Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Nye metoder for å studere gustatorisk koding

Published: June 29, 2017 doi: 10.3791/55868
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1
1National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health (NIH), 2Max Planck Institute for Brain Research
* These authors contributed equally

Summary

Vi presenterer tre nye metoder for å studere gustatorisk koding . Ved å bruke et enkelt dyr, beskriver moth Manduca sexta ( Manduca ) en disseksjonsprotokoll, bruk av ekstracellulære tetroder for å registrere aktiviteten til flere gustatoriske reseptorneuroner, og et system for levering og overvåking av nøyaktig tidsbestemte pulser av smakstoffer.

Abstract

Sans for smak tillater dyr å oppdage kjemikalier i miljøet, noe som gir opphav til atferd som er kritisk for overlevelse. Når Gustatory Receptor Neurons (GRNs) oppdager tastantmolekyler, koder de informasjon om identiteten og konsentrasjonen av smaken som mønstre av elektrisk aktivitet som deretter propagerer til følge neuroner i hjernen. Disse mønstrene utgjør interne representasjoner av tastanten, som deretter tillater dyret å velge handlinger og danne minner. Bruken av relativt enkle dyremodeller har vært et kraftig verktøy for å studere grunnleggende prinsipper i sensorisk koding. Her foreslår vi tre nye metoder for å studere gustatorisk koding ved hjelp av moth Manduca sexta . Først presenterer vi en disseksjonsprosedyre for å eksponere de maksillære nerver og subesophageal zone (SEZ), slik at registrering av aktiviteten av GRNs fra deres axoner. For det andre beskriver vi bruken av ekstracellulære elektroder for å registrere aktiviteten til flere GRNer ved å plassere teTråden ledes direkte inn i den maksillære nerveen. For det tredje presenterer vi et nytt system for levering og overvåking, med høy temporal presisjon, pulser av forskjellige smakestoffer. Disse metodene tillater karakterisering av nevrale responser in vivo direkte fra GRNs før, under og etter smaksprøver blir levert. Vi gir eksempler på spenningsspor registrert fra flere GRNer, og presenterer et eksempel på hvordan en spikesortingsteknikk kan brukes på dataene for å identifisere svarene til individuelle nevroner. Til slutt, for å validere vår opptakstilgang sammenligner vi ekstracellulære opptak hentet fra GRN med tetroder til intracellulære opptak oppnådd med skarpe glasselektroder.

Introduction

Gustatory og olfactory systemer genererer interne representasjoner av kjemikalier i miljøet, som gir opphav til oppfatning av smak og lukt, henholdsvis. Disse kjemiske sansene er avgjørende for å fremkalle en rekke atferd som er kritiske for organismenes overlevelse, alt fra å finne venner og måltider for å unngå rovdyr og toksiner. Prosessen begynner når miljøkjemikalier samhandler med reseptorer lokalisert i plasmamembranene av sensoriske reseptorceller; Disse cellene, direkte eller gjennom interaksjoner med nevroner, overfører informasjon om identitet og konsentrasjon av kjemikalier til elektriske signaler. Disse signalene overføres deretter til høyere rekkefølge neuroner og til andre hjernestrukturer. Etter hvert som disse trinnene utvikler seg, gjennomgår det opprinnelige signalet alltid endringer som fremmer organismens evne til å oppdage, diskriminere, klassifisere, sammenligne og lagre sensoriske opplysninger og velge en passende handling. Forstå hvordan bhI forvandler informasjon om miljøkjemikalier for best å utføre en rekke oppgaver er et grunnleggende spørsmål i nevrovitenskap.

Gustatkodning har blitt antatt å være relativt enkel: En allsidig oppfatning peker på at hvert kjemisk molekyl som fremkaller en smak (en "tastant") naturlig hører til en av de omtrentlige fem eller så grunnleggende smakegenskaper ( dvs. søt, bitter, sur , Salt og umami) 1 . I denne "grunnleggende smak" -visningen er jobben til gustatory systemet å avgjøre hvilken av disse grunnleggende smakene som er tilstede. Videre er nevrale mekanismer som ligger bak grunnleggende smakrepresentasjon i nervesystemet uklare, og antas å være styrt av enten en "merket linje" 2 , 3 , 4 , 5 , 6 eller en "over fibermønster" 7 , 8 kode. I en merket linjekode reagerer hver sensoriske celle og hver av sine nevrale følgere på en enkelt smakskvalitet, og danner sammen en direkte og uavhengig kanal til høyere behandlingssentre i sentralnervesystemet dedikert til den smaken. I motsetning til, i en tverrfibermønsterkode, kan hver sensorisk celle reagere på flere smaksegenskaper slik at informasjon om tastanten er representert ved den generelle responsen til befolkningen av sensoriske nevroner. Hvorvidt gjengivelsesinformasjon er representert ved grunnleggende smak, gjennom merkede linjer, eller gjennom en annen mekanisme, er uklart og er fokus for den nylige undersøkelsen 3 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Vårt eget siste arbeid tyder på at gustatory systemet bruker en spatiotemporal befolkningskode for å generereRepresentasjoner av individuelle smaksprøver i stedet for grunnleggende smakskategorier 10 .

Her tilbyr vi 3 nye verktøy som hjelper til med studiet av gustatorisk koding. Først foreslår vi bruken av hawkmoth Manduca sexta som en relativt enkel modellorganisme som er egnet til elektrofysiologisk smakstudie og beskriver en disseksjonsprosedyre. For det andre foreslår vi bruk av ekstracellulære "tetroder" for å registrere aktiviteten til individuelle GRNs. Og for det tredje foreslår vi et nytt apparat for levering og overvåkning av nøyaktig tidsbestemte pulser av smakende til dyret. Disse verktøyene ble tilpasset teknikker som vårt laboratorium og andre har brukt til å studere det olfaktoriske systemet.

