Summary
Эта рукопись описывает протокол для изображений в vivo сетчатки мышь с разрешением спектральной области оптическая когерентная томография (SD-Октябрь). Она фокусируется на клетки сетчатки ганглии (РЦ) в околососковой области с несколькими сканирование и количественного подходов, описанных.
Abstract
Структурные изменения в сетчатке являются распространенными проявлениями офтальмологических заболеваний. Оптическая когерентная томография (Окт) позволяет их идентификации в естественных условиях— быстро, многократно и с высоким разрешением. Этот протокол описывает OCT изображения на сетчатке мыши как мощный инструмент для изучения оптической невропатии (OPN). Окт система является альтернативой общей посмертное гистологических анализов, на основе интерферометрии, неинвазивная. Она обеспечивает быстрые и точные оценки толщины сетчатки, позволяя возможность отслеживать изменения, такие как истончение сетчатки или утолщение. Мы представляем визуализации процесса и анализ на примере линии мышиdelTTAG Opa1. Предлагаются три типа сканирования, с двумя методами количественной оценки: стандартные и домашние суппортов. Последний лучше всего подходит для использования на сетчатке околососковой во время радиальных сканирования; будучи более точной, является предпочтительным для анализа тоньше структур. Все описанные здесь подходы предназначены для клеток сетчатки ганглии (РЦ), но легко адаптируется для других клеточных популяций. В заключение Окт эффективен в мыши модель фенотипа и имеет потенциал, чтобы быть использованы для надежной оценки терапевтических вмешательств.
Introduction
OCT-это диагностический инструмент, который облегчает изучение сетчатки структуры1, включая головку зрительного нерва (БЕЙКЕ). С годами он стал надежным показателем прогрессирования заболевания людей2,3, а также в грызунов4,5. Он использует интерферометрии для создания поперечных изображения слоев сетчатки осевой с разрешением 2 мкм. Внутренний слой является сетчатки слой нервных волокон (RNFL), содержащий RGC аксонов, который сопровождается слоя клеток ганглия (GCL), содержащие главным образом RGC органов. Далее идет внутренний сплетениевидный слой (IPL), где RGC дендритов встречаются биполярный, горизонтальные и Амакриновые аксоны ячейки. Это, вместе с горизонтальной клетки, формируют внутренний ядерный слой (INL), и их выступов соединиться с фоторецепторных аксоны в внешний сплетениевидный слой (ОБН). Это сопровождается ядерной слоя (ONL), с органами фоторецепторных клеток и отделена от фоторецепторных слоя внешней ограничивающим мембраны (OLM), также называемый внутренний сегмент/наружный сегмент (IS / OS) слоя. Наконец последний наблюдаемых слои в сетчатке мыши являются пигментный эпителий сетчатки (ПЭС) и сосудистое (C). Только RNFL обычно слишком тонким, чтобы быть измерена в мышей; Таким образом вместо анализа RNFL GCL — предпочтительно4,5. Другой возможностью является GC комплекс слой, который содержит последний дополнение к IPL, облегчая толще и таким образом даже для измерения на Окт сканирует4. Следовательно OCT может обеспечить понимание патологическое состояние сетчатки, такие как в OPNs.
Кроме того толщина сетчатки мыши часто анализируется с посмертной гистологии. Однако этот метод лица ограничения, касающиеся ткани коллекции, фиксации, резки, окрашивание, монтаж, и т.д. следовательно, некоторые дефекты, такие как толщина тонкие изменения, не может быть обнаружена. Наконец, поскольку и та же мышь не может быть протестирован в несколько раз указывает, количество животных каждого исследования значительно увеличивается, в отличие от для октября. Все в всех не инвазивность, с высоким разрешением, возможности для повторения, время мониторинга во времени и простота использования технологии OCT делают его методом выбора в исследования заболеваний сетчатки.
Мыши модели используются для выявления дефектов гена и прояснения молекулярных механизмов лежащие в основе ретинопатии6. OPN — это форма ретинопатии с существенный ущерб зрительного нерва (на), которая состоит из примерно 1,2 миллиона RGC аксоны. OPN может быть направлена на ON или может быть вторичным на другие заболевания, врожденные или не7, приводит к потере зрительного поля и позднее, слепота. Характерные черты OPN являются RGC потери и об ущербе, который может наблюдаться в человека OCT RNFL и GCL истончение2,3. Тем временем патофизиологии OPN еще плохо поняты, и поэтому остается необходимость тестирования мыши сетчатки.
Эта рукопись описывает изображений и количественной оценки толщины слоя сетчатки, используя пример Opa1delTTAG мыши линии8,9, модель доминирующим атрофия зрительного нерва (DOA)10. Чтобы оценить RGC патофизиологии, радиальные, прямоугольные и кольцевой проверки были количественно. Это было сделано с стандартных суппортов, предоставляемый OCT программного обеспечения или с домашним макрос, разработанные для обработки изображений открытым исходным кодом программы. Стандартные калибры трудно манипулировать и часто толще, чем RNFL/GCL, в то время как домашние суппорта проста в использовании, воспроизводимые и более точным. Макрос выполняет измерения автоматически обнаруженных слоя, в 5 пунктах и на стационарных позициях, на обеих сторонах БЕЙКЕ в околососковой области. Цель представленных протокола является описание OCT сканирования приобретение для указания сетчатки позиционирования, с акцентом на РГК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
экспериментальный протокол был одобрен Institut национальный de la santé et de la recherche сообщала (Inserm; Монпелье, Франция), в соответствии с европейскими директивами и соответствует Арво заявление для использования животных в офтальмологических исследований. Она осуществляется по соглашению Лангедок Руссийон вежливости этики в животных экспериментов (CEEALR; nuCEEA-LR-12123).
1. Установка оборудования и подготовка предварительной визуализации
Примечание: здесь, Окт была выполнена на мыши сетчатки с помощью спектральной области (SD) офтальмологический тепловизионные системы ( рис. 1A). SD-Окт аппарат состоит из базы и животных изображений горе (AIM) с грызунов выравнивание стадии (РАН) ( рис. 1B). База включает в себя компьютер, двигатель OCT, SD-Окт зонд и мыши конкретного объектива. Датчик монтируется на цель, которая включает в себя Z-переводчик. РАН используется для позиционирования благодаря таблицы с X - и Y-переводчик, кассету, которую можно поворачивать и поворачивается, мыши и съемный укус бар с группой нос. Программное обеспечение, предоставляемое изготовителем позволяет для приобретения и анализ файлов OCT, хотя последний также может быть сделано с открытым исходным кодом изображения обработки программой.
- Твердо место в целью штырь.
- Подключить мышь конкретного объектива зонда.
- Руку ссылку настройки для конкретного объектива (здесь, мощность на 086 и позиции в 964).
- Убедившись, что мыши конкретные объектив достаточно отдаленные от кассеты, приложите укус бар с группой нос на кассету.
Примечание: Расстояние между линзой и кассета может быть скорректирована с Z-переводчик винт, задней цель. Группа нос является коммерчески доступных резинкой, и его напряжения должны быть скорректированы в зависимости от размера мыши. - Включите блок питания (правом нижнем углу корзины), а затем компьютер.
- Для запуска программы обработки изображений, дважды щелкнуть соответствующий ярлык на экране.
Примечание: Это зависит от типа объектива; здесь, мышь сетчатки. - Создать новые клинические исследования и добавьте желаемый протоколы. В противном случае, использовать существующие клинические исследования и/или протоколы.
- Добавить новое исследование, выбрав " исследования NameŔ " IDŔ " спецификации рукой лечения " (здесь, " рубрики "); и предопределенные " сканирования протоколы ", если они существуют.
- Выберите " экзаменатор " в " клинические исследования " раздел.
Примечание: для новой " экзаменатор ", перейдите " установки экзаменаторов & врачей " определить it. - Добавить новый пациент в экзамен пациента раздел, нажмите на добавить пациент; ввода " ID ", " имя ", " фамилия ", " секс ", и " Дата рождения " (опционально).
Примечание: Для этого перед тестирование каждой мыши, если более удобным. Убедитесь, что идентификатор не более 10 символов. Для мыши, рефракционной ошибки для обоих глаз 0 и осевой длина 23,0. - Нажмите на " добавить экзамен " и выберите " протокол ", добавив " пресет сканирует " из списка, начиная с глаз, который будет оцениваться сначала (здесь, правый глаз), или путем настройки сканирования.
- Для настройки сканирования, либо использовать существующий сканирования в качестве шаблона и изменить его или создание его с нуля путем " добавить настраиваемые сканирования " вариант. После добавления в список всех проверок, определить новый протокол с помощью " ввод " новое имя протокола " вариант (OS: oculus зловещий, левый глаз; ОД: oculus dexter, правый глаз).
Примечание: Здесь, протокол включает в себя три сканов: (i) радиальные сканирование, с диаметром 1,4 мм, горизонтальное и вертикальное смещение 0 мм, 1000 линии А-сканов/B-скан, 100 Б-сканов/объем, 1 кадр/B-скан, 80 линий неактивных А-сканов/B-Scan, и 1 объем; (ii) прямоугольной сканирование, с 1.4-мм длины и ширины, угол 0°, горизонтальное и вертикальное смещение 0-мм, 1000 линии А-сканов/B-скан, 100 Б-сканов, 1 кадр/B-скан, 80 линий неактивных А-сканов/B-Scan, и 1 объем; и (iii) кольцевой сканирование, с 0,4 мм минимальный и 0,6 мм максимальный диаметр, горизонтальное и вертикальное смещение 0-мм, 1000 линии А-сканов/B-скан, 3 Б-сканов/объем, 48 кадров/B-скан, 80 линий неактивных А-сканов/B-Scan, и 1 объем.
2. Подготовка мыши
- глаз дилатация и иммобилизации
- по крайней мере 15 минут до сбора данных, привить 10% фенилэфрина глазные капли в глаза мыши, удалить излишки и привить глазные капли 0,5% Тропикамид.
Примечание: Первый дилатации может быть сделано сразу для всех мышей, которые будут проверяться в ходе сессии. Убедитесь, что жидкости при комнатной температуре. - Сразу же после вызывающих общий наркоз (шаг 2.2), администрировать 0,4% oxybuprocaine гидрохлорид глазные капли, сохраняя их в место для 3 s анестезировать и иммобилизации глаза. После этого, вытирать капли и повторите внушение 10% фенилэфрина и 0,5% Тропикамид, чтобы убедиться, что глаза хорошо расширены.
Примечание: Убедитесь, что жидкости при комнатной температуре и что мышь не глотать oxybuprocaine.
- по крайней мере 15 минут до сбора данных, привить 10% фенилэфрина глазные капли в глаза мыши, удалить излишки и привить глазные капли 0,5% Тропикамид.
- Наркоз
- подготовить анестезирующий раствор кетамин (20 мг/мл) и ксилазина (1,17 мг/мл) в солевой раствор. Хранить при 4 ° C для максимум 2 недели.
- Около 5 мин до начала испытания, внутрибрюшинно придать 5-10 мкл раствора анестетика на 1 г массы тела, в зависимости от возраста и размера мыши.
Примечание: Молодые и/или тонкой мышей необходимость менее обезболивающий, взять меньше времени чтобы анестезировать, но также пробудить быстрее. Здесь, 8 мкл/g (160 мг/кг кетамина, 9,33 мг/кг Ксилазина). - При необходимости смазывать глаза с вязкие глазные капли или глазной гель, чтобы избежать сухости роговицы.
3. Позиционирования мыши
- смазывать глаза с вязкой на основе гликоля глаз капли предоставлять роговицы гидратации.
Примечание: Если глаза, кажется сухим во время экзамена, повторно применять глазные капли. - Обертывание мыши в листе хирургических марлевых держать его теплым.
- С помощью губки или хлопка фитиль, нанесите тонкий слой глазной гель с гипромеллоза 0,3% на каждый глаз, свести к минимуму преломление света, во избежание помутнения и безопасных роговицы гидратации. При этом, переместите ресницы и усы сторону.
- Позиция мыши в кассету, с головой прямо и указывая вперед.
- Осторожно откройте зажим бар укус и поместите панель в рот; используйте нос группы для обеспечения позиции.
Примечание: Убедитесь, что панель укус в середине кассету. - Место, хлопок катиться под правой (левой) стороны, если тестируется правый глаз (слева).
- При сохранении кончик клип направленный на мышь конкретного объектива, привести его к глазу, поворачивая против часовой стрелки винт Z-переводчик.
- Вращения и поворота кассеты и, поворачивая укус бар и X-переводчик винты, предварительно задать положение мыши; цель должна иметь правый глаз смотреть прямо в объектив и, таким образом, чтобы выровнять оптических осей глаз и объектив.
Примечание: Если мышь является слишком высокой или слишком низкой, винт Y-переводчик должен использоваться сначала. - Выбрать первая проверка в " экзамен ", нажмите на " начать направленный " и сделать любой дальнейшей ручной корректировки для сетчатки воображения.
- С помощью Z-переводчик винт, переместите сетчатки вертикально на левой панели ( Рисунок 2, выравнивание горизонтальных B-скан) и по горизонтали на rГруппа полета ( Рисунок 2, выравнивание вертикальной B-скан).
- Поворота кассеты довести БЕЙКЕ в середине правой панели, перемещая БЕЙКЕ вверх или вниз. Используйте винт бар укус выпрямить сетчатки на правой панели. Вертлюг кассетный позиционировать БЕЙКЕ в середине левой панели.
- Использовать винт X-переводчик для уровня сетчатки на левой панели. Принимая во внимание основные функции каждого модулятор, далее Отрегулируйте положение сетчатки для централизации БЕЙКЕ.
Примечание: Используйте винт Y-переводчик для перемещения БЕЙКЕ вверх и вниз на правой панели, при необходимости. Позиция может быть изысканным в любое время между операциями сканирования.
4. SD-Окт Imaging БЕЙКЕ и сетчатки
- после контента с коррективов, нажмите на " начать снимок " чтобы начать сканирование SD-Окт.
- Если 3D визуализации не требуется, снимите флажок с опции OCU.
- Сохранить сканирования и отчет.
- С следующего сканирования.
- К изображению второй глаз, после втягивания объектива, поверните кассеты соответственно и повторите шаги 3.6-4.3.
5. Приобретение завершение
- когда приобретение является полным, удалить мыши из кассеты, применять глазной гель с гипромеллоза 0,3% для каждого глаза и поместите курсор мыши на нагревательной пластинки просыпаться вверх
- После последнего приобретения, закройте программное обеспечение и выключить компьютер и октября машина (кнопка блока питания).
- Чистый кассету с протравителем.
6. Анализ
- для измерения толщины слоя сетчатки, используйте программное обеспечение автоматической сегментации, предоставляемой производителем.
- Нажмите на " пациента ", выбрать желаемый " экзамен " от, то список и нажмите на " обзор экзамен " параметр.
- Загрузить желаемого OCT данные на программное обеспечение OCT, щелкнув правой кнопкой на значке папки в желаемой сканирования.
- Правой кнопкой мыши на B-скан; Настройка суппорта, позволяя до 10 измерения суппортов; и ввести их имена, углов и цвета.
- Выбор желаемого суппорта, щелкнув правой кнопкой на B-скан; место соответственно на сетчатку измерения.
Примечание: Для сканирования, сосредоточены на БЕЙКЕ, установите 5 суппортов на каждой стороне его, равноотстоящих друг от друга. Для анализа околососковой убедитесь, что скоба находится не слишком далеко от БЕЙКЕ. Для радиальных сканирования, анализировать 10 фотографии за сканирования, которые были выбраны OCT программного обеспечения. Их число может быть найдена в " отчеты " папка. - Сохранить результаты для анализа в программу электронных таблиц, щелкните правой кнопкой мыши на B-скан и нажав " сохранить результаты ".
Примечание: Результаты можно найти в той же папке, что сканирования данных.
- В качестве альтернативы, используйте макрос домашнее суппорта, " МРТ сетчатки инструмент ", разработанные в программе обработки изображений открытым исходным кодом (см. таблицу материалы).
- Убедитесь, что " МРТ сетчатки инструмент " и " изменить раздел многоугольник " макросы являются активными. Загрузите изображение. Нажмите на кнопку для начала измерения м.
Примечание: Макрос автоматически создает один 0,2 мм Лонг измерения кассеты по обе стороны БЕЙКЕ. Каждая кассета содержит 5 точек измерения эту функцию как суппортов. Боковое положение является неизменяемым и настраивается для peripapilla в радиальных сканирует. Горизонтальное положение кассеты предопределен для измерения толщины RNFL/GCL, но это легко модифицируемые измерить GC комплекс слой вместо. Если качество сканирования бедных, горизонтальное положение необходимо скорректировать или изображение необходимо исключить из анализа. - Для горизонтальной регулировки, нажмите на кнопку e. В недавно открытом " ROI менеджер " окно, выберите первый кассетный.
- Нажмите на синий многоугольника кнопку и отрегулировать положение первой кассеты, нажав на границах измеренных слоя на картинке. Кассета
- повторить для второго, первый, выбрав его в " ROI менеджер " окно и затем нажмите на соответствующее изображение. Нажмите на кнопку "r" для повторного измерения. Просмотр результатов в " измерения " окно.
Примечание: Результаты могут быть скопированы в программу электронных таблиц программного обеспечения в любое время. Они содержат следующие значения для правой кассеты (r), левый кассеты (l) и всего: Intden - интегрированный плотности внутри кассеты; Площадь: области измерения, 2 мм; Len: длина суппорта в пределах кассеты, в мм; Среднее: означает интенсивность сигнала в пределах кассеты; и Std: Стандартная ошибка средней интенсивности сигнала. - С следующее изображение.
- Далее анализировать данные в программу электронных таблиц программного обеспечения.
Примечание: Чтобы найти средняя толщина слоя, принять десять Len значения.
- Убедитесь, что " МРТ сетчатки инструмент " и " изменить раздел многоугольник " макросы являются активными. Загрузите изображение. Нажмите на кнопку для начала измерения м.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SD-Окт технология позволяет сетчатки воображая и анализ толщины, что сопоставимо с гистологии, но быстрее и более подробные (рис. 3). Как представлены с мышей C57Bl/6 wildtype, хотя качество сканирования SD-Октябрь (рис. 3A, право) не так хорошо, как и изображение сетчатки сечения (Рисунок 3А, слева), он визуализирует больше слоев (например, OLM). Кроме того она занимает лишь около 40 мин, включая подготовку мыши, дней или недель для гистологического анализа. Наконец она не требует обработки и окрашивания, например гематоксилин, эозин и шафран, которые могут повредить ткани и вызвать коллекции ошибочных данных. Сетчатки слои, легко поддающиеся измерению в OCT охватывают RNFL/GCL, IPL, INL, ОБН, ONL, IS / OS, НПП и C (рис. 3B), таким образом позволяя для комплексного изучения всего сетчатки. Таким образом структурные изменения сетчатки отражают развитие болезни. В случае OPNs это относится к РГК и ON и таким образом RNFL/GCL и IPL.
DOA является одним из наиболее распространенных OPNs и характеризуется RGC дегенерация и потеря RNFL11. Из-за мутации в гене OPA1 12это приводит к нарушения зрения и слепота. Используя модель мышиdelTTAG Opa1, которая осуществляет человека периодические c.2708delTTAG мутации, было обнаружено, что Opa1 haplo недостаточность затрудняет видение в обнаруживавшие секс8,9. Это было определено на основе OCT измерения толщины сетчатки, который показал прогрессивного утолщение GC комплекс слоя (рис. 4A) и околососковой RNFL (рис. 4б, 4 C) в Opa1+ / самок. В этих экспериментах расчеты были сделаны с стандартных суппортов для прямоугольных сканов и с открытым исходным кодом изображения программа для кольцевой проверки обработки. Для радиальных сканирования, которые часто являются Нижняя качества и производить минимум 10 изображений за сетчатки для анализа, домашние макрос был разработан. Сравнение стандартных и домашние суппорта (рис. 4 d) показали значительно меньше толщина RNFL/GCL и сложные слои GC измеряется с последним. Это потому, что стандартные калибры намного толще и более сложной для место на границе слоя. Таким образом это лучше избегать использования стандартных суппортов для тонких слоев, особенно на радиальных сканирования.
Подводя итоги, SD-Окт позволяет мыши визуальные фенотипа, который может быть повторен через несколько времени точки. Однако тип сканирования OCT и метод измерения должны быть адаптированы к исследуемого заболевания и таким образом в слое сетчатки. Тем не менее Окт обеспечивает достаточную информацию для выявления дефектов в структуре сетчатки. Однако это должны быть также проанализированы с другой метод, чтобы обеспечить полное понимание основных механизмов.
Рисунок 1: система офтальмологических изображений SD-Окт. (A) обзор базы и AIM-РАН частей устройства SD-Октябрь. (B) Обзор компонентов, цель-ран. A: компьютер, B: источник питания, C: OCT двигатель ссылка руку, D: SD-Окт зонд, линзы мыши конкретных E:, F: Z-переводчик, G: AIM-РАН таблицы, H: Y-переводчик, I: кассеты (ротаторной), J: Укус бар, K – нос группы, L: кассеты шарнирного соединения, M: X-переводчик и направленный N: чаевые. Этот figute цветом, как показано на рисунке 2, с-модуляторы сетчатки позиции помечены в розовом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: позиционирование сетчатки. По горизонтали (слева) и вертикальной (справа) вид выравнивания Б-скан. Стрелки соответствуют движений, вызванных цветом модуляторы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: слоях сетчатки. (A) Wildtype мыши сетчатки гистологии после гематоксилин, эозином и шафран окрашивание (слева) и SD-OCT (справа); линейки: 50 µm. (B) сетчатки толщин для 3 месяц старый wildtype мышей; n = 14, означает ± SEM, шкалы бар: 50 µm. GC: клеток ганглия, RNFL/GCL: слой клеток сетчатки нервных волокон слой/ганглия, IPL: внутренний сплетениевидный слой, INL: внутренний слой ядерной, ОБН: внешний сплетениевидный слой, ONL: наружный слой ядерного, является / OS: фоторецептор внутренний сегментов и наружной сегменты, НПП: пигментный эпителий сетчатки и сосудистой оболочки C:. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: измерения образцовые SD-Окт. Толщина комплекса слоя (A) GC в прямоугольные сканирует, сосредоточены на БЕЙКЕ, измеренная с стандартных суппортов; Opa1delTTAG мыши линии, n = 4, означает ± SEM, ** p < 0,01, оценку с t критерия Стьюдента. (B) околососковой RNFL в SD-Октябрь (C) околососковой RNFL толщина в кольцевой сканирует, определяется как расчет площади RNFL в поле; Opa1delTTAG самок мышей, n = 5-11, означает ± SEM, * p < 0,05, оценку с t критерия Стьюдента. (D) RNFL/GCL и GC комплекс толщины в радиальных сканирует, измеренная с стандартной или домашнее суппорта для 3 или 10 проверок, соответственно; wildtype мышей, n = 8, означает ± SEM, ** p < 0.01, *** p < 0,001 оценены с t критерия Стьюдента. RNFL/GCL - слой клеток сетчатки нервных волокон слой/ганглия, GC: клеток ганглия. Фигуры A-C адаптировано из Sarzi и др. 9. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Системе OCT, неинвазивная в vivo imaging метод, обеспечивает высоким разрешением сканирования сетчатки кросс-секторальная-как. Таким образом ее главным преимуществом является ее потенциал для детального анализа, прекрасная возможность транспонировать протоколы обычно применяется для людей мыши модели.
В этом примере Opa1delTTAG мутантных мышей SD-Окт результаты показали увеличение толщины RNFL и GC комплекс слоя, что позволило для дальнейшего изучения патофизиологии DOA9. Было бы не возможно исключительно с гистологический анализ. В сравнении гистология не предоставляют возможность визуализации всего сетчатки, в отличие от кольцевых и радиальных OCT сканирования. Кроме того он является более длительным и дорогостоящим, учитывая увеличение числа животных в исследованиях с несколькими моментами времени. В самом деле SD-Окт проложили путь к вину новый тип клеток сетчатки в DOA, Мюллер ячейку9. Это было сделано несмотря на тот факт, что одноклеточных резолюции ни идентификация конкретных клеток возможны с системой. Напротив ориентированных на толщину и/или общих ориентированных государственных околососковой области является анализ во многом достаточно, чтобы обнаружить сотовой ухудшения. Дополнительные исследования с гистология затем может проводиться с четкое представление о том, что искать. Таким образом тот же метод может применяться для оценки терапевтических вмешательств, чтобы предотвратить или затормозить дегенерации сетчатки.
Для дальнейшего повышения полезности OCT, домашние суппортами были разработаны и имел гораздо более высокой точностью, чем стандартные. Несмотря на то, что стандарт толще, чем RNFL/GCL, некоторые команды использовать его так или иначе, но для крупных слоев13. Здесь мы уделили сравнительный анализ РГК в 10 радиальные сканирований в сетчатке, все в околососковой области. RNFL только не поддающихся измерению радиальные сканов в любом случае. Этот уровень был слишком тонкая и расплывчатым; Таким образом вместо измерялись RNFL GCL и комплекс слой GC. В то же время нам удалось в измерении с использованием кольцевого сканирования, которые оказались полезными для мыши фенотипа RNFL. Однако надежность может быть спорным. В всех этих подходов важнейшим шагом было по центру сканирует на БЕЙКЕ и визуализировать сетчатки без теней и помутнения. Бывший может быть легко регулируется следующие шаги протокола с точки зрения позиционирования сетчатки. Последний зависит прозрачность роговицы и кристаллических. Например если глазной гель распределяется неравномерно, сканирования размытые или сетчатки появляется Бент. Чтобы исправить это, было бы достаточно, чтобы должным образом повторно применять гель. Если кристаллическое непрозрачное, сканирования темные или неполными. Решением здесь будет повторить сканирование еще один день, если возвращает прозрачность кристаллический. Еще одна возможная причина плохого качества сканирования является наличие препятствий, таких как усы или ресницы. Они могут быть легко удалены путем выделения и применения немного глазной гель держать их на месте. Другие аналитические подходы, которые различаются с точки зрения тип оборудования, типа проверки, угол и другие параметры также существуют и имеют разное количество анализируемых изображений. Это необходимо учитывать, если качество результата до сих пор не является удовлетворительным. Например Лю et al. взял радиальные сканирование нескольких углов13, по сравнению с нашей радиальные сканирует только в одном, отчетности немного толще слои. Тем не менее приобретение OCT и аналитических подходов, предложенных в этой рукописи, подходят для анализа РГК в сетчатке околососковой мыши.
В заключение Октябрь — это технология, с большим потенциалом. Это позволяет выявлять тонкие изменения в структуре сетчатки — включая РГК, особенно в отношении OPNs — и оказывается незаменимым для видения науки. Таким образом представленный протокол является практичным для OPN мыши модель фенотипа, а что касается оценки Роман терапии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Inserm, университет Монпелье, Франция сетчатки, Союза национальных des Aveugles et Déficients Visuels (UNADEV), Ассоциация синдром де Wolfram, Фонд налить la Recherche сообщала, Фондасьон де Франс и лаборатории передового опыта EpiGenMed программа.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| Opa1delTTAG mouse | Institute for Neurosciences in Montpellier, INSERM UMR 1051, France | - | Opa1 knock-in mice carrying OPA1 c.2708_2711delTTAG mutation on C57Bl6/J background |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | - | Spectral-Domain Optic Coherence Tomography system |
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software | Bioptigen, Leica Microsystems, Germany | - | Software for OCT acquisition and analysis |
| ImageJ 1.48v | Wayne Rasband, National Institutes of Health, USA | - | Software for analysis, requires downloading and installing two hommade macros: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool |
| Self-regulating heating plate | Bioseb, France | BIO-062 | Protection against hypothermia |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies | |||
| Nose Band | - | - | Elastic band |
| Gauze pads 3" x 3" | Curad, USA | CUR20434ERB | Protection against hypothermia |
| Dual Ended Cotton tip applicator | Essence of Beauty, CVS Health Corporation, USA | - | Gel application |
| Cotton Twists | CentraVet, France | T.7979C.CS | Mouse positioning |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Drugs | |||
| Néosynéphrine Faure 10% | Laboratoires Europhtha, Monaco | - | Eye dilatation |
| Mydriaticum 0.5% | Laboratoires Théa, France | 3397908 | Eye dilatation |
| Cebesine 0.4% | Laboratoire Chauvin, Bausch&Lomb, France | 3192342 | Local anesthesia |
| Imalgene 1000 | Merial, France/CentraVet, France | IMA004 | General anesthesia |
| Rompun | Bayer Healthcare, Germany/CentraVet, France | ROM001 | General anesthesia, analgesia, muscle relaxation |
| NaCl 0.9% | Laboratoire Osalia, France | 103697114 | Physiological serum |
| Systene Ultra | Alcon, Novartis, USA | - | Hydration of eyes |
| GenTeal' | Alcon, Novartis, USA | - | Ophtalmic gel to minimize light refraction and opacities |
| Aniospray Surf 29 | Laboratoires Anios, France | 59844 | Desinfectant |
References
- Drexler, W., Fujimoto, J. G. State-of-the-art retinal optical coherence tomography. Prog Retin Eye Res. 27 (1), 45-88 (2008).
- Grenier, J., et al. WFS1 in Optic Neuropathies: Mutation Findings in Nonsyndromic Optic Atrophy and Assessment of Clinical Severity. Ophthalmology. 123 (9), 1989-1998 (2016).
- Zmyslowska, A., et al. Retinal thinning as a marker of disease progression in patients with Wolfram syndrome. Diabetes Care. 38 (3), e36-e37 (2015).
- Fischer, M. D., et al. Noninvasive, in vivo assessment of mouse retinal structure using optical coherence tomography. PLoS One. 4 (10), e7507 (2009).
- Grieve, K., Thouvenin, O., Sengupta, A., Borderie, V. M., Paques, M. Appearance of the Retina With Full-Field Optical Coherence Tomography. Invest Ophthalmol Vis Sci. 57 (9), OCT96-OCT104 (2016).
- Chang, B., et al. Retinal degeneration mutants in the mouse. Vision Res. 42 (4), 517-525 (2002).
- Mustafa, S., Pandit, L. Approach to diagnosis and management of optic neuropathy. Neurol India. 62 (6), 599-605 (2014).
- Sarzi, E., et al. The human OPA1delTTAG mutation induces premature age-related systemic neurodegeneration in mouse. Brain. 135 (Pt 12), 3599-3613 (2012).
- Sarzi, E., et al. Increased steroidogenesis promotes early-onset and severe vision loss in females with OPA1 dominant optic atrophy. Hum Mol Genet. 25 (12), 2539-2551 (2016).
- Delettre-Cribaillet, C., Hamel, C. P., Lenaers, G., et al. Optic Atrophy Type 1. Gene Reviews. Pagon, R. A. 7 (2007), University of Washington. Seattle. (2007).
- Lenaers, G., et al. Dominant optic atrophy. Orphanet J Rare Dis. 7 (46), (2012).
- Delettre, C., et al. Nuclear gene OPA1, encoding a mitochondrial dynamin-related protein, is mutated in dominant optic atrophy. Nat Genet. 26 (2), 207-210 (2000).
- Liu, Y., et al. Monitoring retinal morphologic and functional changes in mice following optic nerve crush. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (6), 3766-3774 (2014).
