Summary
Vi præsenterer tre nye metoder til at studere gustatorisk kodning . Ved hjælp af et simpelt dyr beskriver mothen Manduca sexta ( Manduca ) en dissektionsprotokol, brugen af ekstracellulære tetroder til registrering af aktiviteten af flere gustatoriske receptorneuroner og et system til levering og overvågning af præcist timede pulser af smagsstoffer.
Abstract
Sansens smag giver dyr mulighed for at påvise kemikalier i miljøet, hvilket giver anledning til adfærd, der er kritisk for overlevelse. Når gødningsreceptorneuroner (GRNs) registrerer tastante molekyler, koder de information om identiteten og koncentrationen af smagsprøven som mønstre af elektrisk aktivitet, som derefter formerer sig for at følge neuroner i hjernen. Disse mønstre udgør interne repræsentationer af smagsprøven, som derefter tillader dyret at vælge handlinger og danne minder. Brugen af relativt enkle dyremodeller har været et kraftfuldt værktøj til at studere grundlæggende principper i sensorisk kodning. Her foreslår vi tre nye metoder til at studere gustatorisk kodning ved hjælp af moth Manduca sexta . For det første præsenterer vi en dissektionsprocedure for at udsætte de maksillære nerver og subesophageal zone (SEZ), hvilket gør det muligt at optage aktiviteten af GRN'er fra deres axoner. For det andet beskriver vi brugen af ekstracellulære elektroder til registrering af aktiviteten af flere GRN'er ved at placere teTroede ledninger direkte ind i den maksillære nerve. For det tredje præsenterer vi et nyt system til levering og overvågning, med høj temporal præcision, pulser af forskellige smagsstoffer. Disse metoder tillader karakterisering af neuronale responser in vivo direkte fra GRN'er før, under og efter smagning afleveres. Vi giver eksempler på spændingsspor registreret fra flere GRN'er, og præsenterer et eksempel på, hvordan en spikesorteringsmetode kan anvendes til dataene for at identificere svarene fra individuelle neuroner. Endelig sammenligner vi ekstracellulære optagelser fra GRN'er med tetroder til intracellulære optagelser opnået med skarpe glaselektroder for at validere vores optagelsesmetode.
Introduction
Gustatory og olfactory systemer genererer interne repræsentationer af kemikalier i miljøet, hvilket giver opfattelse af henholdsvis smag og lugt. Disse kemiske sanser er afgørende for at fremkalde adskillige opførsel, der er kritiske for organismens overlevelse, lige fra at finde hjælpere og måltider for at undgå rovdyr og toksiner. Processen begynder, når miljøkemikalier interagerer med receptorer lokaliseret i plasmamembraner af sensoriske receptorceller; Disse celler, direkte eller gennem interaktioner med neuroner, transducere information om identitet og koncentration af kemikalier i elektriske signaler. Disse signaler overføres derefter til højere ordensneuroner og til andre hjernestrukturer. Da disse trin udvikler sig, undergår det oprindelige signal altid ændringer, der fremmer organismens evne til at opdage, diskriminere, klassificere, sammenligne og lagre sensoriske oplysninger og vælge en passende handling. Forstå hvordan bhI transformerer information om miljøkemikalier for bedst at udføre en række opgaver er et grundlæggende spørgsmål i neurovidenskab.
Gustatkodning er blevet antaget at være forholdsvis simpel. Et bredt set synspunkt er, at hvert kemisk molekyle, der fremkalder en smag (en "smagsprøve") naturligt tilhører en af de cirka fem eller så grundlæggende smagskvaliteter ( dvs. sød, bitter, sur , Salt og umami) 1 . I denne "basale smag" -visning er opgaven med gustationssystemet at bestemme hvilken af disse grundlæggende smag der er til stede. Desuden er neurale mekanismer, der ligger til grund for grundlæggende smagsrepræsentation i nervesystemet, uklare og antages at være styret af enten en "mærket linje" 2 , 3 , 4 , 5 , 6 eller en "over fibermønster" 7 , 8 kode. I en mærket linjekode reagerer hver sensoriske celle og hver af sine neurale følgere på en enkelt smagskvalitet, der danner en direkte og uafhængig kanal til højere behandlingscentre i centralnervesystemet dedikeret til denne smag. I modsætning hertil kan hver sensorisk celle i en tværgående fibermønsterkode reagere på flere smagskvaliteter, således at information om smagsprøven er repræsenteret af det samlede respons af populationen af sensoriske neuroner. Hvorvidt gustatory information er repræsenteret ved grundlæggende smag, gennem mærkede linjer eller gennem en anden mekanisme, er uklar og er fokus for den nylige undersøgelse 3 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Vores eget seneste arbejde tyder på, at gustatory systemet bruger en spatiotemporal befolkningskode til at generereRepræsentationer af individuelle smagsstoffer i stedet for grundlæggende smagskategorier 10 .
Her tilbyder vi 3 nye værktøjer til at hjælpe med at studere gustatorisk kodning. For det første foreslår vi brugen af hawkmoth Manduca sexta som en relativt simpel modelorganisme, der kan anvendes til elektrofysiologisk undersøgelse af smag og beskriver en dissektionsprocedure. For det andet foreslår vi brugen af ekstracellulære "tetroder" for at registrere aktiviteten af individuelle GRN'er. Og for det tredje foreslår vi et nyt apparat til levering og overvågning af præcis timede pulser af smagsprøve til dyret. Disse værktøjer blev tilpasset fra teknikker vores lab og andre har brugt til at studere det olfaktoriske system.
Insekter som frugtfly Drosophila melanogaster , locust Schistocerca americana , samt moth Manduca sexta har i årtier givet kraftige ressourcer til at forstå grundlæggende principper om nedreVous system, herunder sensorisk kodning ( fx olfaction 13 ). I pattedyr er smagsreceptorer specialiserede celler, der kommunikerer med neuroner gennem komplekse anden-messenger-veje 1 , 14 . Det er enklere i insekter: deres smagsreceptorer er neuroner. Yderligere er pattedyrsmagestier nær periferien forholdsvis komplekse med flere parallelle neurale veje, og vigtige komponenter er udfordrende for adgang, indeholdt i små benformede strukturer 15 . Insekt smagsstier synes at være enklere. I insekter findes GRN'er i specialiserede strukturer kendt som sensilla, der ligger i antennen, mundstykker, vinger og ben 16 , 17 . GRN'erne direkte projekterer til subesophageal zone (SEZ), en struktur, hvis rolle er blevet anset for at være hovedsagelig gustatory 17 , og som indeholder anden ordenGustatoriske neuroner 10 . Derefter rejser informationen til kroppen for at køre reflekser, og til højere hjerneområder, der skal integreres, opbevares og i sidste ende drive adfærdsmæssige valg 16 .