Insekter som fruktflugten Drosophila melanogaster , gresshoppet Schistocerca americana , samt moth Manduca sexta, har i flere tiår gitt kraftige ressurser for å forstå grunnleggende prinsipper om nedreVous system, inkludert sensorisk koding (for eksempel olfaction 13 ). I pattedyr er smaksreseptorer spesialiserte celler som kommuniserer med nevroner gjennom komplekse andre messengerbaner 1 , 14 . Det er enklere i insekter: deres smakreseptorer er nevroner. Videre er pattedyrsmaksveier nær periferien relativt komplekse, med flere parallelle nevrale ruter, og viktige komponenter er utfordrende å få tilgang til, inneholdt i små benformede strukturer 15 . Insekt smaksstier synes å være enklere. I insekter finnes GRNs i spesialiserte strukturer kjent som sensilla, plassert i antennen, munnstykker, vinger og ben 16 , 17 . GRNs prosjektet direkte til subesophageal zone (SEZ), en struktur som har vært antatt å være hovedsakelig gustatory 17 , og som inneholder andre rekkefølgeGustatoriske nevroner 10 . Derfra reiser informasjonen til kroppen for å kjøre reflekser, og til høyere hjerneområder som skal integreres, lagres og til slutt drive opptaksvalg 16 .

Det er nødvendig å karakterisere perifer smaksrespons for å forstå hvordan smaksinformasjon er forplantet og forvandlet fra punkt til punkt gjennom hele nervesystemet. Den mest brukte metoden for direkte overvåking av den nevrale aktiviteten til GRNs i insekter er tips-opptaksteknikken 12 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . Dette innebærer å plassere en elektrode direkte på en sensillum, hvorav mange er relativt lett tilgjengelige. Tasteren er inkludert i elektroden, slik at man kan aktivere og utstyreMåler racellulært neuronale responser av GRN i sensillum. Men fordi tastanten er inneholdt i elektroden, er det ikke mulig å måle GRN-aktivitet før tastanten leveres eller etter at den er fjernet, eller å bytte ut tastanter uten å erstatte elektroden 20 . En annen metode, "sidevegg" -opptaksteknikken, har også blitt brukt til å registrere GRNs-aktivitet. Her settes en innspillingselektrode inn i bunnen av en smak sensillum 24 , og smakestoffer leveres via en separat glasskapillær på sensillumets spiss. Begge teknikkene begrenser innspillingen fra GRN til en bestemt sensillum. Her foreslår vi en ny teknikk: innspilling fra tilfeldig utvalgte GRN-axoner fra forskjellige sensillaer, samtidig som de leverer sekvenser av tastants til proboscis. Axon-opptak oppnås ved å plassere enten skarpe glasselektroder eller ekstracellulære elektrodbunter (tetroder) inn i nerven som bærer axoner fraGRNs i proboscis til SEZ 10 . I Manduca går disse axonene over den maksillære nerveen, som er kjent for å være rent avferent, noe som tillater en entydig registrering av sensoriske responser 25 . Denne metoden for opptak fra axoner tillater, i mer enn to timer, stabil måling av GRN-responsene før, under og etter en rekke tastantpresentasjoner.

Her beskriver vi en disseksjonsprosedyre for å eksponere de maksillære nerver sammen med SEZ, som kan tillate at man samtidig registrerer svarene på flere GRN og neuroner i SEZ 10 . Vi beskriver også bruken av ekstracellulære innspillinger av GRNs ved hjelp av en skreddersydd 4-kanals vridet trådtetrode som i kombinasjon med en spikesorteringsmetode tillater analyse av flere (i våre hender opptil seks) GRNs samtidig. Vi sammenligner videre opptak laget med tetroder til opptak gjort med skarp intracellulærelektroder. Til slutt beskriver vi et nytt apparat for å levere tastant stimuli. Tilpasset fra utstyr som lenge brukes av mange forskere til å levere luktstoffer i olfaction-studier, tilbyr vårt nye apparat fordeler for å studere gustation: forbedring ved tidligere flerkanalsleveringssystem som de som utvikles av Stürckow og kollegaer (se referanser 26 , 27 ), våre apparater oppnår presis Kontroll over tidspunktet for tastantilførselen mens du gir en spenningsavlesning av denne timingen; Og det tillater rask, sekventiell levering av flere tastant stimuli 10 . Apparatet bader probosciset i en konstant strøm av rent vann inn i hvilken kontrollerte pulser av tastant kan leveres. Hver tastantpuls passerer over proboscis og vaskes deretter bort. Tastants inneholder en liten mengde smakløs matfarging, slik at en fargesensor kan overvåke, med presis tid, passeringen av tastant ovEr proboscis.

Protocol

Forsiktig: Fine, pulverformige skalaer som frigjøres av Manduca, kan være allergifremkallende, slik at bruk av laboratoriesikkerhetshansker og ansiktsmaske anbefales.

1. Disseksjon av Manduca sexta for å avdekke Maxillary Nerves og SEZ

  1. Velg en passende møll av begge kjønn basert på følgende trekk: tre dager etter eclosion med et generelt sunt utseende (vingene skal være fullt utvidet, og proboscis og antenner bør være intakte).
    1. Plasser møllen individuelt i en plastikkkopp for transport.
  2. Sett moten i et polypropylenrør.
    Forsiktig: Vi anbefaler at du utfører dette trinnet i en avtrekksdeksel for å hindre at malens pulverformige skalaer sprer seg.
    1. Røret bør være litt lengre enn motets kropp ( figur 1A ). Røret kan fremstilles ved å kutte et 15 ml polypropylenrør.
      2. <Li> Skyv moten til hodet er eksponert og sett balled opp vevpapir inn i den andre enden av røret for å holde moten immobile ( Figur 1A ).
  3. Fjern håret fra moths eksponerte hode (ventral og dorsal) ved å blåse trykkluft på den.
    1. En luftstråle kan gjøres ved å koble en sprøyte (1 ml med en nål, ID rundt 1,4 mm, med skarp spiss fjernet) til en trykkluftkilde.
      Merk: Etter at håret har blitt fjernet, kan alle trinnene utføres utenpå avtrekksdekselet.
  4. Når det meste av håret er fjernet, plasserer du røret i et holdkammer med den dorsale delen av hodet oppad, som vist i figur 1B .
    1. På en petriskål bruker du modelleringsleir for å bygge en trekantig base ca 7 cm lang, 2,5 cm høy ( figur 1B ).


