Summary
Presentiamo tre nuovi metodi per studiare la codifica gustativa . Utilizzando un animale semplice, la falena Manduca sexta ( Manduca ) , descriviamo un protocollo di dissezione, l'uso di tetrodes extracellulari per registrare l'attività di molti neuroni gastatoriali e un sistema per la consegna e il monitoraggio di impulsi precisi di tastanti.
Abstract
Il senso del gusto consente agli animali di rilevare sostanze chimiche nell'ambiente, dando vita a comportamenti critici per la sopravvivenza. Quando i Neuroni Gustatory Receptor (GRNs) rilevano molecole tastanti, codificano le informazioni sull'identità e la concentrazione del tastante come modelli di attività elettrica che poi si propagano ai neuroni seguenti nel cervello. Questi schemi rappresentano rappresentazioni interne del tastante, che poi consentono all'animale di selezionare azioni e di formare memorie. L'uso di modelli animali relativamente semplici è stato un potente strumento per studiare i principi fondamentali nella codifica sensoriale. Qui proponiamo tre nuovi metodi per studiare la codifica gustativa usando la falena Manduca sexta . In primo luogo, presentiamo una procedura di dissezione per esporre i nervi maxillari e la zona sottosofagea (SEZ), permettendo di registrare l'attività dei GRN dai loro assoni. In secondo luogo, descriviamo l'utilizzo di elettrodi extracellulari per registrare l'attività di GRN multipli collocando teI fili di trode direttamente nel nervo maxillario. In terzo luogo, presentiamo un nuovo sistema di consegna e monitoraggio, con elevata precisione temporale, impulsi di tastanti diversi. Questi metodi consentono di caratterizzare le risposte neuronali in vivo direttamente da GRN prima, durante e dopo la consegna dei tastanti. Forniamo esempi di tracce di tensione registrate da più GRNs e presentano un esempio di come una tecnica di ordinamento di picchi può essere applicata ai dati per identificare le risposte dei singoli neuroni. Infine, per convalidare il nostro metodo di registrazione, confrontiamo le registrazioni extracellulari ottenute da GRN con tetrodes alle registrazioni intracellulari ottenute con elettrodi di vetro nitidi.
Introduction
I sistemi gustativi e olfattivi generano le rappresentazioni interne delle sostanze chimiche nell'ambiente, dando luogo a percezioni di gusti e odori, rispettivamente. Questi sensi chimici sono essenziali per elicitare numerosi comportamenti critici per la sopravvivenza dell'organismo, che vanno dalla ricerca di compagni e pasti per evitare predatori e tossine. Il processo inizia quando le sostanze chimiche ambientali interagiscono con i recettori situati nelle membrane plasmatiche delle cellule del recettore sensoriale; Queste cellule, direttamente o attraverso interazioni con i neuroni, trasudano informazioni in merito all'identità e alla concentrazione di sostanze chimiche in segnali elettrici. Questi segnali vengono poi trasmessi ai neuroni di ordine superiore e ad altre strutture cerebrali. Mentre questi passaggi avanzano, il segnale originale subisce sempre cambiamenti che promuovono la capacità dell'organismo di rilevare, discriminare, classificare, confrontare e memorizzare le informazioni sensoriali e di selezionare un'azione appropriata. Capire come il reggisenoIn trasforma le informazioni sulle sostanze chimiche ambientali per eseguire al meglio svariati compiti è una questione fondamentale nella neuroscienza.
La codifica gustativa è stata considerata relativamente semplice: una visione ampiamente contenuta afferma che ogni molecola chimica che genera un gusto (un "tastante") naturalmente appartiene ad una delle qualità del gusto di circa cinque o di base ( cioè dolce, amaro, acido , Salato e umami) 1 . In questa visione "gusto di base", il lavoro del sistema gustativo è quello di determinare quale di questi gusti di base è presente. Inoltre, i meccanismi neurali sottostanti alla rappresentazione gusto di base nel sistema nervoso non sono chiari e sono ritenuti governati da una "linea etichettata" 2 , 3 , 4 , 5 , 6 o da un "modello di fibra" 7 , codice 8 . In un codice di codice etichettato, ogni cellula sensoriale e ciascuno dei suoi seguaci neurali rispondono a una singola qualità di gusto, insieme formando un canale diretto e indipendente verso centri di lavorazione più alti nel sistema nervoso centrale dedicato a quel gusto. Al contrario, in un codice di pattern di fibre diverse, ogni cellula sensoriale può rispondere a molteplici qualità del gusto in modo che le informazioni sul tastante siano rappresentate dalla risposta complessiva della popolazione dei neuroni sensoriali. Sia che le informazioni gustative siano rappresentate dai gusti di base, attraverso linee etichettate, o attraverso un altro meccanismo, sia poco chiara ed è al centro della recente indagine 3 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Il nostro lavoro recente suggerisce che il sistema gustativo utilizza un codice di popolazione spatiotemporale da generareRappresentazioni di singoli sapori piuttosto che categorie di gusto di base 10 .
Qui offriamo 3 nuovi strumenti per assistere nello studio della codifica gustativa. Innanzitutto, suggeriamo l'uso della hawkmoth Manduca sexta come un organismo modello relativamente semplice adatto allo studio elettrofisiologico del gusto e descrivere una procedura di dissezione. In secondo luogo, suggeriamo l'utilizzo di "tetrodes" extracellulari per registrare l'attività dei singoli GRN. E, in terzo luogo, suggeriamo un nuovo apparecchio per la consegna e il monitoraggio di impulsi prefissati di tastante all'animale. Questi strumenti sono stati adattati da tecniche che il nostro laboratorio e altri hanno usato per studiare il sistema olfattivo.
Gli insetti come la frutta Drosophila melanogaster , la locusta Schistocerca americana e la falena Manduca sexta hanno da decenni forti risorse per comprendere i principi fondamentali sul nerVous, compresa la codifica sensoriale ( es., Olfazione 13 ). Nei mammiferi, i recettori del gusto sono cellule specializzate che comunicano con i neuroni attraverso complessi percorsi secondari messaggeri 1 , 14 . È più semplice negli insetti: i loro recettori del gusto sono neuroni. Inoltre, i percorsi di gusto dei mammiferi nei pressi della periferia sono relativamente complessi, caratterizzati da percorsi neurali multipli e paralleli e componenti importanti sono difficili da accedere, contenuti in piccole strutture ossee 15 . I percorsi di gusto dell'insetto sembrano essere più semplici. Negli insetti, le GRN sono contenute in strutture specializzate noti come sensilla, situate nell'antenna, bocche, ali e gambe 16 , 17 . I GRN proiettano direttamente la zona sottosofagea (SEZ), una struttura il cui ruolo è stato ritenuto prevalentemente gustativo 17 e che contiene secondo ordineNeuroni gustatori 10 . Da lì le informazioni si spingono verso il corpo per guidare riflessi e verso aree cerebrali più alte da integrare, conservare e, in ultima analisi, guidare scelte comportamentali 16 .
È necessario caratterizzare le risposte del gusto periferico per capire come le informazioni di gusto vengono propagate e trasformate da punto a punto in tutto il sistema nervoso. Il metodo più comunemente usato per monitorare direttamente l'attività neurale delle GRN negli insetti è la tecnica di registrazione delle punte 12 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . Ciò comporta l'immissione di un elettrodo direttamente su un sensillum, molti dei quali sono relativamente facili da accedere. Il tastante è incluso nell'elettrodo, permettendo di attivare ed estrarreMisura racellulare le risposte neuronali delle GRN nel sensillum. Ma poiché il tastante è contenuto nell'elettrodo, non è possibile misurare l'attività GRN prima che il tastante venga consegnato o dopo essere stato rimosso o sostituito da tastanti senza sostituire l'elettrodo 20 . Un altro metodo, la tecnica di registrazione "parete", è stata utilizzata anche per registrare l'attività di GRN. Qui, un elettrodo di registrazione viene inserito nella base di un sensitio di gusto 24 , e i tastanti vengono consegnati attraverso un capillare di vetro separato sulla punta del sensilum. Entrambe le tecniche limitano la registrazione da GRN ad un particolare sensillum. Qui suggeriamo una nuova tecnica: registrazione da assoni GRN randomly selezionati da sensilla diversa, mentre separatamente distribuire sequenze di tastanti alla proboscide. Le registrazioni Axon vengono ottenute mettendo elettrodi di vetro o fasci di elettrodi extracellulari (tetrodes) nel nervo che trasporta gli assoni daGRNs nella proboscide della SEZ 10 . In Manduca , questi assi attraversano il nervo maxillare, che è noto per essere puramente afferente, permettendo la registrazione inequivocabile delle risposte sensoriali 25 . Questo metodo di registrazione da assoni consente, per più di due ore, una misura stabile delle risposte GRN prima, durante e dopo una serie di presentazioni tastative.
Qui descriviamo una procedura di dissezione per esporre i nervi maxillari insieme alla SEZ, che può consentire di registrare simultaneamente le risposte di più GRN e neuroni nella SEZ 10 . Descriviamo anche l'uso di registrazioni extracellulari di GRN usando un tetrode a filo metallico a 4 canali personalizzato che, combinato con un metodo di ordinamento a picchi, consente l'analisi simultanea di più (fino a sei) GRNs. Inoltre confrontiamo le registrazioni fatte con tetrodes a registrazioni effettuate con intracellulare forteelettrodi. Infine, descriviamo una nuova apparecchiatura per fornire stimoli tastanti. Adattato da apparecchiature utilizzate da molti ricercatori per distribuire odoranti negli studi di olfatto, la nostra nuova apparecchiatura offre vantaggi per studiare la tastatura: migliorare il sistema di consegna multicanale precedente, come quelli sviluppati da Stürckow e colleghi (vedi i riferimenti 26 , 27 ). Controllare la tempistica della consegna tastant mentre fornisce una lettura di tensione di questo tempo; E consente la rapida e sequenziale consegna di stimoli tastanti multipli 10 . L'apparecchio bagna la proboscide in un flusso costante di acqua pulita in cui possono essere consegnati impulsi controllati di tastante. Ogni impulso tastante passa sopra la proboscide e viene poi lavato via. I sapori contengono una piccola quantità di coloranti alimentari insapori, permettendo al sensore di colore di monitorare, con tempi precisi, il passaggio di tastant ovLa proboscide.
Protocol
Attenzione: Le bilance lische e polverose rilasciate da Manduca possono essere allergiche e si raccomanda l'uso di guanti di sicurezza in laboratorio e una maschera.
1. Dissection of Manduca sexta per rivelare i nervi maxillari e la SEZ
- Scegliere una falena appropriata di entrambi i sessi in base alle seguenti caratteristiche: tre giorni dopo l'eclizione con un aspetto generale sano (le ali devono essere completamente estese e le proboscide e le antenne devono essere intatte).
- Posizionare la falena singolarmente in una tazza di plastica per il trasporto.
- Inserire la falena in un tubo di polipropilene.
Attenzione: si consiglia di eseguire questo passaggio in una cappa di fumo per impedire che le scale powdery della falena si diffondano.- Il tubo deve essere leggermente più lungo del corpo della falena ( Figura 1A ). Il tubo può essere fatto tagliando un tubo in polipropilene da 15 ml. <Li> Spingere la falena fino a quando la testa è esposta e inserire la carta intestata nella seconda estremità del tubo per aiutare a mantenere immobile la falena ( Figura 1A ).
- Un getto d'aria può essere realizzato collegando una siringa (1 mL con un ago, ID intorno a 1,4 mm, con punta tagliente rimossa) ad una sorgente di aria compressa.
Nota: Dopo aver rimosso i capelli tutti i seguenti passaggi possono essere eseguiti al di fuori della cappa aspirante.
- Su un piatto di Petri, utilizzare la modellazione di argilla per costruire una base triangolare di circa 7 cm di lunghezza, 2,5 cm di altezza ( Figura 1B ).
Figura 1 : Preparazione della camera di dissezione per Manduca . ( A ) Una falena è trattenuta in un tubo. La testa è esposta su un'estremità, mentre l'altra estremità è collegata a carta tissue. ( B ) Viene mostrata una camera di dissezione fatta da un piatto di Petri e da un argilla modellante. La parte dorsale della testa è rivolta verso l'alto. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Proteggere le antenne e le proboscide.
- Preparare 3 piccoli tubi tagliando una punta pipetta (punte gialle, 1-200 μL) con una lama di rasoio in 3 pezzi di circa 0,5 cm di lunghezza. Il diametro interno deve essere abbastanza grande in modo che l'antenna e la proboscide possano adattarsi in modo snello.
- Preparare un gancio daPiegando un filo (22 AWG, di circa 7 cm di lunghezza). Estendi la proboscide della falena e poi inserisca in uno dei piccoli tubi tirandola attraverso il gancio del filo finché il tubo non raggiunge la parte prossimale della proboscide.
- Fissare il piccolo tubo con cera di batik (usando, ad esempio, una cera elettrica dentale per sciogliere e dirigere la cera) alla parte dorsale della capsula testa della falena ( figura 2A a sinistra).
- Posizionare ciascuna antenna in un tubo e fissare i tubi con la cera di batik come mostrato nella Figura 2A (a sinistra). Fare attenzione a non danneggiare le antenne con la cera calda.
- Stabilizzare il cervello contro il movimento tagliando i muscoli che coprono la superficie anteriore del cervello ( cioè il muscolo del compressore buccale).
- Sotto il microscopio di dissezione, utilizzare forbici a microdisezione o una mini-ax formata da un chip da raso incollato ad uno stuzzicadenti per aprire la capsula capaUn piccolo taglio appena sotto la punta ( figura 2A , inserto superiore sinistro).
- Usare forbici a microdissezione per tagliare il muscolo del compressore buccale (per illustrazioni vedere il riferimento 25 ). Poiché il muscolo non è facilmente visibile, è consigliabile eseguire il seguente test comportamentale per confermare che è stato tagliato.
- Diluire il saccarosio in acqua distillata per ottenere una soluzione da 1 M.
- Utilizzare una pipetta per fornire circa 200 μL di soluzione di saccarosio alla distale 2/3 del proboscide e osservare la proboscide per 5 minuti. Se il muscolo è stato tagliato correttamente l'insetto non dovrebbe essere in grado di estendere o spostare la proboscide.
- Applicare uno strato di cera di batik fuso per sigillare l'apertura nella capsula.
- Girare l'insetto in modo che il lato ventrale della capsula sia rivolto verso l'alto.
- Per perfezionare la soluzione salina durante e dopo la procedura di dissezione costruire una tazza di cera intorno al lato ventrale della testa usinG la cera elettrica: sotto un microscopio di dissezione, iniziare a costruire la tazza applicando la prima fila di cera lungo la parte anteriore della testa, muovendosi verso la parte posteriore. Mantenere i provini e i tubi dell'antenna all'interno della tazza ( figura 2A a destra).
- Continuare a costruire la coppa verso l'esterno e verso l'alto fino a raggiungere il livello degli occhi.
- Usare la pinza per prendere uno dei due palpi labiali, quindi posizionarlo sul lato e fissarlo nella tazza di cera, aggiungendo cera fuso più. Fai lo stesso con l'altro palpatore di massima ( figura 2A a destra).
- Sigillare eventuali aperture nella tazza e nei tubi di cera.
Nota: in questa fase l'epossidico viene utilizzato perché aiuta a sigillare facilmente i vuoti nelle cere e nei tubi e evita qualsiasi danno causato dal calore all'antenna e alla punta.- Utilizzare uno stuzzicadenti per mescolare l'epoxy binario in un piatto di miscelazione di plastica. Tenere il piatto di miscelazione.
- Utilizzare lo stuzzicadenti per applicare un sottileStrato di epossidico all'esterno e all'interno della tazza ( figura 2B ).
- Riempire lo spazio vuoto nei tubi che contengono le punte e le antenne con l'epossidico e riempire la parte del tubo di polipropilene che circonda il collo con abbondante epossidica per tenerlo saldamente in posizione ( Figura 2B ).
- Lasciare asciugare l'epossidico per circa 20 minuti. Per verificare questo, provare l'epossidico rimasto nel piatto di miscelazione di plastica per assicurarsi che sia solido e non sia più appiccicoso.
- Riempire la tazza di cera con la soluzione fisiologica Manduca 28 e aspettare un paio di minuti per assicurarsi che non ci siano perdite. Se una perdita è visibile, provare a sigillare applicando più cera calda e / o epossidica.
Figura 2 : Preparazione Manduca </ Em> per la dissezione. ( A ) Antenne e punte sono protette all'interno di piccoli tubi fatti da punte pipetta tagliate in tre pezzi di circa 0,5 cm di lunghezza. (Pannello sinistro, grande immagine) I tubi sono fissati con cera di batica fuso applicata attorno alla parte dorsale della testa. (Pannello sinistro, inserto) Per rimuovere il muscolo del compressore buccale, si apre il lato dorsale della capsula facendo un piccolo taglio come indicato dalla linea tratteggiata nella grande immagine. (Pannello destro) È stata creata una tazza di cera che circonda il lato ventrale della testa come serbatoio per la salina perfusa durante la procedura di dissezione e gli esperimenti di registrazione. ( B ) L'epoxy viene utilizzato per sigillare i vuoti tra la base della coppa di cera e la parte dorsale della testa (pannello sinistro) e tra la cera ei tubi che contengono le antenne e la punta, comprese le aperture dei tubi (pannello destro ). Clicca qui tO visualizzare una versione più grande di questa figura.
- Sotto il microscopio di dissezione, utilizzare forbici a microdissezione per tagliare i palpi labiali.
- Usate forbici a microdissezione o mini ascia per aprire il lato ventrale della capsula facendo quattro tagli: due tagli lungo la cuticola che circonda ogni occhio da indietro all'altra, un taglio sulla cuticola lungo il dorso della testa, E uno tagliato sulla cuticola lungo la parte anteriore della testa vicino alla proboscide ( Figura 3A ).
- Estrarre delicatamente la cuticola utilizzando pinze a microdissecco per esporre il cervello.
- Utilizzando due forti micro-dissection forchetti lentamente e con attenzione rimuovere il tessuto grasso e la trachea che copre la SEZ. Evitare qualsiasi danno al cervello o ai nervi (es., Nervo maxillo, nervo ottico, connettivo cervicale). Sciacquare il cervello sostituendo spesso la soluzione salina e regolare spesso la luce per una maggiore visibilità. Nota: questa può essere la parte più critica della dissection; È facile inavvertitamente danneggiare il nervo maxillare tirandolo o schiacciandolo.
Nota: a questo punto la SEZ ei nervi maxillari devono essere chiaramente visibili ( Figura 3B -3C ). Tuttavia, il cervello e i nervi maxillari sono coperti da una guaina sottile. - Per rimuovere la guaina, sostituire la soluzione salina nella tazza di cera con 10% (w / v) collagenasi / dispersione disciolta in soluzione salina e lasciarlo in posizione per 5 min. Quindi, dopo aver risciacquato diverse volte il cervello con la soluzione salina, rimuovere delicatamente la guaina con delle pinze micro-dissection super-fine tirando la guaina dalla SEZ attraverso i nervi maxillari.
- Cominciate a perfezionare la tazza di cera con salina fresca. Mettere il tubo da una linea di gocciolamento salino nella tazza di cera e fissarlo lì con cera fuso.
FiguraUre 3 : Manduca procedura di dissezione. ( A ) I palpi labiali rimossi, la capsula testa viene aperta facendo quattro tagli come indicato dalla linea punteggiata. ( B ) Una immagine ingrandita del cervello dopo aver aperto la capsula capa e rimuovendo i tessuti e la trachea grassi, permettendo la visualizzazione dei nervi maxillari (MxNs) e della zona sub esofagea (SEZ, termine che si riferisce all'area del cervello sotto il esofago). I nervi maxillari trasportano assoni dai neuroni del recettore gustativo (GRNs) nella proboscide alla SEZ. ( C ) Uno schema di un cervello di Manduca . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
2. Sistema di consegna a piacere
- Il sistema di consegna tastativo è composto da quattro elementi principali: la sorgente d'acqua, il collettore tastante, il sensore di colore e il sito che contiene leProboscide, tutte collegate ad un tubo di plastica rigido ( Figura 4A -4B ). Per costruire questo sistema, seguire i passaggi mostrati nella Figura 4B . Utilizzare un tubo di plastica rigido di circa 6 cm di lunghezza (ID 0,3 cm).
- Usare un ferro saldato per fare un piccolo foro nel tubo in cui verrà posto la proboscide ( Figura 4A -4B ).
- Per garantire che le proboscisi di diversi animali siano sempre posizionati nella stessa posizione, collegare il materiale di schermatura plastica (mesh, dimensione di circa 0,1 cm) nel tubo ( Figura 4A -4B ). Con una lama di rasoio o un utensile rotante tagliare il tubo rigido circa 5 mm sopra il foro della punta. Mettere la maglia tra i due pezzi di tubo. Fissare la rete e ricollegare i tubi applicando l'epossidico all'esterno dei tubi. Lasciare asciugare l'epossidico per circa 20 minuti.
- Per la consegna tastativa utilizzare un pressurizzatoSistema di perfusione con tanti tubi di tastatura necessari, uniti a un collettore (vedi sotto). Utilizzare il saldatore per fare un piccolo foro nel tubo rigido circa 1 cm sopra la maglia. Inserire il tubo di uscita dal sistema di perfusione (ID 0.86 mm) nel tubo rigido e fissarlo lì applicando l'epossidico ( Figura 4A -4B ).
- Utilizzare una pompa peristaltica per fornire un flusso costante (~ 40 mL / min) di acqua distillata. Collegarlo con tubo in silicone al tubo rigido ( Figura 4A -4C ). Collegare l'altro lato del tubo rigido ad un altro tubo di silicio per dirigere l'uscita in un grande contenitore di rifiuti ( Figura 4A -4C ).
- Per erogare il tastante, iniettare l'aria compressa nel collettore del sistema di perfusione. Ciò può essere ottenuto, ad esempio, utilizzando una pompa pneumatica (10 psi) controllata da un impulso di tensione temporizzato per iniettare l'aria compressa nel manifol D contenente il tastante desiderato. L'impulso di 1s espelle circa 0,5 ml di tastante.
3. Preparazione del tastante e controllo della consegna del tastante
- Diluire il sapore in acqua distillata alla concentrazione desiderata. Sappiate che il sapore sarà ulteriormente diluito dal flusso d'acqua. Abbiamo misurato la concentrazione finale che raggiunge la proboscide come il 77% della concentrazione iniziale (vedi riferimenti 10 , 29 ).
- Aggiungere un colorante alimentare artificiale a ciascuna soluzione tastante per consentire di determinare la precisa tempistica con cui il tastante passa sopra la proboscide. Abbiamo scoperto che il colorante verde (vedi Elenco materiali ) a 0,05% w / v non attiva Mandriva GRN.
- Utilizzare un sensore di colore (vedere tabella 1) per rilevare la colorazione alimentare nelle soluzioni tastative. Utilizzare un saldatore per fare un foro adiacente alla maglia e 0,5 cm sotto il tubo di uscita del sistema di perfusione ( S = "xfig"> Figura 4A -4B). Collegare il sensore al tubo rigido e fissarlo lì applicando l'epossidico all'esterno.
- Registrare l'uscita di tensione del sensore colore come segnale analogico insieme a segnali fisiologici (vedere sezione 4). Il segnale di tensione del sensore di colore può essere amplificato utilizzando un amplificatore DC collegato al sensore ( Figura 4A ).
- Assicurarsi che il sensore di colore funziona fornendo il tastante e registrando l'uscita di tensione del sensore. Il segnale emesso dal colorante dovrebbe superare il livello di rumore.
- Regolare la portata costante dell'acqua per rendere il segnale il più vicino alla piazza possibile.
Nota: quando viene consegnato più tastatori in sequenza, notare che la prima prova con un nuovo tastant consisterà in una miscela del tastante nuovo e precedente. Per questo motivo non abbiamo analizzato questi primi processi.
- Regolare la portata costante dell'acqua per rendere il segnale il più vicino alla piazza possibile.
Figura 4 : Sistema di consegna a piacere. ( A ) Uno schema dell'apparecchio utilizzato per la consegna e il monitoraggio di impulsi temporizzati di tastanti alla proboscide dell'animale. Le componenti principali del sistema sono indicate con numeri rossi. Un flusso costante di acqua distillata viene mantenuto attraverso la punta da una pompa peristaltica collegata a tubo di silicone al tubo di plastica rigido (1) in cui deve essere posizionato il proboscide (6). I tastanti contenenti una piccola quantità di colorante senza sapore vengono consegnati usando un sistema di perfusione a pressione a 16 canali pressurizzato. I serbatoi contenenti i tastanti sono collegati ad un collettore (2) attaccato al tubo rigido, sopra il foro in cui deve essere posizionato il proboscide (5). L'aria compressa da una pompa pneumatica viene iniettata al sistema di perfusione per fornire rapidamente un tastante, con timing controllato da software personalizzato. UNIl sensore di colore (3) viene utilizzato per monitorare la consegna tastante. Il sensore è collegato al tubo rigido adiacente alla proboscide e al di sotto dell'uscita del sistema di perfusione tastante. Il segnale di tensione del sensore di colore viene amplificato da un amplificatore DC. La traccia rossa sull'inserto adiacente all'amplificatore illustra un segnale di colore registrato usando un software personalizzato di acquisizione dati; Il rapido aumento e la diminuzione del segnale riflettono rispettivamente l'arrivo e il lavaggio del tastante. La proboscide della falena è posta in un foro (5) situato appena sotto il sensore di colore. Una mesh (4) è posta sopra il foro per assicurare che le proboscisi di diversi animali siano sempre posizionati nella stessa posizione. L'altro lato del tubo rigido è collegato ad un altro tubo di silicio per dirigere l'uscita in un contenitore di scarto (7). ( B ) Immagine che mostra gli elementi principali del sistema di consegna tastante collegato al tubo di plastica rigido, che sono indicati con i numeri rossi come mostrato nel pannello A: l'acqua(2), il sensore di colore (3), la maglia (4) e il foro in cui deve essere inserito il tastatore (5) tutti collegati in un tubo di plastica rigido (1) . ( C ) Viene mostrato il posizionamento della preparazione Manduca nel set-up. Il distale t2 / 3 della proboscide della falena viene introdotto nel foro (5) sul tubo rigido di plastica (1). La proboscide è fissata al posto con la cera dentale e l'epossidica come mostrato dall'inserto. L'ingresso dell'acqua al tubo rigido e la sua uscita in un contenitore di rifiuti sono indicati rispettivamente dai numeri 6 e 7. Il numero 2 indica il tubo di uscita del collettore tastativo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
4. Registrazione di tetrodi extracellulari per monitorare l'attività evocata dai GRN
- Preparare la preparazione della falena su una piattaforma sotto uno stereomicroscopio su una vibrazione( Figura 4C ).
- Mettere i due terzi distali della proboscide della falena nel tubo rigido del sistema di consegna tastante ( Figura 2B ). Per fare questo, estendere la proboscide della falena e poi inserirla nel foro del tubo rigido spingendola delicatamente con l'aiuto di una pinza. Sigillare la proboscide in posizione con cera dentale morbida e quindi uno strato di epoxy per evitare le perdite ( figura 4C , ingresso).
- Collegare la linea di perfusione salina alla capsula testa e impostare il flusso di perfusione ad una velocità costante di circa 0,04 L / h.
- Immergere un elettrodo di terra ( cioè un filo d'argento clorurato) nel bagno salino ( figura 5A ).
- Utilizzare un tetrodo a filo metallico su misura realizzato seguendo la procedura di fabbricazione descritta in 30 (sono consigliati 4 fili di elettrodo per ottenere unità ben isolate e adattarsiil nervo). Prima dell'esperimento, impilare l 'elettrodo seguendo le fasi descritte in 30 .
- Utilizzare un micromanipulatore manuale per posizionare il tetrodo vicino al nervo maxillare. Avanzate il tetrodo finché non comincia ad entrare nel nervo ( Figura 5 ).
- Attendere almeno 10 minuti dopo aver posizionato il tetrode per consentirgli di stabilizzare entro il nervo prima della registrazione.
- Amplificare il segnale (3000x) e utilizzare un filtro passa-banda impostato tra 0,3-6 kHz. Acquisire il segnale ad una frequenza di campionamento a 40 kHz usando il software di acquisizione dati.
- Dopo aver terminato l'esperimento, posizionare la preparazione della falena nel congelatore.
Figura 5 : Registrazione di tetrodi da GRN. ( A , immagine grande) Un micromanipulator è usato per pPizzo il tetrode del filo contorto nel nervo maxillare (MxN) per registrare l'attività dei GRNs. Un elettrodo di argento di cloruro di cloruro viene posto nel bagno salino come mostrato. ( A , inset) Un'immagine ingrandita del cervello che mostra il tetrode nel nervo maxillare. Viene inoltre indicata la zona sottosofagea (SEZ). ( B ) Uno schema di un cervello Manduca orientato come in A. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Representative Results
L'attività di GRNs può essere registrata utilizzando un elettrodo tetrode extracellulare prima, durante e dopo la consegna del tastante ( Figura 6A e 6C ). La Figura 6A (pannelli centrale e inferiore) mostra tracce di tensione filtrate (300-6000 Hz) registrate da ciascuno dei quattro fili disposti nel nervo mascellare, dove si possono osservare segnali di diverse ampiezze che riflettono i potenziali d'azione (frecce). Un impulso di tastan (1 M di saccarosio) di 1 s è stato consegnato 2 volte dopo l'inizio dell'esperimento; L'inizio e l'offset dello stimolo sono stati monitorati dal sensore di colore ( Figura 6A , pannello superiore). I tastanti hanno causato picchi che possono essere osservati in ciascuno dei quattro canali ( figura 6A , pannello centrale). I GRNs possono essere identificati e distinti dai meccanosensori (nessuno mostrato qui) quando rispondono ad alcuni tastanti e non altri Per identificare e isolare le risposte di singolo neurone dalle registrazioni di tetrode, abbiamo eseguito l'ordinamento di spike off-line utilizzando un insieme di funzioni personalizzate basate sui metodi di Pouzat 31 e Kleinfeld 32 , 33 (questi metodi sono descritti in queste citazioni: 10 , 29 ). La Figura 6B mostra un esempio di ordinamento di spike applicato ai dati mostrati nella Figura 6A , in cui sono state trovate tre unità ben isolate. I diagrammi raster della Figura 6C descrivono le risposte delle tre unità isolate nella Figura 6B a sei diverse tipologie (1 M saccarosio, maltosio e NaCl, 100 mM caffeina e 10 mM berberina e lobeline) consegnati in sequenza (4 sperimentazioniS / tastant sono mostrati). Come mostrato nella Figura 6C , i GRN registrati hanno livelli diversi di attività di base, che vanno da silenziosi (GRNs 1) a bassi o moderati (GRN 2 e 3). Dopo l'inizio tastante, i GRN mostrano diversi pattern di attività e mostrano una selettività diversa rispetto ai tastanti. Ad esempio, GRN 1 ha risposto solo al saccarosio, mentre GRN 2 ha risposto al maltosio e alla NaCl con burst di picchi e alla lobeline con spiking solo all'insorgenza dello stimolo. Inoltre, alcune risposte sono bloccate alla temporizzazione dello stimolo ( ad esempio la risposta GRN 1 al saccarosio), mentre altre risposte superano la durata dello stimolo ( ad esempio la risposta GRN 3 a berberina) o contengono componenti sia eccitatoriali che inibitori ( ad esempio, Figura 7 Risposte GRN 2 a NaCl e saccarosio). Per ulteriori informazioni sulle diverse sensibilità e modelli di attività dei GRN, vedere il riferimento 10 . Figura 7 ). Le tracce di tensione nella scatola verde del pannello A sono state registrate intracellulariamente da GRN 1 durante 5 prove consecutive della presentazione di saccarosio e le stesse risposte sono mostrate come diagrammi raster nel pannello B. (Si noti che questo tipo di risposta corrisponde a quello ottenuto con tetrodes e Mostrato in Figura 6C .) GRN 2, registrata con elettrodi intracellulari affilati, mostra un modello di risposta più ampio. 
Figura 6: Risultati rappresentativi delle registrazioni dei nervi maxillari con tetrosi extracellulari. ( A ) Sono mostrate tracce di tensione filtrate (300-6,000 Hz) registrate da ciascuno dei quattro fili al nervo mascellare (pannello centrale). Un impulso di tastante da 1 s è stato applicato durante il periodo indicato dall'ombreggiatura rossa nel pannello centrale. L'inizio e l'offset dello stimolo è stato monitorato dal sensore di colore come indicato dalla traccia di tensione rossa sul pannello superiore e viene indicato sul pannello centrale dall'area a colori rossi. Le linee orizzontali punteggiate indicano +50 (alto), 0 (medio) e -50 (basso) μV. Viene mostrato un ingrandimento delle tracce di tensione raw corrispondenti all'area all'interno delle linee verticali tratteggiate (pannello inferiore). Esempi di punti sono indicati dalle frecce. ( B ) Un esempio di ordinamento di spike applicato ai dati mostrati nel pannello A. Le forme d'onda registrate in ognuno dei quattro fili extracellulari (1-4) arE identificati con tre GRN differenti (unità 1-3) che contribuiscono ai segnali registrati. Sono indicate le manifestazioni individuali (linee sottili colorate) e la media (spessore della linea nera) per le tre unità. È necessario considerare un certo numero di criteri statistici per identificare in modo affidabile le unità indipendenti usando il metodo di classificazione delle chiavi (cfr. I riferimenti 10 , 29 ). ( C ) Le trame raster rappresentanti le risposte delle tre unità isolate ad una sequenza di sei diversi tastanti (4 prove / tastant sono mostrate). Il periodo di consegna tastant (1 s) è indicato dall'area a colori rossi. Le concentrazioni di tastanti erano o 1 M (saccarosio, maltosio, NaCl), 100 mM (caffeina) e 10 mM (berberina e lobeline). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Lass = "xfigimg" src = "/ files / ftp_upload / 55868 / 55868fig7.jpg" />
Figura 7 : Registrazioni Intracellulari da GRN Axons. ( A , pannello a scatola verde) Tracce di tensione registrate da un GRN con elettrodi intracellulari di vetro nitidi (resistenza di 80-120 MΩ) immessi nel nervo maxillario, causati da 5 stimoli consecutivi con 1 M sucrose (Suc). ( B ) Raster trame delle risposte di due GRN, comprese le risposte riportate nel pannello A (pannello verde), a due diversi tastanti consegnati in sequenza (100 mM colore grigio caratteri, 1M colore nero caratteri) registrati con elettrodi intracellulari di vetro nitidi Posizionati nel nervo maxillare (7 prove / tastant e 3 prove / acqua sono mostrate). Il tempo di consegna è indicato da aree a tonalità rosse in entrambi i pannelli. L'inizio e l'offset dello stimolo è stato monitorato dal sensore di colore, come indicato dalle tracce di tensione rossa nella parte inferiore di ciascun pannello.Es / ftp_upload / 55868 / 55868fig7large.jpg "target =" _ blank "> Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
I metodi qui descritti consentono di registrare in vivo da un animale relativamente semplice, Manduca sexta , a caratterizzare l'attività di GRN multipli selezionati in modo casuale per lunghe durate (per più di 2 ore), prima, durante e dopo la consegna del sapore. Questi metodi consentono anche la rapida e sequenziale consegna di stimoli tastanti multipli con preciso controllo temporale, vantaggi utili per studiare meccanismi neurali alla base della rappresentazione tastante. Questo protocollo è stato utilizzato per studiare come le risposte dei GRN ai tastanti vengono trasformate quando vengono trasmesse ai loro neuroni targetistici postinaptici ( ad es. Nella SEZ) monitorando GRN simultaneamente con gli interneuroni 10 monocinapticamente collegati. Inoltre, questi metodi possono essere adattati alle esigenze del sperimentatore, permettendo l'esecuzione di paradigmi complessi per studiare aspetti fondamentali della codifica gustativa.
Quando cominciaNei nostri studi, un problema tecnico a volte dovuto risolvere è stato l'incapacità di rilevare segnali di picco dal nervo maxillare con i fili tetrode. Le cause possibili per questo sono diverse, poiché il protocollo di dissezione è impegnativo e occorre una certa pratica per ottenere una buona preparazione. Innanzitutto, durante la dissezione delle falene i nervi maxillari sono facili da danneggiare, soprattutto durante la rimozione della guaina che circonda il tessuto nervoso. In secondo luogo, se la guaina non viene rimossa completamente, i fili tetrode potrebbero non essere in grado di accedere al nervo. In entrambi i casi, avviare una nuova preparazione è spesso il modo più semplice per risolvere questi problemi. In terzo luogo, potrebbe esserci un problema con i cavi tetrode. Questo può essere verificato misurando l'impedenza dei cavi che dovrebbe essere di ~ 270 kΩ a 1 kHz. Se il valore dell'impedenza è superiore a ~ 300 kΩ, impilare i cavi con oro per ottenere l'impedenza desiderata (vedi riferimento 30 ). Quarto, un pezzo di apparecchiatura potrebbe essere disconnessoO malfunzionamenti.
Un altro possibile problema è che vengono registrati segnali spiking ma i neuroni sembrano non rispondere ai tastanti. Ciò potrebbe essere dovuto al fatto che i neuroni registrati sono insensibili all'insieme dei tastanti consegnati. Inoltre, è importante tenere a mente che, oltre agli assoni di GRN, il nervo maxillare porta anche fibre meccanosensorie. Così, è possibile registrare da neuroni meccanosensori anziché, o in aggiunta a, GRNs. Tuttavia, il sistema di consegna tastante è stato progettato per fornire un costante input meccanico durante l'esperimento rendendo improbabile che le risposte a un tastante saranno confuse dalle risposte alla componente meccanica della sua consegna. I neuroni che rispondono ad alcuni ma non altri tastanti, o in modi diversi ai tastanti diversi, possono essere classificati in modo non definito come GRNs. Si consiglia di utilizzare tostanti appena diluiti per evitare variazioni di concentrazione o composizione tastante a causa del degrado o dell'evaporazione compostaDel solvente. Raccomandiamo inoltre di pulire regolarmente il sistema per evitare contaminazioni e / o ostacoli.
Un altro possibile problema tecnico è un rapporto segnale-rumore svantaggioso. Questo problema può essere spesso risolto con re-clorizzazione o regolazione della posizione dell'elettrodo di terra del bagno. Altre soluzioni potrebbero richiedere schermature e ridurre al minimo la lunghezza di ogni connessione elettrica nell'apparecchio.
Infine, è importante notare che un'analisi corretta dei dati ottenuti utilizzando le registrazioni di tetrode richiede un'attenta selezione dei picchi. Abbiamo scoperto che i metodi completamente automatizzati sono generalmente inadeguati. Prima di analizzare i dati di tetrode 10 , 29 , 31 , 32 , 33 , si consiglia di familiarizzare con la letteratura di classificazione delle chiavi.
Alternative alla nostra dissezione proPuò essere utilizzato il tocol. Qui abbiamo descritto una dissezione attraverso la parte ventrale della testa della falena, che fornisce l'accesso ai nervi maxillari e SEZ, ma è anche possibile accedere a queste strutture attraverso la dissezione attraverso il lato dorsale. Abbiamo trovato che la preparazione laterale dorsale non è ottimale per fare registrazioni da queste strutture gustative grazie alla loro posizione profonda, ma questa preparazione offre il vantaggio di consentire registrazioni da strutture di ordine superiore come il corpo di funghi, un'area associata a multi Integrazione -sensoriale, apprendimento associativo e elaborazione della memoria 34 . Ci siamo concentrati sull'utilizzo di elettrodi tetrodi per registrare dal nervo maxillare, ma, come abbiamo illustrato, possono anche essere utilizzati standard elettrodi intracellulari affilati. Inoltre, entrambe le tecniche possono essere combinate per eseguire registrazioni simultanee da più aree cerebrali 10 . La letteratura neuroscienze offre molti esempi di iModelli nertebrati che si sono dimostrati potenti strumenti per rivelare principi fondamentali di elaborazione sensoriale, come la codifica olfattiva, che si applicano sia agli insetti che ai vertebrati 35 , 36 , 37 , 38 , 39 . Speriamo che i nostri metodi porti a nuove conoscenze fondamentali sulla codifica gustativa.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da una concessione intramurale da parte di NIH-NICHD a MS Ringraziamo G. Dold e T. Talbot della NIH-NIMH Instrumentation Core Facility per assistenza nella progettazione del sistema di consegna tastante.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection and Specimen Preparation | |||
| Polypropylene tube, 15 mL Falcon | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Needle, Short bevel, 19 G x 1 - 1/2" | MONOJET | 888200144 | For applying air to remove the hair from the moth. |
| Modeling Clay-Van Aken Plastalina | DickBlick | 33268 | |
| Petri dish -100 x 15 mm | VWR International | 89000-304 | |
| Pipette tip (1 - 200 µL) | USA Scientific | 1111-0806 | |
| Razor blade | Techni Edge | TE05-071 | |
| 22 AWG standard hookup wire | AlphaWire | 1551 | For inserting the proboscis into the pippete tip. |
| Batik wax | Jacquard | 7946000 | |
| Electric waxer | Almore International | 66000 | |
| Stereo Myscroscope | Leica | MZ75 | |
| Dumont #1 forceps (coarse) | World Precision Instruments | 500335 | For removing fat and non-nervous tissue. |
| Dumont #5 titanium forceps (fine) | World Precision Instruments | 14096 | For removing fat and non-nervous tissue. |
| Dumont #5SF forceps (super-fine) | World Precision Instruments | 500085 | For desheathing the nervous tissue. |
| Vannas scissors (fine) | World Precision Instruments | 500086 | For removing the cuticle. |
| Collagenase/Dispase | Sigma-Aldrich | 11097113001 | |
| Epoxy | Permatex | 84101 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline Perfusion System | |||
| Extension set with rate flow regulator | B Braun Medical Inc. | V5200 | |
| IV administration set with Y injection site | B Braun Medical Inc. | V1402 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tastant Delivery System | |||
| White Translucent Nylon Tubing OD 1/4", ID 1/8" | Small Parts Inc. | B001JJT4SA | Rigid tube that connects the four main elements of the system. |
| Soldering iron | Circuit Specialists | ZD200BK | |
| Rotary tool-Dremel | Dremel | 4200 | |
| Polypropylene mesh, hole size (hole size 0.1 x 0.13 cm) | Industrial Netting | XN5170 | For ensuring that the probosises of different animals are placed in the same location. |
| Pressurized 16-Channel perfusion system | Bioscience Tools | PS-16H | For tastant delivery. This system includes pinch valves, tubing, manifold, solution cylinders, valve controller and fitting accessories. |
| Polypropylene tubing, ID 0.034", ID 0.050" | Becton, Dickinson & Co | 427421 | Output tube from the perfusion system. |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For controlling the output channel of the perfusion system. |
| Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card | National Instruments | LabVIEW 2011 | To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor. |
| Compulab 3 Manostat peristaltic pump | Sigma | P1366 | For pumping water. |
| Silicone tubing, ID 1/16" OD 1/8" | Cole-Parmer | WU-95802-02 | To connect the water source to the peristaltic pump tubing, and the outlet tube of the pump to the rigid tube of the delivery system. |
| Color sensor-digital fiber optic sensor | Keyence | FS-V31M | For monitoring tastant delivery. |
| Color sensor-reflective fiber unit | Keyence | FU35-FZ | To connect the color sensor device. |
| Dental periphery Wax | Henry-Schein Dental | 6652151 | To secure the proboscis into the rigid tube. |
| Two 3.7 L containers | To provide water to the system, and to recollect the water waste. | ||
| Fast green FCF | Sigma | F7258 | |
| Dressing forceps 25.5 cm | WPI | 500364 | To introduce moth proboscis into the proboscis hole in the rigid tube. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electrophysiology Equipment | |||
| D.C. amplifier | Brown-Lee | 440 | |
| Lamp | Schott | Schott Fostec Light Source DCR 2 | |
| Manual micromanipulator | Leica | micromanipulator | To precisely insert the tetrodes into the animal's brain. The manipulator has to allow fine and coarse movements in x, y and z axis. |
| Stereomicroscope | Leica | MZ75 | |
| Vibration-isolation table (MICRO-g lab table) | TMC | 63-541 | |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2014 | |
| 16-channle pre-amplifier and amplifier | 16 Channel MA-800 Amplifier System | B.E.S 2013 | |
| Computer | Dell | optiplex 780 | The following are the minimum recommended requirements. RAM: 3.32 GHz, 3GB. Processor: Intel Core 2 Duo. Graphic card: integrated Intel GMA X4500. |
| Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card | National Instruments | LabVIEW 2011 | To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor and electrode. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tastants | |||
| KAc | Sigma-Aldrich | P5708 | |
| LiCl | Sigma-Aldrich | L9650 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 73575 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 |
References
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