Det er nødvendigt at karakterisere perifer smagsreaktioner for at forstå, hvordan smagsinformation er forplantet og omdannet fra punkt til punkt i hele nervesystemet. Den mest almindeligt anvendte metode til direkte overvågning af den neurale aktivitet af GRN'er i insekter er tipoptagelsesteknikken 12 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . Dette indebærer at placere en elektrode direkte på en sensillum, hvoraf mange er forholdsvis let tilgængelige. Smagsprøven er inkluderet i elektroden, hvilket gør det muligt at aktivere og udstyreMåle neurologisk respons af GRN'er i sensillumet racellulært. Men fordi smagsprøven er indeholdt i elektroden, er det ikke muligt at måle GRN-aktivitet, før smageren leveres eller efter at den er fjernet, eller at udveksle smagsstoffer uden at udskifte elektroden 20 . En anden metode, "sidevæg" optagelsesteknik, er også blevet brugt til at registrere GRNs aktivitet. Her indsættes en optagelektrode i bunden af en smaksensillum 24 , og smagsstoffer leveres via en separat glaskapillær på sensillumets spids. Begge teknikker begrænser optagelse fra GRN'er til en bestemt sensillum. Her foreslår vi en ny teknik: optagelse fra tilfældigt udvalgte GRN-axoner fra forskellige sensillaer, mens de separat leverer sekvenser af smagsstoffer til proboscis. Axonoptagelser opnås ved at placere enten skarpe glaselektroder eller ekstracellulære elektrodbundler (tetroder) ind i nerven, der bærer axoner fraGRNs i proboscis til SEZ 10 . I Manduca krydser disse axoner den maksillære nerve, som er kendt for at være rent afferent, hvilket tillader en entydig registrering af sensoriske responser 25 . Denne metode til optagelse fra axoner tillader i mere end to timer stabil måling af GRN respons før, under og efter en række smagspræsentationer.
Her beskriver vi en dissektionsprocedure for eksponering af de maksillære nerver sammen med SEZ, som kan tillade at man samtidig registrerer svarene på flere GRN'er og neuroner i SEZ 10 . Vi beskriver også brugen af ekstracellulære optagelser af GRN'er ved hjælp af en specialfremstillet 4-kanals twisted wire tetrode, der i kombination med en spikesorteringsmetode tillader analyse af flere (i vores hænder op til seks) GRN'er samtidigt. Vi sammenligner yderligere optagelser foretaget med tetroder til optagelser lavet med skarp intracellulærelektroder. Endelig beskriver vi et nyt apparat til levering af tastant stimuli. Tilpasset fra udstyr, som mange forskere har brugt til at levere lugtstoffer i olfaction-undersøgelser, giver vores nye apparat fordele ved undersøgelse af gustation: forbedring af tidligere multikanal-leveringssystemer som dem, der udvikles af Stürckow og kolleger (se referencer 26 , 27 ), vores apparat opnår præcise Kontrol over tidspunktet for tastantilførslen, mens der tilvejebringes en spændingsafregning af denne timing; Og det tillader hurtig, sekventiel levering af flere smagsstimuler 10 . Apparatet bader probosciset i en konstant strøm af rent vand ind i hvilke kontrollerede pulser af smagsprøve kan afgives. Hver smagsimpuls passerer over probosciset og vaskes derefter væk. Tastants indeholder en lille mængde usmageligt madfarvning, hvilket giver en farvesensor mulighed for at overvåge, med præcis timing, passagen af smagsprøve ovEr proboscis.
Protocol
Forsigtig: Fine, pulverskalaer, der frigives af Manduca, kan være allergifremkaldende, så det anbefales at bruge laboratoriesikkerhedshandsker og ansigtsmaske.
1. Dissektion af Manduca Sexta for at afsløre Maxillary Nerves og SEZ
- Vælg en passende møll af begge køn baseret på følgende funktioner: Tre dage efter eclosion med et generelt sundt udseende (vingerne skal udvides fuldt ud, og proboscis og antenner skal være intakte).
- Placer møllen individuelt i en plastikbeholder til transport.
- Indsæt møllen i et polypropylenrør.
Forsigtig: Vi anbefaler at udføre dette trin i en dampkoge for at forhindre, at malens pulverformede skalaer spredes.- Røret skal være lidt længere end møllens krop ( figur 1A ). Røret kan fremstilles ved at skære et 15 ml polypropylenrør. <Li> Skub mothen, indtil hovedet er eksponeret og indsæt bølget tissuepapir i den anden ende af røret for at holde moten ubevægelig ( Figur 1A ).
- En luftstråle kan fremstilles ved at forbinde en sprøjte (1 ml med en nål, ID omkring 1,4 mm, med skarp spids fjernet) til en trykluftkilde.
Bemærk: Efter fjernelse af håret kan alle nedenstående trin udføres udenfor dampen.
- På en petriskål skal du bruge modellerings ler til at bygge en trekantet bund omkring 7 cm lang, 2,5 cm høj ( figur 1B ).
Figur 1 : Fremstilling af Dissektionskammeret for Manduca . ( A ) En møll er fastholdt i et rør. Hovedet er udsat i den ene ende, mens den anden ende er tilsluttet med tissuepapir. ( B ) Et dissektionskammer fremstillet af en petriskål og modellerings ler er vist. Den dorsale del af hovedet vender opad. Klik her for at se en større version af denne figur.
- Beskyt antenner og proboscis.
- Forbered 3 små rør ved at skære en pipetip (gule spidser, 1-200 μL) med et barberblad i 3 stykker på ca. 0,5 cm i længden. Den indre diameter skal være stor nok, så antennen og proboscis kan passe tæt.
- Forbered en krog vedBøjning af en ledning (22 AWG, ca. 7 cm lang). Udvid møllens proboscis og indsæt det i et af de små rør ved at trække det igennem med trådkrogen, indtil røret når den proksimale del af probosciset.