Figur 1 : Fremstilling av Disseksjonskammeret for Manduca . ( A ) En møll er fastholdt i et rør. Hodet er utsatt i den ene enden, mens den andre enden er plugget med vevpapir. ( B ) Et disseksjonskammer laget av en petriskål og modelleringsleire er vist. Den dorsale delen av hodet vender oppover. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Beskytt antennene og proboscisene.
    1. Forbered 3 små rør ved å kutte en pipettespiss (gule tips, 1-200 μL) med et knivblad i 3 stykker på ca 0,5 cm i lengden. Den indre diameteren skal være stor nok, slik at antennen og proboscisen kan passe godt sammen.
    2. Klargjør en krokBøyning av en ledning (22 AWG, ca 7 cm lang). Forleng moths proboscis og sett det deretter inn i et av de små rørene ved å trekke det gjennom med trådkroken til røret når den proksimale delen av proboscis.
    3. Fest det lille røret med fast batikvoks (ved hjelp av for eksempel en dental elektrisk voks for å smelte og lede voksen) til den dorsale delen av møllens hodekapsel ( figur 2A til venstre).
    4. Plasser hver antenne i et rør og fest rørene med batik voks som vist på figur 2A (til venstre). Pass på å unngå å skade antennene med varmt voks.
  2. Stabiliser hjernen mot bevegelse ved å kutte muskler som dekker den fremre overflaten av hjernen ( dvs. bukkal kompressor muskel).
    1. Under disseksjonsmikroskopet, bruk mikrodisseksjonssaks eller en mini-øksformet fra en razorchip limt til en tannpirke for å åpne hodekapselet av makLegg inn et lite kutt like under proboscis ( Figur 2A , venstre øvre innsats).
    2. Bruk mikrodisseksjonssaks til å kutte bukkalkompressormuskelen (for illustrasjoner se referanse 25 ). Siden muskelen ikke er lett synlig, anbefales følgende atferdstest for å bekrefte at den har blitt kuttet.
    3. Fortynn sukrose i destillert vann for å oppnå en 1 M løsning.
    4. Bruk en pipette til å levere ca. 200 μl sukroseoppløsning til den distale 2/3 av proboscisen, og følg proboscis i 5 min. Hvis muskelen var ordentlig kuttet, bør insektet ikke kunne forlenge eller flytte proboscis.
    5. Påfør et lag med smeltet batik voks for å forsegle åpningen i hodekapselet.
  3. Vend insektet over, så den ventrale siden av hodekapslen er nå vendt oppover.
  4. For å perfuse saltvann under og etter disseksjonsprosedyren, oppbygg en vokskopp rundt den ventrale siden av hodet usinG den elektriske vokseren: Under et disseksjonsmikroskop, begynn å bygge koppen ved å påføre den første raden av voks langs forsiden av hodet og bevege seg mot baksiden. Hold proboscis og antenne rør inne i koppen ( Figur 2A høyre).
    1. Fortsett å bygge koppen utover og oppover til den når øynene.
  5. Bruk tanger for å ta en av de to labial palpsene, sett den på siden og fest den inn i vokskoppen ved å legge til mer smeltet voks. Gjør det samme med den andre maxillary palp ( Figur 2A høyre).
  6. Søl noen åpninger i vokskoppen og -rørene.
    Merk: I dette trinnet brukes epoxy fordi det bidrar til å forsegle hull i voks og rør, og unngår varmeskader på antennene og proboscisene.
    1. Bruk en tannpirke til å blande binær epoksy i en plastblanding. Hold på blandingsretten.
    2. Bruk tannpirken til å bruke en tynnLag av epoxy til utsiden og innsiden av koppen ( figur 2B ).
    3. Fyll det tomme rommet i rørene som inneholder proboscis og antenner med epoxy, og fyll den delen av polypropylenrøret som omgir nakken med nok epoxy for å holde den ordentlig på plass ( figur 2B ).
    4. La epoksyet tørke i ca 20 minutter. For å sjekke dette, test epoxy gjenværende i plastblandingen for å sikre at den er solid og ikke lenger klebrig.
    5. Fyll vokskoppen med Manduca fysiologisk saltvann 28 og vent et par minutter for å sikre at det ikke er noen lekkasjer. Hvis en lekkasje er synlig, prøv å forsegle den ved å bruke mer varm voks og / eller epoksy.

Figur 2
Figur 2 : Forbereder Manduca </ Em> for Dissection. ( A ) Antenn og proboscis er beskyttet inne i små rør laget av pipettespisser skåret i tre stykker på ca 0,5 cm i lengde. (Venstre panel, stort bilde) Rørene er festet med smeltet batik voks påført rundt den dorsale delen av hodet. (Venstre panel, innsett) For å fjerne bukkal kompressormuskulaturen, åpnes den dorsale siden av hodekapselen ved å lage et lite kutt som angitt av den stiplede linjen i det store bildet. (Høyre panel) En vokskopp er bygget rundt den ventrale siden av hodet som et reservoar for perfusert saltvann under disseksjonsprosedyren og opptaksforsøk. ( B ) Epoksy brukes til å forsegle hull mellom bunnen av vokskoppen og den dorsale delen av hodet (venstre panel), og mellom voks og rør som inneholder antennene og proboscisene, inkludert rørets åpninger (høyre panel ). Vennligst klikk her tO se en større versjon av denne figuren.

  1. Under disseksjonsmikroskopet, bruk mikro-disseksjon saks for å kutte av labial palps.
  2. Bruk micro-disseksjon saks eller en mini-økse for å åpne ventralsiden av hode kapsel ved å lage fire kutt: to kutt langs kutikula som omgir hvert øye fra baksiden til forsiden, en kutt på neglene langs baksiden av hodet, Og en kutt på kuttebåndet langs forsiden av hodet nær probosciset ( figur 3A ).
  3. Trekk forsiktig av kutikulaen ved hjelp av mikrodisseksjonsspor for å avsløre hjernen.
  4. Ved å bruke to skarpe mikro-disseksjonspincer sakte og forsiktig fjern fettvev og trachea som dekker SEZ. Unngå skade på hjernen eller nervene (f.eks. Maxillary nerve, optisk nerve, cervical connective). Skyll hjernen ved ofte å erstatte saltoppløsningen, og juster lyset ofte for bedre synlighet. Merk: Dette kan være den mest kritiske delen av dissection; Det er lett å utilsiktet skade den maksillære nerven ved å rive på eller knuse den.
    Merk: På dette punktet bør SEZ og maksillære nerver være tydelig synlige ( Figur 3B -3C ). Imidlertid er hjernen og de maksillære nerver dekket av en tynn skjede.
  5. For å fjerne skede, erstatt saltvannet i vokskoppen med 10% (w / v) kollagenase / dispas oppløst i saltoppløsning og la den stå på plass i 5 minutter. Deretter, etter at du har spylt hjernen flere ganger med saltvann, fjern forsiktig skjeden med superfine mikrodisseksjonspincett ved å trekke skjeden opp fra SEZ gjennom de maksillære nerver.
  6. Begynn å perfuse vokskoppen med fersk saltvann. Plasser røret fra en saltoppløsning i vokskoppen og fest den med smeltet voks.

