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Neuroscience

Neue Methoden zum Studieren der Gustatory Coding

doi: 10.3791/55868 Published: June 29, 2017
* These authors contributed equally

Summary

Wir präsentieren drei neue Methoden, um die gustende Kodierung zu untersuchen . Mit einem einfachen Tier, der Motte Manduca sexta ( Manduca ) , beschreiben wir ein Dissektionsprotokoll, die Verwendung von extrazellulären Tetroden zur Aufzeichnung der Aktivität von mehreren Gustatorrezeptor-Neuronen und ein System zur Bereitstellung und Überwachung von präzise zeitgesteuerten Impulsen.

Abstract

Der Geschmackssinn erlaubt es den Tieren, Chemikalien in der Umwelt zu erkennen, was zu Verhaltensweisen führt, die für das Überleben entscheidend sind. Wenn Gustatory Receptor Neurons (GRNs) schmeckende Moleküle erkennen, kodieren sie Informationen über die Identität und Konzentration des Geschmacks als Muster der elektrischen Aktivität, die sich dann zu den Neuronen im Gehirn ausbreiten. Diese Muster bilden innere Darstellungen des Geschmacks, die es dem Tier erlauben, Handlungen auszuwählen und Erinnerungen zu bilden. Die Verwendung von relativ einfachen Tiermodellen war ein mächtiges Werkzeug, um Grundprinzipien in der sensorischen Kodierung zu untersuchen. Hier schlagen wir drei neue Methoden vor, um mit der Motte Manduca sexta die Gustatory Coding zu untersuchen. Zuerst stellen wir ein Dissektionsverfahren für die Freilegung der Oberkiefernerven und der subösophagealen Zone (SEZ) vor, was die Aufzeichnung der Aktivität von GRNs aus ihren Axonen ermöglicht. Zweitens beschreiben wir die Verwendung von extrazellulären Elektroden, um die Aktivität von mehreren GRNs aufzuzeichnen, indem man teTrommeln direkt in den N. maxillaris Drittens präsentieren wir ein neues System für die Bereitstellung und Überwachung, mit hoher zeitlicher Präzision, Impulse verschiedener Geschmacksrichtungen. Diese Methoden erlauben die Charakterisierung von neuronalen Reaktionen in vivo direkt von GRNs vor, während und nach der Verabreichung von Leckerbissen. Wir stellen Beispiele für Spannungsspuren dar, die von mehreren GRNs aufgenommen wurden, und stellen ein Beispiel dar, wie eine Spike-Sortierungstechnik auf die Daten angewendet werden kann, um die Antworten einzelner Neuronen zu identifizieren. Um unseren Aufzeichnungsansatz zu validieren, vergleichen wir extrazelluläre Aufnahmen von GRNs mit Tetroden zu intrazellulären Aufnahmen, die mit scharfen Glaselektroden erhalten wurden.

Introduction

Die gustatorischen und olfaktorischen Systeme erzeugen interne Darstellungen von Chemikalien in der Umwelt, was zu einer Wahrnehmung von Geschmack und Gerüchen führt. Diese chemischen Sinne sind wesentlich für das Auslösen zahlreicher Verhaltensweisen, die für das Überleben des Organismus kritisch sind, von der Suche nach Kumpel und Mahlzeiten zur Vermeidung von Raubtieren und Toxinen. Der Prozess beginnt, wenn Umweltchemikalien mit Rezeptoren interagieren, die sich in den Plasmamembranen von sensorischen Rezeptorzellen befinden; Diese Zellen, direkt oder durch Wechselwirkungen mit Neuronen, übertragen Informationen über die Identität und Konzentration von Chemikalien in elektrische Signale. Diese Signale werden dann auf Neuronen höherer Ordnung und auf andere Hirnstrukturen übertragen. Wenn diese Schritte fortschreiten, wird das ursprüngliche Signal immer Veränderungen unterworfen, die die Fähigkeit des Organismus fördern, die sensorischen Informationen zu erkennen, zu unterscheiden, zu klassifizieren, zu vergleichen und zu speichern und eine geeignete Aktion auszuwählen. Verstehen, wie der BHIn verwandelt Informationen über Umweltchemikalien, um am besten eine Vielzahl von Aufgaben zu erfüllen ist eine grundlegende Frage in der Neurowissenschaften.

Die Gustator-Codierung wurde als relativ einfach angesehen: Eine weit verbreitete Ansicht stellt fest, dass jedes chemische Molekül, das einen Geschmack hervorruft (ein "schmackhaft"), natürlich zu einer der etwa fünf oder so grundlegenden Geschmackseigenschaften gehört ( dh süß, bitter, sauer , Salzig und umami) 1 . In dieser "Grundgeschmack" -Ansicht ist die Aufgabe des Geschmackssystems zu bestimmen, welcher dieser Grundgeschmack vorhanden ist. Ferner sind die neuronalen Mechanismen, die der grundlegenden Geschmacksdarstellung im Nervensystem zugrunde liegen, unklar und werden durch eine "markierte Linie" 2 , 3 , 4 , 5 , 6 oder ein "über Fasermuster" 7 bestimmt , 8 code. In einem etikettierten Liniencode reagiert jede sensorische Zelle und jede ihrer neuralen Anhänger auf eine einzige Geschmacksqualität, die zusammen einen direkten und unabhängigen Kanal zu höheren Bearbeitungszentren im zentralen Nervensystem bildet, die diesem Geschmack gewidmet sind. Im Gegensatz dazu kann in einem across-Faser-Muster-Code jede sensorische Zelle auf mehrere Geschmackseigenschaften reagieren, so dass Informationen über den Geschmack durch die Gesamtreaktion der Population von sensorischen Neuronen repräsentiert werden. Ob gustatorische Information durch grundlegende Geschmäcke, durch markierte Linien oder durch einen anderen Mechanismus repräsentiert wird, ist unklar und steht im Mittelpunkt der neueren Untersuchung 3 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Unsere eigenen jüngsten Arbeiten deuten darauf hin, dass das Geschmackssystem einen räumlich-zeitlichen Bevölkerungscode verwendet, um zu erzeugenDarstellungen einzelner Geschmacksrichtungen anstatt der Grundgeschmackskategorien 10 .

Hier bieten wir 3 neue Werkzeuge an, um das Studium der Gustatory Coding zu unterstützen. Zuerst schlagen wir die Verwendung des hawkmoth Manduca sexta als relativ einfacher Modellorganismus vor, der dem elektrophysiologischen Studium des Geschmacks zugänglich ist und ein Sektionsverfahren beschreibt. Zweitens schlagen wir die Verwendung von extrazellulären "Tetroden" vor, um die Aktivität einzelner GRNs aufzuzeichnen. Und drittens schlagen wir einen neuen Apparat vor, um präzise zeitgesteuerte Impulse für das Tier zu liefern und zu überwachen. Diese Werkzeuge wurden aus Techniken unseres Labors angepasst und andere haben das olfaktorische System untersucht.

Insekten wie die Fruchtfliege Drosophila melanogaster , die Heuschrecke Schistocerca americana , sowie die Motte Manduca sexta, haben seit Jahrzehnten leistungsstarke Mittel, um Grundprinzipien über den Ner zu verstehenVous-System, einschließlich sensorischer Codierung ( zB Olution 13 ). Bei Säugetieren sind Geschmacksrezeptoren spezialisierte Zellen, die mit Neuronen über komplexe Sekundärboten 1 , 14 kommunizieren. Es ist einfacher bei Insekten: ihre Geschmacksrezeptoren sind Neuronen. Weiterhin sind Säugetier-Geschmackswege in der Nähe der Peripherie relativ komplex, mit mehreren, parallelen neuronalen Strecken, und wichtige Komponenten sind herausfordernd zugänglich, in kleinen knöchernen Strukturen enthalten. Insektengeschäftswege scheinen einfacher zu sein. Bei Insekten sind GRNs in spezialisierten Strukturen, die als Sensilla bekannt sind, in der Antenne, den Mundstücken, den Flügeln und den Beinen 16 , 17 enthalten . Die GRNs direkt projektieren, um die subösophageale Zone (SEZ), eine Struktur, deren Rolle wurde vor allem gustatory 17 , und die Zweite Ordnung enthältGeschmack Neuronen 10 . Von dort aus gelangt die Information zum Körper, um Reflexe zu fahren und höhere Gehirnbereiche zu integrieren, zu speichern und letztlich Verhaltensweisen zu treffen 16 .

Es ist notwendig, periphere Geschmacksreaktionen zu charakterisieren, um zu verstehen, wie die Geschmacksinformation propagiert und von Punkt zu Punkt im ganzen Nervensystem transformiert wird. Die am häufigsten verwendete Methode zur direkten Überwachung der neuronalen Aktivität von GRNs bei Insekten ist die Tip-Recording-Technik 12 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . Dabei geht es darum, eine Elektrode direkt auf ein Sensillum zu legen, von denen viele relativ leicht zugänglich sind. Der Geschmack ist in der Elektrode enthalten, so dass man zu aktivieren und extRaumuläre Messung der neuronalen Reaktionen von GRNs im Sensillum. Da aber der Geschmack in der Elektrode enthalten ist, ist es nicht möglich, die GRN-Aktivität zu messen, bevor der Geschmack abgegeben wird oder nachdem er entfernt wurde, oder um Tastants auszutauschen, ohne die Elektrode 20 zu ersetzen. Eine andere Methode, die "Seitenwand" Aufnahmetechnik, wurde auch verwendet, um GRNs Aktivität aufzuzeichnen. Hier wird eine Aufzeichnungselektrode in die Basis eines Geschmacksensilums 24 eingeführt und die Geschmackstoffe werden durch eine separate Glaskapillare an der Spitze des Sensillums abgegeben. Beide Techniken beschränken die Aufzeichnung von GRNs auf ein bestimmtes Sensillum. Hier schlagen wir eine neue Technik vor: Aufzeichnung von zufällig ausgewählten GRN-Axonen aus verschiedenen Sensillen, während sie separat Septionen von Tasting an den Rüssel liefern. Axon-Aufnahmen werden erreicht, indem entweder scharfe Glaselektroden oder extrazelluläre Elektrodenbündel (Tetroden) in den Nerven gebracht werden, der Axone trägtGRNs im Rüssel der SEZ 10 . In Manduca durchqueren diese Axone den N. maxillaris, der bekanntermaßen rein afferent ist und die eindeutige Aufzeichnung von Sinnesreaktionen ermöglicht. Diese Methode der Aufzeichnung von Axonen, erlaubt für mehr als zwei Stunden, stabile Messung der GRN-Antworten vor, während und nach einer Reihe von leckeren Präsentationen.

Hier beschreiben wir ein Sektionsverfahren, um die Oberkiefernerven zusammen mit der SEZ auszusetzen, die es erlauben, gleichzeitig die Reaktionen von mehreren GRNs und Neuronen in der SEZ 10 aufzuzeichnen. Wir beschreiben auch die Verwendung von extrazellulären Aufnahmen von GRNs mit einer maßgeschneiderten 4-Kanal-Twisted-Wire-Tetrode, die in Kombination mit einer Spike-Sortiermethode die Analyse von mehreren (in unseren Händen bis zu sechs) GRNs gleichzeitig ermöglicht. Wir vergleichen weiter Aufnahmen mit Tetroden zu Aufnahmen mit scharfen intrazellulären gemachtElektroden Schließlich beschreiben wir einen neuen Apparat für die Bereitstellung von schmackhaften Reizen. Angepasst von Geräten, die von vielen Forschern verwendet wurden, um Geruchsstoffe in Olivitätsstudien zu liefern, bietet unser neues Gerät Vorteile für das Studieren von Böen: Verbesserung des bisherigen Mehrkanal-Abgabesystems, wie sie von Stürckow und Kollegen entwickelt wurden (siehe Referenzen 26 , 27 ), unser Gerät erreicht präzise Kontrolle über den Zeitpunkt der Tastant-Abgabe, während eine Spannungsauslesung dieser Zeitsteuerung bereitgestellt wird; Und es ermöglicht die schnelle, sequentielle Lieferung von mehrfachen Taststimuli 10 . Die Apparatur badet den Rüssel in einem konstanten Strom von sauberem Wasser, in das kontrollierte Impulse des Geschmacks geliefert werden können. Jeder schmackhafte Puls geht über den Rüssel und wird dann weggewaschen. Schmecken enthalten eine kleine Menge von geschmacklosen Lebensmittel Färbung, so dass ein Farbsensor zu überwachen, mit präzisen Timing, die Passage von schmackhaften ovEr ist der Rüssel.

Protocol

Achtung: Feine, pulverförmige Schuppen, die von Manduca freigesetzt werden, können Allergene sein, so dass der Einsatz von Laborschutzhandschuhen und einer Gesichtsmaske empfohlen wird.

1. Dissektion von Manduca sexta zur Aufdeckung der Oberkiefernerven und der SEZ

  1. Wählen Sie eine passende Motte eines jeden Geschlechts, basierend auf den folgenden Merkmalen: drei Tage nach der Eklosion mit einem allgemeinen gesunden Aussehen (Flügel sollten vollständig ausgedehnt werden, und die Rüssel und Antennen sollten intakt sein).
    1. Legen Sie die Motte einzeln in eine Plastikbecher für den Transport.
  2. Setzen Sie die Motte in ein Polypropylenrohr ein.
    Achtung: Wir empfehlen, diesen Schritt in einer Dunstabzugshaube durchzuführen, um zu verhindern, dass sich die pulverförmigen Schuppen der Motte ausbreiten.
    1. Die Röhre sollte etwas länger sein, dass der Körper der Motte ( Abbildung 1A ). Der Schlauch kann durch Schneiden eines 15-ml-Polypropylen-Rohres hergestellt werden.
    2. <Li> Schieben Sie die Motte, bis der Kopf ausgesetzt ist, und legen Sie das geballte Tissue-Papier in das andere Ende des Röhrchens ein, um zu helfen, die Motte unbeweglich zu halten ( Abbildung 1A ).
  3. Entfernen Sie die Haare aus dem Mottenaugenkopf (ventral und dorsal), indem Sie Druckluft darauf aufblasen.
    1. Ein Luftstrahl kann durch Verbinden einer Spritze (1 ml mit einer Nadel, ID um 1,4 mm, mit scharfer Spitze entfernt) zu einer Druckluftquelle hergestellt werden.
      Hinweis: Nach dem Entfernen der Haare können alle folgenden Schritte außerhalb der Dunstabzugshaube durchgeführt werden.
  4. Sobald die meisten Haare entfernt worden sind, legen Sie den Schlauch in eine Haltekammer, wobei der dorsale Teil des Kopfes nach oben zeigt, wie in Abbildung 1B gezeigt .
    1. Auf einer Petrischale verwenden Sie Modellier-Ton, um eine dreieckige Basis von etwa 7 cm Länge, 2,5 cm Höhe zu bauen ( Abbildung 1B ).


Abbildung 1 : Vorbereitung der Dissektionskammer für Manduca . ( A ) Eine Motte wird in einer Röhre zurückgehalten. Der Kopf ist an einem Ende ausgesetzt, während das andere Ende mit Seidenpapier verstopft ist. ( B ) Eine aus einer Petrischale hergestellte Zerlegungskammer und modellierender Ton ist gezeigt. Der dorsale Teil des Kopfes steht nach oben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

  1. Schützen Sie die Antennen und den Rüssel.
    1. 3 kleine Röhrchen vorbereiten, indem man eine Pipettenspitze (gelbe Spitzen, 1-200 μl) mit einer Rasierklinge in 3 Stücke von etwa 0,5 cm Länge schneidet. Der Innendurchmesser sollte groß genug sein, damit die Antenne und der Rüssel genau passen können.
    2. Bereite einen Haken vorBiegen eines Drahtes (22 AWG, von etwa 7 cm lang). Verlängere den Motto der Motte und stecke ihn dann in einen der kleinen Röhrchen ein, indem er ihn mit dem Drahthaken durchzieht, bis das Rohr den proximalen Teil des Rüsseles erreicht.
    3. Sichern Sie das kleine Röhrchen mit festem Batikwachs (z. B. mit einem zahnärztlichen elektrischen Wachs, um das Wachs zu schmelzen und das Wachs zu leiten) auf den Rücken der Kopfkapsel der Motte ( Abbildung 2A links).
    4. Legen Sie jede Antenne in ein Rohr und sichern Sie die Röhrchen mit Batikwachs wie in Abbildung 2A (links) gezeigt. Achten Sie darauf, die Antennen mit dem heißen Wachs zu beschädigen.
  2. Stabilisieren Sie das Gehirn gegen Bewegung durch Schneiden von Muskeln, die die vordere Oberfläche des Gehirns ( dh bukkale Kompressor Muskel) zu decken.
    1. Unter dem Sektions-Mikroskop, verwenden Sie Mikro-Dissektion Schere oder eine Mini-Axt aus einem Rasiermesser-Chip geklebt, um einen Zahnstocher, um die Kopf-Kapsel von mak zu öffnenEinen kleinen Schnitt gerade unter dem Rüssel ( Abbildung 2A , linke obere Einlage).
    2. Verwenden Sie eine Mikrodissektionsschere, um den bukkalen Kompressormuskel zu schneiden (siehe Abbildungen siehe Referenz 25 ). Da der Muskel nicht gut sichtbar ist, empfiehlt sich der folgende Verhaltenstest, um zu bestätigen, dass er geschnitten wurde.
    3. Sulfat in destilliertem Wasser verdünnen, um eine 1 M Lösung zu erhalten.
    4. Verwenden Sie eine Pipette, um etwa 200 μl Saccharose-Lösung auf die distale 2/3 des Rüsseles zu liefern, und beobachten Sie den Rüssel für 5 min. Wenn der Muskel richtig geschnitten wurde, sollte das Insekt nicht in der Lage sein, den Rüssel zu verlängern oder zu bewegen.
    5. Tragen Sie eine Schicht aus geschmolzenem Batikwachs auf, um die Öffnung in der Kopfkapsel abzudichten.
  3. Flip das Insekt über so die ventrale Seite der Kopf-Kapsel ist jetzt nach oben.
  4. Um Saline während und nach dem Sezierverfahren zu benennen, bauen Sie einen Wachsbecher um die ventrale Seite des Kopfes usin aufG der elektrische waxer: Unter einem Sektionsmikroskop beginnen Sie, den Becher zu bauen, indem Sie die erste Reihe von Wachs an der Vorderseite des Kopfes anwenden und sich nach hinten bewegen. Halten Sie die Rüssel und Antennenröhrchen in der Tasse ( Abbildung 2A rechts).
    1. Setzen Sie fort, den Becher nach außen und nach oben zu bauen, bis er das Niveau der Augen erreicht.
  5. Verwenden Sie Pinzette, um eine der beiden labialen Palmen zu nehmen, legen Sie sie dann auf die Seite und sichern Sie sie in den Wachsbecher, indem Sie mehr geschmolzenes Wachs hinzufügen. Machen Sie das gleiche mit dem anderen Oberkiefer ( Abb. 2A rechts).
  6. Dichtung irgendwelche Öffnungen in den Wachsbecher und Röhren.
    Anmerkung: In diesem Schritt wird Epoxy verwendet, weil es hilft, Lücken im Wachs und in den Rohren leicht zu entfernen und vermeidet hitzebedingte Schäden an den Antennen und dem Rüssel.
    1. Verwenden Sie einen Zahnstocher, um binäres Epoxid in einer Plastikmischschale zu mischen. Halten Sie die Mischschale auf.
    2. Verwenden Sie den Zahnstocher, um eine dünne aufzutragenSchicht aus Epoxy nach außen und im Inneren des Bechers ( Abbildung 2B ).
    3. Füllen Sie den leeren Raum in den Röhren, die den Rüssel und die Antennen mit Epoxy enthalten, und füllen Sie den Teil des Polypropylen-Rohres um den Hals mit ausreichend Epoxy, um es fest zu halten ( Abbildung 2B ).
    4. Lassen Sie das Epoxy ca. 20 min trocknen. Um dies zu überprüfen, teste das Epoxid, das in der Plastikmischschale verbleibt, um sicherzustellen, dass es fest und nicht mehr klebrig ist.
    5. Füllen Sie den Wachsbecher mit Manduca physiologische Kochsalzlösung 28 und warten Sie ein paar Minuten, um sicherzustellen, dass es keine Lecks gibt. Wenn ein Leck sichtbar ist, versuchen Sie es zu versiegeln, indem Sie mehr heißes Wachs und / oder Epoxy anwenden.

Figur 2
Abbildung 2 : Vorbereitung von Manduca </ Em> für die Dissektion. ( A ) Antennen und Rüssel sind in kleinen Röhren aus Pipettenspitzen geschützt, die in drei Stücke von etwa 0,5 cm Länge geschnitten sind. (Linkes Feld, großes Bild) Die Röhren werden mit geschmolzenem Batikwachs um den dorsalen Teil des Kopfes befestigt. (Linkes Paneel, Inset) Um den bukkalen Kompressormuskel zu entfernen, wird die dorsale Seite der Kopfkapsel durch einen kleinen Schnitt geöffnet, wie durch die gestrichelte Linie im großen Bild angezeigt. (Rechte Tafel) Ein Wachsbecher wird um die ventrale Seite des Kopfes als Reservoir für perfundierte Kochsalzlösung während des Sektionsvorgangs und Aufzeichnungsexperimente gebaut. ( B ) Epoxy wird verwendet, um Lücken zwischen der Basis des Wachsbechers und dem dorsalen Teil des Kopfes (linke Platte) und zwischen dem Wachs und den Röhren, die die Antennen und den Rüssel enthalten, einschließlich der Öffnungen der Rohre (rechte Platte) abzudichten ). Bitte hier klicken tO eine größere Version dieser Figur ansehen.

  1. Unter dem Sektionsmikroskop verwenden Sie die Mikrodissektionsschere, um die labialen Palmen abzuschneiden.
  2. Verwenden Sie Mikro-Dissektion Schere oder eine Mini-Axt, um die ventrale Seite der Kopfkapsel zu öffnen, indem Sie vier Schnitte: zwei Schnitte entlang der Nagelhaut, die jedes Auge von hinten nach vorne umgibt, ein Schnitt auf der Nagelhaut entlang der Rückseite des Kopfes, Und ein Schnitt auf der Nagelhaut entlang der Vorderseite des Kopfes in der Nähe des Rüssel ( Abbildung 3A ).
  3. Ziehen Sie die Nagelhaut vorsichtig mit einer Mikrozerkleinerungszange ab, um das Gehirn freizulegen.
  4. Durch die Verwendung von zwei scharfen Mikro-Dissektion Pinzette langsam und sorgfältig entfernen Fettgewebe und die Trachea für die SEZ. Vermeiden Sie jegliche Schädigung des Gehirns oder der Nerven (zB N. maxillaris, Sehnerv, Gebärmutterhalskrebs). Spülen Sie das Gehirn, indem Sie häufig die Kochsalzlösung ersetzen und das Licht oft für eine bessere Sichtbarkeit einstellen. Hinweis: Dies kann der kritischste Teil der DiSsektion; Es ist leicht, den N. maxillaris versehentlich zu beschädigen, indem man ihn zerreißt oder zerdrückt.
    Anmerkung: An dieser Stelle sollten die SEZ und die Oberkiefernerven deutlich sichtbar sein ( Abbildung 3B- 3C ). Allerdings sind das Gehirn und die Oberkiefernerven von einer dünnen Hülle bedeckt.
  5. Um die Hülle zu entfernen, ersetzen Sie die Kochsalzlösung in der Wachsschale mit 10% (w / v) Kollagenase / Dispase in Salzlösung gelöst und lassen Sie sie für 5 min. Dann, nachdem man das Gehirn mehrmals mit Kochsalzlösung gespült hat, entfernen Sie die Hülle vorsichtig mit einer superfeinen Mikrodissektionszange, indem Sie die Hülle von der SEZ durch die Oberkiefernerven ziehen.
  6. Beginne den Wachsbecher mit frischer Kochsalzlösung. Legen Sie den Schlauch aus einer Salzlösung in den Wachsbecher und befestigen Sie ihn dort mit geschmolzenem Wachs.

Abbildung 3
FeigeUre 3 : Manduca Dissektionsverfahren. ( A ) Die Labialpalme wird entfernt, die Kopfkapsel wird durch vier Schnitte geöffnet, wie durch die gestrichelte Linie angedeutet. ( B ) Ein vergrößertes Bild des Gehirns nach dem Öffnen der Kopfkapsel und Entfernung von Fettgewebe und Trachea, ermöglicht die Visualisierung der Oberkiefer Nerven (MxNs) und der Sub-Ösophagus-Zone (SEZ, ein Begriff, der sich auf den Bereich des Gehirns unter der Speiseröhre). Die Oberkiefernerven tragen Axone aus Gustatorrezeptorneuronen (GRNs) im Rüssel der SEZ. ( C ) Ein Schema eines Manduca- Gehirns. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

2. Tasting Delivery System

  1. Das Tastant-Abgabesystem besteht aus vier Hauptelementen: der Wasserquelle, dem Tastverteiler, dem Farbsensor und dem AufstellungsortRüssel, die alle mit einem starren Kunststoffrohr verbunden sind ( Abbildung 4A -4B ). Um dieses System zu erstellen, folgen Sie den in Abbildung 4B gezeigten Schritten. Verwenden Sie ein starres Plastikrohr mit einer Länge von ca. 6 cm (ID 0,3 cm).
  2. Verwenden Sie einen Lötkolben, um ein kleines Loch in der Röhre zu machen, wo der Rüssel platziert wird ( Abbildung 4A -4B ).
  3. Um sicherzustellen, dass die Rüssel der verschiedenen Tiere immer an der gleichen Stelle platziert werden, befestigen Sie Kunststoff- Siebmaterial (Maschenweite, Lochgröße von ca. 0,1 cm) in das Röhrchen ( Abbildung 4A -4B ). Mit einer Rasierklinge oder einem Drehwerkzeug schneiden Sie das starre Rohr etwa 5 mm über dem Rüsselloch. Legen Sie das Netz zwischen die beiden Rohrstücke. Sichern Sie das Netz und schließen Sie die Rohre wieder an, indem Sie Epoxy auf die Außenseite der Rohre auftragen. Lassen Sie das Epoxy ca. 20 min trocknen.
  4. Für eine leckere Lieferung einen Druck verwendenPerfusionssystem mit so vielen schmackhaften Röhren wie nötig, verbunden mit einem Mannigfaltigkeit (siehe unten). Benutzen Sie den Lötkolben, um ein kleines Loch im starren Rohr ca. 1 cm über dem Netz zu machen. Setzen Sie das Ausgangsrohr aus dem Perfusionssystem (ID 0.86 mm) in das starre Rohr ein und sichern Sie es dort, indem Sie Epoxy auftragen ( Abbildung 4A -4B ).
  5. Verwenden Sie eine peristaltische Pumpe, um einen konstanten Durchfluss (~ 40 ml / min) destilliertem Wasser zu liefern. Verbinden Sie es mit Silikonschlauch mit dem starren Rohr ( Abbildung 4A -4C ). Verbinden Sie die andere Seite des starren Rohres mit einem anderen Silikonschlauch, um den Ausgang in einen großen Abfallbehälter zu leiten ( Abbildung 4A -4C ).
  6. Um den Geschmack zu liefern, spritzen Sie Druckluft in die Mannigfaltigkeit des Perfusionssystems. Dies kann beispielsweise erreicht werden, indem eine pneumatische Pumpe (10 psi) verwendet wird, die durch einen zeitgesteuerten Spannungsimpulseingang gesteuert wird, um Druckluft in den Manifol einzuspritzen D Röhrchen mit dem gewünschten Tastant. Ein 1s-Puls entstößt etwa 0,5 mL an Geschmack.

3. Tasting Vorbereitung und Überwachung Tastant Delivery

  1. Verdünnung in destilliertem Wasser auf die gewünschte Konzentration verdünnen Seien Sie sich bewusst, dass der Geschmack durch den Wasserstrom weiter verdünnt wird. Wir haben die Endkonzentration gemessen, die den Rüssel als 77% der Anfangskonzentration erreicht (siehe Literatur 10 , 29 ).
  2. Fügen Sie einen künstlichen Lebensmittel Farbstoff zu jeder Tasting-Lösung, um die Bestimmung der genauen Timing, mit dem der Geschmack über den Rüssel geht. Wir fanden, dass der grüne Farbstoff (siehe Materialliste ) bei 0,05% w / v nicht Manduca GRNs aktiviert.
  3. Verwenden Sie einen Farbsensor (siehe Tabelle 1), um die Lebensmittelfärbung in den schmackhaften Lösungen zu erkennen. Verwenden Sie ein Lötkolben, um ein Loch neben dem Netz und 0,5 cm unterhalb des Ausgangsrohres des Perfusionssystems zu bilden ( S = "xfig"> Abbildung 4A -4B). Verbinden Sie den Sensor mit dem starren Rohr und befestigen Sie ihn dort mit Epoxy auf der Außenseite.
    1. Zeichnen Sie den Farbsensor Spannungsausgang als Analogsignal zusammen mit physiologischen Signalen auf (siehe Abschnitt 4). Das Farbsensor-Spannungssignal kann mit einem an den Sensor angeschlossenen Gleichstromverstärker verstärkt werden ( Bild 4A ).
  4. Vergewissern Sie sich, dass der Farbsensor arbeitet, indem Sie den Geschmack liefern und den Spannungsausgang des Sensors aufzeichnen. Das Signal, das durch den Farbstoff hervorgerufen wird, sollte den Geräuschpegel überschreiten.
    1. Stellen Sie die konstante Wassermenge ein, um das Signal so nahe wie möglich zu machen.
      Hinweis: Bei der Bereitstellung mehrerer Geschmacksrichtungen in der Reihenfolge, beachten Sie die erste Studie mit einem neuen Geschmack wird aus einer Mischung aus dem neuen und früheren Schmecken bestehen. Aus diesem Grund haben wir diese ersten Versuche nicht analysiert.
"> Abbildung 4
Abbildung 4 : Tastant Delivery System. ( A ) Ein Schema der Vorrichtung, die für die Bereitstellung und Überwachung von zeitgesteuerten Impulsen von Geschmacksrichtungen zum Rüssel des Tieres verwendet wird. Die Hauptkomponenten des Systems sind mit roten Zahlen gekennzeichnet. Eine konstante Strömung von destilliertem Wasser wird über den Rüssel durch eine peristaltische Pumpe, die mit Silikonschlauch verbunden ist, an dem starren Kunststoffrohr (1) gehalten, wo der Rüssel platziert werden soll (6). Schmecken, die eine geringe Menge an geschmackfreiem Farbstoff enthalten, werden mit einem unter Druck stehenden 16-Kanal-Perfusionssystem geliefert. Die Reserve, die die Geschmacksstoffe enthalten, sind mit einem Verteiler (2) verbunden, der an dem starren Rohr befestigt ist, oberhalb des Loches, wo der Rüssel platziert werden soll (5). Druckluft aus einer pneumatischen Pumpe wird in das Perfusionssystem eingespeist, um schnell einen Geschmack zu liefern, wobei das Timing durch kundenspezifische Software gesteuert wird. EINFarbsensor (3) dient zur Überwachung der Kostüme. Der Sensor ist mit dem starren Rohr neben dem Rüssel und unterhalb des Auslasses des schmackhaften Perfusionssystems verbunden. Das Farbsensor-Spannungssignal wird durch einen Gleichstromverstärker verstärkt. Die rote Spur auf der Einfügung neben dem Verstärker veranschaulicht ein Farbsignal, das mit der benutzerdefinierten Datenerfassungssoftware aufgezeichnet wurde. Die rasche Zunahme und Abnahme des Signals spiegeln die Ankunft und die Auswaschung des Schmeckens wider. Der Rüssel der Motte wird in ein Loch (5) gelegt, das sich direkt unter dem Farbsensor befindet. Ein Netz (4) ist oberhalb des Loches angeordnet, um sicherzustellen, dass die Rüssel der verschiedenen Tiere immer an der gleichen Stelle positioniert sind. Die andere Seite des starren Rohres ist mit einem anderen Siliziumrohr verbunden, um den Ausgang in einen Abfallbehälter (7) zu leiten. ( B ) Bild, das die Hauptelemente des Tastant-Abgabesystems zeigt, das mit dem starren Kunststoffrohr verbunden ist, die mit den roten Ziffern bezeichnet sind, wie in Tafel A gezeigt: das Wasser(2), dem Farbsensor (3), dem Gitter (4) und dem Loch, in dem der Rüssel (5) in ein starres Kunststoffrohr (1) eingefügt werden soll, . ( C ) Die Platzierung der Manduca- Vorbereitung in den Aufbau ist dargestellt. Die distale T2 / 3 des Motto-Rüsseles werden in das Loch (5) am starren Kunststoffrohr (1) eingeführt. Der Rüssel wird mit Dentalwachs und Epoxy gesichert, wie durch den Einsatz gezeigt. Der Wassereingang zum starren Rohr und dessen Ausgang zu einem Abfallbehälter sind durch die Ziffern 6 bzw. 7 gekennzeichnet. Die Nummer 2 zeigt den Talkantverteilerrohr an. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

4. Extrazelluläre Tetrode-Aufzeichnung zur Überwachung der Schmecker-evozierten Aktivität von GRNs

  1. Platzieren Sie die Mottenvorbereitung auf eine Plattform unter einem Stereomikroskop auf einem VibrAtionisolierende Tabelle ( Abbildung 4C ).
  2. Setzen Sie die distalen zwei Drittel des Motto-Rüssel in die starre Röhre des schmackhaften Abgabesystems ( Abbildung 2B ). Um dies zu tun, verlängere den Motto der Mütter und stecke ihn dann in das Loch des starren Rohres ein, indem ich ihn sanft mit Hilfe der Zangenpfeife drückt. Den Rüssel mit weichem Dentalwachs und dann mit einer Epoxidschicht aufnehmen, um Lecks zu vermeiden ( Abbildung 4C , Einlass).
  3. Verbinden Sie die salzhaltige Perfusionslinie mit der Kopfkapsel und setzen Sie den Perfusionsfluss auf eine konstante Rate von etwa 0,04 L / h.
  4. Tauchen Sie eine Masseelektrode ( dh einen chlorierten Silberdraht) in das Kochsalzbad ein ( Abbildung 5A ).
  5. Benutzen Sie eine maßgeschneiderte verdrehte Draht-Tetrode, die nach dem in 30 beschriebenen Herstellungsverfahren gebaut wurde (4 Elektrodendrähte werden vorgeschlagen, um gut isolierte Einheiten zu erzielen und zu passender Nerv). Vor dem Experiment die Elektrode nach den in 30 beschriebenen Schritten galvanisieren.
  6. Verwenden Sie einen manuellen Mikromanipulator, um die Tetrode in der Nähe des N. maxillaris zu positionieren. Führen Sie die Tetrode vor, bis sie anfängt, den Nerv zu betreten ( Abbildung 5 ).
  7. Warten Sie mindestens 10 Minuten nach dem Platzieren der Tetrode, damit es innerhalb der Nerven vor der Aufnahme zu stabilisieren.
  8. Verstärken Sie das Signal (3000x) und verwenden Sie einen Bandpassfilter zwischen 0,3-6 kHz. Erfassen Sie das Signal bei einer Abtastrate von 40 kHz mit der Datenerfassungssoftware.
  9. Nach Beendigung des Experiments die Mottenvorbereitung in den Gefrierschrank stellen.

Abbildung 5
Abbildung 5 : Tetrode-Aufzeichnung von GRNs. ( A , großes Bild) Ein Mikromanipulator wird verwendet, um pSpitze die verdrehte Draht-Tetrode in den N. maxillary Nerv (MxN), um die Aktivität von GRNs aufzuzeichnen. Eine Chlorid-Silber-Masseelektrode wird wie gezeigt in das Kochsalzbad eingebracht. ( A , Inset) Ein vergrößertes Bild des Gehirns zeigt die Tetrode im N. maxillaris. Die subösophageale Zone (SEZ) ist auch angegeben. ( B ) Ein Schema eines Manduca- Gehirns, das wie in A orientiert ist. Klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Representative Results

Die Aktivität von GRNs kann mit einer extrazellulären Tetrodelektrode vor, während und nach der Tastantabgabe aufgezeichnet werden ( Abbildung 6A und 6C ). Fig. 6A (mittlere und untere Tafeln) zeigt gefilterte (300-6.000 Hz) Spannungsspuren, die von jedem der vier Drähte aufgezeichnet werden, die im N. maxillaris angeordnet sind, wobei Signale mit unterschiedlichen Amplituden, die die Aktionspotentiale (Pfeile) widerspiegeln, beobachtet werden können. Ein 1 s Puls von Tastament (1 M Saccharose) wurde 2s nach Beginn des Experiments geliefert; Der Beginn und der Versatz des Stimulus wurde durch den Farbsensor überwacht ( Bild 6A , oberes Feld). Die schmackhaft induzierten Spikes, die in jedem der vier Kanäle beobachtet werden können ( Abbildung 6A , Mitteltafel). GRNs können identifiziert und von Mechanosensoren (hier nicht gezeigt) unterschieden werden, wenn sie auf einige Geschmacksrichtungen und nicht auf andere reagieren

Um einzelne Neuronenantworten aus den Tetrodenaufnahmen zu identifizieren und zu isolieren, führten wir mit einer Reihe von benutzerdefinierten Funktionen auf der Basis von Pouzats 31 und Kleinfelds 32 , 33 Methoden (diese Methoden sind in diesen Zitaten beschrieben: 10 , 29 ). Fig. 6B zeigt ein Beispiel einer Spikesortierung, die auf die in Fig. 6A gezeigten Daten angewendet wurde, in denen drei gut isolierte Einheiten gefunden wurden.

Rasterplots aus Abbildung 6C zeigen die Reaktionen der drei isolierten Einheiten in Abbildung 6B auf sechs verschiedene Geschmacksstoffe (1 M Saccharose, Maltose und NaCl, 100 mM Koffein und 10 mM Berberin und Lobeline), die nacheinander (4 Versuch)S / tastant werden gezeigt). Wie in Abbildung 6C gezeigt , haben die aufgezeichneten GRNs unterschiedliche Ebenen der Baselineaktivität, die von stiller (GRNs 1) bis zu niedrig oder mäßig (GRN 2 und 3) reichen. Nach dem anstrengenden Beginn zeigen GRNs diverse Aktivitätsmuster und zeigen unterschiedliche Selektivität für die Geschmackstoffe. Zum Beispiel antwortete GRN 1 nur auf Saccharose, während GRN 2 auf Maltose und NaCl mit Stacheln von Spikes und Lobeline mit Spiking nur zu Beginn des Reizes reagierte. Darüber hinaus sind einige Reaktionen mit dem Timing des Stimulus verriegelt ( zB GRN 1-Antwort auf Saccharose), während andere Reaktionen die Dauer des Reizes ( zB GRN 3-Response auf Berberine) überdauern oder sowohl exzitatorische als auch inhibitorische Komponenten enthalten ( z GRN 2 -Antworten auf NaCl und Saccharose). Für weitere Informationen über die unterschiedlichen Empfindlichkeiten und Aktivitätsmuster von GRNs siehe Referenz 10 .

7 ). Die Spannungsspuren in der grünen Box in Panel A wurden intrazellulär von GRN 1 während 5 aufeinanderfolgenden Versuchen der Saccharose-Präsentation aufgezeichnet, und die gleichen Antworten werden als Raster-Diagramme in Panel B gezeigt. (Beachten Sie, dass diese Art von Antwort mit der mit Tetroden und Gezeigt in 6C .) GRN 2, aufgezeichnet mit scharfen intrazellulären Elektroden, zeigt ein breiteres Antwortmuster.

Abbildung 6 Abbildung 6: Repräsentative Ergebnisse von Nervenaufnahmen mit extrazellulären Tetroden. ( A ) Gefilterte (300-6.000 Hz) Spannungsspuren, die von jedem der vier Drähte im N. maxillaris aufgezeichnet wurden, werden angezeigt (Mittelfeld). Ein 1 s Puls von Tastament wurde während der Zeitspanne angewendet, die durch eine rote Schattierung in der mittleren Platte angezeigt wurde. Der Beginn und der Versatz des Stimulus wurde durch den Farbsensor überwacht, wie durch die rote Spannungsspur auf der oberen Tafel angezeigt und wird auf dem mittleren Feld durch den rot-schattierten Bereich angezeigt. Die gepunkteten horizontalen Linien bezeichnen +50 (oben), 0 (Mitte) und -50 (unten) μV. Eine Vergrößerung der Rohspannungsspuren entsprechend der Fläche innerhalb der vertikalen gestrichelten Linien ist dargestellt (Bodenplatte). Beispiele für Spikes sind durch die Pfeile gekennzeichnet. ( B ) Ein Beispiel für eine Spikesortierung, die auf die in der Platte A gezeigten Daten angewendet wird. Die Wellenformen, die an jedem der vier extrazellulären Drähte (1-4) aufgezeichnet wurden,E identifiziert mit drei verschiedenen GRNs (Einheiten 1-3), die zu den aufgezeichneten Signalen beitragen. Einzelne Ereignisse (farbige dünne Linien) und die mittlere (dicke schwarze Linie) werden für die drei Einheiten gezeigt. Es müssen mehrere statistische Kriterien betrachtet werden, um unabhängige Einheiten nach der Spike-Sortiermethode zuverlässig zu identifizieren (siehe Referenzen 10 , 29 ). ( C ) Rasterplots, die die Antworten der drei isolierten Einheiten auf eine Sequenz von sechs verschiedenen Tastants darstellen (4 Versuche / Geschmack sind gezeigt). Die Zeitspanne der schmackhaften Zustellung (1 s) wird durch den rot-schattierten Bereich angezeigt. Die Konzentrationen der Geschmacksstoffe waren entweder 1 M (Saccharose, Maltose, NaCl), 100 mM (Koffein) und 10 mM (Berberin und Lobeline). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 7 Lass = "xfigimg" src = "/ files / ftp_upload / 55868 / 55868fig7.jpg" />
Abbildung 7 : Intrazelluläre Aufnahmen von GRN-Axonen. ( A , grünes Kastenfeld) Spannungsspuren, die von einem GRN mit scharfen Glas intrazellulären Elektroden (Widerstand von 80 - 120 MΩ) aufgezeichnet wurden, die in den N. maxillaris eingebracht wurden, entstanden durch 5 aufeinanderfolgende Stimulationen mit 1 M Saccharose (Suc). ( B ) Raster-Plots der Reaktionen von zwei GRNs, einschließlich der in Panel A (Green Box Panel) gezeigten Reaktionen auf zwei verschiedene Talkants, die nacheinander geliefert wurden (100 mM Grau-Schriftfarbe, 1 M Schwarz-Schriftfarbe), aufgenommen mit scharfen Glas-Intrazellulären Elektroden In den N. maxillaris (7 Versuche / Geschmack und 3 Versuche / Wasser werden gezeigt). Die Tastzeit wird in den beiden Tafeln durch rot-schattierte Bereiche angezeigt. Der Beginn und der Versatz des Stimulus wurde durch den Farbsensor überwacht, wie durch die roten Spannungsspuren am Boden jedes Panels angezeigt.Es / ftp_upload / 55868 / 55868fig7large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Discussion

Die hier beschriebenen Verfahren erlauben in vivo Aufnahmen von einem relativ einfachen Tier, Manduca sexta , um die Aktivität mehrerer, zufällig ausgewählter GRNs über lange Zeitdauern (für mehr als 2 h) vor, während und nach der Tastantlieferung zu charakterisieren. Diese Methoden erlauben auch die schnelle, sequentielle Abgabe von mehrfachen Taststimuli mit präziser zeitlicher Kontrolle, Vorteile, die für das Studium von neuronalen Mechanismen, die einer schmackhaften Repräsentation zugrunde liegen, nützlich sind. Dieses Protokoll wurde verwendet, um zu untersuchen, wie die Reaktionen von GRNs auf Geschmackstoffe transformiert werden, wenn sie auf ihre postsynaptischen Zielneuronen ( z. B. in der SEZ) übertragen werden, indem sie GRNs gleichzeitig mit monosynaptisch verbundenen Interneuronen überwachen. Darüber hinaus können diese Methoden an die Bedürfnisse des Experimentators angepasst werden, so dass die Durchführung von komplexen Paradigmen grundlegende Aspekte der gustatory Codierung zu studieren.

Wenn anfangsG unsere Studien, ein technisches Problem, das wir manchmal zu beheben hatten, war die Unfähigkeit, Spiking-Signale aus N. maxillaris mit den Tetrodendrähten zu erkennen. Mögliche Ursachen dafür sind vielfältig, da das Dissektionsprotokoll anspruchsvoll ist und manche Praxis notwendig ist, um eine gute Vorbereitung zu erhalten. Zuerst werden während der Motten-Sezierung die Oberkiefer-Nerven leicht zu beschädigen, besonders während der Entfernung der Hülle, die das Nervengewebe umgibt. Zweitens, wenn die Scheide nicht vollständig entfernt wird, können die Tetrodendrähte nicht in der Lage sein, auf den Nerv zuzugreifen. In beiden Fällen ist das Starten einer neuen Vorbereitung oft der einfachste Weg, um diese Probleme zu lösen. Drittens kann es ein Problem mit den Tetrodendrähten geben. Dies kann durch Messung der Impedanz der Drähte, die ~ 270 kΩ bei 1kHz sein sollte, überprüft werden. Wenn der Impedanzwert über ~ 300 kΩ liegt, galvanisieren Sie die Drähte mit Gold, um die gewünschte Impedanz zu erreichen (siehe Referenz 30 ). Viertens kann ein Gerät verkürzt werdenOder fehlerhaft

Ein weiteres mögliches Problem ist, dass spiking Signale aufgezeichnet werden, aber die Neurone (n) erscheinen unempfänglich für die Tastamente. Dies könnte daran liegen, dass die aufgezeichneten Neuronen unempfindlich gegenüber dem gelieferten Geschmack sind. Auch ist wichtig zu beachten, dass zusätzlich zu den Axonen der GRNs der N. maxillaris auch mechanosensorische Fasern trägt. So ist es möglich, von mechanosensorischen Neuronen anstelle von oder zusätzlich zu GRNs aufzuzeichnen. Das Tastant-Abgabesystem ist jedoch so ausgelegt, dass es während des gesamten Experiments eine konstante mechanische Eingabe liefert, was es unwahrscheinlich macht, dass Reaktionen auf einen Geschmack durch Reaktionen auf die mechanische Komponente seiner Auslieferung verwechselt werden. Neuronen, die auf einige, aber nicht andere Geschmacksrichtungen reagieren, oder auf unterschiedliche Weise zu verschiedenen Geschmacksrichtungen, können eindeutig als GRNs eingestuft werden. Wir empfehlen, frisch verdünnte Geschmacksstoffe zu verwenden, um Variationen der Geschmackskonzentration oder -zusammensetzung aufgrund von vermindertem Abbau oder Verdampfung zu vermeidenDes Lösungsmittels. Wir empfehlen auch, das System regelmäßig zu reinigen, um Schlauchverunreinigungen und / oder Hindernisse zu vermeiden.

Ein weiteres mögliches technisches Problem ist ein nachteiliges Signal-Rausch-Verhältnis. Dieses Problem kann oft durch Rechlorieren oder Einstellen der Position der Bad-Masseelektrode gelöst werden. Andere Lösungen können eine Abschirmung erfordern und die Länge jeder elektrischen Verbindung im Gerät minimieren.

Schließlich ist es wichtig zu beachten, dass eine korrekte Analyse der Daten, die mit Tetrodenaufnahmen erhalten wurden, eine sorgfältige Spikesortierung erfordert. Wir haben festgestellt, dass vollautomatische Methoden in der Regel unzureichend sind. Wir empfehlen, mit der Spike-Sortierliteratur vertraut zu werden, bevor wir die Tetrodendaten 10 , 29 , 31 , 32 , 33 analysieren.

Alternativen zu unserer Sektion ProTocol kann verwendet werden. Hier haben wir eine Zergliederung durch den ventralen Teil des Mottenkopfes beschrieben, der Zugang zu den Oberkiefernerven und SEZ bietet, aber es ist auch möglich, auf diese Strukturen zuzugreifen, indem sie durch die dorsale Seite zerlegen. Wir fanden die dorsale Seite Vorbereitung ist nicht optimal für die Aufnahmen von diesen Geschmack Strukturen aufgrund ihrer tiefen Lage, aber diese Vorbereitung bietet den Vorteil der Ermöglichung von Aufnahmen aus höheren Ordnung Strukturen wie der Pilz Körper, ein Bereich, der mit Multi verbunden war -sensorische Integration, assoziatives Lernen und Gedächtnisverarbeitung 34 . Wir haben uns auf die Verwendung von Tetrodenelektroden konzentriert, um aus dem N. maxillaris aufzutragen, aber, wie wir veranschaulicht haben, können auch standardmäßige intrazelluläre scharfe Elektroden verwendet werden. Darüber hinaus können beide Techniken kombiniert werden, um simultane Aufnahmen von mehreren Gehirnbereichen auszuführen 10 . Die neurowissenschaftliche Literatur bietet viele Beispiele für iWirbeltiermodelle, die sich als mächtige Werkzeuge erwiesen haben, um grundlegende Prinzipien der sensorischen Verarbeitung, wie z. B. olfaktorische Kodierung, die sowohl für Insekten als auch für Wirbeltiere 35 , 36 , 37 , 38 , 39 gelten, aufzudecken. Wir hoffen, dass unsere Methoden zu grundlegenden neuen Einsichten über die gustatorische Kodierung führen werden.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde von einem intramuralen Stipendium von NIH-NICHD an MS unterstützt. Wir danken G. Dold und T. Talbot von der NIH-NIMH Instrumentation Core Facility für die Unterstützung bei der Gestaltung des Tastant Delivery Systems.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissection and Specimen Preparation
Polypropylene tube, 15 mL Falcon Fisher Scientific 14-959-53A
Needle, Short bevel, 19 G x 1 - 1/2"   MONOJET 888200144 For applying air to remove the hair from the moth.
Modeling Clay-Van Aken Plastalina  DickBlick 33268
Petri dish -100 x 15 mm  VWR International 89000-304
Pipette tip (1 - 200 µL) USA Scientific 1111-0806
Razor blade Techni Edge TE05-071
22 AWG standard hookup wire AlphaWire 1551 For inserting the proboscis into the pippete tip.
Batik wax Jacquard 7946000
Electric waxer Almore International 66000
Stereo Myscroscope Leica MZ75
Dumont #1 forceps (coarse)  World Precision Instruments 500335 For removing fat and non-nervous tissue.
Dumont #5 titanium forceps (fine)  World Precision Instruments 14096 For removing fat and non-nervous tissue.
Dumont #5SF forceps (super-fine) World Precision Instruments 500085 For desheathing the nervous tissue.
Vannas scissors (fine) World Precision Instruments 500086 For removing the cuticle.
Collagenase/Dispase Sigma-Aldrich 11097113001
Epoxy Permatex 84101
Name Company Catalog Number Comments
Saline Perfusion System
Extension set with rate flow regulator  B Braun Medical Inc. V5200
IV administration set with Y injection site  B Braun Medical Inc. V1402
Name Company Catalog Number Comments
Tastant Delivery System
White Translucent Nylon Tubing OD 1/4", ID 1/8" Small Parts Inc. B001JJT4SA Rigid tube that connects the four main elements of the system.
Soldering iron Circuit Specialists ZD200BK
Rotary tool-Dremel Dremel 4200
Polypropylene mesh, hole size (hole size 0.1 x 0.13 cm)  Industrial Netting XN5170 For ensuring that the probosises of different animals are placed in the same location.
Pressurized 16-Channel perfusion system  Bioscience Tools PS-16H For tastant delivery. This system includes pinch valves, tubing, manifold, solution cylinders, valve controller and fitting accessories.
Polypropylene tubing, ID 0.034", ID 0.050" Becton, Dickinson & Co 427421 Output tube from the perfusion system.
Pneumatic PicoPump World Precision Instruments SYS-PV820 For controlling the output channel of the perfusion system. 
Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card National Instruments LabVIEW 2011 To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor.
Compulab 3 Manostat peristaltic pump Sigma P1366 For pumping water.
Silicone tubing, ID 1/16" OD 1/8" Cole-Parmer WU-95802-02 To connect the water source to the peristaltic pump tubing, and the outlet tube of the pump to the rigid tube of the delivery system.
Color sensor-digital fiber optic sensor Keyence  FS-V31M For monitoring tastant delivery. 
Color sensor-reflective fiber unit Keyence FU35-FZ To connect the color sensor device.
Dental periphery Wax Henry-Schein Dental 6652151 To secure the proboscis into the rigid tube.
Two 3.7 L containers To provide water to the system, and to recollect the water waste.
Fast green FCF  Sigma F7258
Dressing forceps 25.5 cm WPI 500364 To introduce moth proboscis into the proboscis hole in the rigid tube.
Name Company Catalog Number Comments
Electrophysiology Equipment
D.C. amplifier Brown-Lee 440
Lamp Schott Schott Fostec Light Source DCR 2
Manual micromanipulator Leica micromanipulator To precisely insert the tetrodes into the animal's brain. The manipulator has to allow fine and coarse movements in x, y and z axis.
Stereomicroscope Leica MZ75
Vibration-isolation table (MICRO-g lab table) TMC 63-541
Oscilloscope Tektronix  TDS2014
16-channle pre-amplifier and amplifier 16 Channel MA-800 Amplifier System  B.E.S 2013
Computer Dell optiplex 780 The following are the minimum recommended requirements. RAM: 3.32 GHz, 3GB. Processor: Intel Core 2 Duo. Graphic card: integrated Intel GMA X4500. 
Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card National Instruments LabVIEW 2011 To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor and electrode.
Name Company Catalog Number Comments
Tastants
KAc Sigma-Aldrich P5708
LiCl Sigma-Aldrich L9650
NaCl Sigma-Aldrich 73575
Sucrose Sigma-Aldrich 84097

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References

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Neue Methoden zum Studieren der Gustatory Coding
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Boronat-García, A., Reiter, S., Sun, K., Stopfer, M. New Methods to Study Gustatory Coding . J. Vis. Exp. (124), e55868, doi:10.3791/55868 (2017).More

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