- Fastgør det lille rør med fast batik voks (ved hjælp af for eksempel en dental elektrisk voks til at smelte og styre voksen) til den dorsale del af møllens hovedkapsel ( Figur 2A til venstre).
- Placer hver antenne i et rør og fastgør rørene med batik voks som vist i figur 2A (til venstre). Pas på at undgå at beskadige antennerne med den varme voks.
- Stabiliser hjernen mod bevægelse ved at skære muskler, der dækker den forreste overflade af hjernen ( dvs. buccal kompressor muskel).
- Under dissektionsmikroskopet skal du bruge mikrodissektionssaks eller en mini-ax formet fra en razorchip limet til et tandstikker for at åbne hovedkapslen af makIndsæt et lille snit lige under probosciset ( Figur 2A , venstre øvre indgang).
- Brug mikro-dissektion saks til at skære buccal kompressor muskel (for illustrationer se reference 25 ). Da muskelen ikke er let synlig, anbefales følgende adfærdstest for at bekræfte, at den er blevet skåret.
- Fortynd saccharose i destilleret vand for at opnå en 1 M opløsning.
- Brug en pipette til at levere ca. 200 μl saccharoseopløsning til den distale 2/3 af proboscis og observere proboscis i 5 min. Hvis musklerne blev skåret ordentligt, skulle insektet ikke være i stand til at udvide eller flytte proboscis.
- Påfør et lag smeltet batik voks for at forsegle åbningen i hovedkapslen.
- Flip insektet over, så den ventrale side af hovedkapslen er nu vendt opad.
- For at perfuse saltopløsning under og efter dissektionsproceduren opbygges en vokskopp omkring den ventrale side af hovedet usinG den elektriske voks: Under et dissektionsmikroskop skal du begynde at bygge koppen ved at påføre den første række voks langs forsiden af hovedet og bevæge sig mod bagsiden. Hold proboscis og antenne rør inde i koppen ( Figur 2A højre).
- Fortsæt med at bygge koppen udad og opad, indtil den når øjeniveauet.
- Brug tænger til at tage en af de to labial palps, og læg den derefter på siden og fastgør den i vokskoppen ved at tilføje mere smeltet voks. Gør det samme med den anden maxillary palp ( Figur 2A højre).
- Tæt eventuelle åbninger i vokskoppen og rørene.
Bemærk: I dette trin bruges epoxy, fordi det hjælper med til let at forsegle huller i voks og rør og undgår enhver varmelignende skade på antennene og probosciserne.- Brug et tandstikker til at blande binær epoxy i en plastisk blandeskål. Opbevar blandeskålen.
- Brug tandstikket til at påføre en tyndLag af epoxy på ydersiden og indersiden af koppen ( figur 2B ).
- Fyld det tomme rum i rørene, der indeholder proboscis og antenner med epoxy, og fyld den del af polypropylenrøret, der omslutter halsen, med tilstrækkelig epoxy til at holde den fast på plads ( figur 2B ).
- Lad epoxyen tørre i ca. 20 minutter. For at kontrollere dette skal du teste den resterende epoxy i plastblanderen for at sikre, at den er fast og ikke længere klæbrig.
- Fyld vokskoppen med Manduca fysiologisk saltvand 28 og vent et par minutter for at sikre, at der ikke er lækager. Hvis en lækage er synlig, prøv at forsegle den ved at anvende mere varm voks og / eller epoxy.
Figur 2 : Forberedelse af Manduca </ Em> til Dissection. ( A ) Antenn og proboscis er beskyttet inde i små rør fremstillet af pipettespidser skåret i tre stykker på ca. 0,5 cm i længden. (Venstre panel, stort billede) Rørene er sikret med smeltet batik voks anbragt rundt om den dorsale del af hovedet. (Venstre panel, indsats) For at fjerne buccal kompressormuskel åbnes hovedkapsulens dorsale side ved at lave et lille snit som angivet med den stiplede linje i det store billede. (Højre panel) En voksboks er bygget omkring den ventrale side af hovedet som et reservoir for perfusionsopløsning under dissektionsproceduren og optagelsesforsøg. ( B ) Epoxy bruges til at forsegle huller mellem bunden af vokskoppen og den dorsale del af hovedet (venstre panel) og mellem voks og rør indeholdende antenner og proboscis, herunder åbningerne af rørene (højre panel ). Venligst klik her tO se en større version af denne figur.
- Under dissektionsmikroskopet skal du bruge mikrodissektionssaks til at afskære den labielle palps.
- Brug micro-dissection saks eller en mini-økse til at åbne den ventrale side af hovedkapslen ved at lave fire udskæringer: to snit langs krybdyret, der omgiver hvert øje fra bagtil forside, et skåret på snitbåndet langs hovedets bagside, Og en klippe på snitbåndet langs forenden af hovedet nær probosciset ( figur 3A ).
- Træk forsigtigt kutiklen væk ved hjælp af mikrodissektionstænger for at udsætte hjernen.
- Ved at bruge to skarpe mikro-dissektionstænger langsomt og forsigtigt fjern fedtvæv og luftrøret, der dækker SEZ. Undgå skader på hjernen eller nerverne (fx maxillarynerve, optisk nerve, cervikalbindende). Skyl hjernen ved ofte at erstatte saltvandsløsningen og juster lyset ofte for bedre synlighed. Bemærk: Dette kan være den mest kritiske del af dissection; Det er nemt at utilsigtet beskadige den maksillære nerve ved at trække på eller knuse den.
Bemærk: På dette tidspunkt skal SEZ og maxillary nerver være tydeligt synlige ( Figur 3B -3C ). Dog er hjernen og de maksillære nerver dækket af en tynd kappe. - For at fjerne skeden erstattes saltopløsningen i voksbeholderen med 10% (vægt / volumen) kollagenase / dispas opløst i saltvand og lad den være på plads i 5 minutter. Derefter, efter at du har skyllet hjernen flere gange med saltvand, skal du forsigtigt fjerne kappen med superfine mikrodissektionspinde ved at trække kappen op fra SEZ gennem de maksillære nerver.
- Begynd at perfuse vokskoppen med frisk saltvand. Placer røret fra en saltvandsledning i vokskoppen og fastgør den der med smeltet voks.
FigUre 3 : Manduca Dissection Procedure. ( A ) De labielle palper fjernes, hovedkapslen åbnes ved at lave fire udskæringer som angivet med den stiplede linje. ( B ) Et forstørret billede af hjernen efter åbning af hovedkapslen og fjernelse af fedtvæv og luftrør, hvilket muliggør visualisering af de maksillære nerver (MxNs) og den subesofagale zone (SEZ, et udtryk der henviser til hjerneområdet under esophagus). De maksillære nerver bærer axoner fra gustatoriske receptorneuroner (GRN'er) i proboscis til SEZ. ( C ) En skematisk af en Manduca hjerne. Klik her for at se en større version af denne figur.
2. Tastant Delivery System
- Det smagfulde leveringssystem består af fire hovedelementer: vandkilden, smagsprøven, farvesensoren og det sted, der indeholderProboscis, alle forbundet med et stift plastrør ( Figur 4A -4B ). For at opbygge dette system følg trinene vist i Figur 4B . Brug et stift plastrør omkring 6 cm i længden (ID 0,3 cm).
- Brug et loddejern til at lave et lille hul i røret, hvor proboscisen skal placeres ( Figur 4A -4B ).
- For at sikre, at proboscierne fra forskellige dyr altid er placeret på samme sted, skal plastikskærmemateriale (maske, hulstørrelse på ca. 0,1 cm) fastgøres i røret ( Figur 4A -4B ). Med et knivblad eller et roterende værktøj skæres det stive rør ca. 5 mm over proboscis hullet. Placer masken mellem de to stykker rør. Fastgør netværket og genforbind rørene ved at påføre epoxy på ydersiden af rørene. Lad epoxyen tørre i ca. 20 minutter.
- Til tastant levering brug en trykPerfusion system med så mange smagsrør som nødvendigt, sammenføjet med en manifold (se nedenfor). Brug loddejernet til at lave et lille hul i det stive rør ca. 1 cm over masken. Indsæt outputrøret fra perfusionssystemet (ID 0.86 mm) i det stive rør og fastgør det ved at påføre epoxy ( Figur 4A -4B ).
- Brug en peristaltisk pumpe til at levere et konstant flow (~ 40 ml / min) destilleret vand. Tilslut det med silikone rør til det stive rør ( Figur 4A -4C ). Tilslut den anden side af det stive rør til et andet siliciumrør for at lede udgangen til en stor affaldsbeholder ( Figur 4A -4C ).
- For at levere smagsprøven, indsprøjt trykluft ind i manifoldsystemet i perfusionssystemet. Dette kan opnås ved at anvende en pneumatisk pumpe (10 psi) styret af en tidsindstillet spændingsimpulsindgang for at indsprøjte trykluft ind i manifolden D-rør indeholdende det ønskede smagsstof. En 1s pulse udleder ca. 0,5 ml smagsprøve.
3. Tastant forberedelse og overvågning Tastant levering
- Fortynd tastant i destilleret vand til den ønskede koncentration. Vær opmærksom på, at smagsprøven vil blive yderligere fortyndet af vandstrømmen. Vi målte den endelige koncentration, der nåede proboscis som 77% af den oprindelige koncentration (se referencer 10 , 29 ).
- Tilsæt en kunstig madfarvestof til hver smagsopløsning, så du kan bestemme den præcise timing, som smagsprøven passerer over probosciset. Vi fandt ud af, at det grønne farvestof (se Materialeliste ) ved 0,05% w / v ikke aktiverer Manduca GRNs.
- Brug en farvesensor (se tabel 1) til at registrere fødevarens farve i smagsopløsningerne. Brug et loddejern til at lave et hul ved siden af masken og 0,5 cm under perfusionssystemets udløbsrør ( S = "xfig"> Figur 4A -4B). Tilslut sensoren til det stive rør og fastgør det med epoxy på ydersiden.
- Optag farvesensorens spændingsudgang som et analogt signal sammen med fysiologiske signaler (se afsnit 4). Farvesensorspændingssignalet kan forstærkes ved brug af en DC-forstærker, der er forbundet til sensoren ( Figur 4A ).
- Sørg for, at farvesensoren fungerer ved at levere tastanten og optage sensorens spændingsudgang. Signalet fremkaldt af farvestoffet bør overstige støjniveauet.
- Juster den konstante vandmængde for at gøre signalet så tæt på kvadratet som muligt.
Bemærk: Når du leverer flere tastanter i rækkefølge, bemærk det første forsøg med en ny smagsmand, der består af en blanding af den nye og tidligere tastant. Af denne grund analyserede vi ikke disse første forsøg.
- Juster den konstante vandmængde for at gøre signalet så tæt på kvadratet som muligt.
Figur 4 : Tastant Delivery System. ( A ) En skematisk af apparatet anvendt til at levere og overvåge tidsbestemte pulser af smagsstoffer til dyrets proboscis. Hovedkomponenterne i systemet er betegnet med røde tal. En konstant strøm af destilleret vand opretholdes over probosciset ved hjælp af en peristaltisk pumpe forbundet med silicone rør til det stive plastrør (1), hvor probosciset skal placeres (6). Tastanter indeholdende en lille mængde smagfrit farvestof leveres ved anvendelse af et 16-kanals perfusionssystem med tryk. Reservoirerne, der indeholder smagsstoffer, er forbundet med en manifold (2), som er fastgjort til det stive rør, over hullet, hvor proboscis skal placeres (5). Trykluft fra en pneumatisk pumpe injiceres til perfusionssystemet for hurtigt at levere en smagsprøve, med timing styret af brugerdefineret software. ENFarvesensor (3) bruges til at overvåge tastantilførsel. Sensoren er forbundet med det stive rør ved siden af proboscis og under udløbet af det smagfulde perfusionssystem. Farvesensorspændingssignalet forstærkes af en DC-forstærker. Det røde spor på indgangen ved siden af forstærkeren illustrerer et farvesignal, der er optaget ved hjælp af brugerdefineret dataopsamlingssoftware; Den hurtige stigning og fald i signalet afspejler ankomst og udvaskning af henholdsvis tastanten. Moths proboscis er placeret i et hul (5), der ligger lige under farvesensoren. Et maske (4) er anbragt over hullet for at sikre, at proboscises af forskellige dyr altid er placeret på samme sted. Den anden side af det stive rør er forbundet med et andet siliciumrør for at lede udgangen til en affaldsbeholder (7). ( B ) Billede, der viser hovedelementerne i smagsleveringssystemet, der er forbundet med det stive plastrør, som betegnes med de røde tal som vist i panel A: vandetKilde (6), smagsprøveudgangsslangen (2), farvesensoren (3), masken (4) og hullet, hvor probosciset skal indsættes (5) alle forbundet i et stift plastrør (1) . ( C ) Placeringen af Manduca- præparatet i opsætningen er vist. Den distale t2 / 3 af møllens proboscis indføres i hullet (5) på det stive plastrør (1). Problemerne er fastgjort på plads med tandvoks og epoxy som vist ved indsatsen. Vandindgangen til det stive rør og dets udgang til en affaldsbeholder er angivet med henholdsvis tallene 6 og 7. Nummeret 2 angiver udgangsslangen til tastant manifold. Klik her for at se en større version af denne figur.
4. Ekstracellulær Tetrode Optagelse til Monitor Tastant-fremkaldt aktivitet fra GRNs
- Placer malpræparation på en platform under et stereomikroskop på en vibrAtion-isolerende bord ( figur 4C ).
- Sæt de distale to tredjedele af møllens proboscis i det stive rør i smagsleveringssystemet ( figur 2B ). For at gøre dette skal du udvide møllens proboscis og derefter indsætte den i det stive rørs hul ved forsigtigt at skubbe den igennem ved hjælp af dressingpinde. Sæt proboscis på plads med blød tandvoks og derefter et lag epoxy for at undgå lækager ( figur 4C , indløb).
- Tilslut saltvandsp perfusionslinjen til hovedkapslen og sæt perfusionsstrømmen til en konstant hastighed på ca. 0,04 L / time.
- Sænk en jordelektrode ( dvs. en klorid sølvtråd) i saltvandsbadet ( Figur 5A ).
- Brug en specialfremstillet snoet wire tetrode bygget efter fremstillingsproceduren beskrevet i 30 (4 elektroder ledninger foreslås at opnå godt isolerede enheder og at passe ind iNerveen). Før forsøget elektroplader elektroden efter trinene beskrevet i 30 .
- Brug en manuel micromanipulator til at placere tetroderen tæt på den maksillære nerve. Forsæt tetroden, indtil den begynder at gå ind i nerven ( Figur 5 ).
- Vent i mindst 10 minutter efter at tetrode er sat for at gøre det muligt at stabilisere sig inden for nerven før optagelse.
- Forstærk signalet (3000x) og brug et band-pass filter sæt mellem 0,3-6 kHz. Indhent signalet ved en samplinghastighed på 40 kHz ved hjælp af dataopsamlingssoftware.
- Efter afslutning af eksperimentet placeres møllens forberedelse i fryseren.
Figur 5 : Tetrode-optagelse fra GRN'er. ( A , stort billede) En mikromanipulator bruges til at pSnøre den snoet tråd tetrode ind i den maksillære nerve (MxN) for at registrere aktiviteten af GRNs. En klorid sølvbundelektrode anbringes i saltvandsbadet som vist. ( A , indsats) Et forstørret billede af hjernen, der viser tetroden i den maksillære nerve. Den subesofageale zone (SEZ) er også angivet. ( B ) En skematisk af en Manduca hjerne orienteret som i A. Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Representative Results
Aktiviteten af GRN'er kan registreres ved anvendelse af en ekstracellulær tetrodeelektrode før, under og efter tastantlevering ( figur 6A og 6C ). Figur 6A (mellem- og bundpaneler) viser filtrerede (300-6.000 Hz) spændingsspor registreret af hver af de fire ledninger placeret i maxillarynerven, hvor signaler af forskellige amplituder, der afspejler virkningsmuligheder (pile), kan observeres. En 1 s pulserende smagsprøve (1 M saccharose) blev leveret 2 s efter forsøgets begyndelse; Stimulans begyndelse og forskydning blev overvåget af farvesensoren ( figur 6A , øverste panel). De smagsinducerede pigge, der kan observeres i hver af de fire kanaler ( Figur 6A , mellempanel). GRN'er kan identificeres og skelnes fra mekanosensorer (ingen vist her), når de reagerer på nogle smagsstoffer og ikke andre For at identificere og isolere enkelt neuronresponser fra tetrode-optagelserne udførte vi off-line spikesortering ved hjælp af et sæt brugerdefinerede funktioner baseret på Pouzat's 31 og Kleinfelds 32 , 33 metoder (disse metoder beskrives i disse citater: 10 , 29 ). Figur 6B viser et eksempel på spikesortering påført dataene vist i figur 6A , hvor der blev fundet tre godt isolerede enheder. Rasterplotter fra figur 6C afbilder reaktioner fra de tre isolerede enheder i figur 6B til seks forskellige smagsstoffer (1 M saccharose, maltose og NaCl, 100 mM koffein og 10 mM berberin og lobeline) leveret i rækkefølge (4 forsøgS / tastant er vist). Som vist i figur 6C har de indspillede GRN'er forskellige niveauer af baselineaktivitet, lige fra lydløs (GRNs 1) til lav eller moderat (GRN 2 og 3). Efter smagsprøvning viser GRN'er forskellige aktivitetsmønstre og udviser forskellige selektivitet over for smagsstoffer. For eksempel reagerede GRN 1 kun på saccharose, hvorimod GRN 2 reagerede på maltose og NaCl med spidser og til lobeline med spiking kun ved stimulans begyndelse. Derudover er nogle reaktioner låst til stimulusens timing ( fx GRN 1-respons på saccharose), mens andre responser overskrider stimulusens varighed ( fx GRN 3-respons på berberin) eller indeholder både excitatoriske og hæmmende komponenter ( fx figur 7 GRN 2 reaktioner på NaCl og saccharose). For mere information om GRNs forskellige følsomheder og aktivitetsmønstre, se reference 10 . figur 7 ). Spændingssporene i den grønne boks i panel A blev registreret intracellulært fra GRN 1 i 5 på hinanden følgende forsøg med saccharosepræsentation, og de samme svar vises som rasterplots i panel B. (Bemærk at denne type svar svarer til det, der opnås med tetroder og Vist i figur 6C .) GRN 2, optaget med skarpe intracellulære elektroder, viser et bredere responsmønster. 
Figur 6: Repræsentative resultater fra Maxillary Nerve Recordings med Extracellulære Tetroder. ( A ) Spændingsspor, der er optaget af hver af de fire ledninger ved den maksillære nerve, er filtreret (300-6000 Hz) vist (midterpanel). En 1 s puls af smagsprøve blev påført i den periode, der var angivet ved rød skygging i mellempanelet. Begyndelsen og forskydningen af stimulus blev overvåget af farvesensoren som angivet ved det røde spændingsspor på overpanelet og betegnes på midten af det røde skyggede område. De stiplede vandrette linjer angiver +50 (øverste), 0 (midten) og -50 (nederst) μV. En udvidelse af de rå spændingsspor svarende til området inde i de lodrette stiplede linjer er vist (bundpanel). Eksempler på pigge er angivet med pilene. ( B ) Et eksempel på spikesortering anvendt på dataene vist i panel A. De bølgeformer, der er optaget ved hver af de fire ekstracellulære ledninger (1-4) arE identificeret med tre forskellige GRN'er (enheder 1-3), der bidrager til de indspillede signaler. Individuelle begivenheder (farvede tynde linjer) og den gennemsnitlige (tykke sorte linje) vises for de tre enheder. En række statistiske kriterier skal betragtes som pålideligt at identificere uafhængige enheder ved hjælp af spikesorteringsmetoden (se referencer 10 , 29 ). ( C ) Rasterplotter repræsenterer svar fra de tre isolerede enheder til en sekvens af seks forskellige smagsstoffer (4 forsøg / smagsprøver er vist). Tidsperioden for tastant levering (1 s) er angivet med det røde skyggede område. Koncentrationerne af smagsstoffer var enten 1 M (saccharose, maltose, NaCl), 100 mM (koffein) og 10 mM (berberin og lobeline). Klik her for at se en større version af denne figur. Lass = "xfigimg" src = "/ files / ftp_upload / 55868 / 55868fig7.jpg" />
Figur 7 : Intracellulære optagelser fra GRN Axons. ( A , green box panel) Spændingsspor registreret fra en GRN med skarpe glas intracellulære elektroder (modstand på 80 - 120 MΩ) placeret i maxillarynerven fremkaldt af 5 på hinanden følgende stimuleringer med 1 M saccharose (Suc). ( B ) Raster-tegninger af svarene på to GRN'er, herunder svar vist i panel A (grønt feltpanel), til to forskellige tastanter leveret i sekvens (100 mM grå skriftfarve, 1 M sort skrifttype farve) optaget med skarpe glas intracellulære elektroder Placeret i maxillarynerven (7 forsøg / smagsprøver og 3 forsøg / vand er vist). Tastant leveringstid er angivet med rødt skraverede områder i begge paneler. Begyndelsen og forskydningen af stimulus blev overvåget af farvesensoren, som angivet ved de røde spændingsspor i bunden af hvert panel.Es / ftp_upload / 55868 / 55868fig7large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
De her beskrevne fremgangsmåder tillader in vivo optagelser fra et relativt simpelt dyr, Manduca sexta , at karakterisere aktiviteten af flere, tilfældigt udvalgte GRN'er over lange varigheder (i mere end 2 timer) før, under og efter tastantlevering. Disse metoder tillader også den hurtige, sekventielle levering af flere smagsstimuler med præcis temporal kontrol, fordele, der er nyttige til at studere neurale mekanismer, der ligger til grund for smagspræsentationen. Denne protokol er blevet brugt til at studere, hvordan svarene fra GRN'er til smagsstoffer transformeres, når de overføres til deres postsynaptiske målneuroner ( f.eks. I SEZ) ved overvågning af GRN'er samtidig med monosynaptisk forbundne interneuroner 10 . Derudover kan disse metoder tilpasses eksperimentets behov, hvilket gør det muligt at gennemføre komplekse paradigmer at studere grundlæggende aspekter af gustatorisk kodning.
Når begynderG vores studier, et teknisk problem, vi nogle gange måtte fejle, var manglende evne til at registrere spiking signaler fra maxillary nerve med tetrode ledninger. Mulige årsager til dette er forskellige, da dissektionsprotokollen er udfordrende, og en del øvelse er nødvendig for at opnå en god forberedelse. For det første er det i løbet af moddissektionen let at beskadige de maksimale nerver, især under fjernelse af kappen omkring det nervøse væv. For det andet, hvis kappen ikke fjernes fuldt ud, kan tetrodekablerne muligvis ikke få adgang til nerven. I begge tilfælde er det ofte den nemmeste måde at løse disse problemer på ved at starte et nyt præparat. For det tredje kan der være et problem med tetrodekablerne. Dette kan kontrolleres ved at måle impedansen af ledningerne, som skal være ~ 270 kΩ ved 1 kHz. Hvis impedansværdien er over ~ 300 kΩ, elektroplader wireene med guld for at opnå den ønskede impedans (se referencen 30 ). For det fjerde kan et udstyr undgåsEller misbrug.
Et andet muligt problem er at spiking signaler registreres, men neuronen (e) synes ikke at reagere på smagene. Dette kan skyldes, at de registrerede neuroner er ufølsomme over for det sæt af leverede smagsstoffer. Det er også vigtigt at huske på, at i tillæg til axoner af GRN'er bærer den maksillære nerve også mekanosensory fibre. Det er således muligt at optage fra mekanosensoriske neuroner i stedet for eller i tillæg til GRN'er. Imidlertid er smagsleveringssystemet designet til at tilvejebringe en konstant mekanisk indgang gennem hele eksperimentet, hvilket gør det usandsynligt, at svar på en smagsprøve vil blive forvirret af reaktioner på den mekaniske komponent i dens levering. Neuroner, der reagerer på nogle men ikke andre smagsstoffer eller på forskellige måder til forskellige smagsstoffer, kan entydigt klassificeres som GRNs. Vi anbefaler at bruge frisk fortyndede smagsstoffer for at undgå variationer i smagskoncentration eller sammensætning som følge af sammensat nedbrydning eller fordampningAf opløsningsmidlet. Vi anbefaler også at rengøre systemet regelmæssigt for at undgå forurening af slanger og / eller forhindringer.
Et andet muligt teknisk problem er et uhensigtsmæssigt signal-til-støjforhold. Dette problem kan ofte løses ved rechloridering eller justering af bademelektroden. Andre løsninger kan kræve afskærmning og minimere længden af hver elektrisk forbindelse i apparatet.
Endelig er det vigtigt at bemærke, at korrekt analyse af data opnået ved brug af tetrodeoptagelser kræver omhyggelig spids sortering. Vi fandt ud af, at fuldt automatiserede metoder generelt ikke er tilstrækkelige. Vi anbefaler at blive fortrolig med spikesorteringslitteraturen før analyse af tetrode-data 10 , 29 , 31 , 32 , 33 .
Alternativer til vores dissektion proTocol kan anvendes. Her beskrev vi en dissektion gennem den ventrale del af møllens hoved, der giver adgang til de maksillære nerver og SEZ, men det er også muligt at få adgang til disse strukturer ved at dissekere gennem dorsalsiden. Vi fandt, at dorsalforberedelsen ikke er optimal til optagelse af disse gustatoriske strukturer på grund af deres dybe placering, men dette præparat giver fordelen ved at muliggøre optagelser fra højere ordensstrukturer som svampekroppen, et område, der har været forbundet med multi -sensorisk integration, associativ læring og hukommelsesbehandling 34 . Vi har fokuseret på brugen af tetrodeelektroder til optagelse fra maxillarynerven, men som vi illustrerede kan standard intracellulære skarpe elektroder også anvendes til dette formål. Derudover kan begge teknikker kombineres til at udføre samtidige optagelser fra flere hjerneområder 10 . Neurovidenskabslitteraturen indeholder mange eksempler på jegNvertebratmodeller, der har vist sig at være effektive redskaber til afsløring af grundlæggende principper for sensorisk behandling, såsom olfaktorisk kodning, der gælder for både insekter og hvirveldyr 35 , 36 , 37 , 38 , 39 . Vi håber, at vores metoder vil føre til grundlæggende nye indsigter om gustatorisk kodning.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev understøttet af et intramuralt tilskud fra NIH-NICHD til MS. Vi takker G. Dold og T. Talbot fra NIH-NIMH Instrumentation Core Facility for at hjælpe med at designe smagsleveringssystemet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection and Specimen Preparation | |||
| Polypropylene tube, 15 mL Falcon | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Needle, Short bevel, 19 G x 1 - 1/2" | MONOJET | 888200144 | For applying air to remove the hair from the moth. |
| Modeling Clay-Van Aken Plastalina | DickBlick | 33268 | |
| Petri dish -100 x 15 mm | VWR International | 89000-304 | |
| Pipette tip (1 - 200 µL) | USA Scientific | 1111-0806 | |
| Razor blade | Techni Edge | TE05-071 | |
| 22 AWG standard hookup wire | AlphaWire | 1551 | For inserting the proboscis into the pippete tip. |
| Batik wax | Jacquard | 7946000 | |
| Electric waxer | Almore International | 66000 | |
| Stereo Myscroscope | Leica | MZ75 | |
| Dumont #1 forceps (coarse) | World Precision Instruments | 500335 | For removing fat and non-nervous tissue. |
| Dumont #5 titanium forceps (fine) | World Precision Instruments | 14096 | For removing fat and non-nervous tissue. |
| Dumont #5SF forceps (super-fine) | World Precision Instruments | 500085 | For desheathing the nervous tissue. |
| Vannas scissors (fine) | World Precision Instruments | 500086 | For removing the cuticle. |
| Collagenase/Dispase | Sigma-Aldrich | 11097113001 | |
| Epoxy | Permatex | 84101 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline Perfusion System | |||
| Extension set with rate flow regulator | B Braun Medical Inc. | V5200 | |
| IV administration set with Y injection site | B Braun Medical Inc. | V1402 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tastant Delivery System | |||
| White Translucent Nylon Tubing OD 1/4", ID 1/8" | Small Parts Inc. | B001JJT4SA | Rigid tube that connects the four main elements of the system. |
| Soldering iron | Circuit Specialists | ZD200BK | |
| Rotary tool-Dremel | Dremel | 4200 | |
| Polypropylene mesh, hole size (hole size 0.1 x 0.13 cm) | Industrial Netting | XN5170 | For ensuring that the probosises of different animals are placed in the same location. |
| Pressurized 16-Channel perfusion system | Bioscience Tools | PS-16H | For tastant delivery. This system includes pinch valves, tubing, manifold, solution cylinders, valve controller and fitting accessories. |
| Polypropylene tubing, ID 0.034", ID 0.050" | Becton, Dickinson & Co | 427421 | Output tube from the perfusion system. |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For controlling the output channel of the perfusion system. |
| Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card | National Instruments | LabVIEW 2011 | To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor. |
| Compulab 3 Manostat peristaltic pump | Sigma | P1366 | For pumping water. |
| Silicone tubing, ID 1/16" OD 1/8" | Cole-Parmer | WU-95802-02 | To connect the water source to the peristaltic pump tubing, and the outlet tube of the pump to the rigid tube of the delivery system. |
| Color sensor-digital fiber optic sensor | Keyence | FS-V31M | For monitoring tastant delivery. |
| Color sensor-reflective fiber unit | Keyence | FU35-FZ | To connect the color sensor device. |
| Dental periphery Wax | Henry-Schein Dental | 6652151 | To secure the proboscis into the rigid tube. |
| Two 3.7 L containers | To provide water to the system, and to recollect the water waste. | ||
| Fast green FCF | Sigma | F7258 | |
| Dressing forceps 25.5 cm | WPI | 500364 | To introduce moth proboscis into the proboscis hole in the rigid tube. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electrophysiology Equipment | |||
| D.C. amplifier | Brown-Lee | 440 | |
| Lamp | Schott | Schott Fostec Light Source DCR 2 | |
| Manual micromanipulator | Leica | micromanipulator | To precisely insert the tetrodes into the animal's brain. The manipulator has to allow fine and coarse movements in x, y and z axis. |
| Stereomicroscope | Leica | MZ75 | |
| Vibration-isolation table (MICRO-g lab table) | TMC | 63-541 | |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2014 | |
| 16-channle pre-amplifier and amplifier | 16 Channel MA-800 Amplifier System | B.E.S 2013 | |
| Computer | Dell | optiplex 780 | The following are the minimum recommended requirements. RAM: 3.32 GHz, 3GB. Processor: Intel Core 2 Duo. Graphic card: integrated Intel GMA X4500. |
| Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card | National Instruments | LabVIEW 2011 | To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor and electrode. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tastants | |||
| KAc | Sigma-Aldrich | P5708 | |
| LiCl | Sigma-Aldrich | L9650 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 73575 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 |
References
- Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).
