenvolvido por um programa de processamento de imagem de código-fonte aberto (ver a tabela de materiais).
   1. Certifique-se de que o " ferramenta de Retina MRI " e o " modificar o polígono seção ferramenta " macros são ativas. Carrega a imagem. Clique no botão para iniciar a medição de m.
      Nota: A macro cria automaticamente um 0,2 mm de comprimento medição gaveta em ambos os lados do HNO. Cada gaveta contém 5 pontos de medição que funcionam como pinças. Sua posição lateral é inalterável e personalizada para o peripapilla nos scans radiais. A posição horizontal das fitas é predefinida para medir a espessura RNFL/GCL, mas é facilmente modificável para medir a camada de complexo de GC em vez disso. Se a qualidade da digitalização é pobre, a posição horizontal precisa ser ajustada ou a imagem precisa ser excluídos da análise.
   2. Para ajuste horizontal, clique no botão e. No recém-inaugurado " ROI Manager " janela, escolha a primeira gaveta.
   3. Clique no polígono azul botão e ajustar a posição da primeira fita clicando nas fronteiras da camada medida na foto.
   4. Repetir pela segunda gaveta, primeiro escolhendo-a no " ROI Manager " janela e em seguida, clicando na imagem apropriada. Clique no botão r para medir novamente. Exibir os resultados na " medições " janela.
      Nota: Os resultados podem ser copiados para um programa de software de planilha eletrônica, a qualquer momento. Eles contêm os seguintes valores para a direita (r), gaveta esquerda (l) e gaveta total: Intden - densidade integrada dentro da gaveta; Área: área da medição, em mm ²; Len: comprimento da maxila dentro da gaveta, em mm; Quer dizer: quer dizer a intensidade do sinal dentro da gaveta; e Std: erro padrão da média intensidade do sinal.
   5. Prosseguir com a próxima imagem.
   6. Mais analisar os dados em um programa de software de planilha eletrônica.
      Nota: Para localizar a espessura média da camada, leve o Len de dez valores.

Representative Results

A tecnologia SD-OCT permite imaginar da retina e análise de espessura que é comparável à histologia, mas é mais rápido e mais detalhadas (Figura 3). Tal como apresentado com camundongos C57Bl/6 de sua, mesmo que a qualidade de uma varredura de SD-OCT (Figura 3A, direito) não é tão bom quanto o de uma imagem de uma secção da retina (Figura 3A, à esquerda), visualiza mais camadas (por exemplo, Proteus). Além disso, leva apenas cerca de 40 min, incluindo preparação de rato, versus dias ou semanas para análise histológica. Finalmente, não requer processamento e coloração, como hematoxilina eosina e açafrão, que podem danificar o tecido e causar a coleção de dados errôneos. As camadas da retina facilmente mensuráveis em OCT englobam o RNFL/GCL, IPL, INL, OPL, ONL, IS / OS, RPE e C (Figura 3B), permitindo, portanto, um estudo complexo da retina inteira. Como tal, mudanças estruturais da retina refletem o desenvolvimento da doença. No caso de OPNs, isso se aplica a RGCs e a diante e assim o RNFL/GCL e IPL.

DOA é um dos OPNs mais comuns e é caracterizada por degeneração RGC e a perda do RNFL¹¹. Devido a mutações no gene OPA1 ¹², leva à cegueira e deficiência visual. Usando o modelo de rato^delTTAG Opa1, que transporta a mutação humana c.2708delTTAG recorrentes, foi descoberto que Opa1 strigatus-insuficiência dificulta a visão em uma maneira dependente do sexo^8,9. Isso foi determinado com base em medições de OCT de espessura da retina, que mostrou um progressivo espessamento da camada de complexo de GC (Figura 4A) e o peripapillary RNFL (Figura 4B, 4C) em Opa1^{+ /-} fêmeas. Nesses experimentos, os cálculos foram feitos com as pinças padrão para varreduras retangulares e com uma programa para os exames de anulares de processamento de imagem de código-fonte aberto. Para varreduras radiais, que muitas vezes são de uma qualidade inferior e produzir que um mínimo de 10 imagens por retina para análise, uma macro caseira foi desenvolvido. Uma comparação entre os compassos de calibre padrão e caseiros (Figura 4) mostrou significativamente menor espessura do RNFL/GCL e camadas complexas GC, medidas com o último. Isto é porque os compassos de calibre padrão são muito mais espessa e mais difícil de colocar na fronteira da camada. Portanto, é melhor evitar usar as pinças padrão para camadas finas, especialmente nos scans radiais.

Para resumir, o SD-OCT permite fenotipagem de visual do mouse que pode ser repetida em vários pontos de tempo. No entanto, o tipo de varredura OCT e método de medição devem ser adaptados para a doença investigada e, portanto, a camada da retina em questão. Não obstante, a OCT fornece informações suficientes para identificar defeitos na estrutura da retina. No entanto, isto deve ser analisado ainda mais com um outro método para fornecer uma compreensão completa dos mecanismos subjacentes.

Figura 1: sistema de imagens oftálmica de SD-OCT. (A) visão geral da base e objetivo-RAS partes do dispositivo SD-OCT. (B) visão geral dos componentes do objectivo-RAS. R: computador de alimentação b:, c: OCT referência, sonda d: SD-OCT, motor lente de rato específicos e:, f: Z-tradutor, g: AIM-RAS de tabela, h: Y-tradutor, i: gaveta (rotator), j: barra de mordida, K – banda do nariz, do giro de gaveta l:, m: X-Tradutor e n: com o objetivo de ponta. Este figute é codificados por cores como ilustrado na Figura 2, com não-moduladores da posição da retina marcado em rosa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: posicionamento da Retina. Horizontal (à esquerda) e vertical (à direita) vista do B-scan de alinhamento. As setas correspondem aos movimentos induzidos pelos moduladores codificados por cores. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: camadas da retina. (A) sua histologia da retina de rato depois de hematoxilina eosina e açafrão coloração (esquerda) e SD-OCT (à direita); barra de escala: 50 µm. (B) espessura da retina as medições para 3 meses sua ratos; n = 14, quer dizer SEM ±, barra de escala: 50 µm. GC: células ganglionares, RNFL/GCL: camada de célula de camada/gânglio retinal da fibra do nervo, IPL: camada plexiforme interna, INL: camada nuclear interna, OPL: camada plexiforme externa, ONL: camada nuclear exterior, IS / OS: fotorreceptoras interior segmentos/exterior segmentos, RPE: epitélio pigmentar da retina e coroide c:. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: medições exemplar SD-OCT. Espessura de camada complexa (A) GC em scans retangulares centrada sobre o HNO, medido com as pinças padrão; Linha de rato Opa1^delTTAG , n = 4, quer dizer SEM ±, * * p < 0,01 avaliadas com o teste t de Student. (B) Peripapillary RNFL na espessura de SD-OCT (C) Peripapillary RNFL em scans anulares, determinado como o cálculo da área RNFL por campo; Opa1^delTTAG de ratos fêmeas, n = 5-11, quer dizer SEM ±, * p < 0.05 avaliadas com o teste t de Student. Espessura de camada complexa (D) RNFL/GCL e GC em scans radiais, medido com as pinças padrão ou caseiras para varreduras de 3 ou 10, respectivamente; sua ratos, n = 8, quer dizer SEM ±, * * p < 0,01, * * * p < 0.001 avaliadas com o teste t de Student. RNFL/GCL - camada de célula de camada/gânglio retinal da fibra do nervo, GC: células ganglionares. Figuras A C adaptada de Sarzi et al ⁹. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

O sistema OCT, um não-invasivo na vivo por imagens método, fornece scans de cross-section-como retina de alta resolução. Assim, sua principal vantagem é o seu potencial para análise detalhada, com a maravilhosa oportunidade de transpor protocolos rotineiramente aplicados aos seres humanos a modelos de rato.

No exemplo de Opa1^delTTAG ratos mutantes, SD-OCT resultados mostraram um aumento de espessura de camada complexa de RNFL e GC, que permitiu maior exploração de DOA fisiopatologia⁹. Não seria possível apenas com a análise histológica. Em comparação, a histologia não oferece a possibilidade de visualizar a retina inteira, ao contrário de varreduras de OCT anulares ou radiais. Além disso, é mais demorada e dispendiosa, considerando o aumento do número de animais em estudos com vários pontos de tempo. Na verdade, SD-OCT pavimentou o caminho para incriminar um novo tipo de célula da retina em DOA, a célula de Müller⁹. Isto foi feito apesar do fato de que são possíveis com o sistema de célula única resolução nem identificações de célula específica. Pelo contrário, a análise centrada no estado centrada em espessura e/ou geral da região peripapillary é largamente suficiente para detectar deterioração celular. Investigações adicionais com histologia então podem ser realizadas com uma ideia clara de o que procurar. Portanto, o mesmo método também pode ser aplicado para a avaliação de intervenções terapêuticas para prevenir ou degeneração da retina de freio.

Para melhorar ainda mais a utilidade da OCT, pinças caseiras foram desenvolvidas e tinham uma precisão muito maior do que os padrões. Mesmo que o padrão é mais grosso que o GCL/RNFL, algumas equipes usá-lo de qualquer maneira, mas para maiores camadas¹³. Aqui, nós focalizamos a análise comparativa em RGCs em 10 scans radiais por retina, todos na região de peripapillary. O RNFL sozinho não era mensurável nos exames radiais de qualquer maneira. Esta camada era magra demais e vago; Portanto, o RNFL/GCL e a camada de complexo de GC foram medidos em vez disso. Ao mesmo tempo, conseguimos medir o RNFL usando varreduras anulares, que provou ser benéficas para fenotipagem de rato. No entanto, a confiabilidade pode ser controversa. Em todas essas abordagens, a etapa crítica foi para o centro os scans sobre o HNO e visualizar a retina sem sombras e opacidades. O primeiro pode ser facilmente ajustado, seguindo os passos do protocolo em termos de posicionamento da retina. O último depende a transmitância de córnea e o cristalino. Por exemplo, se o gel oftálmico se espalha uniformemente, a varredura é embaçada e/ou retina aparece dobrada. Para corrigir isso, seria suficiente para re-aplicar o gel. Se o cristalino é opaco, a varredura é obscuro ou incompleto. A solução aqui seria para repetir o exame mais um dia, se a transparência do cristalino retorna. Uma outra razão possível para uma varredura de má qualidade é a presença de obstáculos, tais como bigodes ou cílios. Estas podem ser facilmente removidas deixando de lado e aplicando um pouco do gel oftálmico para mantê-los no lugar. Outras abordagens analíticas que diferem em termos de tipo de equipamento, tipo de verificação, ângulo e outros parâmetros existem também e tem números diferentes de imagens analisadas. Esta deve ser considerada se a qualidade do resultado ainda não é satisfatória. Por exemplo, Liu et al tomou varreduras radiais em vários ângulos¹³, em comparação com nossa varredura radial em apenas um, relatando um pouco mais grossas camadas. No entanto, a aquisição da OCT e abordagens analíticas propostas neste manuscrito são adequadas para a analisar RGCs na retina do rato peripapillary.

Em conclusão, o TOC é uma tecnologia com grande potencial. Permite a detecção de mudanças sutis na estrutura da retina — incluindo os RGCs, especialmente em relação do OPNs — e prova indispensável para Ciências da visão. Portanto, o protocolo apresentado é prático para OPN rato modelo fenotipagem, bem como para a avaliação de novas terapias.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice
Opa1delTTAG mouse	Institute for Neurosciences in Montpellier, INSERM UMR 1051, France	-	Opa1 knock-in mice carrying  OPA1 c.2708_2711delTTAG mutation on C57Bl6/J background
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System	Bioptigen, Leica Microsystems, Germany	-	Spectral-Domain Optic Coherence Tomography system
EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software	Bioptigen, Leica Microsystems, Germany	-	Software for OCT acquisition and analysis
ImageJ 1.48v	Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA	-	Software for analysis, requires downloading and installing two hommade macros: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool
Self-regulating heating plate	Bioseb, France	BIO-062	Protection against hypothermia
Name	Company	Catalog Number	Comments
Supplies
Nose Band	-	-	Elastic band
Gauze pads 3" x 3"	Curad, USA	CUR20434ERB	Protection against hypothermia
Dual Ended Cotton tip applicator	Essence of Beauty, CVS Health Corporation, USA	-	Gel application
Cotton Twists	CentraVet, France	T.7979C.CS	Mouse positioning
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Drugs
Néosynéphrine Faure 10%	Laboratoires Europhtha, Monaco	-	Eye dilatation
Mydriaticum 0.5%	Laboratoires Théa, France	3397908	Eye dilatation
Cebesine 0.4%	Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, France	3192342	Local anesthesia
Imalgene 1000	Merial, France/CentraVet, France	IMA004	General anesthesia
Rompun	Bayer Healthcare, Germany/CentraVet, France	ROM001	General anesthesia, analgesia, muscle relaxation
NaCl 0.9%	Laboratoire Osalia, France	103697114	Physiological serum
Systene Ultra	Alcon, Novartis, USA	-	Hydration of eyes
GenTeal'	Alcon, Novartis, USA	-	Ophtalmic gel to minimize light refraction and opacities
Aniospray Surf 29	Laboratoires Anios, France	59844	Desinfectant