Summary
本発明者らは、味覚コーディングを研究する3つの新しい方法を提示する。単純な動物、 Manduca sexta（ Manduca ）を用いて、解剖プロトコール、複数の味覚受容体ニューロンの活動を記録するための細胞外テロドールの使用、および味物質の正確なタイミングパルスの送達および監視のためのシステムを記載する。
Abstract
味覚は動物が環境中の化学物質を検出することを可能にし、生存に不可欠な行動を引き起こします。味覚受容器ニューロン（GRN）が味覚分子を検出すると、脳内のフォロワーニューロンに伝播する電気活動のパターンとして、味覚物質の同一性および濃度に関する情報をコード化する。これらのパターンは味物質の内部表現を構成し、動物が行動を選択して記憶を形成することを可能にする。比較的単純な動物モデルの使用は、感覚コーディングにおける基本原則を研究するための強力なツールであった。ここでは、moth Manduca sextaを用いて練習コーディングを研究する3つの新しい方法を提案する。まず、軸索からのGRNの活性を記録することを可能にする、上顎神経および食道下領域（SEZ）を暴露するための解剖処置を提示する。第2に、細胞外電極を使用して、複数のGRNの活性を記録することを記載する上顎神経に直接ワイヤを通す。第3に、我々は、高い時間精度で異なる味物質のパルスを送達および監視するための新しいシステムを提示する。これらの方法は、味物質が送達される前、中および後で、GRNからのインビボでのニューロン応答の特性決定を直接的に可能にする。複数のGRNから記録された電圧トレースの例を示し、個々のニューロンの応答を特定するためにスパイクソート手法をデータにどのように適用できるかの例を示します。最後に、本発明者らの記録方法を検証するために、GRNから得られた細胞外記録をテトロドと比較し、シャープなガラス電極で得られた細胞内記録と比較する。
Introduction
味覚システムと嗅覚システムは、環境中の化学物質の内部表現を生成し、それぞれ味覚と臭気の認識を生じさせる。これらの化学感覚は、仲間や食事の発見から捕食者や毒素の回避に至るまで、生物の生存に不可欠な多くの行動を引き出すために不可欠です。プロセスは、環境化学物質が感覚受容細胞の原形質膜に位置する受容体と相互作用するときに始まる。これらの細胞は、直接またはニューロンとの相互作用を介して、化学物質の同一性および濃度に関する情報を電気信号に変換する。これらの信号は、高次のニューロンや他の脳構造に伝達されます。これらのステップが進むにつれて、元の信号は、感覚情報を検出し、識別し、分類し、比較し記憶し、適切な行動を選択する生物の能力を促進する変化を常に受ける。ブラジャーの仕組みを理解する環境化学物質に関する情報を変換することで、さまざまな作業を最善に実行することが、神経科学の基本的な問題です。
味覚コーディングは、比較的単純であると考えられている。味を引き出すすべての化学分子（「味覚」）は、約5またはそれ以下の基本味質（ すなわち、甘味、苦味、酸味）塩味、うま味） 1 。この「基本的な味」の観点では、味覚システムの仕事は、これらの基本的な嗜好のどれが存在するかを判断することです。さらに、神経系における基本的な味覚表現の根底にある神経機構は不明であり、「標識された線」2,3,4,5,6または「繊維横断パターン」 7によって支配されると考えられている、 8コード。標識されたラインコードでは、各感覚細胞およびその神経フォロアーの各々は、単一の味質に反応し、一緒にその味に特化した中枢神経系のより高い処理中心への直接かつ独立した経路を形成する。対照的に、横繊維パターンコードでは、各感覚細胞は複数の味覚特性に応答して、味覚物質に関する情報が感覚ニューロンの集団全体の応答によって表される。味覚情報が基本的な嗜好であるかどうかにかかわらず、ラベルされた線を介して、または他の何らかのメカニズムによって、不明瞭であり、最近の調査の焦点である3,8,9,10,11,12。私たちの最近の研究は、味覚システムが時空間集団コードを使って基本的な味のカテゴリーではなく個々の味の表現10 。
ここでは、味覚コーディングの研究を支援する3つの新しいツールを提供します。まず、味覚の電気生理学的研究に適した比較的単純なモデル生物としてのハクモス・マンジュカ・セクスタの使用を示唆し、解剖処置を記述する。次に、個々のGRNの活動を記録するために細胞外の「四極管」を使用することを提案します。第3に、我々は動物に正確に時間を合わせた鼓動を届けるための新しい装置を提案する。これらのツールは、私たちの研究室や他の研究者が嗅覚システムを研究するために使用した技術から適応されました。
ショウジョウバエ（Drosophila melanogaster ）、イナゴミツバチ （ Mist Manduca sexta）などの昆虫は、何十年もの間、ナルについての基本原則を理解するための強力な資源を提供してきた感覚コーディング（ 例えば、嗅覚13 ）を含む大脳系。哺乳動物において、味覚受容体は、複雑なセカンドメッセンジャー経路を介してニューロンと通信する特殊細胞である。昆虫ではより簡単です。味覚受容体はニューロンです。さらに、周辺の哺乳類の味覚経路は、比較的複雑であり、複数の平行な神経経路を特徴とし、重要な構成要素は、小さな骨構造15に含まれるアクセスするのが難しい。昆虫の味の経路はより単純に見える。昆虫では、GRNは、アンテナ、口、翼および脚16,17に位置する、感覚器として知られる特殊な構造に含まれている。 GRNは、副食道ゾーン（SEZ）に直接投影され、その役割は主に味覚17と考えられており、2次味覚ニューロン10 。そこから情報が身体に届いて反射神経を駆動し、より高い脳領域に統合され、記憶され、最終的に行動選択肢を駆動する16 。
味覚情報がどのように伝播され、神経系全体にわたってポイントからポイントに変換されるのかを理解するために、末梢味覚応答を特徴付けることが必要である。昆虫におけるGRNの神経活動を直接的にモニターする最も一般的に使用される方法は、先端記録技術である12,18,19,20,21,22,23である。これは、感知器の上に電極を直接配置することを含み、その多くはアクセスが比較的容易である。味物質は電極内に含まれており、活性化および延長が可能であるsensillumにおけるGRNsのニューロン応答を測定する。しかし、味物質が電極に含まれているので、味物質が送達される前または除去された後にGRN活性を測定すること、または電極20を交換することなく味物質を交換することは不可能である。別の方法である「サイドウォール」記録技術も、GRNの活動を記録するために使用されている。ここでは、味覚センサ24の基部に記録電極を挿入し、味覚センサの先端にある別のガラスキャピラリを介して味物質を供給している。両方の技術は、GRNから特定の感覚器への記録を制限する。ここでは、新しいテクニックを提案します：異なる感覚器からの無作為に選択されたGRN軸索からの記録、別々に嗅覚器に一連の味覚物質を送達すること。軸索記録は、軸索を運ぶ神経に鋭利なガラス電極または細胞外電極束（四極管）を配置することによって達成されるSEZ 10への鼻腔内のGRN。 Manducaでは、これらの軸索は純粋に求心性であることが知られている上顎神経を横断し、感覚反応の明瞭な記録を可能にする25 。軸索から記録するこの方法は、一連の味わいのあるプレゼンテーションの前、中および後に、2時間以上にわたって、GRN応答の安定した測定を可能にする。
ここでは、SEZと一緒に上顎神経を曝露するための解剖手順を説明します。これにより、SEZ 10内の複数のGRNおよびニューロンの応答を同時に記録することができます。また、スパイクソート法と組み合わせると複数のGRNを同時に解析することができるカスタムメイドの4チャネルツイストワイヤーテトロードを使用したGRNの細胞外記録の使用についても説明します。我々はさらに、テトロドで作製した記録を、鋭い細胞内で作製した記録と比較する電極。最後に、味覚刺激を提供する新しい装置について説明する。多くの研究者が嗅覚研究で匂い物質を送達するために長い間使用されてきた装置から適応されたこの新しい装置は、咀嚼研究の利点を提供します：Stürckowらが開発した従来のマルチチャンネル送達システム（参考文献26,27参照）このタイミングの電圧読み出しを提供しながら、味のある供給のタイミングを制御する。それは複数の味覚刺激10の迅速で連続的な送達を可能にする。装置は、一定の流量の清浄な水の中に鼻腔を浸し、制御された耳の鼓動を送達することができる。それぞれの鼓動は頸部を通過して洗い流されます。味は味のない食べ物の着色を少量含んでおり、正確なタイミングで味わいのあるov鼻腔があります。
Protocol
注意： Manducaによって放出される細かい粉状の鱗はアレルギー性である可能性がありますので、実験室の安全手袋とフェイスマスクの使用を推奨します。
1.上顎神経とSEZを明らかにするManduca sextaの解剖
- 以下の特徴に基づいて、どちらかの性別の適切な蛾を選択してください：一般的な健康的な外観（翼は十分に伸ばして、頸部および腱は無傷でなければならない）で腐敗した3日後。
- 輸送のために、プラスチックカップに個別に蛾を置きます。
- 蛾をポリプロピレンチューブに挿入します。
注意：私たちは、蛾の粉鱗が広がらないように、煙霧フードでこの手順を実行することをお勧めします。- チューブは蛾の体より少し長くする必要があります（ 図1A ）。チューブは、15mLポリプロピレンチューブを切断することによって作製することができる。 <li>頭部が露出するまで蛾を押し、チューブの他端にボールアップしたティシューペーパーを挿入して、蛾を動かないようにします（ 図1A ）。
- エアージェットは、シリンジ（1mLのニードル、ID約1.4mm、鋭い先端を除去したもの）を加圧空気源に接続することによって行うことができる。
注意：髪を除去した後、以下のすべてのステップをヒュームフードの外側で行うことができます。
- ペトリ皿上で、モデリング粘土を使用して、長さ約7cm、高さ2.5cmの三角形の基部を構築する（ 図1B ）。
図1 ： マンデュカの解剖チャンバーの準備。 （ A ）チューブに蛾が拘束されている。頭部は一方の端部に露出され、他方の端部はティシュペーパーで塞がれる。 （ B ）ペトリ皿と造形粘土から作られた解剖室が示されている。頭部の背部が上を向いている。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
- アンテナと鼻腔を保護する。
- カミソリの刃でピペットチップ（黄色の先端、1-200μL）を約0.5cmの長さの3つの断片に切断して3本の小さな管を準備する。内径は、アンテナと鼻腔がぴったり合うように十分大きくなければなりません。
- フックを準備するワイヤーを曲げる（約7cmの長さの22AWG）。コップの近位部に達するまで、ワイヤーフックでワイヤーを引っ張って、蛾の吻を伸ばして小さなチューブの1つに挿入します。
- 小さなチューブをしっかりとしたバティックワックスで固定します（例えば、歯科用電気ワックスを使ってワックスを溶かして、蛾の頭部カプセルの背部に固定します ）。
- 各アンテナをチューブに入れ、 図2A （左）に示すようにバティックワックスでチューブを固定します 。ホットワックスでアンテナを損傷しないように注意してください。
- 脳の前面（ すなわち、頬側のコンプレッサー筋肉）を覆う筋肉を切断することによって、脳の動きを安定させる。
- 解剖顕微鏡の下で、マイクロ解剖はさみまたは爪楊枝に接着されたかみそりチップから作られたミニアックスを使用して、マック（ 図2A 、左上の挿入図）。
- 頬側コンプレッサーの筋肉を切断するには、マイクロ解剖はさみを使用します（イラスト25参照）。筋肉が容易に見えないので、筋肉が切断されたことを確認するために以下の行動テストを推奨する。
- スクロースを蒸留水で希釈して1M溶液を得る。
- 約200μLのスクロース溶液をピペットで遠位2/3まで送達し、5分間観察する。筋肉が適切に切断された場合、昆虫は鼻腔を伸ばしたり動かすべきではありません。
- 溶かしたバティックワックスの層を塗布して、ヘッドカプセル内の開口を密封する。
- 昆虫をひっくり返して、ヘッドカプセルの腹側が上になるようにします。
- 解剖の手順中および後に生理食塩水を灌流するために、頭の腹側の周囲にワックスカップを構築する電気ワックス：解剖顕微鏡の下で、頭の前部に沿ってワックスの最初の列を、後ろに向かって動かすことによってカップを構築し始める。鼻と管のチューブをカップの中に入れておきます （ 図2A右）。
- 目の高さに達するまで、カップを外側に上向きに構築し続けます。
- 鉗子を使用して、2つの唇のパルプの1つを取ってから、それを側面に置き、より融解したワックスを加えてワックスカップに固定します。もう一方の上顎骨（ 図2A右）と同じことをします。
- ワックスカップとチューブの開口部をシールします。
注記：このステップでは、ワックスとチューブの隙間を簡単にシールするのに役立ち、アンテナや鼻腔への熱に関連する損傷を避けるため、エポキシが使用されます。- プラスチック製混合皿に二成分エポキシを混ぜるために爪楊枝を使用してください。混合ディッシュを保持する。
- 薄いものを適用するために爪楊枝を使用するエポキシの層をカップの外側および内側に配置する（ 図2B ）。
- プローブとアンテナを含むチューブの空いている部分をエポキシで満たし、エポキシをしっかりと保持するために首を囲むポリプロピレンチューブの部分をしっかりと固定します （ 図2B ）。
- エポキシを約20分間乾燥させたままにしておきます。これを確認するには、プラスチック混合皿に残っているエポキシをテストして、固体であり、もはや粘着性でないことを確認します。
- Manduca生理食塩水28でワックスカップを満たし、漏れがないことを確認するために数分待ってください。漏れが見える場合は、より熱いワックスやエポキシを塗布して密閉してください。
図2 ： Manducaの準備</ em>をクリックします。 （ A ）約0.5cmの長さの3つの部分に切断したピペットチップから作られた小さなチューブの内側で、アンテナと胸部を保護します。 （左パネル、大きな画像）チューブは、頭部の背部周辺に適用された溶かしたバティックワックスで固定されています。 （左パネル、インセット）頬側コンプレッサー筋肉を除去するために、大きな画像の点線で示されるように小さな切れ目をつけて頭部カプセルの背側を開く。 （右側のパネル）解剖手順および記録実験の間、灌流された生理食塩水のためのリザーバとして、頭の腹側を囲むワックスカップが構築される。 （ B ）エポキシは、ワックスカップの基部と頭部の背部（左パネル）との間の隙間をシールするために使用され、ワックスとアンテナと鼻腔を含むチューブ（チューブの開口部を含む） ）。 ここをクリックしてくださいoこの図のより大きなバージョンを見る。
- 解剖顕微鏡の下で、唇の触角を切断するためにマイクロ解剖はさみを使用してください。
- 頭蓋骨の腹側を開くには、マイクロ解剖はさみまたはミニアックスを使用して、4つのカットを作成します：各目を前後に囲むキューティクルに沿った2つのカット、1つは頭の後ろに沿ったクチクラのカット、 （ 図3A ）の頭の前部に沿ってキューティクルを切断します。
- 静かに脳を露出させるためにマイクロ解剖鉗子を使用してキューティクルを引っ張ってください。
- 2つの鋭いマイクロ解剖鉗子を使用することにより、ゆっくりと注意深く脂肪組織とSEZを覆う気管を取り除く。脳や神経の損傷（例えば、上顎神経、視神経、頸部結合）を避けてください。生理食塩水を頻繁に交換して脳をすすぎ、視界を改善するために頻繁に光を調節する。注：これはdiの最も重要な部分かもしれないセクション。誤って上顎神経を掴んだり破砕したりすることによってうっかり損傷することは容易である。
注意：この時点で、SEZと上顎神経ははっきりと見えるはずです（ 図3B -3C ）。しかし、脳と上顎神経は薄い鞘で覆われています。 - シースを取り外すには、ワックスカップの生理食塩水を生理食塩水に溶解した10％（w / v）コラゲナーゼ/ディスパーゼで置き換え、5分間そのままにしておきます。その後、生理食塩水で数回脳をすすいだ後、SEZから上顎神経を通ってシースを引き上げることにより、超微細微細解剖鉗子で鞘を静かに除去する。
- ワックスカップを新鮮な生理食塩水で灌流させ始める。チューブを生理食塩水滴ラインからワックスカップに入れ、そこに融解したワックスで固定する。
イチジクure 3 ： マンドカの解剖手順。 （ A ）唇側パップを除去し、点線で示すように4回の切開を行って頭部カプセルを開く。 （ B ）頭嚢を開いて脂肪組織と気管を取り除いた後の脳の拡大像で、上顎神経（MxNs）と下食道領域（SEZ、脳の下の脳の領域を指す言葉食道）。上顎神経は、鼻腔内の味覚受容体ニューロン（GRN）からSEZまでの軸索を運ぶ。 （ C ） マンデュカ脳の略図。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
2.味覚伝達システム
- 味のあるデリバリーシステムは、4つの主要な要素から構成されています：水源、味の多いマニホールド、カラーセンサー、（ 図 4A〜4B ）、すべて硬いプラスチックチューブに接続されています。このシステムを構築するには、 図4Bに示す手順に従います。長さ約6 cm（ID 0.3 cm）の硬質プラスチックチューブを使用してください。
- プローブを置く予定のチューブにはんだごてを使用して小さな穴をあけてください（ 図4A -4B ）。
- 異なる動物の睾丸が常に同じ場所に配置されるようにするために、プラスチックのスクリーニング材料（メッシュ、約0.1cmの穴のサイズ）をチューブに取り付ける （ 図 4A〜4B ）。カミソリの刃や回転工具で硬いチューブを頚部の穴の約5 mm上に切断します。チューブの2つの部分の間にメッシュを置きます。メッシュを固定し、チューブの外側にエポキシを塗布してチューブを再接続します。エポキシを約20分間乾燥させたままにしておきます。
- 味のある送達のためには、必要に応じて多くの味チューブを備えた灌流システムをマニホールドに接続します（下記参照）。はんだこてを使用して、メッシュの上約1cmの剛性チューブに小さな穴を開けます。灌流システム（ID 0.86 mm）からの出力チューブを剛性チューブに挿入し、エポキシを適用することによって固定します （ 図4A -4B ）。
- 蠕動ポンプを使用して、一定流量（〜40 mL /分）の蒸留水を送達します。シリコンチューブで剛性チューブに接続します（ 図4A〜図 4C ）。剛性チューブのもう一方の側を別のシリコンチューブに接続して、大きな廃棄物容器に出力を向ける（ 図4A〜図 4C ）。
- 味を出すには、灌流システムのマニホールドに圧縮空気を注入します。これは、例えば、圧縮空気をマニホルに注入するための時間調整された電圧パルス入力によって制御される空気圧ポンプ（10psi）を使用することによって達成することができる所望の味物質を含むdチューブ。 1秒のパルスは約0.5mLの味を放出する。
3.味覚の準備と味の配達の監視
- 蒸留水で味を所望の濃度に希釈する。味物質は水の流れによってさらに希釈されることに注意してください。鼻腔に到達する最終濃度を初期濃度の77％として測定した（参考文献10,29参照）。
- それぞれの味のある溶液に人工食品の色素を加えて、味覚物質が鼻腔を通過する正確なタイミングを決定できるようにします。我々は、0.05％（w / v）の緑色染料（ マテリアルリスト参照）がマンデュカ GRNを活性化しないことを見出した。
- 味のある溶液の食物着色を検出するには、カラーセンサー（表1参照）を使用します。はんだごてを使用してメッシュに隣接し、灌流システムの出力チューブの下0.5cmの穴を作る s = "xfig">図4A-4B）。センサーを剛性チューブに接続し、外側にエポキシを塗布して固定します。
- カラー信号電圧出力を生理信号とともにアナログ信号として記録する（セクション4参照）。カラーセンサ電圧信号は、センサに接続されたDCアンプを使用して増幅できます（ 図4A ）。
- 味を出してセンサーの電圧出力を記録することで、カラーセンサーが作動していることを確認してください。色素によって誘発されたシグナルは、ノイズレベルを超えなければならない。
- 信号をできるだけ正方形に近づけるように一定の水流量を調整します。
注：複数の味を順番に提供する場合は、新しい味を使った最初の試行に、新しい味と前の味のブレンドが含まれていることに注意してください。このため、これらの第1試行は分析しなかった。
- 信号をできるだけ正方形に近づけるように一定の水流量を調整します。
図4 ：味覚伝達システム。 （ A ）動物の頸部に味物質のタイミングパルスを送達し、監視するために使用される装置の概略図。システムの主な構成要素は赤色の数字で示されています。硬質プラスチックチューブ（1）にシリコーンチューブで接続された蠕動ポンプにより、鼻腔を横切って一定の流量の蒸留水が維持され、鼻腔が配置される（6）。少量の味のない色素を含む味物質は、加圧された16チャネルの灌流システムを用いて送達される。味物質を含むリザーバは、硬管に取り付けられたマニホールド（2）に、鼻腔が配置される穴の上に接続される（5）。空気圧ポンプからの圧縮空気を灌流システムに注入して、カスタムソフトウェアによって制御されたタイミングで味覚を迅速に送達する。 A色センサ（3）を使用して味覚伝達を監視する。センサは、尾部に隣接し、灌流システムの出口の下にある剛性チューブに接続される。カラーセンサ電圧信号は、DC増幅器によって増幅される。アンプに隣接するインセット上の赤いトレースは、カスタムデータ収集ソフトウェアを使用して記録された色信号を示しています。信号の急速な増加と減少はそれぞれ味物質の到着と洗い流しを反映する。蛾の胸部をカラーセンサーの真下にある穴（5）に入れます。穴の上にメッシュ（4）を配置して、異なる動物の生殖腺が常に同じ場所に配置されるようにします。剛性チューブの他方の側は、別のシリコンチューブに接続され、出力を廃棄物容器（7）に導く。 （ B ）硬質プラスチックチューブに接続された味覚伝達システムの主要な要素を示す画像であり、パネルAに示す赤色の数字で示されている：水（2）、カラーセンサ（3）、メッシュ（4）、および頚部が挿入される穴（5）のすべてが剛性プラスチックチューブ（1）に接続されている、 。 （ C ）セットアップへのManduca調製物の配置が示されている。蛾の胸郭の遠位t2 / 3は、硬質プラスチックチューブ（1）の穴（5）に導入される。歯冠は、挿入図に示すように歯科用ワックスとエポキシで固定されています。硬質管への水の投入量と廃棄物容器への排出量は、それぞれ番号6と7で示されています。番号2は、味わいのあるマニホールド出力チューブを示します。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
4. GRNからの味覚誘発活性をモニターするための細胞外Tetrode記録
- 振動上の実体顕微鏡下のプラットフォーム上に蛾の準備をする（ 図4C ）。
- 蛾の吻の遠位の3分の2を味のあるデリバリーシステムの硬いチューブに入れます（ 図2B ）。これを行うには、蛾の吻を伸ばし、ドレッシング鉗子の助けを借りて軽く押して、硬いチューブの穴に挿入します。柔らかい歯科用ワックスを塗布し、漏れを防ぐためにエポキシの層を貼り付けます（ 図4C 、注入口）。
- 生理食塩水灌流ラインを頭部カプセルに接続し、灌流を約0.04L / hの一定速度に設定する。
- 接地電極（塩素化銀線）を生理食塩水に浸します（ 図5A ）。
- 30で説明されている製造手順に従って作られたカスタムメイドのツイストワイヤーテトロードを使用してください（4本の電極ワイヤーは、よく分離されたユニットを達成し、神経）。実験の前に、 30で説明した手順に従って電極を電気めっきします。
- 手動のマイクロマニピュレーターを使用して四肢を上顎神経の近くに配置する。四極管が神経に入るようになるまで前進させます （ 図5 ）。
- 記録する前に神経内で安定するようにtetrodeを配置した後、少なくとも10分間待つ。
- 信号（3000x）を増幅し、0.3-6kHzの間に設定されたバンドパスフィルターを使用してください。データ収集ソフトウェアを使用して40 kHzのサンプリングレートで信号を取得します。
- 実験終了後、蛾の調製物を冷凍庫に入れます。
図5 ：GRNからのTetrode記録。 （ A 、大きな画像）マイクロマニピュレーターを用いてpGRNの活動を記録するために、捻転したワイヤの四極線を上顎神経（MxN）に縛る。塩化銀電極を図示のように食塩水槽に入れる。 （ A 、インセット）上顎神経の四肢を示す脳の拡大画像。食道下区域（SEZ）も示されている。 （ B ）A.のように指向されたマンデュカの脳の回路図。この図の拡大版を見るにはここをクリックしてください。
Representative Results
GRNの活性は、味覚送達の前、間および後に細胞外四極電極を用いて記録することができる（ 図6Aおよび6C ）。 図6A （中および下のパネル）は、上顎神経に配置された4本のワイヤーのそれぞれによって記録されたフィルターされた（300-6,000Hz）電圧トレースを示し、活動電位（矢印）を反映する異なる振幅の信号が観測される。試験開始後2秒後に味物質（1 Mショ糖）の1秒パルスを送達した。刺激の開始およびオフセットを、カラーセンサ（ 図6A 、上部パネル）によってモニターした。 4つのチャネルのそれぞれにおいて観察され得る味覚誘発スパイク（ 図6A 、中央パネル）。 GRNは、いくつかの味物質に応答する場合、メカノセンサー（ここに示されていない）と識別され、区別され得る tetrode記録から単一のニューロン応答を同定し単離するために、我々は、Pouzat 31およびKleinfeldの32,33方法（これらの方法はこれらの引用文献に記載されている：10,29）に基づく一連のカスタム関数を用いてオフラインスパイクソーティングを行った。 図6Bは、 図6Aに示すデータに適用されたスパイクソーティングの例を示し、3つの孤立したユニットが見出された。 図6Cのラスタプロットは、 図6Bの 3つの単離されたユニットの応答を、6つの異なる味物質（1Mショ糖、マルトースおよびNaCl; 100mMカフェインおよび10mMベルベリンおよびロブライン）s / tastantが示されている）。 図6Cに示すように、記録されたGRNは、サイレント（GRN 1）から低または中程度（GRN 2および3）の範囲で異なるベースライン活動レベルを有する。劇的な発症後、GRNは多様な活性パターンを示し、味物質に対して異なる選択性を示す。例えば、GRN1はスクロースにのみ応答し、一方、GRN2はマルトースおよびNaClにスパイクのバーストを伴って応答し、刺激の開始時にのみスパイクを伴うロブラインに応答した。さらに、いくつかの応答は、刺激の持続時間（ 例えば 、ショ糖に対するGRN1応答）に固定され、他の応答は刺激の持続時間より長く（ 例えば 、ベルベリンに対するGRN3応答）、または興奮性および阻害性成分GRN 2はNaClおよびスクロースに応答する）。 GRNの多様な感受性および活性パターンの詳細については、参考文献10を参照のこと。 図7 ）。パネルAの緑色ボックス内の電圧トレースは、ショ糖提示の5回の連続した試験中にGRN1から細胞内に記録され、同じ反応はパネルBのラスタプロットとして示されている（このタイプの応答は四極および図6Cに示される）。鋭い細胞内電極で記録されたGRN2は、より広い応答パターンを示す。 
図6： 細胞外Tetrodesを伴う上顎神経記録からの代表的な結果。 （ A ）上顎神経の4本のワイヤの各々によって記録されたフィルタリングされた（300-6,000Hz）電圧トレースが示されている（中央パネル）。中央のパネルに赤色の陰影が付いている期間中、味覚物質の1秒パルスを印加した。刺激の開始およびオフセットは、上部パネル上の赤色電圧トレースによって示されるように、カラーセンサによってモニタされ、赤色陰影領域によって中間パネルに示されている。点線の水平線は、+ 50（上）、0（中）および-50（下）μVを示す。縦の点線内の領域に対応する生の電圧トレースの拡大が示されている（下のパネル）。スパイクの例は矢印で示されています。 （ B ）パネルAに示されたデータに適用されたスパイクソーティングの一例.4つの細胞外ワイヤー（1-4）の各々に記録された波形eは、記録された信号に寄与する3つの異なるGRN（ユニット1〜3）で識別される。 3つのユニットの個々のイベント（細い線）と平均（太い黒い線）が示されています。スパイクソート法（参考文献10,29参照）を用いて、独立したユニットを確実に識別するためには、いくつかの統計的基準を考慮する必要があります。 （ C ）3つの孤立したユニットの反応を6つの異なる味物質（4つの試験/味覚物質が示されている）に示すラスタプロット。味覚送達の期間（1秒）は、赤色の陰影を付けた領域によって示される。味物質の濃度は、1M（スクロース、マルトース、NaCl）、100mM（カフェイン）および10mM（ベルベリンおよびロブライン）のいずれかであった。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。 lass = "xfigimg" src = "/ files / ftp_upload / 55868 / 55868fig7.jpg" />
図7 ：GRN軸索からの細胞内記録。 （ A 、緑色ボックスパネル）1Mのスクロース（Suc）で5回連続して刺激することにより誘発された、鋭いガラス細胞内電極（抵抗80〜120MΩ）を有するGRNから記録された電圧トレース。 （ B ）シャープなガラス細胞内電極を用いて記録した2つの異なる味物質（100mMの灰色のフォント色; 1Mの黒色）にパネルA（緑色のボックスパネル）で示された応答を含む2つのGRNの応答のラスタプロット上顎神経に配置された（7回の試行/味覚および3回の試行/水が示されている）。味わい深い納品時間は、両方のパネルの赤い陰影のある領域によって示される。刺激の開始およびオフセットは、各パネルの下部に赤色の電圧トレースによって示されるように、カラーセンサによって監視された。es / ftp_upload / 55868 / 55868fig7large.jpg "target =" _ blank ">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
Discussion
本明細書に記載の方法は、比較的単純な動物Manduca sextaからのインビボでの記録が、長期間にわたって（2時間以上）、味覚送達の前、最中および後に複数の無作為に選択されたGRNの活性を特徴付けることを可能にする。これらの方法はまた、正確な時間制御を有する複数の味覚刺激の迅速で連続的な送達を可能にし、味覚表現の基礎となる神経機構を研究するのに有用である。このプロトコルは、シナプス後の標的ニューロン（ 例えば、 SEZ）に伝達されたときにGRNを単シナプスで接続された介在ニューロンと同時にモニタリングすることによって、GRNの味物質への応答がどのように変化するかを研究するために用いられているさらに、これらの方法は、実験者のニーズに適合させることができ、複雑なパラダイムの実行が味覚コーディングの基本的な側面を研究することを可能にする。
beginnin私たちの研究では、トラブルシューティングが必要な技術的な問題の1つは、四極線で上顎神経からのスパイク信号を検出できないことでした。この解剖プロトコールは困難であり、良好な準備を得るためにはいくつかのプラクティスが必要であるため、これに対する考えられる原因は多様である。第1に、蛾の解剖の間、上顎神経は、特に神経組織を取り囲むシースの除去中に損傷することが容易である。第2に、シースが完全に除去されない場合、四極線は神経にアクセスできない可能性がある。どちらの場合も、新しい準備を開始することは、これらの問題を解決する最も簡単な方法です。第三に、四極ワイヤに問題があるかもしれない。これは、1kHzで〜270kΩになるはずのワイヤのインピーダンスを測定することによって確認できます。インピーダンス値が〜300kΩを超える場合は、ワイヤを金で電気めっきして、所望のインピーダンスにします（参考文献30を参照）。第4に、機器が誤って接続されている可能性がありますまたは誤動作。
別の考えられる問題は、スパイク信号が記録されるがニューロンは味物質に応答しないように見えることである。これは、記録されたニューロンが、送達された味覚物質のセットに対して感受性がないためであり得る。また、GRNの軸索に加えて、上顎神経もまた、機械感覚線維を運ぶことを覚えておくことが重要である。したがって、GRNの代わりに、またはGRNに加えて、機械感覚ニューロンから記録することが可能である。しかしながら、味のある送達システムは実験を通じて一定の機械的入力を提供するように設計されているため、味物質に対する応答は送達の機械的構成要素に対する応答によって混乱することはない。いくつかの他の味覚物質に反応するニューロン、または異なる味物質に異なる方法で応答するニューロンは、GRNとして明白に分類することができる。化合物の分解または蒸発による味物質濃度または組成の変動を避けるために、新たに希釈した味物質を使用することを推奨しますの溶媒を含む。また、チューブの汚れや詰まりを避けるため、システムを定期的に清掃することをお勧めします。
別の可能な技術的問題は、不利な信号対雑音比である。この問題は、しばしば、浴の接地電極の位置を再塩素化または調整することによって解決することができる。他の解決策では、装置内の各電気的接続の長さを遮蔽し最小限に抑える必要があるかもしれない。
最後に、テトロード記録を使用して得られたデータの正確な分析には注意深いスパイクソートが必要であることに注意することが重要です。我々は、完全自動化された方法は一般的に不十分であることを発見した。四極データ10,29,31,32,33を分析する前に、スパイクソートの文献に精通することをお勧めします。
私たちの解剖プロの代替トコールを使用することができます。ここでは、蛾の頭の腹側部分を切開し、上顎神経およびSEZへのアクセスを提供するが、背側を通ってこれらの構造にアクセスすることも可能である。私たちは背側の準備が深い場所のためにこれらの味覚構造から録音するのに最適ではないことを発見しましたが、この準備はマッシュルーム本体のような高次構造からの録音を可能にする利点を提供します感覚統合、連合学習、記憶処理34 。我々は、上顎神経から記録するために四極電極の使用に焦点を当ててきたが、図示のように、標準的な細胞内の鋭い電極もこの目的のために使用することができる。さらに、両方の技術を組み合わせて、複数の脳領域10からの同時記録を行うことができる。神経科学文献には、昆虫と脊椎動物の両方35,36,37,38,39 に適用される、嗅覚コーディングのような感覚処理の基本原理を明らかにするための強力なツールであることが証明された無脊椎動物モデル。私たちのメソッドが味覚コーディングについての基本的な新しい洞察につながることを願っています。
Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
この作業は、NIH-NICHDからMSへの教室グラントによってサポートされました.NATH-NIMH Instrumentation Core FacilityのG. DoldとT. Talbotに感謝の意を表します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection and Specimen Preparation | |||
| Polypropylene tube, 15 mL Falcon | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Needle, Short bevel, 19 G x 1 - 1/2" | MONOJET | 888200144 | For applying air to remove the hair from the moth. |
| Modeling Clay-Van Aken Plastalina | DickBlick | 33268 | |
| Petri dish -100 x 15 mm | VWR International | 89000-304 | |
| Pipette tip (1 - 200 µL) | USA Scientific | 1111-0806 | |
| Razor blade | Techni Edge | TE05-071 | |
| 22 AWG standard hookup wire | AlphaWire | 1551 | For inserting the proboscis into the pippete tip. |
| Batik wax | Jacquard | 7946000 | |
| Electric waxer | Almore International | 66000 | |
| Stereo Myscroscope | Leica | MZ75 | |
| Dumont #1 forceps (coarse) | World Precision Instruments | 500335 | For removing fat and non-nervous tissue. |
| Dumont #5 titanium forceps (fine) | World Precision Instruments | 14096 | For removing fat and non-nervous tissue. |
| Dumont #5SF forceps (super-fine) | World Precision Instruments | 500085 | For desheathing the nervous tissue. |
| Vannas scissors (fine) | World Precision Instruments | 500086 | For removing the cuticle. |
| Collagenase/Dispase | Sigma-Aldrich | 11097113001 | |
| Epoxy | Permatex | 84101 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline Perfusion System | |||
| Extension set with rate flow regulator | B Braun Medical Inc. | V5200 | |
| IV administration set with Y injection site | B Braun Medical Inc. | V1402 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tastant Delivery System | |||
| White Translucent Nylon Tubing OD 1/4", ID 1/8" | Small Parts Inc. | B001JJT4SA | Rigid tube that connects the four main elements of the system. |
| Soldering iron | Circuit Specialists | ZD200BK | |
| Rotary tool-Dremel | Dremel | 4200 | |
| Polypropylene mesh, hole size (hole size 0.1 x 0.13 cm) | Industrial Netting | XN5170 | For ensuring that the probosises of different animals are placed in the same location. |
| Pressurized 16-Channel perfusion system | Bioscience Tools | PS-16H | For tastant delivery. This system includes pinch valves, tubing, manifold, solution cylinders, valve controller and fitting accessories. |
| Polypropylene tubing, ID 0.034", ID 0.050" | Becton, Dickinson & Co | 427421 | Output tube from the perfusion system. |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For controlling the output channel of the perfusion system. |
| Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card | National Instruments | LabVIEW 2011 | To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor. |
| Compulab 3 Manostat peristaltic pump | Sigma | P1366 | For pumping water. |
| Silicone tubing, ID 1/16" OD 1/8" | Cole-Parmer | WU-95802-02 | To connect the water source to the peristaltic pump tubing, and the outlet tube of the pump to the rigid tube of the delivery system. |
| Color sensor-digital fiber optic sensor | Keyence | FS-V31M | For monitoring tastant delivery. |
| Color sensor-reflective fiber unit | Keyence | FU35-FZ | To connect the color sensor device. |
| Dental periphery Wax | Henry-Schein Dental | 6652151 | To secure the proboscis into the rigid tube. |
| Two 3.7 L containers | To provide water to the system, and to recollect the water waste. | ||
| Fast green FCF | Sigma | F7258 | |
| Dressing forceps 25.5 cm | WPI | 500364 | To introduce moth proboscis into the proboscis hole in the rigid tube. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electrophysiology Equipment | |||
| D.C. amplifier | Brown-Lee | 440 | |
| Lamp | Schott | Schott Fostec Light Source DCR 2 | |
| Manual micromanipulator | Leica | micromanipulator | To precisely insert the tetrodes into the animal's brain. The manipulator has to allow fine and coarse movements in x, y and z axis. |
| Stereomicroscope | Leica | MZ75 | |
| Vibration-isolation table (MICRO-g lab table) | TMC | 63-541 | |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2014 | |
| 16-channle pre-amplifier and amplifier | 16 Channel MA-800 Amplifier System | B.E.S 2013 | |
| Computer | Dell | optiplex 780 | The following are the minimum recommended requirements. RAM: 3.32 GHz, 3GB. Processor: Intel Core 2 Duo. Graphic card: integrated Intel GMA X4500. |
| Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card | National Instruments | LabVIEW 2011 | To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor and electrode. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tastants | |||
| KAc | Sigma-Aldrich | P5708 | |
| LiCl | Sigma-Aldrich | L9650 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 73575 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 |
References
- Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).
- Chen, X., Gabitto, M., Peng, Y., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. A Gustotopic Map of Taste Qualities in the Mammalian Brain. Science. 333 (6047), (2011).
- Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. Common Sense about Taste: From Mammals to Insects. Cell. 139 (2), 234-244 (2009).
- Mueller, K. L., Hoon, M. A., Erlenbach, I., Chandrashekar, J., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. The receptors and coding logic for bitter taste. Nature. 434 (7030), 225-229 (2005).
- Zhao, G. Q., Zhang, Y., et al. The receptors for mammalian sweet and umami taste. Cell. 115 (3), 255-266 (2003).
- Huang, A. L., Chen, X., et al. The cells and logic for mammalian sour taste detection. Nature. 442 (7105), 934-938 (2006).
- Pfaffmann, C., Carl, The afferent code for sensory quality. Am Psychol. 14 (5), 226-232 (1959).
- Lemon, C. H., Katz, D. B. The neural processing of taste. BMC Neurosci. 8 (Suppl 3), (2007).
- Barretto, R. P. J., Gillis-Smith, S., et al. The neural representation of taste quality at the periphery. Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).
- Reiter, S., Campillo Rodriguez, C., Sun, K., Stopfer, M. Spatiotemporal Coding of Individual Chemicals by the Gustatory System. J Neurosci. 35 (35), 12309-12321 (2015).
- Wilson, D. M., Boughter, J. D., et al. Bitter Taste Stimuli Induce Differential Neural Codes in Mouse Brain. PLoS ONE. 7 (7), e41597 (2012).
- Glendinning, J. I., Davis, A., Ramaswamy, S. Contribution of different taste cells and signaling pathways to the discrimination of "bitter" taste stimuli by an insect. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 22 (16), 7281-7287 (2002).
- Kay, L. M., Stopfer, M. Information processing in the olfactory systems of insects and vertebrates. Semin Cell Dev Biol. 17 (4), 433-442 (2006).
- Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral Coding of Taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).
- Carleton, A., Accolla, R., Simon, S. A. Coding in the Mammalian Gustatory System. Trends Neurosci. 33 (7), 326-334 (2010).
- Stocker, R. F. The organization of the chemosensory system in Drosophila melanogaster: a rewiew. Cell Tissue Res. 275 (1), 3-26 (1994).
- Mitchell, B. K., Itagaki, H., Rivet, M. P. Peripheral and central structures involved in insect gustation. Microsc Res Tech. 47 (6), 401-415 (1999).
- Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. Labellar taste organs of Drosophila melanogaster. J Morphol. 150 (2), 327-341 (1976).
- Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. Physiology of a primary chemoreceptor unit. Science. 122 (3166), 417-418 (1955).
- Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. J Vis Exp. (84), e51355 (2014).
- Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila). Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
- Descoins, C., Marion-Poll, F. Electrophysiological responses of gustatory sensilla of Mamestra brassicae (Lepidoptera, Noctuidae) larvae to three ecdysteroids: ecdysone, 20-hydroxyecdysone and ponasterone. A. J Insect Physiol. 45 (10), 871-876 (1999).
- Popescu, A., Couton, L., et al. Function and central projections of gustatory receptor neurons on the antenna of the noctuid moth Spodoptera littoralis. J Comp Physiol. 199 (5), 403-416 (2013).
- Morita, H., Yamashita, S. Generator potential of insect chemoreceptor. Science. 130 (3380), 922 (1959).
- Davis, N. T., Hildebrand, J. G. Neuroanatomy of the sucking pump of the moth, Manduca sexta (Sphingidae, Lepidoptera). Arthropod Struct Dev. 35 (1), 15-33 (2006).
- Stürckow, B., Adams, J. R., Wilcox, T. A. The Neurons in the Labellar Nerve of the Blow Fly. Z Vergl Physiol. 54, 268-289 (1967).
- Stürckow, B. Electrophysiological studies of a single taste hair of the fly during stimulation by a flowing system. Proceed 16 Intern Contr Zool. 3 (8), 102-104 (1963).
- Christensen, T. A., Hildebrand, J. G. Male-specific, sex pheromone-selective projection neurons in the antennal lobes of the moth Manduca sexta. J Comp Physiol A. 160, 553-569 (1987).
- Reiter, S. Gustatory Information Processing. , https://repository.library.brown.edu/studio/item/bdr:386235/PDF/?embed=true (2014).
- Saha, D., Leong, K., Katta, N., Raman, B. Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits. J Vis Exp. (71), (2013).
- Pouzat, C., Mazor, O., Laurent, G. Using noise signature to optimize spike-sorting and to assess neuronal classification quality. J Neurosci Methods. 122 (1), 43-57 (2002).
- Hill, D. N., Mehta, S. B., Kleinfeld, D. Quality Metrics to Accompany Spike Sorting of Extracellular Signals. J Neurosci. 31 (24), 8699-8705 (2011).
- Fee, M. S., Mitra, P. P., Kleinfeld, D. Automatic sorting of multiple unit neuronal signals in the presence of anisotropic and non-Gaussian variability. J Neurosci Methods. 69 (2), 175-188 (1996).
- Heisenberg, M. Mushroom body memoir: from maps to models. Nat Rev Neurosci. 4 (4), 266-275 (2003).
- Naraghi, M., Laurent, G. Odorant-induced oscillations in the mushroom bodies of the locust. J Neurosci. 14, 2993-3004 (1994).
- Laurent, G., Wehr, M., Davidowitz, H. Temporal representations of odors in an olfactory network. J Neurosci. 16, 3837-3847 (1996).
- Perez-Orive, J., et al. Oscillations and sparsening of odor representations in the mushroom body. Science. 297, 359-365 (2002).
- Stopfer, M., Jayaraman, V., Laurent, G. Odor identity vs. intensity coding in an olfactory system. Neuron. 39, 991-1004 (2003).
- Laurent, G. Olfactory network dynamics and the coding of multidimensional signals. Nature Re Neurosci. 3, 884-895 (2002).