- Chen, X., Gabitto, M., Peng, Y., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. A Gustotopic Map of Taste Qualities in the Mammalian Brain. Science. 333 (6047), (2011).
- Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. Common Sense about Taste: From Mammals to Insects. Cell. 139 (2), 234-244 (2009).
- Mueller, K. L., Hoon, M. A., Erlenbach, I., Chandrashekar, J., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. The receptors and coding logic for bitter taste. Nature. 434 (7030), 225-229 (2005).
- Zhao, G. Q., Zhang, Y., et al. The receptors for mammalian sweet and umami taste. Cell. 115 (3), 255-266 (2003).
- Huang, A. L., Chen, X., et al. The cells and logic for mammalian sour taste detection. Nature. 442 (7105), 934-938 (2006).
- Pfaffmann, C., Carl, The afferent code for sensory quality. Am Psychol. 14 (5), 226-232 (1959).
- Lemon, C. H., Katz, D. B. The neural processing of taste. BMC Neurosci. 8 (Suppl 3), (2007).
- Barretto, R. P. J., Gillis-Smith, S., et al. The neural representation of taste quality at the periphery. Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).
- Reiter, S., Campillo Rodriguez, C., Sun, K., Stopfer, M. Spatiotemporal Coding of Individual Chemicals by the Gustatory System. J Neurosci. 35 (35), 12309-12321 (2015).
- Wilson, D. M., Boughter, J. D., et al. Bitter Taste Stimuli Induce Differential Neural Codes in Mouse Brain. PLoS ONE. 7 (7), e41597 (2012).
- Glendinning, J. I., Davis, A., Ramaswamy, S. Contribution of different taste cells and signaling pathways to the discrimination of "bitter" taste stimuli by an insect. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 22 (16), 7281-7287 (2002).
- Kay, L. M., Stopfer, M. Information processing in the olfactory systems of insects and vertebrates. Semin Cell Dev Biol. 17 (4), 433-442 (2006).
- Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral Coding of Taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).
- Carleton, A., Accolla, R., Simon, S. A. Coding in the Mammalian Gustatory System. Trends Neurosci. 33 (7), 326-334 (2010).
- Stocker, R. F. The organization of the chemosensory system in Drosophila melanogaster: a rewiew. Cell Tissue Res. 275 (1), 3-26 (1994).
- Mitchell, B. K., Itagaki, H., Rivet, M. P. Peripheral and central structures involved in insect gustation. Microsc Res Tech. 47 (6), 401-415 (1999).
- Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. Labellar taste organs of Drosophila melanogaster. J Morphol. 150 (2), 327-341 (1976).
- Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. Physiology of a primary chemoreceptor unit. Science. 122 (3166), 417-418 (1955).
- Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. J Vis Exp. (84), e51355 (2014).
- Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila). Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
- Descoins, C., Marion-Poll, F. Electrophysiological responses of gustatory sensilla of Mamestra brassicae (Lepidoptera, Noctuidae) larvae to three ecdysteroids: ecdysone, 20-hydroxyecdysone and ponasterone. A. J Insect Physiol. 45 (10), 871-876 (1999).
- Popescu, A., Couton, L., et al. Function and central projections of gustatory receptor neurons on the antenna of the noctuid moth Spodoptera littoralis. J Comp Physiol. 199 (5), 403-416 (2013).
- Morita, H., Yamashita, S. Generator potential of insect chemoreceptor. Science. 130 (3380), 922 (1959).
- Davis, N. T., Hildebrand, J. G. Neuroanatomy of the sucking pump of the moth, Manduca sexta (Sphingidae, Lepidoptera). Arthropod Struct Dev. 35 (1), 15-33 (2006).
- Stürckow, B., Adams, J. R., Wilcox, T. A. The Neurons in the Labellar Nerve of the Blow Fly. Z Vergl Physiol. 54, 268-289 (1967).
- Stürckow, B. Electrophysiological studies of a single taste hair of the fly during stimulation by a flowing system. Proceed 16 Intern Contr Zool. 3 (8), 102-104 (1963).
- Christensen, T. A., Hildebrand, J. G. Male-specific, sex pheromone-selective projection neurons in the antennal lobes of the moth Manduca sexta. J Comp Physiol A. 160, 553-569 (1987).
- Reiter, S. Gustatory Information Processing. , https://repository.library.brown.edu/studio/item/bdr:386235/PDF/?embed=true (2014).
- Saha, D., Leong, K., Katta, N., Raman, B. Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits. J Vis Exp. (71), (2013).
- Pouzat, C., Mazor, O., Laurent, G. Using noise signature to optimize spike-sorting and to assess neuronal classification quality. J Neurosci Methods. 122 (1), 43-57 (2002).
- Hill, D. N., Mehta, S. B., Kleinfeld, D. Quality Metrics to Accompany Spike Sorting of Extracellular Signals. J Neurosci. 31 (24), 8699-8705 (2011).
- Fee, M. S., Mitra, P. P., Kleinfeld, D. Automatic sorting of multiple unit neuronal signals in the presence of anisotropic and non-Gaussian variability. J Neurosci Methods. 69 (2), 175-188 (1996).
- Heisenberg, M. Mushroom body memoir: from maps to models. Nat Rev Neurosci. 4 (4), 266-275 (2003).
- Naraghi, M., Laurent, G. Odorant-induced oscillations in the mushroom bodies of the locust. J Neurosci. 14, 2993-3004 (1994).
- Laurent, G., Wehr, M., Davidowitz, H. Temporal representations of odors in an olfactory network. J Neurosci. 16, 3837-3847 (1996).
- Perez-Orive, J., et al. Oscillations and sparsening of odor representations in the mushroom body. Science. 297, 359-365 (2002).
- Stopfer, M., Jayaraman, V., Laurent, G. Odor identity vs. intensity coding in an olfactory system. Neuron. 39, 991-1004 (2003).
- Laurent, G. Olfactory network dynamics and the coding of multidimensional signals. Nature Re Neurosci. 3, 884-895 (2002).
