Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

שיטות חדשות לחקר קידוד גוסטוריאלי

Published: June 29, 2017 doi: 10.3791/55868
Automatic Translation
*1, *1,2, 1, 1
1National Institute of Child Health and Human Development (NICHD), National Institutes of Health (NIH), 2Max Planck Institute for Brain Research
* These authors contributed equally

Summary

אנו מציגים שלוש שיטות חדשות כדי ללמוד קידוד gustatory . בעזרת חיית מחמד פשוטה, המנדוקה סוקה ( Manduca ) , אנו מתארים פרוטוקול לנתיחה, השימוש tetrodes תאיים להקליט את הפעילות של נוירונים קולטן רב גוסטורי, ומערכת לאספקת ומעקב פולסים תזמון מדויק של טעימות.

Abstract

חוש הטעם מאפשר לבעלי חיים לזהות חומרים כימיים בסביבה, מה שמביא להתנהגויות חיוניות להישרדות. כאשר נוירונים קולטן גוסטורי (GRNs) לזהות מולקולות טסטנט, הם לקודד מידע על הזהות ואת הריכוז של הטעם כמו דפוסי הפעילות החשמלית כי אז להפיץ נוירונים עוקבים במוח. דפוסים אלה מהווים ייצוגים פנימיים של הטעם, אשר לאחר מכן לאפשר החיה לבחור פעולות לזכרונות. השימוש במודלים של בעלי חיים פשוטים יחסית היה כלי רב עוצמה ללימוד עקרונות בסיסיים בקוד החושי. כאן, אנו מציעים שלוש שיטות חדשות ללמוד קידוד gustatory באמצעות mextuca mextuca sexta . ראשית, אנו מציגים הליך לנתיחה לחשיפת עצבים מקסימילריים אזור תת אזורית (SEZ), המאפשר הקלטה של ​​הפעילות של GRNs מן האקסונים שלהם. שנית, אנו מתארים את השימוש של אלקטרודות תאיים כדי להקליט את הפעילות של GRNs מרובים על ידי הצבת teTrode חוטים ישירות לתוך העצב Maxillary. שלישית, אנו מציגים מערכת חדשה לאספקת ניטור, עם דיוק גבוהה בזמן, פולסים של טסטנטים שונים. שיטות אלה מאפשרים אפיון של תגובות העצבית vivo ישירות GRNs לפני, במהלך ואחרי הטעמים מועברים. אנו מספקים דוגמאות של עקבות מתח שנרשמו מ GRNs מרובים, ולהציג דוגמה כיצד טכניקה מיון ספייק ניתן ליישם את הנתונים כדי לזהות את התגובות של נוירונים בודדים. לבסוף, כדי לאמת את הגישה שלנו הקלטה, אנו משווים הקלטות תאיים המתקבל GRNs עם tetrodes הקלטות תאיים שהושגו עם אלקטרודות זכוכית חדה.

Introduction

מערכות המעי הגס וחוש הריח מייצרות ייצוגים פנימיים של כימיקלים בסביבה, מה שמביא לתפיסות של טעמים וריחות, בהתאמה. החושים הכימיים האלה חיוניים להפקת התנהגויות רבות חיוניות להישרדות האורגניזם, החל מציאת בני זוג וארוחות, כדי למנוע טורפים ורעלים. התהליך מתחיל כאשר כימיקלים סביבתיים אינטראקציה עם קולטנים הממוקם בקרום פלזמה של תאים קולטניים סנסוריים; תאים אלה, ישירות או באמצעות אינטראקציות עם נוירונים, transduce מידע על הזהות והריכוז של כימיקלים לתוך אותות חשמליים. אותות אלה מועברים לנוירונים מסדר גבוה יותר ומבני מוח אחרים. ככל שצעדים אלה מתקדמים, האות המקורי עובר תמיד שינויים המקדמים את יכולתו של האורגניזם לזהות, להפלות, לסווג, להשוות ולאחסן את המידע החושי, ולבחור בפעולה המתאימה. הבנת איך החזייהב transforms מידע על כימיקלים סביבתיים כדי לבצע מגוון רחב של משימות היא שאלה בסיסית בתחום מדעי המוח.

קידוד גוסטורי נחשב כפשוט יחסית: תפיסה הרווחת גורסת כי כל מולקולה כימית שמקבלת טעם ("טסטנט") שייכת באופן טבעי לאחת מחמש תכונות הטעם הבסיסיות ( כלומר , מתוק, מריר, חמוץ) , מלוח ואומאמי) 1 . בתפיסת "הטעם הבסיסי" הזה, תפקידה של מערכת התסכול הוא לקבוע אילו טעמים בסיסיים אלה קיימים. יתר על כן, המנגנונים העצביים המונחים ביסוד הטעם הבסיסי במערכת העצבים אינם ברורים, והם נחשבים להיות נשלט על ידי "קו מסומן" 2 , 3 , 4 , 5 , 6 או "על פני דפוס סיבים" 7 , 8 קוד. בקוד קו מסומן, כל תא חושי וכל אחד מחסידיו העצביים מגיבים לאיכות טעם אחת ויוצרים ערוץ ישיר ועצמאי למרכזי עיבוד גבוהים יותר במערכת העצבים המרכזית המוקדשים לטעם. לעומת זאת, בקוד דפוס סיבי, כל תא חושי יכול להגיב לאיכויות הטעם המרובות, כך שהמידע על הטעם מיוצג על ידי התגובה הכוללת של אוכלוסיית הנוירונים הסנסוריים. בין אם מידע גוסטיווי מיוצג על ידי טעמים בסיסיים, באמצעות קווים מסומנים, או באמצעות מנגנון אחר, אינו ברור והוא מוקד החקירה האחרונה 3 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . העבודה שלנו לאחרונה עולה כי מערכת gustatory משתמש קוד האוכלוסייה spatiotemporal ליצורייצוגים של טסטנטים בודדים ולא בקטגוריות טעם בסיסיות 10 .

כאן אנו מציעים 3 כלים חדשים כדי לסייע במחקר של קידוד gustatory. ראשית, אנו מציעים את השימוש של סנדקה hawkmoth מאנדוקה כמו אורגניזם מודל פשוט יחסית הנלמד מחקר אלקטרופיזיולוגי של טעם לתאר הליך לנתיחה. שנית, אנו מציעים את השימוש "tetrodes" תאיים להקליט את הפעילות של GRNs הפרט. ושלישית, אנו מציעים מנגנון חדש לאספקת ניטור מדויק של פעימות מתוזמן של טסטנט אל החיה. כלים אלה הותאמו טכניקות המעבדה שלנו ואחרים השתמשו כדי ללמוד את מערכת חוש הריח.

חרקים כמו זבוב הפירות תסיסנית melanogaster , ארבה Schistocerca אמריקה , כמו גם עש סנדקה עש , יש עשרות שנים סיפק משאבים רבי עוצמה כדי להבין עקרונות בסיסיים על nerVOS, כולל קידוד סנסורי ( למשל, olfaction 13 ). אצל יונקים, קולטני הטעם הם תאים מיוחדים שמתקשרים עם נוירונים דרך מסלולים מורכבים של מסיר שני, 1 , 14 . זה פשוט יותר חרקים: קולטני הטעם שלהם הם נוירונים. יתר על כן, מסלולי הטעם של יונקים ליד הפריפריה הם מורכבים יחסית, שמציעות מסלולים עצביים מרובים מקבילים, ורכיבים חשובים הם מאתגרים לגישה, הכלולים במבנים גרמיים קטנים 15 . חרקים טעם חרקים נראה פשוט יותר. ב חרקים, GRNs כלולים מבנים מיוחדים המכונה סנסילה, הממוקם באנטנה, mouthparts, כנפיים ורגליים 16 , 17 . את GRNs ישירות לפרויקט לאזור תת תת קרקעי (SEZ), מבנה שתפקידו נחשב להיות בעיקר gustatory 17 , ואשר מכיל סדר שנינוירונים גוסטיים 10 . משם המידע מגיע לגוף כדי להניע רפלקסים, ולאזורים מוחיים גבוהים יותר להיות משולבים, מאוחסנים, ובסופו של דבר לנהוג בחירות התנהגותיות 16 .