Figur 3
figUre 3 : Manduca Disseksjonsprosedyre. ( A ) De labielle palpene fjernes, hodekapselet åpnes ved å lage fire kutt som angitt av den stiplede linjen. ( B ) Et forstørret bilde av hjernen etter å ha åpnet hodekapselet og fjerning av fettvev og luftrør, noe som gjør det mulig å visualisere maksilærnervene (MxNs) og den subesofagale sone (SEZ, et begrep som refererer til hjerneområdet under øsofagus). De maksillære nerver bærer aksoner fra gustatoriske reseptorneuroner (GRNs) i proboscis til SEZ. ( C ) En skjematisk av en Manduca- hjerne. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

2. Tastant Delivery System

  1. Kjøttleveringssystemet består av fire hovedelementer: vannkilden, smaksprøven, fargesensoren og stedet som inneholderProboscis, alle koblet til et stivt plastrør ( Figur 4A -4B ). For å bygge dette systemet følger du trinnene som vises i Figur 4B . Bruk et stivt plastrør ca 6 cm i lengden (ID 0,3 cm).
  2. Bruk et loddejern til å lage et lite hull i røret hvor proboscis skal plasseres ( figur 4A -4B ).
  3. For å sikre at probosene til forskjellige dyr alltid er plassert på samme sted, fest plastbeskyttelsesmateriale ( maskehullstørrelse på ca 0,1 cm) inn i røret ( Figur 4A -4B ). Ved hjelp av et knivblad eller et roterende verktøy kutt det stive røret ca 5 mm over proboscis-hullet. Plasser masken mellom de to rørstykkene. Sikre masken og koble til rørene igjen ved å påføre epoxy på utsiden av rørene. La epoksyet tørke i ca 20 minutter.
  4. For tastant levering, bruk trykkPerfusjonssystem med så mange tastantrør etter behov, sammen med en manifold (se nedenfor). Bruk loddejernet til å lage et lite hull i det stive røret ca. 1 cm over masken. Sett utløpsrøret fra perfusjonssystemet (ID 0.86 mm) inn i det stive røret og fest det ved å påføre epoxy ( Figur 4A -4B ).
  5. Bruk en peristaltisk pumpe til å levere en konstant strømning (~ 40 ml / min) destillert vann. Koble den med silikonrør til det stive røret ( Figur 4A -4C ). Koble den andre siden av det stive røret til et annet silikonrør for å lede utgangen til en stor avfallsbeholder ( figur 4A -4C ).
  6. For å levere tastanten, injiser trykkluft inn i manifoldsystemet i perfusjonssystemet. Dette kan oppnås, for eksempel ved å bruke en pneumatisk pumpe (10 psi) styrt av en tidsstyrt spenningspulsinngang for å injisere komprimert luft inn i manifollen D-rør som inneholder det ønskede smaksstoffet. En 1s puls utløser ca. 0,5 ml tastant.

3. Tastant forberedelse og overvåking Tastant Levering

  1. Fortynn smaken i destillert vann til ønsket konsentrasjon. Vær oppmerksom på at smaken vil bli ytterligere fortynnet av vannstrømmen. Vi målte den endelige konsentrasjonen som nådde proboscisen som 77% av den opprinnelige konsentrasjonen (se referanser 10 , 29 ).
  2. Legg til et kunstig matfargestoff til hver smakløsning for å bestemme nøyaktig tidspunktet som tastanten passerer over proboscis. Vi fant at det grønne fargestoffet (se Materialeliste ) ved 0,05% w / v ikke aktiverer Manduca GRNs.
  3. Bruk en fargesensor (se tabell 1) for å oppdage matfargingen i smakløsningen. Bruk et loddestål for å lage et hull i nærheten av masken og 0,5 cm under utløpsrøret i perfusjonssystemet ( S = "xfig"> Figur 4A -4B). Koble sensoren til det stive røret og fest det med epoxy på utsiden.
    1. Ta opp fargesensorens spenningsutgang som et analogt signal sammen med fysiologiske signaler (se avsnitt 4). Fargesensorspenningssignalet kan forsterkes ved hjelp av en likestrømforsterker som er koblet til sensoren ( figur 4A ).
  4. Kontroller at fargesensoren fungerer ved å levere tastanten og registrere sensorens spenningsutgang. Signalet fremkalt av fargestoffet bør overstige støynivået.
    1. Juster konstant vannstrømning for å få signalet så nært som mulig.
      Merk: Når du leverer flere tastants i rekkefølge, merk det første forsøket med en ny tastant vil bestå av en blanding av den nye og tidligere tastanten. Derfor analyserte vi ikke disse første forsøkene.
"> Figur 4
Figur 4 : Tastant Delivery System. ( A ) En skjematisk oversikt over apparatet som brukes til å levere og overvåke tidsbestemte pulser av smaksprøver til dyrets proboscis. Hovedkomponentene i systemet er betegnet med røde tall. En konstant strøm av destillert vann opprettholdes over probosciset ved hjelp av en peristaltisk pumpe forbundet med silikonrør til det stive plastrøret (1) der proboscisen skal plasseres (6). Tastanter som inneholder en liten mengde smaksfrit fargestoffer, leveres med et trykksatt 16-kanals perfusjonssystem. Reservoarene som inneholder smakene er koblet til en manifold (2) som er festet til det stive røret, over hullet der proboscis skal plasseres (5). Trykkluft fra en pneumatisk pumpe injiseres til perfusjonssystemet for raskt å levere en tastant, med timing kontrollert av tilpasset programvare. ENFargesensor (3) brukes til å overvåke tastantlevering. Sensoren er koblet til det stive røret ved siden av proboscis og under utløpet til smakeprøvesystemet. Fargesensorspenningssignalet forsterkes av en DC-forsterker. Det røde sporet på innsatsen ved siden av forsterkeren illustrerer et fargesignal som er registrert ved hjelp av tilpasset datainnsamlingsprogramvare; Den raske økningen og nedgangen i signalet reflekterer ankomst og utvasking av tastanten. Moths proboscis er plassert i et hull (5) som ligger like under fargesensoren. Et maske (4) er plassert over hullet for å sikre at probosene til forskjellige dyr alltid er plassert på samme sted. Den andre siden av det stive rør er koblet til et annet silisiumrør for å lede utgangen til en avfallsbeholder (7). ( B ) Bilde som viser hovedelementene i tastantilførselssystemet koblet til det stive plastrøret, som er betegnet med de røde tallene som vist i panel A: vannetKilden (6), smaksprøveutgangsslangen (2), fargesensoren (3), masken (4) og hullet der probosciset skal settes inn (5) alle sammenkoplet til et stivt plastrør (1) . ( C ) Plasseringen av Manduca- preparatet i oppsettet er vist. Den distale t2 / 3 av moths proboscis blir innført i hullet (5) på det stive plastrøret (1). Proboscosen er sikret på plass med tannvoks og epoksy som vist ved innsatsen. Vanninntaket til det stive rør og dets utgang til en avfallsbeholder er indikert med tallene henholdsvis 6 og 7. Tallet 2 indikerer utgangsslangen til tastant manifold. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

4. Ekstracellulær Tetrode Opptak til Monitor Tastant-fremkalt aktivitet fra GRNs

  1. Plasser mølpreparat på en plattform under et stereomikroskop på en vibrasjonAtion-isolerende bord ( Figur 4C ).
  2. Sett de distale to tredjedelene av møllens proboscis inn i det stive rør av tastantilførselssystemet ( Figur 2B ). For å gjøre dette, forlenge moths proboscis og deretter sette det inn i hullet i det stive rør ved forsiktig å skyve det gjennom med hjelp av dressing tang. Tett proboscis på plass med myk dental voks og deretter et lag epoxy for å unngå lekkasjer ( figur 4C , innløp).
  3. Koble saltvannsperfusjonslinjen til hodekapselet og sett perfusjonsstrømmen til en konstant hastighet på ca. 0,04 l / h.
  4. Demp en jordelektrode ( dvs. en klorid sølvtråd) i saltvannsbadet ( Figur 5A ).
  5. Bruk en skreddersydd vridet trådtetrode bygget etter fabrikasjonsprosedyren beskrevet i 30 (4 elektrodekabler foreslås å oppnå godt isolerte enheter og passe inn iNerve). Før forsøket, elektroplate elektroden etter trinnene beskrevet i 30 .
  6. Bruk en manuell micromanipulator til å plassere tetroden nær maksillarynerven. Forflytt tetroden til den begynner å gå inn i nerven ( Figur 5 ).
  7. Vent i minst 10 minutter etter at du har satt tetroden slik at den stabiliserer seg i nerve før opptak.
  8. Forsterk signalet (3000x) og bruk et båndpassfilter sett mellom 0,3-6 kHz. Oppnå signalet ved en samplingrate på 40 kHz ved hjelp av datainnsamlingsprogramvare.
  9. Etter ferdigstillelse plasserer preparatet preparatet i fryseren.

Figur 5
Figur 5 : Tetrode-opptak fra GRNs. ( A , stort bilde) En mikromanipulator brukes til pBlonder den snoede tråden tetrode inn i maxillarynerven (MxN) for å registrere aktiviteten til GRNs. En klorid sølv jordelektrode er plassert i saltvannsbadet som vist. ( A , innsett) Et forstørret bilde av hjernen som viser tetroden i maxillarynerven. Den subesofageale sonen (SEZ) er også indikert. ( B ) En skjematisk av en Manduca hjerne orientert som i A. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Representative Results

Aktiviteten til GRNs kan registreres ved bruk av en ekstracellulær tetrodeelektrode før, under og etter tastantilførsel ( Figur 6A og 6C ). Figur 6A (mellom- og bunnpaneler) viser filtrerte (300-6000 Hz) spenningsspor registrert av hver av de fire ledningene plassert i maksillærnerven, hvor signaler med forskjellige amplituder som reflekterer virkningspotensialer (piler) kan observeres. En 1 s puls av tastant (1 M sukrose) ble levert 2s etter begynnelsen av forsøket; Utbruddet og forskyvningen av stimulansen ble overvåket av fargesensoren ( figur 6A , øvre panel). De tastantinduerte pigger som kan observeres i hver av de fire kanalene ( Figur 6A , midtpanel). GRNs kan identifiseres og skiller seg fra mekanosensorer (ingen vist her) når de reagerer på noen tastants og ikke andre

For å identifisere og isolere enkle neuronresponser fra tetrode-opptakene, utførte vi off-line spike sortering ved hjelp av et sett av tilpassede funksjoner basert på Pouzat's 31 og Kleinfelds 32 , 33 metoder (disse metodene er beskrevet i disse sitatene: 10 , 29 ). Fig. 6B viser et eksempel på spikesortering påført dataene vist i fig. 6A , hvor tre godt isolerte enheter ble funnet.

Rasterplott fra figur 6C viser responsene fra de tre isolerte enhetene i figur 6B til seks forskjellige smakestoffer (1 M sukrose, maltose og NaCl, 100 mM koffein og 10 mM berberin og lobelin) levert i sekvens (4 forsøkS / tastant er vist). Som vist i figur 6C har de registrerte GRNene forskjellige nivåer av baselineaktivitet, alt fra stille (GRNs 1) til lave eller moderate (GRN 2 og 3). Etter tastant utbrud viser GRNs ulike aktivitetsmønstre og utviser forskjellig selektivitet til smakene. For eksempel reagerte GRN 1 bare på sukrose, mens GRN 2 reagerte på maltose og NaCl med spissesperre og til lobeline med spiking bare ved starten av stimulus. I tillegg er noen responser låst til stimuleringstiden ( f.eks. GRN 1-respons på sukrose), mens andre responser overskrider stimulansvarigheten ( f.eks. GRN 3-respons på berberin) eller inneholder både eksitatoriske og inhibitoriske komponenter ( f.eks. Figur 7 GRN 2 respons på NaCl og sukrose). For mer informasjon om de ulike sensitivitetene og aktivitetsmønstrene til GRNs, se referanse 10 .

Figur 7 ). Spenningssporene i den grønne boksen i panel A ble registrert intracellulært fra GRN 1 i løpet av 5 påfølgende forsøk med sukrosepresentasjon, og de samme responsene er vist som rasterplott i panel B. (Merk at denne typen respons samsvarer med det som er oppnådd med tetroder og Vist i figur 6C .) GRN 2, registrert med skarpe intracellulære elektroder, viser et bredere responsmønster.

Figur 6 Figur 6: Representative resultater fra Maxillary Nerve Recordings med ekstracellulære tetroder. ( A ) Spenningsspor som er filtrert (300-6000 Hz) registrert av hver av de fire ledningene ved den maksillære nerve er vist (midtpanel). En 1 s puls av tastant ble påført i løpet av tidsperioden indikert ved rød skygge i midtpanelet. Utbruddet og forskyvningen av stimulusene ble overvåket av fargesensoren som angitt av det røde spenningssporet på oversiden, og betegnes på midtpanelet ved det røde skyggelagte området. De stiplede horisontale linjene angir +50 (topp), 0 (midt) og -50 (bunn) μV. En forstørrelse av de rå spenningssporene som svarer til området inne i de vertikale stiplede linjene er vist (bunnpanel). Eksempler på pigger er indikert av pilene. ( B ) Et eksempel på spikesortering påført dataene vist i panel A. Bølgeformene registrert ved hver av de fire ekstracellulære ledninger (1-4) erE identifisert med tre forskjellige GRNs (enheter 1-3) som bidrar til registrerte signaler. Individuelle hendelser (fargede tynne linjer) og gjennomsnittlig (tykk svart linje) vises for de tre enhetene. En rekke statistiske kriterier må vurderes for å identifisere selvstendige enheter på pålitelig måte ved hjelp av spikesorteringsmetoden (se referanser 10 , 29 ). ( C ) Raster-plott som representerer responsene fra de tre isolerte enhetene til en sekvens av seks forskjellige smakstoffer (4 forsøk / tastant er vist). Tidsperioden for tastantlevering (1 s) er indikert av det rødt skyggede området. Konsentrasjonene av tastanter var enten 1 M (sukrose, maltose, NaCl), 100 mM (koffein) og 10 mM (berberin og lobeline). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 7 Lass = "xfigimg" src = "/ files / ftp_upload / 55868 / 55868fig7.jpg" />
Figur 7 : Intracellulære opptak fra GRN Axons. ( A , grønt eskepanel) Spenningsspor registrert fra en GRN med skarpe glass intracellulære elektroder (motstand på 80 - 120 MΩ) plassert i maksillærnerven, fremkalt av 5 påfølgende stimuleringer med 1 M sukrose (Suc). ( B ) Raster plott av svarene til to GRNs, inkludert svar vist i panel A (grønt feltpanel), til to forskjellige tastants levert i sekvens (100mM grå skriftfarge, 1M svart skrifttypefarge) registrert med skarpe glass intracellulære elektroder Plassert i maxillarynerven (7 forsøk / tastant og 3 forsøk / vann er vist). Tastant leveringstid er indikert med rødt skyggelagte områder i begge panelene. Utbruddet og forskyvningen av stimulansen ble overvåket av fargesensoren, som indikert av de røde spenningssporene nederst på hvert panel.Es / ftp_upload / 55868 / 55868fig7large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Discussion

Metodene beskrevet her tillater in vivo opptak fra et relativt enkelt dyr, Manduca sexta , for å karakterisere aktiviteten til flere, tilfeldig valgte GRNer over lange varigheter (i mer enn 2 timer) før, under og etter tastantlevering. Disse metodene tillater også rask, sekventiell levering av flere smakstimuli med presis temporal kontroll, fordeler som er nyttige for å studere nevrale mekanismer som ligger til grunn for tastantrepresentasjon. Denne protokollen har blitt brukt til å studere hvordan responsene til GRN til smaksprøver blir forvandlet når de overføres til deres postsynaptiske målneuroner ( f.eks. I SEZ) ved å overvåke GRNs samtidig med monosynaptisk forbundne interneuroner 10 . I tillegg kan disse metodene tilpasses eksperimentets behov, slik at gjennomføring av komplekse paradigmer kan studere grunnleggende aspekter ved gustatorisk koding.

Når begynnerG våre studier, et teknisk problem vi noen ganger måtte feilsøke var manglende evne til å oppdage spiking signaler fra maxillary nerve med tetrode ledninger. Mulige årsaker til dette er mangfoldige, da disseksjonsprotokollen er utfordrende, og litt øvelse er nødvendig for å oppnå en god forberedelse. Først i løpet av motdisseksjonen er de maksilære nerver lett å skade, spesielt under fjerning av kappen rundt nervesvevet. For det andre, hvis kappen ikke fjernes fullt, kan tetrode-ledningene ikke være i stand til å få tilgang til nerven. I begge tilfeller er det ofte den enkleste måten å løse disse problemene på med å starte et nytt preparat. For det tredje kan det være et problem med tetrode-ledningene. Dette kan kontrolleres ved å måle impedansen til ledningene som skal være ~ 270 kΩ ved 1 kHz. Hvis impedansverdien er over ~ 300 kΩ, elektroplast ledningene med gull for å oppnå ønsket impedans (se referanse 30 ). For det fjerde kan et utstyr være feilkobletEller misbehavende.

Et annet mulig problem er at spiking signaler blir registrert, men nevronet (e) ser ut som å reagere på smakene. Dette kan skyldes at de registrerte nevronene er ufølsomme for settet av tastanter som leveres. Det er også viktig å huske på at i tillegg til axoner av GRNs bærer den maksillære nerve også mekanosensoriske fibre. Det er således mulig å registrere fra mekanosensoriske nevroner i stedet for, eller i tillegg til, GRNs. Imidlertid er tastantilførselssystemet utformet for å gi en konstant mekanisk inngang gjennom hele forsøket, noe som gjør det usannsynlig at svar på en tastant vil bli forvirret av svar på den mekaniske komponenten av leveransen. Neuroner som reagerer på noen, men ikke andre smaksprøver, eller på forskjellige måter til forskjellige smaksprøver, kan kategoriseres entydig som GRNs. Vi anbefaler at du bruker nyfortynnede smaksprøver for å unngå variasjoner i smakkonsentrasjon eller sammensetning på grunn av sammensatt nedbrytning eller fordampningAv løsningsmidlet. Vi anbefaler også å rengjøre systemet regelmessig for å unngå forurensning av rør og / eller hindringer.

Et annet mulig teknisk problem er et ufordelaktig signal-til-støyforhold. Dette problemet kan ofte løses ved å rekloridere eller justere plasseringen av badjordelektroden. Andre løsninger kan kreve skjerming og minimere lengden på hver elektrisk tilkobling i apparatet.

Endelig er det viktig å merke seg at korrekt analyse av data oppnådd ved bruk av tetrode-opptak krever nøyaktig spik sortering. Vi fant ut at helautomatiserte metoder generelt ikke er tilstrekkelige. Vi anbefaler å bli kjent med spike sorteringslitteraturen før analyse av tetrode data 10 , 29 , 31 , 32 , 33 .

Alternativer til vår disseksjon proTocol kan brukes. Her beskrev vi en disseksjon gjennom den ventrale delen av moth head, som gir tilgang til maxillary nerver og SEZ, men det er også mulig å få tilgang til disse strukturene ved å dissekere gjennom dorsalsiden. Vi fant at dorsalforberedelsen ikke er optimal for å lage opptak fra disse gustatoriske strukturer på grunn av deres dype plassering, men dette preparatet gir fordelen av å aktivere opptak fra høyere ordningsstrukturer som soppkroppen, et område som har vært forbundet med multi -sensorisk integrasjon, assosiativ læring og minnebehandling 34 . Vi har fokusert på bruk av tetrodeelektroder til å ta opp fra maxillarynerven, men som vi illustrert kan standard intracellulære skarpe elektroder også brukes til dette formålet. I tillegg kan begge teknikkene kombineres for å utføre samtidige opptak fra flere hjerneområder 10 . Nevrovitenskapslitteraturen tilbyr mange eksempler på jegNvertebrate-modeller som har vist seg å være kraftige verktøy for å avsløre grunnleggende prinsipper for sensorisk behandling, som for eksempel olfaktorisk koding, som gjelder både insekter og vertebrater 35 , 36 , 37 , 38 , 39 . Vi håper våre metoder vil føre til grunnleggende nye innsikter om gustatory koding.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av et intramuralt tilskudd fra NIH-NICHD til MS. Vi takker G. Dold og T. Talbot fra NIH-NIMH Instrumentation Core Facility for å hjelpe til med å designe smakfullt leveransesystem.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissection and Specimen Preparation
Polypropylene tube, 15 mL Falcon Fisher Scientific 14-959-53A
Needle, Short bevel, 19 G x 1 - 1/2"   MONOJET 888200144 For applying air to remove the hair from the moth.
Modeling Clay-Van Aken Plastalina  DickBlick 33268
Petri dish -100 x 15 mm  VWR International 89000-304
Pipette tip (1 - 200 µL) USA Scientific 1111-0806
Razor blade Techni Edge TE05-071
22 AWG standard hookup wire AlphaWire 1551 For inserting the proboscis into the pippete tip.
Batik wax Jacquard 7946000
Electric waxer Almore International 66000
Stereo Myscroscope Leica MZ75
Dumont #1 forceps (coarse)  World Precision Instruments 500335 For removing fat and non-nervous tissue.
Dumont #5 titanium forceps (fine)  World Precision Instruments 14096 For removing fat and non-nervous tissue.
Dumont #5SF forceps (super-fine) World Precision Instruments 500085 For desheathing the nervous tissue.
Vannas scissors (fine) World Precision Instruments 500086 For removing the cuticle.
Collagenase/Dispase Sigma-Aldrich 11097113001
Epoxy Permatex 84101
Name Company Catalog Number Comments
Saline Perfusion System
Extension set with rate flow regulator  B Braun Medical Inc. V5200
IV administration set with Y injection site  B Braun Medical Inc. V1402
Name Company Catalog Number Comments
Tastant Delivery System
White Translucent Nylon Tubing OD 1/4", ID 1/8" Small Parts Inc. B001JJT4SA Rigid tube that connects the four main elements of the system.
Soldering iron Circuit Specialists ZD200BK
Rotary tool-Dremel Dremel 4200
Polypropylene mesh, hole size (hole size 0.1 x 0.13 cm)  Industrial Netting XN5170 For ensuring that the probosises of different animals are placed in the same location.
Pressurized 16-Channel perfusion system  Bioscience Tools PS-16H For tastant delivery. This system includes pinch valves, tubing, manifold, solution cylinders, valve controller and fitting accessories.
Polypropylene tubing, ID 0.034", ID 0.050" Becton, Dickinson & Co 427421 Output tube from the perfusion system.
Pneumatic PicoPump World Precision Instruments SYS-PV820 For controlling the output channel of the perfusion system. 
Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card National Instruments LabVIEW 2011 To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor.
Compulab 3 Manostat peristaltic pump Sigma P1366 For pumping water.
Silicone tubing, ID 1/16" OD 1/8" Cole-Parmer WU-95802-02 To connect the water source to the peristaltic pump tubing, and the outlet tube of the pump to the rigid tube of the delivery system.
Color sensor-digital fiber optic sensor Keyence  FS-V31M For monitoring tastant delivery. 
Color sensor-reflective fiber unit Keyence FU35-FZ To connect the color sensor device.
Dental periphery Wax Henry-Schein Dental 6652151 To secure the proboscis into the rigid tube.
Two 3.7 L containers To provide water to the system, and to recollect the water waste.
Fast green FCF  Sigma F7258
Dressing forceps 25.5 cm WPI 500364 To introduce moth proboscis into the proboscis hole in the rigid tube.
Name Company Catalog Number Comments
Electrophysiology Equipment
D.C. amplifier Brown-Lee 440
Lamp Schott Schott Fostec Light Source DCR 2
Manual micromanipulator Leica micromanipulator To precisely insert the tetrodes into the animal's brain. The manipulator has to allow fine and coarse movements in x, y and z axis.
Stereomicroscope Leica MZ75
Vibration-isolation table (MICRO-g lab table) TMC 63-541
Oscilloscope Tektronix  TDS2014
16-channle pre-amplifier and amplifier 16 Channel MA-800 Amplifier System  B.E.S 2013
Computer Dell optiplex 780 The following are the minimum recommended requirements. RAM: 3.32 GHz, 3GB. Processor: Intel Core 2 Duo. Graphic card: integrated Intel GMA X4500. 
Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card National Instruments LabVIEW 2011 To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor and electrode.
Name Company Catalog Number Comments
Tastants
KAc Sigma-Aldrich P5708
LiCl Sigma-Aldrich L9650
NaCl Sigma-Aldrich 73575
Sucrose Sigma-Aldrich 84097

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).
  2. Chen, X., Gabitto, M., Peng, Y., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. A Gustotopic Map of Taste Qualities in the Mammalian Brain. Science. 333 (6047), (2011).
  3. Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. Common Sense about Taste: From Mammals to Insects. Cell. 139 (2), 234-244 (2009).
  4. Mueller, K. L., Hoon, M. A., Erlenbach, I., Chandrashekar, J., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. The receptors and coding logic for bitter taste. Nature. 434 (7030), 225-229 (2005).
  5. Zhao, G. Q., Zhang, Y., et al. The receptors for mammalian sweet and umami taste. Cell. 115 (3), 255-266 (2003).
  6. Huang, A. L., Chen, X., et al. The cells and logic for mammalian sour taste detection. Nature. 442 (7105), 934-938 (2006).
  7. Pfaffmann, C., Carl, The afferent code for sensory quality. Am Psychol. 14 (5), 226-232 (1959).
  8. Lemon, C. H., Katz, D. B. The neural processing of taste. BMC Neurosci. 8 (Suppl 3), (2007).
  9. Barretto, R. P. J., Gillis-Smith, S., et al. The neural representation of taste quality at the periphery. Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).
  10. Reiter, S., Campillo Rodriguez, C., Sun, K., Stopfer, M. Spatiotemporal Coding of Individual Chemicals by the Gustatory System. J Neurosci. 35 (35), 12309-12321 (2015).
  11. Wilson, D. M., Boughter, J. D., et al. Bitter Taste Stimuli Induce Differential Neural Codes in Mouse Brain. PLoS ONE. 7 (7), e41597 (2012).
  12. Glendinning, J. I., Davis, A., Ramaswamy, S. Contribution of different taste cells and signaling pathways to the discrimination of "bitter" taste stimuli by an insect. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 22 (16), 7281-7287 (2002).
  13. Kay, L. M., Stopfer, M. Information processing in the olfactory systems of insects and vertebrates. Semin Cell Dev Biol. 17 (4), 433-442 (2006).
  14. Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral Coding of Taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).
  15. Carleton, A., Accolla, R., Simon, S. A. Coding in the Mammalian Gustatory System. Trends Neurosci. 33 (7), 326-334 (2010).
  16. Stocker, R. F. The organization of the chemosensory system in Drosophila melanogaster: a rewiew. Cell Tissue Res. 275 (1), 3-26 (1994).
  17. Mitchell, B. K., Itagaki, H., Rivet, M. P. Peripheral and central structures involved in insect gustation. Microsc Res Tech. 47 (6), 401-415 (1999).
  18. Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. Labellar taste organs of Drosophila melanogaster. J Morphol. 150 (2), 327-341 (1976).
  19. Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. Physiology of a primary chemoreceptor unit. Science. 122 (3166), 417-418 (1955).
  20. Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. J Vis Exp. (84), e51355 (2014).
  21. Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila). Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
  22. Descoins, C., Marion-Poll, F. Electrophysiological responses of gustatory sensilla of Mamestra brassicae (Lepidoptera, Noctuidae) larvae to three ecdysteroids: ecdysone, 20-hydroxyecdysone and ponasterone. A. J Insect Physiol. 45 (10), 871-876 (1999).
  23. Popescu, A., Couton, L., et al. Function and central projections of gustatory receptor neurons on the antenna of the noctuid moth Spodoptera littoralis. J Comp Physiol. 199 (5), 403-416 (2013).
  24. Morita, H., Yamashita, S. Generator potential of insect chemoreceptor. Science. 130 (3380), 922 (1959).
  25. Davis, N. T., Hildebrand, J. G. Neuroanatomy of the sucking pump of the moth, Manduca sexta (Sphingidae, Lepidoptera). Arthropod Struct Dev. 35 (1), 15-33 (2006).
  26. Stürckow, B., Adams, J. R., Wilcox, T. A. The Neurons in the Labellar Nerve of the Blow Fly. Z Vergl Physiol. 54, 268-289 (1967).
  27. Stürckow, B. Electrophysiological studies of a single taste hair of the fly during stimulation by a flowing system. Proceed 16 Intern Contr Zool. 3 (8), 102-104 (1963).
  28. Christensen, T. A., Hildebrand, J. G. Male-specific, sex pheromone-selective projection neurons in the antennal lobes of the moth Manduca sexta. J Comp Physiol A. 160, 553-569 (1987).
  29. Reiter, S. Gustatory Information Processing. , https://repository.library.brown.edu/studio/item/bdr:386235/PDF/?embed=true (2014).
  30. Saha, D., Leong, K., Katta, N., Raman, B. Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits. J Vis Exp. (71), (2013).
  31. Pouzat, C., Mazor, O., Laurent, G. Using noise signature to optimize spike-sorting and to assess neuronal classification quality. J Neurosci Methods. 122 (1), 43-57 (2002).
  32. Hill, D. N., Mehta, S. B., Kleinfeld, D. Quality Metrics to Accompany Spike Sorting of Extracellular Signals. J Neurosci. 31 (24), 8699-8705 (2011).
  33. Fee, M. S., Mitra, P. P., Kleinfeld, D. Automatic sorting of multiple unit neuronal signals in the presence of anisotropic and non-Gaussian variability. J Neurosci Methods. 69 (2), 175-188 (1996).
  34. Heisenberg, M. Mushroom body memoir: from maps to models. Nat Rev Neurosci. 4 (4), 266-275 (2003).
  35. Naraghi, M., Laurent, G. Odorant-induced oscillations in the mushroom bodies of the locust. J Neurosci. 14, 2993-3004 (1994).
  36. Laurent, G., Wehr, M., Davidowitz, H. Temporal representations of odors in an olfactory network. J Neurosci. 16, 3837-3847 (1996).
  37. Perez-Orive, J., et al. Oscillations and sparsening of odor representations in the mushroom body. Science. 297, 359-365 (2002).
  38. Stopfer, M., Jayaraman, V., Laurent, G. Odor identity vs. intensity coding in an olfactory system. Neuron. 39, 991-1004 (2003).
  39. Laurent, G. Olfactory network dynamics and the coding of multidimensional signals. Nature Re Neurosci. 3, 884-895 (2002).

Tags

Neurovidenskap utgave 124 sensorisk koding gustasjon gustatorisk reseptorneuron maxillarynerve sub-esophageal zone elektrofysiologi multi-unit opptak,
Nye metoder for å studere gustatorisk koding
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boronat-García, A., Reiter, S., … More

Boronat-García, A., Reiter, S., Sun, K., Stopfer, M. New Methods to Study Gustatory Coding . J. Vis. Exp. (124), e55868, doi:10.3791/55868 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter