Summary
미식가 코딩을 연구하기위한 세 가지 새로운 방법을 제시 합니다. 나방의 Manduca sexta ( Manduca ) 라는 간단한 동물을 사용하여 우리는 해부 프로토콜, 다중 미각 수용체 뉴런의 활동을 기록하기위한 세포 외 tetrodes의 사용법, 정확한 타이밍 버섯의 전달 및 모니터링 시스템을 설명합니다.
Abstract
맛 감각을 통해 동물은 환경에서 화학 물질을 감지하여 생존에 중요한 행동을 유발할 수 있습니다. 미각 수용체 뉴런 (GRNs)은 맛있는 분자를 검출 할 때 뇌의 팔로워 뉴런으로 전파되는 전기 활동의 패턴으로서 미각의 정체와 집중에 대한 정보를 암호화합니다. 이 패턴들은 미각의 내부 표현을 구성하며, 동물은 행동을 선택하고 추억을 만들 수 있습니다. 상대적으로 간단한 동물 모델의 사용은 감각 코딩의 기본 원리를 연구하는 강력한 도구였습니다. 여기서 우리는 나방 Manduca sexta를 사용하여 맛있는 코딩을 연구하는 3 가지 새로운 방법을 제안합니다. 첫째, 우리는 상악 신경과 부 식도 역 (SEZ)을 노출시키는 해부 과정을 제시하여 축색 돌기에서 GRN의 활성을 기록 할 수있게합니다. 둘째로, 우리는 세포 외 전극의 사용을 기술하여 다중 GRN의 활동을 기록한다.와이어를 상악 신경에 직접 연결하십시오. 셋째, 우리는 높은 시간 정밀도로 다른 맛의 펄스를 전달하고 모니터링하기위한 새로운 시스템을 제시합니다. 이 방법은 전이가 전달되기 전, 중 및 후에 GRN에서 직접 생체 내에서 의 신경 반응 을 특성화 할 수 있습니다. 우리는 여러 GRN에서 기록 된 전압 추적의 예제를 제공하고 개별 뉴런의 반응을 식별하기 위해 데이터에 스파이크 정렬 기술을 적용하는 방법의 예를 제시합니다. 마지막으로 우리의 녹음 접근법을 검증하기 위해 GRN에서 얻은 세포 외 녹음과 tetrodes를 날카로운 유리 전극으로 얻은 세포 내 녹음과 비교합니다.
Introduction
맛과 후각 시스템은 환경에서 화학 물질의 내부 표현을 생성하여 맛과 냄새에 대한 인식을 각각 일으킨다. 이러한 화학적 감각은 짝짓기 및 식사 찾기에서부터 포식자와 독소를 피하는 것에 이르기까지 생물체의 생존에 결정적인 역할을하는 데 필수적입니다. 이 과정은 환경 화학 물질이 감각 수용체 세포의 원형질 막에 위치한 수용체와 상호 작용할 때 시작됩니다. 이러한 세포는 직접적으로 또는 뉴런과의 상호 작용을 통해 화학 물질의 정체와 농도에 대한 정보를 전기 신호로 변환합니다. 이 신호는 고차 뉴런과 다른 뇌 구조로 전달됩니다. 이러한 단계가 진행됨에 따라 원 신호는 항상 감각 정보를 감지, 차별, 분류, 비교 및 저장하고 적절한 조치를 선택하는 생물체의 능력을 향상시키는 변화를 겪습니다. 브래지어 이해 방법환경 화학 물질에 대한 정보는 다양한 작업을 수행하는 데 가장 좋은 방법입니다. 신경 과학의 기본 질문입니다.
맛사지 코딩은 비교적 간단하다고 생각되어왔다. 맛을 이끌어내는 모든 화학 분자는 자연적으로 약 5 가지 정도의 기본 맛질 중 하나에 속한다 ( 즉 , 단맛, 쓴맛, 신맛) , 짠맛 및 우마미) 1 . 이 "기본 취향"관점에서, 미각 시스템의 임무는이 기본 취향 중 어느 것이 존재 하는지를 결정하는 것입니다. 더 나아가, 신경계의 기본적인 맛 표현의 근간을 이루는 신경 메커니즘은 명확하지 않으며 "표식 된 선" 2 , 3 , 4 , 5 , 6 또는 "섬유 패턴" 7 , 8 코드. 분류 된 라인 코드에서 각 감각 세포와 신경 팔로워 각각은 단일 미각 품질에 반응하여 그 미각에 특화된 중추 신경계의보다 높은 처리 센터에 대한 직접적이고 독립적 인 경로를 형성합니다. 반대로 섬유 패턴 코드에서 각 감각 세포는 여러 가지 맛의 특성에 반응 할 수 있으므로 맛에 관한 정보는 감각 뉴런 집단의 전반적인 반응으로 표현됩니다. 미식가 정보가 기본 맛, 표식 된 선 또는 기타 다른 메커니즘을 통해 표현되는지 여부는 불분명하며 최근 조사 3 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 의 초점입니다. 우리의 최근 연구는 미각 시스템이 시공간 인구 코드를 사용하여기본 취향 카테고리보다는 개인 취향의 표현 10 .
여기서 우리는 미식가 코딩을 연구하는 데 도움이되는 3 가지 새로운 도구를 제공합니다. 첫째, 우리는 hawkmoth Manduca sexta 의 사용을 전기 생리 학적으로 맛을 연구 할 수있는 비교적 단순한 모델 유기체로 사용하고 해부 과정을 기술 할 것을 제안한다. 둘째, 우리는 개별 GRN의 활동을 기록하기 위해 세포 외 "tetrodes"의 사용을 제안합니다. 셋째, 우리는 정확한 시간에 맞춘 동물의 맥박을 전달하고 모니터링하기위한 새로운 장치를 제안합니다. 이 도구는 우리 연구실과 다른 사람들이 후각 시스템을 연구하는 데 사용했던 기술을 적용했습니다.
초파리 Drosophila melanogaster , 메뚜기 Schistocerca americana , 나방 Manduca sexta 와 같은 곤충은 수십 년 동안 원주민 에 대한 기본 원칙을 이해하는 데 강력한 자원을 제공했습니다감각 코딩 ( 예, olfaction 13 )을 포함하는 vous system. 포유 동물에서 미각 수용체는 복잡한 두 번째 전령 경로를 통해 뉴런과 통신하는 전문화 된 세포입니다. 곤충에서는 더 간단합니다. 맛 수용체는 뉴런입니다. 또한 주변의 포유류 맛 경로는 비교적 복잡하며 여러 개의 평행 신경 경로를 특징으로하며 중요한 구성 요소는 작은 뼈 구조에 포함되어 접근하기가 어렵습니다 15 . 곤충 맛 경로는 더 단순 해 보인다. 곤충에서 GRN은 안테나, 구강, 날개 및 다리에 위치한 sensilla라고 알려진 특수 구조에 포함되어 있습니다 16 , 17 . GRN은 하부 식도염 (SEZ)에 직접 투영되며, 그 역할은 주로 미각 기태라고 여겨지며 17맛있는 뉴런 10 . 거기에서 정보는 신체로 전달되어 반사 신경을 유도하고, 더 높은 뇌 영역으로 통합되고 저장되며 궁극적으로 행동 선택을 유도합니다 16 .
맛 정보가 신경계 전반에 걸쳐 점에서 점으로 전파되고 변형되는 방법을 이해하기 위해 주변 맛 반응을 특성화하는 것이 필요합니다. 곤충에서 GRNs의 신경 활동을 직접 모니터하는 가장 보편적으로 사용되는 방법은 tip-recording technique 12 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 입니다. 이것은 sensillum 위에 직접 전극을 놓는 것인데, 많은 것은 접근하기가 비교적 쉽습니다. 이 맛은 전극 내에 포함되어 활성화 및 확장이 가능합니다.감각 기관에서 GRNs의 뉴런 반응을 측정합니다. 그러나, 전착제가 전극에 함유되어 있기 때문에, 전착제가 전달되기 전 또는 제거 된 후에 GRN 활성을 측정하거나, 전극 ( 20) 을 대체하지 않고 맛을 교환 할 수 없다. 또 다른 방법 인 "측벽"기록 기술은 GRNs 활동을 기록하는데도 사용되었습니다. 여기서, 녹음 전극은 미각 감각기 ( 24) 의 기저부에 삽입되고, 맛은 감지기의 팁상의 별도의 유리 모세관을 통해 전달된다. 두 기술 모두 GRN에서 특정 감각으로 녹음하는 것을 제한합니다. 여기에 우리는 새로운 기술을 제안합니다 : 다른 sensilla의 무작위로 선택된 GRN 축색 돌기에서 녹음하면서, 따로 따로 타액을 코에 뿌리십시오. Axon 녹음은 축삭을 운반하는 신경에 날카로운 유리 전극 또는 세포 외 전극 다발 (tetrodes)을 삽입하여 이루어집니다.SEZ 10 에 대한 코에있는 GRNs. 만두 카 (Manduca) 에서는 이러한 축색 돌기가 순수 구 심성 인 것으로 알려진 상악 신경을 가로 지르며, 감각 반응의 모호하지 않은 기록을 가능하게합니다 25 . 축색 돌기에서 녹음하는이 방법은 2 시간 이상 동안 일련의 풍성한 프리젠 테이션 전, 진행 중 및 후에 GRN 반응을 안정적으로 측정 할 수 있습니다.
여기에서는 SEZ와 함께 상악 신경을 노출시키는 해부 과정을 설명합니다. SEZ에서는 여러 개의 GRN과 뉴런의 반응을 동시에 기록 할 수 있습니다. 우리는 스파이크 정렬 방법과 결합 할 때 다중 (동시에 6 개까지) GRN을 동시에 분석 할 수있는 맞춤형 4 채널 트위스트 와이어 테 트로 드를 사용하여 GRN의 세포 외 기록을 사용하는 방법을 설명합니다. 우리는 tetrodes로 만든 기록과 날카로운 세포 내 기록으로 만든 기록을 비교합니다전극. 마지막으로 우리는 맛있는 자극을 전달하기위한 새로운 장치를 설명합니다. 많은 연구원들이 olfaction 연구에서 냄새 물질을 전달하기 위해 오랫동안 사용해온 장비 인 Sturckow와 동료 (참고 문헌 26 , 27 참조)가 개발 한 이전의 다 채널 전달 시스템을 개선하여 gustation을 연구하는 데 유리합니다. 이 타이밍의 전압 판독 값을 제공하면서 맛이 좋은 전달의 타이밍을 제어; 여러 가지 맛의 자극을 신속하고 순차적으로 전달할 수 있습니다. 상기 장치는 일정한 흐름의 깨끗한 물 속에서 코를 가볍게 핥아서 정련 된 제어 펄스를 전달할 수있다. 각각의 맛 펄스는 코를 통과하여 씻겨 나간다. 맛이 나는 맛있는 음식 착색제가 약간 포함되어있어 정확한 타이밍으로 맛있는 오븐의 통과를 모니터 할 수 있습니다코에요.
Protocol
주의 : Manduca 가 방출하는 미세한 분말 가루는 알레르기 성이 있으므로 실험실 안전 장갑과 안면 마스크를 사용하는 것이 좋습니다.
1. 만두 카 섹스타 (manduca sexta) 를 해부하여 상악 신경 및 특발성 신경 섬유 (SEZ)를 드러내십시오.
- 다음과 같은 특징에 따라 적절한 성을 선택하십시오 : 일반적인 건강한 외모 (날개는 완전히 펼쳐 져야하며 코와 코는 손상되지 않아야 함)로 부식 3 일 후.
- 나방을 개별적으로 플라스틱 컵에 넣어 운송하십시오.
- 나방을 폴리 프로필렌 튜브에 넣으십시오.
주의 : 나방의 가루가 퍼지는 것을 막기 위해 흄 후드에서이 단계를 수행하는 것이 좋습니다.- 관은 나방의 몸체보다 약간 길어야합니다 ( 그림 1A ). 튜브는 15 mL 폴리 프로필렌 튜브를 절단하여 만들 수 있습니다. <li> 머리가 노출 될 때까지 나방을 밀고 나팔을 움직이지 않게 유지하는 데 도움이되도록 볼의 위로 다른 티슈 페이퍼를 삽입하십시오 ( 그림 1A ).
- 에어 제트는 가압 공기 공급원에 주사기 (바늘이있는 1 mL, ID 약 1.4 mm, 날카로운 팁이 제거 된 상태)를 연결하여 만들 수 있습니다.
참고 : 머리카락을 제거한 후 흄 후드 외부에서 다음 단계를 모두 수행 할 수 있습니다.
- 페트리 접시에 모델링 점토를 사용하여 길이 약 7cm, 높이 2.5cm의 삼각 기둥을 만듭니다 ( 그림 1B ).
그림 1 : Manduca 용 절개 챔버 준비. ( A ) 나방이 튜브에 묶여있다. 헤드는 한쪽 끝이 노출되어 있고 다른 끝은 티슈 페이퍼로 막혀 있습니다. ( B ) 페트리 접시 및 모델링 점토로 만든 해부 챔버가 표시됩니다. 머리의 등 부분이 위를 향하고 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
- 안테나와 코를 보호하십시오.
- 면도날로 피펫 팁 (노란색 팁, 1-200 μL)을 절단하여 길이가 약 0.5 cm 인 3 개의 조각으로 3 개의 작은 튜브를 준비합니다. 안테나와 코가 안락하게 들어갈 수 있도록 내경이 충분히 커야합니다.
- 후크 준비하기와이어를 휘는 것 (22 AWG, 길이 약 7 cm). 나방의 코를 늘린 다음 튜브가 코의 근위 부분에 도달 할 때까지 와이어 훅으로 당겨서 작은 튜브 중 하나에 삽입합니다.
- 나방의 머리 캡슐 ( 그림 2A 왼쪽)의 등 부분에 딱딱한 바틱 왁스 (예 : 치과 용 전기 왁스를 사용하여 왁스를 녹여서 유도)로 작은 튜브를 고정시킵니다.
- 각 안테나를 튜브에 넣고 그림 2A (왼쪽)와 같이 바틱 왁스로 튜브를 고정합니다. 뜨거운 왁스로 안테나를 손상시키지 않도록주의하십시오.
- 두뇌의 전방 표면을 덮는 근육을 절단하여 움직임에 대해 뇌를 안정화시킵니다 ( 예 : 협측 압축기 근육).
- 해부 현미경에서, mak에 의해 머리 캡슐을 여는 이쑤시게에 붙인 면도날 칩으로 만든 마이크로 해부 가위 또는 미니 도끼를 사용하십시오( 그림 2A , 왼쪽 상단 삽 입).
- 마이크로 해부 가위를 사용하여 협측 압축기 근육을 자르십시오 (그림 25 참조). 근육이 쉽게 눈에 보이지 않기 때문에, 다음 행동 테스트는 근육이 잘렸다는 것을 확인하는 것이 좋습니다.
- 증류수로 자당을 희석하여 1M 용액을 얻는다.
- 피펫을 사용하여 약 200 μL의 자당 용액을 코의 원위부 2/3에 전달하고 5 분 동안 코를 관찰하십시오. 근육이 적절하게 절단되면 곤충은 코를 연장하거나 움직일 수 없어야합니다.
- 녹인 바틱 왁스의 레이어를 적용하여 헤드 캡슐의 입구를 밀봉합니다.
- 곤충을 뒤집어 머리 캡슐의 복부 쪽이 위를 향하게하십시오.
- 해부 절차 동안과 후에 식염수를 관류하는 것은 머리의 복부 쪽 주위에 왁스 컵을 구축전기 왁스 제거기 : 해부 현미경을 사용하여 머리 앞면을 따라 왁스의 첫 번째 줄을 뒤쪽으로 움직여 컵을 만들기 시작하십시오. 컵 안에 코와 관을 넣으십시오 ( 그림 2A 오른쪽).
- 눈의 높이에 도달 할 때까지 컵을 바깥쪽으로 그리고 위쪽으로 계속하십시오.
- 겸자를 사용하여 두개의 순측의 palps 중 하나를 취한 다음 옆면에 놓고 녹인 왁스를 추가하여 왁스 컵에 고정시킵니다. 다른 상악골 palp와 동일하게하십시오 ( 그림 2A 오른쪽).
- 왁스 컵과 튜브의 개구부를 봉하십시오.
참고 :이 단계에서는 에폭시가 사용되므로 왁스와 튜브의 틈새를 쉽게 봉인하고 안테나 및 코에 대한 열에 의한 손상을 방지 할 수 있습니다.- 플라스틱 믹싱 접시에 이쑤시게를 사용하여 바이너리 에폭시를 섞으십시오. 혼합 접시를 보관하십시오.
- 얇은지를 적용하려면 이쑤시개를 사용하십시오.에폭시 층은 컵의 외부 및 내부에 위치한다 ( 도 2B ).
- 코와 관을 포함하는 튜브의 빈 공간을 에폭시로 채우고 목을 감싸고있는 폴리 프로필렌 튜브의 일부분을 충분한 에폭시로 채워 단단히 고정시킵니다 ( 그림 2B ).
- 약 20 분 동안 에폭시를 건조 상태로 두십시오. 이를 확인하려면 플라스틱 혼합 접시에 남아있는 에폭시를 테스트하여 단단하고 끈적 거리지 않게하십시오.
- Manduca 생리 식염수 28로 왁스 컵을 채우고 2 분간 누출이 없는지 확인하십시오. 누출이 보이는 경우 더 뜨거운 왁스 및 / 또는 에폭시를 도포하여 밀봉하십시오.
그림 2 : Manduca 준비 </ em> 해부하십시오. ( A ) 길이 0.5cm 정도의 세 조각으로 잘라낸 피펫 팁으로 만든 작은 튜브 안에서 안테나와 코를 보호합니다. (왼쪽 패널, 큰 이미지) 튜브는 머리의 등 부분 주위에 적용된 녹인 바틱 왁스로 고정됩니다. (왼쪽 패널, 인 세트) 협측 압축기 근육을 제거하기 위해 큰 이미지의 점선으로 표시된대로 작은 컷을 만들어 헤드 캡의 등 쪽을 엽니 다. (오른쪽 패널) 왁스 컵은 해부 절차 및 기록 실험 중에 관류 한 생리 식염수의 저장소로 머리의 복부 측면을 둘러싸고 세워졌습니다. ( B ) 에폭시는 왁스 컵의 바닥과 머리의 등 부분 (왼쪽 패널) 사이 및 왁스와 안테나 및 코가있는 튜브 사이의 틈을 막기 위해 사용되며 튜브의 개구부를 포함하여 (오른쪽 패널 ). 여기를 클릭하십시오.o이 그림의 더 큰 버전보기.
- 해부 현미경, 순음 palps를 잘라 마이크로 해부 가위를 사용하십시오.
- 마이크로 해부 가위 또는 미니 도끼를 사용하여 머리 캡슐의 복부 쪽을여십시오. 네 개의 상처를 만듭니다. 앞면에서 앞면까지 각각의 눈을 감싸는 표피를 따라 2 번 자르고, 머리 뒤쪽을 따라 큐티클을 자르고, ( 그림 3A ) 머리 근처의 머리 앞쪽을 따라 큐티클을 하나 자른다.
- 부드럽게 두뇌를 노출 마이크로 해부 포셉을 사용하여 표피를 당겨.
- 두 날카로운 마이크로 해부 포셉을 천천히 조심스럽게 사용하여 지방 조직과 SEZ를 덮고있는 기관을 제거하십시오. 뇌나 신경 손상 (예 : 상악 신경, 시신경, 자궁 경부 연결)을 피하십시오. 생리 식염수를 자주 교체하여 뇌를 헹구고 시야를 개선하기 위해 자주 빛을 조절하십시오. 참고 : 이것은 di의 가장 중요한 부분 일 수 있습니다.단면; 그것은 실수로 상악 신경을 당기거나 부숴 서 쉽게 손상시킬 수 있습니다.
참고 :이 시점에서 SEZ와 상악 신경을 명확하게 볼 수 있어야합니다 ( 그림 3B -3C ). 그러나 뇌와 상악 신경은 얇은 칼집으로 덮여 있습니다. - 칼집을 제거하려면 왁스 컵에있는 식염수를 식염수에 용해 된 10 % (w / v) 콜라게나 제 / 디스 파제로 교체하고 5 분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 염분으로 뇌를 여러 번 헹군 후 SEZ에서 상악 신경을 통해 외장을 당겨 초 미세 미세 절제 겸자로 외과를 부드럽게 제거합니다.
- 신선한 식염수로 왁스 컵을 관류하기 시작합니다. 생리 식 물줄기에서 추출한 튜브를 왁스 컵에 넣고 녹인 왁스로 고정하십시오.
무화과ure 3 : 만두 커 해부 절차. ( A ) 순측 방광판을 제거한 후, 점선으로 표시된대로 4 개의 상처를 만들어 헤드 캡슐을 연다. ( B ) 머리 캡슐을 열고 지방 조직과 기관을 제거한 후 뇌의 확대 된 이미지로 상악 신경 (MxN)과 식도 하부 영역 (SEZ, 뇌 아래의 뇌 영역을 지칭하는 용어)을 시각화 할 수 있습니다. 식도). 상악 신경은 코에있는 충치 수용체 뉴런 (GRNs)에서 SEZ로 축삭을 운반한다. ( C ) 만두 카 (Manduca) 뇌의 도식. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
2. Tastant Delivery System
- 맛있는 전달 시스템은 4 가지 주요 요소로 구성됩니다 : 물 소스, 맛있는 다양체, 컬러 센서 및( 그림 4A- 4B ). 이 시스템을 구축하려면 그림 4B에 나와있는 단계를 따르십시오. 길이 약 6cm의 견고한 플라스틱 튜브를 사용하십시오 (ID 0.3cm).
- 코에 코를 배치 할 작은 구멍을 만들기 위해 납땜 인두를 사용하십시오 ( 그림 4A- 4B ).
- 다른 동물의 가축이 항상 같은 위치에 놓이게하려면 플라스틱 스크리닝 물질 (메시, 구멍 크기 약 0.1 cm)을 튜브에 연결하십시오 ( 그림 4A- 4B ). 면도날이나 회전 도구를 사용하여 강성 튜브를 코의 구멍에서 약 5 mm 정도 잘라냅니다. 튜브의 두 조각 사이에 메쉬를 놓습니다. 메쉬를 고정하고 튜브 외부에 에폭시를 적용하여 튜브를 다시 연결하십시오. 약 20 분 동안 에폭시를 건조 상태로 두십시오.
- 맛있는 전달의 경우 가압 된관류 시스템은 필요에 따라 많은 튜브를 갖추고 매니 폴드에 결합됩니다 (아래 참조). 납땜 인두를 사용하여 메쉬 위 약 1cm의 강체 튜브에 작은 구멍을 만드십시오. 관류 시스템 (ID 0.86 mm)에서 출력 튜브를 단단한 튜브에 삽입하고 에폭시를 적용하여 고정하십시오 ( 그림 4A -4B ).
- 연동 펌프를 사용하여 일정한 유량 (~ 40 mL / min)의 증류수를 공급하십시오. 실리콘 튜빙을 단단한 튜브에 연결하십시오 ( 그림 4A -4C ). 강성 튜브의 다른 쪽을 다른 실리콘 튜브에 연결하여 출력을 대형 폐기물 용기 ( 그림 4A-4C )로 보내십시오.
- 맛을 전달하기 위해, 재관류 시스템의 매니 폴드에 압축 공기를 주입하십시오. 이것은 예를 들어 시간에 따른 전압 펄스 입력에 의해 제어되는 공압 펌프 (10 psi)를 사용하여 매니 폴드에 압축 공기를 주입함으로써 달성 할 수 있습니다 d 튜브에 원하는 맛이 들어 있습니다. 1 초 펄스는 약 0.5 mL의 맛을냅니다.
3. 맛보기 준비 및 모니터링 Tastant Delivery
- 증류수에서 맛을 원하는 농도로 희석하십시오. 맛이 물줄기에 의해 더 희석 될 것이라는 점을 명심하십시오. 우리는 코에 도달하는 최종 농도를 초기 농도의 77 %로 측정했습니다 (참고 문헌 10 , 29 참조).
- 각자의 맛있는 용액에 인공 식품 염료를 첨가하여 맛이 가다랑어를 통과하는 정확한 타이밍을 결정하십시오. 우리는 0.05 % w / v의 녹색 염료 ( 물질 목록 참조)가 만두 카 GRNs를 활성화시키지 않는다는 것을 발견했습니다.
- 맛있는 용액에서 식품의 착색을 감지하려면 색상 센서 (표 1 참조)를 사용하십시오. 솔더링 아이언을 사용하여 메시에 인접한 구멍과 관류 시스템의 출력 튜브 아래 0.5cm의 구멍을 만듭니다 s = "xfig"> 그림 4A -4B). 센서를 단단한 튜브에 연결하고 거기에 에폭시를 바깥쪽에 붙입니다.
- 생체 신호와 함께 컬러 센서 전압 출력을 아날로그 신호로 기록하십시오 (섹션 4 참조). 컬러 센서 전압 신호는 센서에 연결된 DC 증폭기를 사용하여 증폭 될 수 있습니다 ( 그림 4A ).
- 맛을 전달하고 센서의 전압 출력을 기록하여 컬러 센서가 작동하는지 확인하십시오. 염료에 의해 추출 된 신호는 소음 수준을 초과해야합니다.
- 신호를 가능한 한 정사각형에 가깝게 유지하려면 일정한 유속을 조정하십시오.
참고 : 순서대로 여러 맛을 전 달하는 경우 새로운 맛을 가진 첫 번째 시도는 새 맛과 이전 맛을 혼합하여 이루어집니다. 이러한 이유로 우리는 이러한 첫 번째 시도를 분석하지 않았습니다.
- 신호를 가능한 한 정사각형에 가깝게 유지하려면 일정한 유속을 조정하십시오.
그림 4 : Tastant Delivery System. ( A ) 동물의 코에 대한 맛을 측정 한 펄스를 전달하고 모니터링하는데 사용되는 장치의 개략도. 시스템의 주요 구성 요소는 빨간색 숫자로 표시됩니다. 경상의 플라스틱 튜브 (1)에 실리콘 튜빙으로 연결된 연동 식 펌프를 사용하여 코가 주시하는 곳에 일정한 양의 증류수가 유지됩니다 (1). 소량의 무염 염료를 함유 한 맛은 가압 16 채널 관류 시스템을 사용하여 전달됩니다. 미각을 포함하는 저장소는 코가 배치 될 구멍 위에 단단한 튜브에 부착 된 매니 폴드 (2)에 연결됩니다 (5). 공압 펌프의 압축 공기가 관류 시스템에 주입되어 사용자 정의 소프트웨어로 제어되는 타이밍으로 맛을 신속하게 전달합니다. 에이색상 센서 (3)는 맛있는 전달을 모니터하는 데 사용됩니다. 센서는 코에 인접하고 맛이있는 재관류 시스템의 출구 아래에있는 단단한 튜브에 연결됩니다. 컬러 센서 전압 신호는 DC 증폭기에 의해 증폭됩니다. 앰프에 인접한 인셋의 빨간색 트레이스는 맞춤형 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 기록 된 컬러 신호를 보여줍니다. 신호의 급격한 증가 및 감소는 각각 맛의 도착 및 씻김을 반영합니다. 나방의 주둥이는 컬러 센서 바로 아래에있는 구멍 (5)에 넣습니다. 메쉬 (4)는 다른 동물의 종아리가 항상 동일한 위치에 위치하도록 홀 위에 배치됩니다. 강체 튜브의 다른 쪽은 출력을 폐기물 컨테이너 (7)로 향하게하기 위해 다른 실리콘 튜브에 연결됩니다. ( B ) 단단한 플라스틱 튜브에 연결된 맛이 좋은 전달 시스템의 주요 요소를 보여주는 이미지로, 패널 A에 표시된 빨간색 숫자로 표시됩니다. 물(2), 컬러 센서 (3), 메시 (4) 및 코가 삽입 될 구멍 (5)은 모두 단단한 플라스틱 튜브 (1)에 연결되어 있습니다. . ( C ) 설치물에 Manduca 준비물을 배치했다. 나방 코의 선단 t2 / 3은 경질 플라스틱 튜브 (1)의 구멍 (5)으로 들어갑니다. 코는 치아 왁스와 에폭시로 고정되어 고정되어 있습니다. 강체 튜브로의 물의 유입량과 폐기물 용기로의 배출량은 각각 숫자 6과 7로 표시됩니다. 번호 2는 풍부한 매니 폴드 출력 튜빙을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
4. GRN에서 Tastant-evoked Activity를 모니터하기위한 세포 외 Tetrode 기록
- 진동에 입체 현미경으로 플랫폼 위에 나방 준비( 그림 4C ).
- 나방의 코의 원위 2/3를 맛이있는 전달 시스템의 단단한 튜브에 넣으십시오 ( 그림 2B ). 이렇게하려면, 나방의 코를 확장 한 다음 드레싱 포셉의 도움으로 가볍게 눌러서 강성 튜브의 구멍에 삽입하십시오. 코치를 연질 치아 왁스로 밀봉 한 다음 누출을 방지하기 위해 에폭시 층을 밀봉하십시오 ( 그림 4C , 입구).
- 염분 관류 라인을 머리 캡슐에 연결하고 관류 흐름을 약 0.04 L / h의 일정한 속도로 설정합니다.
- 접지 전극 (염화은 전선)을 식염수 욕조 ( 그림 5A )에 담그십시오.
- 30에 설명 된 제조 절차에 따라 제작 된 맞춤형 트위스트 와이어 테 트로 드를 사용하십시오 (4 개의 전극 와이어는 잘 격리 된 단위를 달성하고신경). 실험 전에 30에 설명 된 단계에 따라 전극을 전기 도금하십시오.
- 수동 microromanipulator를 사용하여 tetrode를 상악 신경 가까이에 배치하십시오. tetrode가 신경에 들어가기 시작할 때까지 전진하십시오 ( 그림 5 ).
- tetrode를 삽입 한 후 최소 10 분 동안 기다렸다가 녹음 전에 신경 내에서 안정되도록하십시오.
- 신호 (3000x)를 증폭하고 0.3-6 kHz 사이의 대역 통과 필터를 사용하십시오. 데이터 수집 소프트웨어를 사용하여 40 kHz 샘플링 속도로 신호를 수집하십시오.
- 실험을 마치면 나방 준비를 냉동실에 넣으십시오.
그림 5 : GRN에서 Tetrode 기록. ( A , 큰 이미지) micromanipulator는 pGRNs의 활동을 기록하기 위해 꼬인 철사 tetrode을 상악 신경 (MxN)에 레이스. 염화물 은색 접지 전극을 그림과 같이 염분 조에 놓습니다. ( A , 삽입) 상악 신경의 사극을 보여주는 뇌의 확대 된 이미지. 하부 식도 역 (SEZ)도 표시됩니다. ( B ) A에서와 같은 Manduca 두뇌의 도식 .이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Representative Results
GRNs의 활동은 맛있는 전달 전, 도중 및 후에 세포 외 tetrode 전극을 사용하여 기록 할 수 있습니다 ( 그림 6A 및 6C ). 그림 6A (중간 및 하단 패널)는 상악 신경에 배치 된 4 개의 와이어 각각에 의해 기록 된 필터링 된 (300-6,000 Hz) 전압 트레이스를 보여줍니다. 여기에서 활동 전위 (화살표)를 반영하는 다양한 진폭의 신호를 볼 수 있습니다. 시험 시작 후 1 초의 맛이 나는 (1 M 자당) 펄스가 전달되었다. 자극의 개시 및 오프셋은 컬러 센서 ( 도 6A , 상부 패널)에 의해 모니터링되었다. 4 개의 채널 ( 그림 6A , 가운데 패널) 각각에서 관찰 할 수있는 맛이 강한 유도 스파이크. GRN은 일부 타 스탄 (tastant)에 반응 할 때 기계 센서 (mechanosensors) (여기에는 아무 것도 표시되지 않음)와 식별되고 구별 될 수 있습니다 tetrode 기록에서 단일 뉴런 반응을 확인하고 분리하기 위해 Pouzat 31 및 Kleinfeld 32 , 33 방법을 기반으로 한 맞춤 함수 집합을 사용하여 오프라인 스파이크 정렬을 수행했습니다 (이러한 방법은이 인용 문헌에 설명되어 있습니다 : 10 , 29 ). 도 6B 는 도 6A에 도시 된 데이터에 적용된 스파이크 정렬의 예를 도시하며, 잘 격리 된 세 개의 단위가 발견되었다. 도 6C의 래스터 도표는 6 개의 상이한 맛 (1 M 수크로오스, 말 토즈 및 NaCl, 100 mM 카페인 및 10 mM 베르베린 및 로브 라인)에 대한 도 6B 의 3 개의 단리 된 단위의 반응을 순차적으로 전달한 것이다s / tastant가 표시됨). 도 6c에 도시 된 바와 같이, 기록 된 GRN은 침묵 (GRN 1)에서 저온 또는 중등도 (GRN 2 및 3)에 이르는 다양한 기준 활성도를 갖는다. 맛이 진한 발병 후, GRNs는 다양한 활동 패턴을 보이고 맛에 다른 선택성을 보입니다. 예를 들어, GRN 1은 자당에만 반응하는 반면, GRN 2는 말토오스와 NaCl에 스파이크의 파열로 반응했고, 자극의 시작에서만 스파이크로 로브 라인에 반응했습니다. 또한 일부 반응은 자극의 시간 ( 예 : 자당에 대한 GRN 1 반응)에 고정되어 있지만 다른 반응은 자극 지속 시간 ( 예 : 베르베린에 대한 GRN 3 반응)보다 오래 지속되거나 흥분성 및 억제 성 성분을 모두 포함합니다 NaCl 및 자당에 대한 GRN 2 반응). GRNs의 다양한 민감도와 활동 패턴에 대한 더 자세한 정보는 참고 문헌 10을 참조하십시오. 그림 7 ). 패널 A의 녹색 상자에 전압 트레이스는 자당 프레 젠 테이션의 5 연속 시도 동안 GRN 1에서 세포 내 기록되었고, 동일한 반응은 패널 B에서 래스터 플롯으로 표시됩니다 (이 유형의 응답은 tetrodes 및 도 6c에 도시 된 바와 같이). 날카로운 세포 내 전극으로 기록 된 GRN2는 더 넓은 반응 패턴을 나타낸다. 
그림 6 : 세포 외 Tetrodes와 상악 신경 기록의 대표 결과. ( A ) 상악 신경에서 4 개의 와이어 각각에 의해 기록 된 필터링 된 (300-6,000 Hz) 전압 트레이스가 표시됩니다 (중간 패널). 중간 패널에 적색 음영으로 표시된 기간 동안 1 초의 맛을 적용했습니다. 자극의 시작 및 오프셋은 상부 패널의 적색 전압 트레이스에 의해 표시된 바와 같이 컬러 센서에 의해 모니터링되고 중간 패널의 적색 음영 영역으로 표시됩니다. 점선으로 된 수평선은 +50 (상단), 0 (중간) 및 -50 (하단) μV를 나타냅니다. 수직 점선 내부 영역에 해당하는 원시 전압 트레이스가 확대되어 표시됩니다 (하단 패널). 스파이크의 예는 화살표로 표시됩니다. ( B ) 패널 A에 표시된 데이터에 적용된 스파이크 분류의 예. 4 개의 세포 외 와이어 (1-4) 각각에 기록 된 파형e는 기록 된 신호에 기여하는 세 가지 다른 GRN (단위 1 ~ 3)으로 식별됩니다. 세 가지 단위에 대한 개별 사건 (색이있는가는 선)과 평균 (두꺼운 검은 색 선)이 표시됩니다. 스파이크 정렬 방법 (참고 문헌 10 , 29 참조)을 사용하여 독립적 인 단위를 신뢰성있게 식별하기 위해서는 여러 가지 통계적 기준을 고려해야합니다. ( C ) 3 개의 격리 된 단위의 반응을 나타내는 6 개의 다른 맛 (4 가지 시도 / 맛이 나와 있음)에 대한 래스터 그림. 맛있는 전달 시간 (1 초)은 붉은 색 음영 영역으로 표시됩니다. 미각의 농도는 1 M (자당, 말토오스, NaCl), 100 mM (카페인) 및 10 mM (베르베린 및 로브 라인)이었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. lass = "xfigimg"src = "/ files / ftp_upload / 55868 / 55868fig7.jpg"/>
그림 7 : GRN Axons의 세포 내 기록. ( A , 녹색 상자 패널) 1M의 자당 (Suc) 5 연속 자극에 의해 elicited, 상악 신경에 배치 날카로운 유리 세포 내 전극 (80-120 MΩ의 저항)와 GRN에서 기록 된 전압 추적. ( B ) 날카로운 유리 세포 내 전극으로 기록 된 2 개의 상이한 시험 물질 (100 mM 회색 글꼴 색, 1 M 검정색 글꼴 색)에 대한 패널 A (녹색 상자 패널)에 나타난 반응을 포함하여 2 개의 GRN 반응의 래스터 그림 상악 신경에 위치한다. (7 가지 시도 / 맛과 3 가지 시도 / 물이 표시됨). 맛있는 배달 시간은 두 패널의 빨간색 음영 영역으로 표시됩니다. 자극의 개시 및 오프셋은 각 패널의 하단에 빨간색 전압 트레이스로 표시된 것처럼 컬러 센서에 의해 모니터링되었습니다.es / ftp_upload / 55868 / 55868fig7large.jpg "target ="_ blank ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
여기에 설명 된 방법은 비교적 단순한 동물 인 Manduca sexta의 생체 내 기록이 긴 전달 시간 (2 시간 이상) 동안, 맛이 좋은 전달 전, 도중 및 이후에 여러 무작위로 선택된 GRN의 특징을 나타낼 수 있도록합니다. 이 방법은 정확한 시간 제어와 함께 다수의 맛이있는 자극을 신속하고 순차적으로 전달할 수있게 해 주며, 맛있는 표현의 기초가되는 신경 메커니즘을 연구하는데 유용합니다. 이 프로토콜은 monosynaptically 연결 interneurons 10 GRNs를 모니터링하여 postsynaptic 대상 뉴런 ( 예 : SEZ)로 전송할 때 맛에 대한 GRNs의 반응이 변형되는 방법을 연구하는 데 사용되었습니다. 또한, 이러한 방법은 복잡한 패러다임의 실행이 미각 코딩의 기본 측면을 연구 할 수 있도록 실험자의 필요에 맞게 조정할 수 있습니다.
처음 시작할 때우리의 연구 결과로 우리가 때때로 해결해야만했던 기술적 문제 중 하나는 tetrode 전선으로 상악 신경에서 신호를 감지 할 수 없다는 것이 었습니다. 가능한 원인은 해부 프로토콜이 도전적이기 때문에 다양하며 좋은 준비를 얻으려면 일부 연습이 필요합니다. 첫째, 나방 절개 중 상악 신경이 손상되기 쉽습니다. 특히 신경 조직을 둘러싼 외피를 제거하는 동안. 둘째, 외장이 완전히 제거되지 않으면 테트로 드 와이어가 신경에 접근하지 못할 수 있습니다. 두 경우 모두 새로운 준비를 시작하는 것이 종종 이러한 문제를 해결하는 가장 쉬운 방법입니다. 셋째, 테트로 드 와이어에 문제가있을 수 있습니다. 이것은 1kHz에서 ~ 270kΩ이어야하는 전선의 임피던스를 측정하여 점검 할 수 있습니다. 임피던스 값이 ~ 300 kΩ 이상인 경우 와이어를 금으로 전기 도금하여 원하는 임피던스를 얻으십시오 (참조 30 참조). 넷째, 장비가 잘못 연결되었을 수 있습니다.또는 오작동.
또 다른 가능한 문제는 스파이 킹 신호가 기록되지만 뉴런 (들)이 맛이 잘 드러나지 않는 것처럼 보인다는 것입니다. 이것은 기록 된 뉴런이 전달 된 맛의 세트에 민감하지 않기 때문일 수 있습니다. 또한, GRN의 축색 돌기 외에도 상악 신경에는 기계 감각 섬유가 들어 있다는 사실을 기억하는 것이 중요합니다. 따라서, GRN 대신 또는 GRN에 추가하여 기계 감각 뉴런으로부터 기록하는 것이 가능하다. 그러나 맛이 좋은 전달 시스템은 실험 전반에 걸쳐 일정한 기계적 입력을 제공하도록 설계되어있어 맛에 대한 반응이 전달의 기계 구성 요소에 대한 응답으로 뒤죽박죽이 될 가능성이 거의 없습니다. 다른 맛은 아니지만 다른 맛을 나타내는 뉴런은 GRN으로 명확하게 분류 할 수 있습니다. 화합물 분해 또는 증발로 인한 맛의 농도 또는 조성의 변화를 피하기 위해 새로 희석 된 맛을 첨가하는 것이 좋습니다용매의. 또한 시스템을 정기적으로 청소하여 튜브 오염 및 장애물을 피할 것을 권장합니다.
또 다른 기술적 인 문제는 불리한 신호 대 잡음비입니다. 이 문제는 종종 욕실 접지 전극의 위치를 재 염화 또는 조정하여 해결할 수 있습니다. 다른 해결책은 장치 내에서 각각의 전기 접속의 길이를 차폐하고 최소화하는 것을 요구할 수있다.
마지막으로 tetrode 녹음을 사용하여 얻은 데이터를 올바르게 분석하려면 신중한 스파이크 정렬이 필요합니다. 우리는 완전 자동화 된 방법이 일반적으로 부적절하다는 것을 발견했습니다. tetrode 데이터 10 , 29 , 31 , 32 , 33을 분석하기 전에 스파이크 분류 문헌에 익숙해지는 것이 좋습니다.
우리의 해부 프로에 대한 대안tocol을 사용할 수 있습니다. 여기에서는 나방 머리의 복부를 통해 해부를 기술하여 상악 신경과 SEZ에 접근 할 수있게 해주었습니다. 그러나 등쪽을 해부하여 이러한 구조에 접근하는 것도 가능합니다. 우리는 등쪽의 준비가 깊은 위치 때문에 이러한 미각 구조에서 녹음을하기에는 최적이 아니라는 것을 알았지 만,이 준비는 버섯 바디와 같은 고차원 구조의 녹음을 가능하게하는 이점을 제공합니다. - 감각 통합, 연상 학습 및 기억 처리 34 . 우리는 상악 신경에서 기록하기 위해 tetrode 전극의 사용에 초점을 맞추었지만, 우리가 예시 한 바와 같이 표준 세포 내 날카로운 전극도이 목적으로 사용될 수 있습니다. 또한 두 기술을 결합하여 여러 뇌 영역에서 동시 녹음을 수행 할 수 있습니다 10 . 신경 과학 관련 문헌은곤충과 척추 동물 모두 35 , 36 , 37 , 38 , 39에 적용되는 후각 코딩과 같은 감각 처리의 기본 원리를 밝히기위한 강력한 도구로 입증 된 무 모형 모델. 우리의 방법으로 맛있는 코딩에 대한 근본적인 새로운 통찰력이 생길 수 있기를 바랍니다.
Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작업은 NIH-NICHD에서 MS까지의 교내 교부금으로 지원되었습니다. NIH-NIMH 계측 핵심 시설의 G. Dold와 T. Talbot에게 맛있는 전달 시스템 설계에 대한 도움을 주신 데 대해 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection and Specimen Preparation | |||
| Polypropylene tube, 15 mL Falcon | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Needle, Short bevel, 19 G x 1 - 1/2" | MONOJET | 888200144 | For applying air to remove the hair from the moth. |
| Modeling Clay-Van Aken Plastalina | DickBlick | 33268 | |
| Petri dish -100 x 15 mm | VWR International | 89000-304 | |
| Pipette tip (1 - 200 µL) | USA Scientific | 1111-0806 | |
| Razor blade | Techni Edge | TE05-071 | |
| 22 AWG standard hookup wire | AlphaWire | 1551 | For inserting the proboscis into the pippete tip. |
| Batik wax | Jacquard | 7946000 | |
| Electric waxer | Almore International | 66000 | |
| Stereo Myscroscope | Leica | MZ75 | |
| Dumont #1 forceps (coarse) | World Precision Instruments | 500335 | For removing fat and non-nervous tissue. |
| Dumont #5 titanium forceps (fine) | World Precision Instruments | 14096 | For removing fat and non-nervous tissue. |
| Dumont #5SF forceps (super-fine) | World Precision Instruments | 500085 | For desheathing the nervous tissue. |
| Vannas scissors (fine) | World Precision Instruments | 500086 | For removing the cuticle. |
| Collagenase/Dispase | Sigma-Aldrich | 11097113001 | |
| Epoxy | Permatex | 84101 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline Perfusion System | |||
| Extension set with rate flow regulator | B Braun Medical Inc. | V5200 | |
| IV administration set with Y injection site | B Braun Medical Inc. | V1402 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tastant Delivery System | |||
| White Translucent Nylon Tubing OD 1/4", ID 1/8" | Small Parts Inc. | B001JJT4SA | Rigid tube that connects the four main elements of the system. |
| Soldering iron | Circuit Specialists | ZD200BK | |
| Rotary tool-Dremel | Dremel | 4200 | |
| Polypropylene mesh, hole size (hole size 0.1 x 0.13 cm) | Industrial Netting | XN5170 | For ensuring that the probosises of different animals are placed in the same location. |
| Pressurized 16-Channel perfusion system | Bioscience Tools | PS-16H | For tastant delivery. This system includes pinch valves, tubing, manifold, solution cylinders, valve controller and fitting accessories. |
| Polypropylene tubing, ID 0.034", ID 0.050" | Becton, Dickinson & Co | 427421 | Output tube from the perfusion system. |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For controlling the output channel of the perfusion system. |
| Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card | National Instruments | LabVIEW 2011 | To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor. |
| Compulab 3 Manostat peristaltic pump | Sigma | P1366 | For pumping water. |
| Silicone tubing, ID 1/16" OD 1/8" | Cole-Parmer | WU-95802-02 | To connect the water source to the peristaltic pump tubing, and the outlet tube of the pump to the rigid tube of the delivery system. |
| Color sensor-digital fiber optic sensor | Keyence | FS-V31M | For monitoring tastant delivery. |
| Color sensor-reflective fiber unit | Keyence | FU35-FZ | To connect the color sensor device. |
| Dental periphery Wax | Henry-Schein Dental | 6652151 | To secure the proboscis into the rigid tube. |
| Two 3.7 L containers | To provide water to the system, and to recollect the water waste. | ||
| Fast green FCF | Sigma | F7258 | |
| Dressing forceps 25.5 cm | WPI | 500364 | To introduce moth proboscis into the proboscis hole in the rigid tube. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electrophysiology Equipment | |||
| D.C. amplifier | Brown-Lee | 440 | |
| Lamp | Schott | Schott Fostec Light Source DCR 2 | |
| Manual micromanipulator | Leica | micromanipulator | To precisely insert the tetrodes into the animal's brain. The manipulator has to allow fine and coarse movements in x, y and z axis. |
| Stereomicroscope | Leica | MZ75 | |
| Vibration-isolation table (MICRO-g lab table) | TMC | 63-541 | |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2014 | |
| 16-channle pre-amplifier and amplifier | 16 Channel MA-800 Amplifier System | B.E.S 2013 | |
| Computer | Dell | optiplex 780 | The following are the minimum recommended requirements. RAM: 3.32 GHz, 3GB. Processor: Intel Core 2 Duo. Graphic card: integrated Intel GMA X4500. |
| Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card | National Instruments | LabVIEW 2011 | To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor and electrode. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tastants | |||
| KAc | Sigma-Aldrich | P5708 | |
| LiCl | Sigma-Aldrich | L9650 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 73575 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 |
References
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