יש צורך לאפיין תגובות הטעם הפריפריה כדי להבין כיצד מידע הטעם הוא מופץ והשתנה מנקודה לנקודה לאורך מערכת העצבים. השיטה הנפוצה ביותר כדי לפקח ישירות על הפעילות העצבית של GRNs חרקים היא טכניקת ההקלטה קצה 12 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . זה כרוך הצבת אלקטרודה ישירות על סנסילום, שרבים מהם קל יחסית לגשת. הטעם כלול בתוך האלקטרודה, המאפשר אחד להפעיל ו extגזעני למדוד תגובות עצביות של GRNs ב sensillum. אבל, בגלל הטעם הוא הכיל את האלקטרודה, לא ניתן למדוד את פעילות GRN לפני הטעם נמסר או לאחר הסרתו, או להחליף טעימות מבלי להחליף את האלקטרודה 20 . שיטה נוספת, "הקיר בצד" טכניקה הקלטה, יש גם שימשו להקליט פעילות GRNs. כאן, אלקטרודה ההקלטה מוכנס לתוך הבסיס של טעם sensillum 24 , וטעמים מועברים דרך זכוכית נפרדת נימי על קצה הסנסילום. שתי הטכניקות להגביל את ההקלטה מ GRNs כדי sensillum מסוים. כאן, אנו מציעים טכניקה חדשה: הקלטה מתוך אקסון GRN שנבחרו אקראית מ sensilla שונים, תוך מתן בנפרד רצפים של טסטנטים כדי חוטם. הקלטות האקסון מושגות על ידי הנחת או אלקטרודות זכוכית חדה או צרורות אלקטרודה תאיים (tetrodes) לתוך העצב שנושאת אקסונים מGRNs ב חוטם 10 SEZ. במנדוצ'ה , האקסונים האלה חוצים את העצב המקסימלי, הידוע כבעל אופי גרידא, המאפשר הקלטה חד-משמעית של תגובות חושיות 25 . שיטה זו של הקלטה מ אקסונים, מאפשר, במשך יותר משעתיים, מדידה יציבה של תגובות GRN לפני, במהלך ואחרי סדרה של מצגות טעימות.

כאן, אנו מתארים הליך לנתיחה לחשיפת העצבים מקסימילרי יחד עם SEZ, אשר יכול לאפשר אחד להקליט בו זמנית את התגובות של GRNs מרובים נוירונים ב 10 SEZ. כמו כן, אנו מתארים את השימוש של הקלטות תאיים של GRNs באמצעות Custom-made 4 ערוצים tetrode מעוותת אשר, בשילוב עם שיטת מיון ספייק, מאפשר ניתוח של מספר (בידיים שלנו, עד שש) GRNs בו זמנית. אנחנו עוד להשוות הקלטות שנעשו עם tetrodes הקלטות שנעשו עם תאיים חדאלקטרודות. לבסוף, אנו מתארים מנגנון חדש עבור מתן גירויים טעים. הציוד החדש שלנו, המתבסס על הציוד ששימש זמן רב על ידי חוקרים רבים כדי לספק חומרי ריח בחקר האולפונים, מציע יתרונות לחקר הלמידה: שיפור במערכת ההולכה הרב-שנתית הקודמת, כמו אלה שפותחו על ידי סטורקוב ועמיתים (ראה הפניות 26 , 27 ), המנגנון שלנו משיג דיוק שליטה על העיתוי של משלוח טסטנט תוך מתן readout המתח של העיתוי הזה; וזה מאפשר משלוח מהיר, רציף של גירויים טעימות מרובים 10 . המכשיר מנגב את חוטם הזרימה בזרימה מתמדת של מים נקיים, שאליהם ניתן להעביר פולסים מבוקרים של טסטנט. כל דופק טעים עובר מעל חוטם ואז נשטף משם. טסטנטים מכילים כמות קטנה של צבעי מזון חסרי טעם, המאפשרים חיישן צבע לפקח, עם תזמון מדויק, את המעבר של ov טעיםאה חוטם.

Protocol

זהירות: קשקשים בסדר, אבקה שפורסמו על ידי Manduca יכול להיות אלרגני ולכן השימוש בכפפות בטיחות מעבדה מסכת פנים מומלץ.

1. דיסקציה של סקסטה מנדוסה לחשוף את עצבי הזעיר ואת SEZ

  1. בחר עש מתאים של מין או על פי התכונות הבאות: שלושה ימים לאחר eclosion עם מראה בריא כללי (כנפיים צריך להיות המורחבת במלואה, ואת חוטם ואת האנטנות צריך להיות שלם).
    1. מניחים את העש בנפרד בכוס פלסטיק להובלה.
  2. הכנס את עש לתוך צינור פוליפרופילן.
    זהירות: אנו ממליצים לבצע שלב זה במכסה המנוע כדי למנוע את התפשטות קשקשים.
    1. הצינור צריך להיות מעט יותר כי הגוף של עש ( איור 1 א ). הצינור יכול להתבצע על ידי חיתוך צינור פוליפרופילן 15 מ"ל.
      2. < Li> דחפו את העש עד שהראש נחשף והכניסו נייר רקמות מקופל לקצה השני של הצינור כדי לסייע לשמור על העש נייח ( איור 1 א ).
  3. הסר את השיער מן הראש החשוף של עש (הגחון והגבי) על ידי נושבת באוויר דחוס על זה.
    1. סילון אוויר יכול להתבצע על ידי חיבור מזרק (1 מ"ל עם מחט, מזהה סביב 1.4 מ"מ, עם קצה חד הוסרו) למקור אוויר דחוס.
      הערה: לאחר הסרת השיער ניתן לבצע את כל השלבים הבאים מחוץ למכסה המנוע.
  4. לאחר רוב השיער הוסר, במקום הצינור לתוך החדר מחזיק עם החלק הגבי של הראש פונה כלפי מעלה, כפי שמוצג בתרשים 1B .
    1. על צלחת פטרי, להשתמש חימר דוגמנות לבנות בסיס משולש על 7 ס"מ, 2.5 ס"מ גבוה ( איור 1 ב ).

Ep-together.within-page = "1"> איור 1
איור 1 : הכנת לשכת המיתרים למנדוקה . ( א ) עש מאופק בצינור. הראש חשוף בקצה אחד, ואילו הקצה השני מחובר עם נייר טישו. ( ב ) תא לנתיחה עשוי צלחת פטרי ו חימר דוגמנות מוצג. החלק האחורי של הראש פונה כלפי מעלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. הגן על האנטנות ועל חוטם.
    1. הכן 3 צינורות קטנים על ידי חיתוך קצה פיפטה (טיפים צהוב, 1-200 μL) עם להב גילוח ל 3 חתיכות של כ 0.5 ס"מ אורך. הקוטר הפנימי צריך להיות גדול מספיק, כך האנטנה ואת חוטם יכול להתאים בנוחות.
    2. הכן וו על ידיכיפוף חוט (22 AWG, של כ 7 ס"מ). הרחבת חוטם של חוטם ולאחר מכן להכניס אותו לאחד הצינורות הקטנים על ידי משיכת אותו דרך וו חוט עד הצינור מגיע החלק הפרוקסימלי של חוטם.
    3. אבטח את הצינור הקטן עם שעווה batik המשרד (באמצעות, למשל, שעווה חשמלי שיניים להמיס לכוון את השעווה) לחלק האחורי של הקפסולה הראש של עש ( איור 2 א שמאל).
    4. מניחים כל אנטנה לתוך צינור לאבטח את צינורות עם שעווה batik כפי שמוצג באיור 2 א (משמאל). היזהר כדי למנוע נזק האנטנות עם שעווה חם.
  2. לייצב את המוח נגד התנועה על ידי חיתוך השרירים המכסים את פני השטח הקדמי של המוח ( כלומר שריר bucal מדחס).
    1. תחת מיקרוסקופ לנתיחה, להשתמש במספריים דיסק לנתח או מיני גרזן מעוצב מתוך שבב גילוח מודבק קיסם לפתוח את הראש כמוסה על ידי makIng חתך קטן ממש מתחת חוטם ( איור 2 א , שמאל העליון השמאלי).
    2. השתמש מספריים לנתח מיקרו לחתוך את שריר מדחס buccal (לאיורים ראה התייחסות 25 ). כמו שריר אינו גלוי בקלות, הבדיקה ההתנהגותית הבאה מומלץ לוודא כי הוא נחתך.
    3. לדלל סוכרוז במים מזוקקים כדי להשיג פתרון 1 M.
    4. השתמש פיפטה לספק כ 200 μL של תמיסת סוכרוז כדי 2/3 דיסטלי של חוטם, ולצפות חוטם במשך 5 דקות. אם השריר היה לחתוך כראוי את החרק לא צריך להיות מסוגל להאריך או להזיז את חוטם.
    5. החל שכבה של שעווה batik נמסה לאטום את הפתח בתוך הראש כמוסה.
  3. הפוך את החרק מעל כך הצד הגחון של הראש כמוסה עכשיו פונה כלפי מעלה.
  4. כדי להחמיץ מלוחים במהלך ואחרי הליך לנתיחה לבנות כוס שעווה סביב הצד הגחון של הראש usinG שעווה חשמלית: תחת מיקרוסקופ לנתיחה, להתחיל בבניית כוס על ידי החלת השורה הראשונה של שעווה לאורך החלק הקדמי של הראש, נע לעבר הגב. שמור את צינורות חוטמים ואנטנות בתוך כוס ( איור 2 א ימין).
    1. ממשיכים לבנות את הספל כלפי מעלה ומעל עד שהוא מגיע לרמה של העיניים.
  5. השתמש מלקחיים לקחת אחד משני מלכודות labial, ואז למקם אותו בצד ולאבטח אותו לתוך כוס שעווה ידי הוספת שעווה נמסה יותר. לעשות את אותו הדבר עם כף הרגל השני ( איור 2 א ימין).
  6. אטום כל הפתחים בשעווה כוס צינורות.
    הערה: בשלב זה משמש אפוקסי כי זה עוזר בקלות חותם הפערים השעווה ואת צינורות, ונמנע כל נזק הקשור לחום אנטנות חוטם.
    1. השתמש קיסם כדי לערבב אפוקסי בינארי בתוך צלחת ערבוב פלסטיק. לשמור על צלחת ערבוב.
    2. השתמש קיסם ליישם רזהשכבת אפוקסי החיצוני הפנימי של הכוס ( איור 2 ב ).
    3. ממלאים את החלל הריק בצינורות המכילים את חוטם ו antioxae עם אפוקסי, ולמלא את החלק של צינור פוליפרופילן סביב הצוואר עם מספיק אפוקסי להחזיק אותו בחוזקה במקום ( איור 2 ב ).
    4. השאירו את אפוקסי להתייבש במשך כ 20 דקות. כדי לבדוק זאת, לבדוק את אפוקסי שנותרו צלחת ערבוב פלסטיק כדי להבטיח שהוא מוצק כבר לא דביק.
    5. ממלאים את כוס השעווה עם מלוקה פיסיולוגית מלוחים 28 ומחכים כמה דקות כדי לוודא שאין דליפות. אם דליפה גלוי, לנסות לאטום אותו על ידי החלת שעווה חם יותר ו / או אפוקסי.

איור 2
איור 2 : הכנת מנדוקה </ Em> עבור ניתוחים. ( א ) אנטנות ו חוטם מוגנים בתוך צינורות קטנים שנעשו טיפים פיפטה לחתוך לשלוש חתיכות של כ 0.5 ס"מ אורך. (הפאנל השמאלי, תמונה גדולה) צינורות מאובטחות עם שעווה batik מותך ליישם סביב החלק הגבי של הראש. (הפאנל השמאלי, הבלעה) כדי להסיר את שריר מדחס buccal, הצד הגבי של הראש כמוסה נפתחת על ידי ביצוע חתך קטן כפי שצוין על ידי קו מקווקו בתמונה גדולה. (פאנל מימין) כוס שעווה בנויה סביב הצד הגחון של הראש כמו מאגר עבור מלוחים perfused במהלך הליך לנתיחה וניסויים הקלטה. ( ב ) אפוקסי משמש כדי לאטום את הפערים בין הבסיס של כוס שעווה לבין החלק הגבי של הראש (הפאנל השמאלי), ובין השעווה לבין צינורות המכילים את האנטנות ואת חוטם, כולל פתחים של הצינורות (פאנל ימין ). אנא לחץ כאןO להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

  1. תחת מיקרוסקופ לנתיחה, להשתמש מספריים לנתח מיקרו לנתק את מלכות labial.
  2. השתמש מספריים מיקרו לנתח או מיני גרזן כדי לפתוח את הצד הגחון של הראש כמוסה על ידי ביצוע ארבעה חתכים: שני חתכים לאורך לציפורן המקיף כל עין מהחזרה לפנים, אחד לחתוך על לציפורן לאורך החלק האחורי של הראש, אחד לחתוך על לציפורן לאורך החלק הקדמי של הראש ליד חוטם ( איור 3 א ).
  3. משוך בעדינות את cuticle באמצעות מלקחיים מיקרו דיסקציה לחשוף את המוח.
  4. באמצעות שני מיקרוסקופים חדה מיקרו דיסקציה לאט ובזהירות להסיר רקמת שומן ואת קנה הנשימה המכסה את SEZ. הימנע מכל נזק למוח או עצבים (למשל, עצב מקסימלי, עצב אופטי, חיבור צוואר הרחם). יש לשטוף את המוח על ידי החלפת תמיסת מלח תמיכתית, ולהתאים את האור לעיתים קרובות לשיפור הראות. הערה: זה עשוי להיות החלק הקריטי ביותר של דיSsection; זה קל לפגוע בשוגג בעצב מקסימלי על ידי משיכה או מוחצת אותו.
    הערה: בשלב זה ה- SEZ ואת העצבים הקסם צריך להיות גלוי בבירור ( איור 3B -3C ). עם זאת, המוח ואת העצבים הקסמתיים מכוסים על ידי נדן דק.
  5. כדי להסיר את נדן, להחליף את מלוחים בכוס שעווה עם 10% (w / V) collagenase / dispase מומס מלוחים ולהשאיר אותו במקום במשך 5 דקות. לאחר מכן, לאחר שטיפת המוח מספר פעמים עם מלוחים, להסיר בעדינות את נדן עם מלקחיים זעירים מיקרו דיסקציה עדינה על ידי משיכת נדן למעלה מ SEZ דרך העצבים מקסימילרי.
  6. מתחילים לבשל את כוס השעווה עם מלוחים טריים. מניחים את הצינור מתוך קו לטפטף מלוחים לתוך כוס שעווה ולאבטח אותו שם עם שעווה נמסה.

איור 3
תאנהUre 3 : הליך המחתרת מנדוקה . ( א ) הלוחות הלוליים הוסרו, הקפסולה הראשית נפתחת על ידי ביצוע ארבעה חתכים כפי שצוין על ידי הקו המקווקו. ( B ) תמונה מוגדלת של המוח לאחר פתיחת הראש כמוסה והסרה של רקמות שומן ו קנה הנשימה, המאפשר הדמיה של העצבים מקסימילרי (MxNs) ואת אזור תת הוושט (SEZ, מונח המתייחס לאזור המוח תחת וֵשֶׁט). העצבים הקסמניים נושאים אקסונים של נוירונים קולטנים (GRNs) במעי הגס ל- SEZ. ( ג ) סכמטית של המוח מנדוקה . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

2. Tastant משלוח המערכת

  1. מערכת משלוח הטסטנט מורכבת מארבעה מרכיבים עיקריים: מקור המים, סעפת הטעם, חיישן הצבע והאתר המכיל אתחוטם, מחובר כל צינור פלסטיק קשיח ( איור 4 א -4 ב ). כדי לבנות מערכת זו בצע את השלבים שמוצג באיור 4 ב . השתמש צינור פלסטיק קשיח על אורך 6 ס"מ (0.3 ס"מ מזהה).
  2. השתמש ברזל הלחמה לעשות חור קטן בצינור שבו חוטם הולך להיות ממוקם ( איור 4 א -4 ב ).
  3. כדי להבטיח probosesises של בעלי חיים שונים ממוקמים תמיד באותו מיקום, לצרף חומר ההקרנה פלסטיק (רשת, גודל חור של כ 0.1 ס"מ) לתוך הצינור ( איור 4 א -4 ב ). עם סכין גילוח או כלי סיבוב לחתוך את הצינור נוקשה על 5 מ"מ מעל החור חוטם. מניחים את הרשת בין שתי חתיכות של צינור. אבטח את הרשת ולחבר מחדש את הצינורות על ידי החלת אפוקסי על החלק החיצוני של הצינורות. השאירו את אפוקסי להתייבש במשך כ 20 דקות.
  4. עבור משלוח טעים להשתמש בלחץמערכת זלוף עם צינורות רבים כמו טסטנט לפי הצורך, הצטרפו סעפת (ראה להלן). השתמש ברזל הלחמה לעשות חור קטן בצינור נוקשה על 1 ס"מ מעל הרשת. הכנס את צינור הפלט ממערכת זלוף (ID 0.86 מ"מ) לתוך הצינור נוקשה לאבטח אותו שם על ידי החלת אפוקסי ( איור 4 א -4 ב ).
  5. השתמש משאבה peristaltic לספק זרימה קבועה (~ 40 מ"ל / דקות) של מים מזוקקים. חבר אותו עם צינורות סיליקון על צינור קשיח ( איור 4A -4C ). חבר את הצד השני של הצינור נוקשה לצינור סיליקון אחר לכוון את הפלט לתוך מיכל פסולת גדול ( איור 4A -4C ).
  6. כדי לספק את הטעם, להזריק אוויר דחוס לתוך סעפת של מערכת זלוף. זה יכול להיות מושגת, למשל, באמצעות משאבת פניאומטית (10 psi) נשלט על ידי קלט מתח מתוזמן הדופק להזריק אוויר דחוס לתוך manifol צינור המכיל את הטעם הרצויה. דופק 1s פולט על 0.5 מ"ל של טסטנט.

3. הכנה טסטנט וניטור משלוח טסטנט

  1. מדולל טסטנט במים מזוקקים לריכוז הרצוי. שימו לב כי הטעם יהיה עוד יותר מדולל על ידי זרם המים. למדוד את הריכוז הסופי להגיע לחוטם כמו 77% הריכוז הראשוני (ראה הפניות 10 , 29 ).
  2. הוסף צבע מזון מלאכותי לכל פתרון טעים כדי לאפשר לקבוע את התזמון המדויק שבו הטעם עובר מעל חוטם. מצאנו כי צבע ירוק (ראה רשימת חומרים ) ב 0.05% w / v אינו מפעיל את מנדוקה GRNs.
  3. השתמש חיישן צבע (ראה טבלה 1) כדי לזהות את צבעי מזון בפתרונות טעים. השתמש ברזל הלחמה לעשות חור הסמוך לרשת ו 0.5 ס"מ מתחת צינור הפלט של מערכת זלוף ( S = "xfig"> איור 4 א -4 ב). חבר את החיישן אל הצינור נוקשה לאבטח אותו שם החלת אפוקסי מבחוץ.
    1. הקלט את יציאת מתח החיישן בצבע כאות אנלוגי יחד עם אותות פיזיולוגיים (ראה סעיף 4). חיישן צבע מתח האות יכול להיות מוגבר באמצעות מגבר DC מחובר החיישן ( איור 4 א ).
  4. ודא שחיישן הצבע פועל על ידי אספקת הטעם והקלטת יציאת המתח של החיישן. האות שנוצר על ידי צבע צריך לחרוג מרמת הרעש.
    1. התאם את קצב זרימת המים הקבוע כדי להפוך את האות קרוב ככל האפשר לריבוע.
      הערה: בעת אספקת טסטנטים מרובים ברצף, לציין את המשפט הראשון עם טסטנט חדש יהיה מורכב תערובת של טסטנט חדש הקודם. מסיבה זו לא ניתחנו את הניסויים הראשונים.
"> איור 4
איור 4 : מערכת משלוח טסטנט. ( א ) סכמטית של המנגנון המשמש להעברת ובקרה של פעימות מתוזמנות של טסטנטים אל חוטם החיה. המרכיבים העיקריים של המערכת מסומנים עם מספרים אדומים. זרימה קבועה של מים מזוקקים נשמרת לאורך החוט על ידי משאבה peristaltic מחובר צינור סיליקון על צינור פלסטיק קשיח (1) שבו חוטם הוא להיות ממוקם (6). טסטנטים המכילים כמות קטנה של צבע ללא טעם מועברים באמצעות מערכת בלחץ 16-בלחץ זלוף. המאגרים המכילים את הטעמים מחוברים לאספן (2) המחובר לצינור הנוקשה, מעל החור שבו יש להציב את החוט (5). אוויר דחוס ממשאבה פנאומטית מוזרק למערכת זלוף כדי לספק במהירות טסטנט, עם תזמון נשלט על ידי תוכנה מותאמת אישית. אחיישן צבע (3) משמש לפקח על משלוח tastant. החיישן מחובר לצינור נוקשה סמוך חוטם ומתחת לשקע של מערכת זלוף טעים. אות מתח חיישן הצבע מוגבר על ידי מגבר DC. עקבות אדום על הבלעה הסמוך המגבר ממחישה אות צבע נרשם באמצעות תוכנה מותאמת אישית רכישת נתונים; הגידול המהיר וירידה האות משקפים את ההגעה ו washout של הטעם, בהתאמה. את חוטם של עש ממוקם לתוך חור (5) הממוקם ממש מתחת חיישן צבע. רשת (4) ממוקמת מעל החור כדי להבטיח probosesises של בעלי חיים שונים ממוקמים תמיד באותו מיקום. הצד השני של הצינור נוקשה מחובר צינור סיליקון אחר לכוון את הפלט לתוך מיכל פסולת (7). ( ב ) תמונה המציגה את המרכיבים העיקריים של מערכת משלוח טסטנט מחובר צינור פלסטיק קשיח, אשר מסומנים על ידי המספרים האדומים כפי שמוצג בלוח א ': המים(6), את צינור הפלט רב הטעם (2), את חיישן הצבע (3), את הרשת (4), ואת החור שבו החוטם צריך להיות מוכנס (5) כל מחובר לתוך צינור פלסטיק קשיח (1) . ( ג ) את המיקום של ההכנה מנדוקה לתוך ההתקנה מוצג. דיסטלי T2 / 3 של חוטם של עש מוכנסים לתוך החור (5) על צינור פלסטיק קשיח (1). חוטם מאובטח במקום עם שעווה שיניים אפוקסי כפי שמוצג על ידי הבלעה. כניסת המים לצינור הנוקשה ותפוקתו למיכל פסולת מסומנים במספרים 6 ו -7, בהתאמה. מספר 2 מציין את צינורות התפוקה רב הטעם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

4. תאיים Tetrode הקלטה לפקח Tastant- עורר פעילות GRNs

  1. הכנת במקום עש על פלטפורמה תחת stereomicroscope על vibrAtion- בידוד השולחן ( איור 4 ג ).
  2. שים את שני שלישים דיסטלי של חוטם של עש לתוך הצינור נוקשה של מערכת משלוח טעים ( איור 2 ב ). כדי לעשות זאת, להאריך את חוטם של עש ולאחר מכן להכניס אותו לתוך החור של צינור קשיח על ידי בעדינות דוחף אותו בעזרת מלקחיים ההלבשה. חותם את חוטם במקום עם שעווה רכה שיניים ולאחר מכן שכבת אפוקסי כדי למנוע דליפות ( איור 4 ג , מפרצון).
  3. חבר את קו זלוף מלוחים לקפסולה הראש ולהגדיר את זרימת זלוף לשיעור קבוע של כ 0.04 L / h.
  4. לטבול אלקטרודה הקרקע ( כלומר חוט כסף כלוריד) באמבטיה מלוחים ( איור 5 א ).
  5. השתמש בהתאמה אישית Tetrode חוט מפותל שנבנה בעקבות הליך ייצור המתואר 30 (4 חוטי אלקטרודה מוצעים כדי להשיג יחידות מבודד היטב להשתלבהעצב). לפני הניסוי, electroplate האלקטרודה בעקבות השלבים המתוארים 30 .
  6. השתמש micromanipulator ידני למקם את tetrode קרוב העצב Maxillary. לקדם את tetrode עד שהוא מתחיל להיכנס לעצב ( איור 5 ).
  7. המתן לפחות 10 דקות לאחר הצבת tetrode כדי לאפשר לו לייצב בתוך העצב לפני ההקלטה.
  8. להגביר את האות (3000x) ולהשתמש במעבר הלהקה לעבור מסנן בין 0.3-6 קילוהרץ. לרכוש את האות בקצב דגימה 40 קילוהרץ באמצעות תוכנת רכישת נתונים.
  9. לאחר סיום הניסוי במקום הכנת עש לתוך המקפיא.

איור 5
איור 5 : הקלטה Tetrode מ GRNs. ( A , תמונה גדולה) micromanipulator משמש pתחרה את tetrode חוט מעוות לתוך העצב Maxillary (MxN) כדי להקליט את הפעילות של GRNs. כלוריד כסף אלקטרודה הקרקע ממוקם באמבטיה מלוחים כפי שמוצג. ( A , Inset) תמונה מוגדלת של המוח מראה את tetrode בעצב מקסימלי. האזור המשוער (SEZ) הוא ציין גם. ( ב ) סכמטית של המוח מנדוקה מכוונת כמו א ' אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Representative Results

הפעילות של GRNs ניתן להקליט באמצעות אלקטרודה tetrode תאיים לפני, במהלך ואחרי משלוח טסטנט ( איור 6 א ו 6 ג ). איור 6 א (פאנל באמצע ותחתון) מראה סימני מתח מסוננים (300-6,000 הרץ) שנרשמו על ידי כל אחד מארבעת חוטי הניצב בעצב מקסימלי, שבו ניתן לזהות סימנים של אמפליטודות שונות המשקפות פוטנציאל פעולה (חיצים). דופק 1 של טסטנט (1 סוכרוז M) נמסר 2S לאחר תחילת הניסוי; את הופעת ו היסט של הגירוי היה פיקוח על ידי חיישן צבע ( איור 6 א , הלוח העליון). טסטנט המושרה קוצים שניתן לראות בכל אחד מארבעת הערוצים ( איור 6 א , לוח באמצע). GRNs יכולים להיות מזוהים ומכובד מן mechanosensors (לא מוצג כאן) כאשר הם מגיבים על כמה טעימות ולא אחרים

כדי לזהות ולבודד תגובות נוירון יחיד מהקלטות tetrode, ביצענו מחוץ לקו ספייק מיון באמצעות קבוצה של פונקציות מותאמות אישית המבוססת על 31 של Pouzat ו 32 של קליינפלד של 33 שיטות (שיטות אלה מתוארים ציטוטים אלה: 10 , 29 ). איור 6 ב מציג דוגמה של מיון ספייק להחיל את הנתונים המוצגים בתרשים 6 א , שבו שלוש יחידות מבודד היטב נמצאו.

מגרשים סריקה איור 6 ג מתארים תגובות של שלוש יחידות מבודדים באיור 6B עד שש טסטנטים שונים (1 סוכרוז M, מלטוז ו NaCl, 100 קפאין מ"מ ו 10 מ"מ ברברין ו לובלין) נמסר ברצף (4 משפט S / tastant מוצגים). כפי שמוצג באיור 6 ג , ה- GRNs המוקלט יש רמות שונות של פעילות בסיסית, החל משתיקה (GRNs 1) כדי נמוך או בינוני (GRN 2 ו -3). לאחר הופעת טסטנט, GRNs להראות דפוסי פעילות מגוונים בתערוכות סלקטיביות שונים הטעמים. לדוגמה, GRN 1 הגיב רק סוכרוז, בעוד GRN 2 הגיב maltose ו NaCl עם פרץ של דוקרנים ל lobeline עם spiking רק עם תחילת הגירוי. בנוסף, חלק מהתגובות נעולות לעיתוי הגירוי ( כמו תגובה GRN 1 ל סוכרוז), בעוד שהתגובות האחרות משפיעות על משך הגירוי ( כגון תגובת GRN 3 לברברין) או המכילות מרכיבים מעוררים ומעכבים ( למשל איור 7 GRN 2 תגובות NaCl ו סוכרוז). לקבלת מידע נוסף על הרגישויות המגוונות ודפוסי הפעילות של GRN ראה התייחסות 10 .

= "1"> כדי לאמת את השימוש בטכניקות tetrode ו- spike-sort כדי להקליט GRNs מהעצב המקסימלי, ביצענו הקלטות תאיים מאקסונים של GRN בבעלי חיים אחרים באמצעות אלקטרודות זכוכית חדות קונבנציונליות (התנגדות של 80-120 MΩ). מצאנו כי דפוסי הפעילות שהושגו באמצעות הקלטות תאיים היו דומים לתגובות שנצפו באמצעות טכניקת tetrode ( איור 7 ). עקבות המתח בתיבה הירוקה בלוח A נרשמו תוך כדי תאימות בין GRN 1 במהלך 5 ניסויים עוקבים של מצגת סוכרוז, ותגובות זהות מוצגות כנקודות רסטר בחלונית B. (שים לב כי סוג זה של תגובה תואם את זה שהתקבל עם tetrodes ו כפי שמוצג באיור 6 ג .) GRN 2, שנרשמה עם אלקטרודות חדות תאיות, מראה דפוס תגובה רחב יותר.

איור 6 איור 6: תוצאות נציג מתוך הקלטות עצבים מקסיליים עם Tetrodes תאיים. ( א ) מסוננים (300-6,000 הרץ) עקבות מתח נרשם על ידי כל אחד מארבעת חוטי בעצב מקסימלי (לוח באמצע). דופק 1 של טעימות היה מוחל במהלך פרק הזמן המצביע על ידי הצללה אדומה בלוח האמצעי. ההתחלה וקיזוז הגירוי נבחנו על ידי חיישן הצבע כפי שצוין על ידי עקבות המתח האדום על הלוח העליון, והיא מסומנת על הלוח האמצעי על ידי השטח המוצל באדום. הקווים האופקיים המנוקדים מציינים +50 (למעלה), 0 (באמצע) ו -50 (למטה) μV. הגדלה של עקבות מתח גולמי המתאים לאזור בתוך הקווים מנוקד אנכי מוצג (הפאנל התחתון). דוגמאות של קוצים מסומנים על ידי החצים. ( ב ) דוגמה של מיון ספייק מוחל על הנתונים המוצגים בלוח א. צורות הגל שנרשמו בכל אחד מארבעת חוטי תאיים (1-4) arE מזוהה עם שלוש GRN שונים (יחידות 1-3) לתרום את האותות המוקלטים. אירועים בודדים (קווים דקים צבעוניים) ואת הממוצע (קו שחור עבה) מוצגים עבור שלוש יחידות. יש לבחון מספר קריטריונים סטטיסטיים כדי לזהות באופן מהימן יחידות עצמאיות תוך שימוש בשיטת מיון ספייק (ראה הפניות 10 , 29 ). ( C ) סריקה מגרשים המייצג תגובות של שלוש יחידות מבודדות רצף של שישה טסטנטים שונים (4 ניסויים / טסטנט מוצגים). פרק הזמן של משלוח טסטנט (1) מסומן על ידי השטח מוצל אדום. ריכוז של טסטנטס היו גם 1 M (סוכרוז, maltose, NaCl), 100 מ"מ (קפאין) ו 10 מ"מ (berberine ו lobeline). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 7 Lass = "xfigimg" src = "/ files / ftp_upload / 55868 / 55868fig7.jpg" />
איור 7 : הקלטות תאיים של אקסונים GRN. ( A , לוח ירוק) עקבות מתח שנרשמו GRN עם זכוכית חדות תאיים אלקטרודות (התנגדות של 80-120 MΩ) הניח לתוך העצב Maxillary, עורר על ידי 5 גירויים רצופים עם סוכרוז M 1 (Suc). ( ב ) סריקה מגרשים של תגובות של שני GRNs, כולל התגובות שמוצג בלוח א '(לוח תיבת ירוק), לשני טסטנטים שונים מועברים ברצף (100 מ"מ צבע גופן אפור, 1 M צבע גופן שחור) נרשם עם זכוכית חדה אלקטרודות תאיים להציב את העצב Maxillary (7 ניסויים / טסטנט ו 3 ניסויים / מים מוצגים). זמן אספקה ​​טעים מסומן על ידי אזורים מוצללים בשני לוחות. ההתחלה וקיזוז הגירוי נבחנו על ידי חיישן הצבע, כפי שצוין על ידי עקבות המתח האדום בתחתית כל פאנל.Es / ftp_upload / 55868 / 55868fig7large.jpg "target =" _ blank "> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

השיטות המתוארות כאן מתירות בהקלטות vivo מחיה פשוטה יחסית, Manduca sexta , כדי לאפיין את פעילותם של מספר רב של GRNs שנבחרו באקראי על פני משכים ארוכים (במשך יותר מ -2 שעות), לפני, במהלך ואחרי משלוח טסטנט. שיטות אלה מאפשרות גם את המסירה המהירה והרצופה של מספר רב של גירויי טסטנט עם שליטה טמפורלית מדויקת, יתרונות שימושיים ללימוד מנגנונים עצביים המונחים ביסוד טסטנט. פרוטוקול זה שימש כדי ללמוד כיצד התגובות של GRNs כדי tastants הם שינו כאשר הם מועברים נוירונים היעד postsynaptic שלהם ( למשל, ב SEZ) על ידי ניטור GRNs בו זמנית עם interneurons מחובר monosynaptically 10 . בנוסף, שיטות אלה ניתן להתאים את הצרכים של הנסיין, המאפשר ביצוע של פרדיגמות מורכבות ללמוד היבטים בסיסיים של קידוד גס.

כאשר מתחיליםG המחקר שלנו, בעיה טכנית אחת היינו לפעמים כדי לפתור את חוסר היכולת לזהות אותות spiking מן העצב Maxillary עם חוטי tetrode. סיבות אפשריות לכך הן מגוונות, כמו פרוטוקול לנתיחה הוא מאתגר, וכמה תרגול הוא הכרחי כדי להשיג הכנה טובה. ראשית, במהלך לנתיחה עש את העצבים מקסימיליים קל נזק, במיוחד במהלך הסרת נדן סביב הרקמה העצבית. שנית, אם הנדן אינו מוסר באופן מלא, חוטי tetrode לא יוכלו לגשת לעצב. בשני המקרים, החל הכנה חדשה היא לעתים קרובות הדרך הקלה ביותר לפתור בעיות אלה. שלישית, ייתכן שיש בעיה עם חוטי tetrode. זה יכול להיבדק על ידי מדידת עכבה של חוטים אשר צריך להיות ~ 270 kΩ ב 1kHz. אם הערך עכבה מעל ~ 300 kΩ, electroplate החוטים עם זהב כדי להשיג את העכבה הרצויה (ראה התייחסות 30 ). רביעית, חתיכת ציוד עשוי להיות מקושריםאו התנהגות לא הולמת.

בעיה נוספת אפשרית היא כי אותות spiking נרשמות אבל הנוירונים (ים) מופיעים להגיב על הטעמים. זה יכול להיות בגלל הנוירונים שהוקלטו הם רגישים למערכת של טעימות נמסר. כמו כן, חשוב לזכור כי בנוסף אקסונים של GRNs, העצב maxillary גם נושאת סיבים מכאנסנסורי. לכן, ניתן להקליט נוירונים mechanosensory במקום, או בנוסף, GRNs. עם זאת, מערכת משלוח טסטנט נועד לספק קלט מכני קבוע לאורך הניסוי מה שעושה את זה סביר כי התגובות טסטנט יהיה מבולבל על ידי תגובות הרכיב המכני של המסירה שלה. נוירונים המגיבים על כמה טעימות אחרות אבל לא, או בדרכים שונות טעימות שונות, ניתן לסווג באופן חד משמעי כמו GRNs. אנו ממליצים להשתמש בטעמים מדולל טרי כדי למנוע וריאציות ריכוז טסטנט או הרכב בשל השפלה או התייבשות מתחםשל הממס. אנו ממליצים גם לנקות את המערכת באופן קבוע כדי למנוע זיהום צינורות ו / או חסימות.

בעיה טכנית אפשרית נוספת היא יחס אות לרעש חלש. בעיה זו יכולה לעתים קרובות להיפתר על ידי rechloriding או התאמת המיקום של האלקטרודה הקרקע אמבטיה. פתרונות אחרים עשויים לדרוש מיגון ומזעור אורך של כל חיבור חשמלי במנגנון.

לבסוף, חשוב לציין כי ניתוח נכון של נתונים שהושגו באמצעות הקלטות tetrode דורש מיון ספייק זהיר. מצאנו כי שיטות אוטומטיות לחלוטין הם בדרך כלל לקוי. אנו ממליצים להכיר את הספייק מיון מיון לפני ניתוח tetrode נתונים 10 , 29 , 31 , 32 , 33 .

חלופות פרו לנתיחה שלנוTocol ניתן להשתמש. כאן, תיארנו דיסקציה דרך החלק הגחון של ראש העש, מתן גישה העצבים מקסימילרי SEZ, אבל אפשר גם לגשת מבנים אלה על ידי לנתח את הצד הגבי. מצאנו כי הכנת הצד הגבי אינה אופטימלית להכנת הקלטות מהמבנים המבעבעים הללו בשל מיקומם העמוק, אך הכנה זו מציעה את היתרון של הפעלת הקלטות ממבנים מסדר גבוה יותר, כגון גוף הפטרייה, אזור שקשור לרבים - אינטגרציה חושית, למידה אסוציאטיבית ועיבוד זיכרון 34 . התמקדנו בשימוש של אלקטרודות tetrode כדי להקליט מן העצב maxillary, אבל, כפי שאנו באיור, אלקטרודות חד תאיים סטנדרטיים יכול לשמש גם למטרה זו. בנוסף, שתי הטכניקות ניתן לשלב לבצע הקלטות בו זמנית מאזורים מרובים במוח 10 . ספרות המוח מציעה דוגמאות רבות של iמודלים של חוליות אשר הוכיחו להיות כלים רבי עוצמה לחשיפת העקרונות הבסיסיים של עיבוד חושי, כגון קידוד הריח, החלים על חרקים ועל חוליות 35 , 36 , 37 , 38 , 39 . אנו מקווים שהשיטות שלנו יובילו לתובנות חדשות יסודיות על קידוד מתסכל.

Disclosures

למחברים אין מה לגלות.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי מענק פנימי בין NIH-NICHD ל- MS אנו מודים G. Dold ו T. טלבוט של NIH-NIMH מכשור מתקן הליבה לעזרה עם עיצוב מערכת משלוח טסטנט.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dissection and Specimen Preparation
Polypropylene tube, 15 mL Falcon Fisher Scientific 14-959-53A
Needle, Short bevel, 19 G x 1 - 1/2"   MONOJET 888200144 For applying air to remove the hair from the moth.
Modeling Clay-Van Aken Plastalina  DickBlick 33268
Petri dish -100 x 15 mm  VWR International 89000-304
Pipette tip (1 - 200 µL) USA Scientific 1111-0806
Razor blade Techni Edge TE05-071
22 AWG standard hookup wire AlphaWire 1551 For inserting the proboscis into the pippete tip.
Batik wax Jacquard 7946000
Electric waxer Almore International 66000
Stereo Myscroscope Leica MZ75
Dumont #1 forceps (coarse)  World Precision Instruments 500335 For removing fat and non-nervous tissue.
Dumont #5 titanium forceps (fine)  World Precision Instruments 14096 For removing fat and non-nervous tissue.
Dumont #5SF forceps (super-fine) World Precision Instruments 500085 For desheathing the nervous tissue.
Vannas scissors (fine) World Precision Instruments 500086 For removing the cuticle.
Collagenase/Dispase Sigma-Aldrich 11097113001
Epoxy Permatex 84101
Name Company Catalog Number Comments
Saline Perfusion System
Extension set with rate flow regulator  B Braun Medical Inc. V5200
IV administration set with Y injection site  B Braun Medical Inc. V1402
Name Company Catalog Number Comments
Tastant Delivery System
White Translucent Nylon Tubing OD 1/4", ID 1/8" Small Parts Inc. B001JJT4SA Rigid tube that connects the four main elements of the system.
Soldering iron Circuit Specialists ZD200BK
Rotary tool-Dremel Dremel 4200
Polypropylene mesh, hole size (hole size 0.1 x 0.13 cm)  Industrial Netting XN5170 For ensuring that the probosises of different animals are placed in the same location.
Pressurized 16-Channel perfusion system  Bioscience Tools PS-16H For tastant delivery. This system includes pinch valves, tubing, manifold, solution cylinders, valve controller and fitting accessories.
Polypropylene tubing, ID 0.034", ID 0.050" Becton, Dickinson & Co 427421 Output tube from the perfusion system.
Pneumatic PicoPump World Precision Instruments SYS-PV820 For controlling the output channel of the perfusion system. 
Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card National Instruments LabVIEW 2011 To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor.
Compulab 3 Manostat peristaltic pump Sigma P1366 For pumping water.
Silicone tubing, ID 1/16" OD 1/8" Cole-Parmer WU-95802-02 To connect the water source to the peristaltic pump tubing, and the outlet tube of the pump to the rigid tube of the delivery system.
Color sensor-digital fiber optic sensor Keyence  FS-V31M For monitoring tastant delivery. 
Color sensor-reflective fiber unit Keyence FU35-FZ To connect the color sensor device.
Dental periphery Wax Henry-Schein Dental 6652151 To secure the proboscis into the rigid tube.
Two 3.7 L containers To provide water to the system, and to recollect the water waste.
Fast green FCF  Sigma F7258
Dressing forceps 25.5 cm WPI 500364 To introduce moth proboscis into the proboscis hole in the rigid tube.
Name Company Catalog Number Comments
Electrophysiology Equipment
D.C. amplifier Brown-Lee 440
Lamp Schott Schott Fostec Light Source DCR 2
Manual micromanipulator Leica micromanipulator To precisely insert the tetrodes into the animal's brain. The manipulator has to allow fine and coarse movements in x, y and z axis.
Stereomicroscope Leica MZ75
Vibration-isolation table (MICRO-g lab table) TMC 63-541
Oscilloscope Tektronix  TDS2014
16-channle pre-amplifier and amplifier 16 Channel MA-800 Amplifier System  B.E.S 2013
Computer Dell optiplex 780 The following are the minimum recommended requirements. RAM: 3.32 GHz, 3GB. Processor: Intel Core 2 Duo. Graphic card: integrated Intel GMA X4500. 
Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card National Instruments LabVIEW 2011 To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor and electrode.
Name Company Catalog Number Comments
Tastants
KAc Sigma-Aldrich P5708
LiCl Sigma-Aldrich L9650
NaCl Sigma-Aldrich 73575
Sucrose Sigma-Aldrich 84097

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Chandrashekar, J., Hoon, M. A., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. The receptors and cells for mammalian taste. Nature. 444 (7117), 288-294 (2006).
  2. Chen, X., Gabitto, M., Peng, Y., Ryba, N. J. P., Zuker, C. S. A Gustotopic Map of Taste Qualities in the Mammalian Brain. Science. 333 (6047), (2011).
  3. Yarmolinsky, D. A., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. Common Sense about Taste: From Mammals to Insects. Cell. 139 (2), 234-244 (2009).
  4. Mueller, K. L., Hoon, M. A., Erlenbach, I., Chandrashekar, J., Zuker, C. S., Ryba, N. J. P. The receptors and coding logic for bitter taste. Nature. 434 (7030), 225-229 (2005).
  5. Zhao, G. Q., Zhang, Y., et al. The receptors for mammalian sweet and umami taste. Cell. 115 (3), 255-266 (2003).
  6. Huang, A. L., Chen, X., et al. The cells and logic for mammalian sour taste detection. Nature. 442 (7105), 934-938 (2006).
  7. Pfaffmann, C., Carl, The afferent code for sensory quality. Am Psychol. 14 (5), 226-232 (1959).
  8. Lemon, C. H., Katz, D. B. The neural processing of taste. BMC Neurosci. 8 (Suppl 3), (2007).
  9. Barretto, R. P. J., Gillis-Smith, S., et al. The neural representation of taste quality at the periphery. Nature. 517 (7534), 373-376 (2015).
  10. Reiter, S., Campillo Rodriguez, C., Sun, K., Stopfer, M. Spatiotemporal Coding of Individual Chemicals by the Gustatory System. J Neurosci. 35 (35), 12309-12321 (2015).
  11. Wilson, D. M., Boughter, J. D., et al. Bitter Taste Stimuli Induce Differential Neural Codes in Mouse Brain. PLoS ONE. 7 (7), e41597 (2012).
  12. Glendinning, J. I., Davis, A., Ramaswamy, S. Contribution of different taste cells and signaling pathways to the discrimination of "bitter" taste stimuli by an insect. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 22 (16), 7281-7287 (2002).
  13. Kay, L. M., Stopfer, M. Information processing in the olfactory systems of insects and vertebrates. Semin Cell Dev Biol. 17 (4), 433-442 (2006).
  14. Liman, E. R., Zhang, Y. V., Montell, C. Peripheral Coding of Taste. Neuron. 81 (5), 984-1000 (2014).
  15. Carleton, A., Accolla, R., Simon, S. A. Coding in the Mammalian Gustatory System. Trends Neurosci. 33 (7), 326-334 (2010).
  16. Stocker, R. F. The organization of the chemosensory system in Drosophila melanogaster: a rewiew. Cell Tissue Res. 275 (1), 3-26 (1994).
  17. Mitchell, B. K., Itagaki, H., Rivet, M. P. Peripheral and central structures involved in insect gustation. Microsc Res Tech. 47 (6), 401-415 (1999).
  18. Falk, R., Bleiser-Avivi, N., Atidia, J. Labellar taste organs of Drosophila melanogaster. J Morphol. 150 (2), 327-341 (1976).
  19. Hodgson, E. S., Lettvin, J. Y., Roeder, K. D. Physiology of a primary chemoreceptor unit. Science. 122 (3166), 417-418 (1955).
  20. Delventhal, R., Kiely, A., Carlson, J. R. Electrophysiological recording from Drosophila labellar taste sensilla. J Vis Exp. (84), e51355 (2014).
  21. Weiss, L. A., Dahanukar, A., Kwon, J. Y., Banerjee, D., Carlson, J. R. The molecular and cellular basis of bitter taste in Drosophila). Neuron. 69 (2), 258-272 (2011).
  22. Descoins, C., Marion-Poll, F. Electrophysiological responses of gustatory sensilla of Mamestra brassicae (Lepidoptera, Noctuidae) larvae to three ecdysteroids: ecdysone, 20-hydroxyecdysone and ponasterone. A. J Insect Physiol. 45 (10), 871-876 (1999).
  23. Popescu, A., Couton, L., et al. Function and central projections of gustatory receptor neurons on the antenna of the noctuid moth Spodoptera littoralis. J Comp Physiol. 199 (5), 403-416 (2013).
  24. Morita, H., Yamashita, S. Generator potential of insect chemoreceptor. Science. 130 (3380), 922 (1959).
  25. Davis, N. T., Hildebrand, J. G. Neuroanatomy of the sucking pump of the moth, Manduca sexta (Sphingidae, Lepidoptera). Arthropod Struct Dev. 35 (1), 15-33 (2006).
  26. Stürckow, B., Adams, J. R., Wilcox, T. A. The Neurons in the Labellar Nerve of the Blow Fly. Z Vergl Physiol. 54, 268-289 (1967).
  27. Stürckow, B. Electrophysiological studies of a single taste hair of the fly during stimulation by a flowing system. Proceed 16 Intern Contr Zool. 3 (8), 102-104 (1963).
  28. Christensen, T. A., Hildebrand, J. G. Male-specific, sex pheromone-selective projection neurons in the antennal lobes of the moth Manduca sexta. J Comp Physiol A. 160, 553-569 (1987).
  29. Reiter, S. Gustatory Information Processing. , https://repository.library.brown.edu/studio/item/bdr:386235/PDF/?embed=true (2014).
  30. Saha, D., Leong, K., Katta, N., Raman, B. Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits. J Vis Exp. (71), (2013).
  31. Pouzat, C., Mazor, O., Laurent, G. Using noise signature to optimize spike-sorting and to assess neuronal classification quality. J Neurosci Methods. 122 (1), 43-57 (2002).
  32. Hill, D. N., Mehta, S. B., Kleinfeld, D. Quality Metrics to Accompany Spike Sorting of Extracellular Signals. J Neurosci. 31 (24), 8699-8705 (2011).
  33. Fee, M. S., Mitra, P. P., Kleinfeld, D. Automatic sorting of multiple unit neuronal signals in the presence of anisotropic and non-Gaussian variability. J Neurosci Methods. 69 (2), 175-188 (1996).
  34. Heisenberg, M. Mushroom body memoir: from maps to models. Nat Rev Neurosci. 4 (4), 266-275 (2003).
  35. Naraghi, M., Laurent, G. Odorant-induced oscillations in the mushroom bodies of the locust. J Neurosci. 14, 2993-3004 (1994).
  36. Laurent, G., Wehr, M., Davidowitz, H. Temporal representations of odors in an olfactory network. J Neurosci. 16, 3837-3847 (1996).
  37. Perez-Orive, J., et al. Oscillations and sparsening of odor representations in the mushroom body. Science. 297, 359-365 (2002).
  38. Stopfer, M., Jayaraman, V., Laurent, G. Odor identity vs. intensity coding in an olfactory system. Neuron. 39, 991-1004 (2003).
  39. Laurent, G. Olfactory network dynamics and the coding of multidimensional signals. Nature Re Neurosci. 3, 884-895 (2002).

Tags

Neuroscience גליון 124 קידוד חושי התלהבות נוירונים קולטנים מתוסכלים עצב מקסימלי אזור תת-הושט אלקטרופיזיולוגיה הקלטות רב-יחידות,
שיטות חדשות לחקר קידוד גוסטוריאלי
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boronat-García, A., Reiter, S., … More

Boronat-García, A., Reiter, S., Sun, K., Stopfer, M. New Methods to Study Gustatory Coding . J. Vis. Exp. (124), e55868, doi:10.3791/55868 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter