Summary
Presentamos tres nuevos métodos para estudiar la codificación gustativa . Utilizando un animal simple, la polilla Manduca sexta ( Manduca ) , describimos un protocolo de disección, el uso de tetródos extracelulares para registrar la actividad de múltiples neuronas receptoras gustativas y un sistema para administrar y controlar pulsos de tastantes precisamente sincronizados.
Abstract
El sentido del gusto permite a los animales detectar los productos químicos en el medio ambiente, dando lugar a comportamientos críticos para la supervivencia. Cuando las Neuronas Receptoras Gustatorias (GRNs) detectan moléculas tastantes, codifican información sobre la identidad y concentración del saborizante como patrones de actividad eléctrica que luego se propagan a las neuronas seguidoras del cerebro. Estos patrones constituyen representaciones internas del tastante, que luego permiten al animal seleccionar acciones y formar recuerdos. El uso de modelos animales relativamente simples ha sido una poderosa herramienta para estudiar los principios básicos en la codificación sensorial. Aquí, proponemos tres nuevos métodos para estudiar la codificación gustativa utilizando la polilla Manduca sexta . En primer lugar, se presenta un procedimiento de disección para exponer los nervios maxilares y la zona subesofágica (SEZ), permitiendo registrar la actividad de GRNs desde sus axones. En segundo lugar, se describe el uso de electrodos extracelulares para registrar la actividad de múltiples GRNs colocando teTrode directamente en el nervio maxilar. En tercer lugar, se presenta un nuevo sistema de entrega y seguimiento, con alta precisión temporal, pulsos de diferentes tastantes. Estos métodos permiten la caracterización de respuestas neuronales in vivo directamente a partir de GRNs antes, durante y después de la liberación de los saborizantes. Proporcionamos ejemplos de trazas de voltaje grabadas a partir de GRN múltiples y presentamos un ejemplo de cómo una técnica de clasificación por punta puede aplicarse a los datos para identificar las respuestas de neuronas individuales. Por último, para validar nuestro enfoque de grabación, se comparan las grabaciones extracelulares obtenidas de GRN con tetrodos a las grabaciones intracelulares obtenidas con electrodos de vidrio afilado.
Introduction
Los sistemas gustativo y olfativo generan representaciones internas de sustancias químicas en el medio ambiente, dando lugar a percepciones de gustos y olores, respectivamente. Estos sentidos químicos son esenciales para obtener numerosos comportamientos críticos para la supervivencia del organismo, que van desde encontrar compañeros y comidas hasta evitar depredadores y toxinas. El proceso comienza cuando los químicos ambientales interactúan con los receptores situados en las membranas plasmáticas de las células sensoriales receptoras; Estas células, directamente oa través de interacciones con neuronas, transducen información sobre la identidad y concentración de sustancias químicas en señales eléctricas. Estas señales se transmiten a neuronas de orden superior ya otras estructuras cerebrales. A medida que estos pasos progresan, la señal original siempre experimenta cambios que promueven la capacidad del organismo de detectar, discriminar, clasificar, comparar y almacenar la información sensorial, y seleccionar una acción apropiada. Comprender cómo el sujetadorEn transforma la información sobre los productos químicos ambientales para realizar mejor una variedad de tareas es una pregunta básica en neurociencia.
Se ha pensado que la codificación gustatoria es relativamente simple: una opinión ampliamente sostenida postula que cada molécula química que provoca un sabor (un "saborizante") pertenece naturalmente a una de las aproximadamente cinco cualidades básicas de sabor ( es decir , dulce, amarga, agria , Salado y umami) 1 . En esta visión del "gusto básico", el trabajo del sistema gustativo es determinar cuál de estos sabores básicos está presente. Además, los mecanismos neuronales que subyacen a la representación básica del gusto en el sistema nervioso no son claros y se piensa que están gobernados por una "línea marcada" 2 , 3 , 4 , 5 , 6 o un "patrón transversal de fibras" 7 , 8 código. En un código de línea etiquetado, cada célula sensorial y cada uno de sus seguidores neurales responde a una única cualidad de sabor, formando juntos un canal directo e independiente a centros de procesamiento superiores en el sistema nervioso central dedicado a ese gusto. Por el contrario, en un código de patrón de fibra transversal, cada célula sensorial puede responder a múltiples cualidades gustativas de modo que la información sobre el saborizante está representada por la respuesta global de la población de neuronas sensoriales. Si la información gustativa está representada por gustos básicos, a través de líneas etiquetadas, oa través de algún otro mecanismo, no está claro y es el foco de la investigación reciente 3 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Nuestro trabajo reciente sugiere que el sistema gustativo utiliza un código de población spatiotemporal para generarRepresentaciones de tastantes individuales en lugar de categorías básicas de gusto 10 .
Aquí ofrecemos 3 nuevas herramientas para ayudar en el estudio de la codificación gustativa. En primer lugar, se sugiere el uso de la hawkmoth Manduca sexta como un organismo modelo relativamente simple susceptible de estudio electrofisiológico del gusto y describir un procedimiento de disección. En segundo lugar, sugerimos el uso de "tetrodos" extracelulares para registrar la actividad de GRNs individuales. Y en tercer lugar, se sugiere un nuevo aparato para la entrega y el seguimiento de pulsos de tastante precisamente sincronizados al animal. Estas herramientas fueron adaptadas de las técnicas de nuestro laboratorio y otros han utilizado para estudiar el sistema olfativo.
Insectos como la mosca de la fruta Drosophila melanogaster , la langosta Schistocerca americana , así como la polilla Manduca sexta, han proporcionado desde hace décadas recursos poderosos para entender los principios básicos sobre el nerIncluyendo la codificación sensorial ( p. Ej., El olfato 13 ). En los mamíferos, los receptores del gusto son células especializadas que se comunican con las neuronas a través de vías complejas de segundo mensajero 1 , 14 . Es más sencillo en los insectos: sus receptores del gusto son neuronas. Además, las vías gustativas de mamíferos cerca de la periferia son relativamente complejas, con múltiples rutas neuronales paralelas, y los componentes importantes son difíciles de acceder, contenidos dentro de estructuras óseas pequeñas [ 15] . Las vías del gusto del insecto parecen ser más simples. En los insectos, los GRN están contenidos en estructuras especializadas conocidas como sensilla, localizadas en la antena, piezas bucales, alas y patas 16 , 17 . Los GRNs se proyectan directamente a la zona subesofágica (SEZ), una estructura cuyo papel se ha pensado que es principalmente de tipo gustativo17, y que contiene un segundo ordenNeuronas gustativas 10 . A partir de ahí la información viaja al cuerpo para impulsar los reflejos, ya las áreas cerebrales superiores para ser integradas, almacenadas y, finalmente, para impulsar las elecciones conductuales 16 .
Es necesario caracterizar las respuestas gustativas periféricas para comprender cómo se propaga y se transforma la información del gusto de un punto a otro en todo el sistema nervioso. El método más comúnmente usado para monitorear directamente la actividad neural de GRNs en insectos es la técnica de registro de punta 12 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . Esto implica colocar un electrodo directamente sobre un sensor, muchos de los cuales son relativamente fáciles de acceder. El saborizante se incluye dentro del electrodo, lo que permite activar y extMiden de manera raconular las respuestas neuronales de GRNs en el sensillum. Sin embargo, debido a que el saborizante está contenido en el electrodo, no es posible medir la actividad de GRN antes de que el saborizante sea suministrado o después de ser retirado, o para intercambiar tastantes sin reemplazar el electrodo 20 . Otro método, la técnica de grabación de "pared lateral", también se ha usado para registrar la actividad de GRNs. Aquí, se inserta un electrodo de registro en la base de un sensor de sabor 24 , y los saborizantes se suministran a través de un capilar de vidrio separado en la punta del sensor. Ambas técnicas restringen la grabación de GRNs a un sensillum particular. Aquí, se sugiere una nueva técnica: la grabación de seleccionados aleatoriamente GRN axones de diferentes sensilla, a la vez que la entrega de secuencias de tastantes a la probóscide. Las grabaciones del axón se logran colocando electrodos de cristal afilados o haces de electrodos extracelulares (tetrodos) en el nervio que lleva los axones deGRNs en la probóscide a la SEZ 10 . En Manduca , estos axones atraviesan el nervio maxilar, que se sabe que es puramente aferente, lo que permite el registro inequívoco de las respuestas sensoriales [ 25] . Este método de registro de axones, permite, durante más de dos horas, la medición estable de GRN respuestas antes, durante y después de una serie de presentaciones de sabor.
En este sentido, describimos un procedimiento de disección para exponer los nervios maxilares junto con la SEZ, lo que permite registrar simultáneamente las respuestas de múltiples GRNs y neuronas en la SEZ 10 . También se describe el uso de grabaciones extracelulares de GRNs utilizando un tetrodo de alambre retorcido de 4 canales hecho a la medida que, combinado con un método de clasificación por puntas, permite el análisis de múltiples (en nuestras manos, hasta seis) GRNs simultáneamente. Comparamos también las grabaciones realizadas con tetrodos a grabaciones realizadas conElectrodos Finalmente, describimos un nuevo aparato para la liberación de estímulos tastantes. Adaptado de equipos utilizados por muchos investigadores para suministrar odorantes en estudios de olfacción, nuestro nuevo aparato ofrece ventajas para estudiar gustation: mejorando el sistema de distribución multicanal anterior, como los desarrollados por Stürckow y colegas (ver referencias 26 , 27 ) Control sobre la temporización de la entrega de saborizante mientras proporciona una lectura de voltaje de esta temporización; Y permite la entrega rápida y secuencial de múltiples estímulos tastantes [ 10] . El aparato baña la probóscide en un flujo constante de agua limpia en el que pueden suministrarse impulsos controlados de saborizante. Cada pulso de sabor tostador pasa sobre la trompa y luego es lavado. Los saborizantes contienen una pequeña cantidad de colorante de alimentos insípido, permitiendo que un sensor de color para monitorear, con tiempo preciso, el paso de tastante ovLa probóscide.
Protocol
Precaución: Las escamas finas y en polvo liberadas por Manduca pueden ser alergénicas, por lo que se recomienda el uso de guantes de seguridad de laboratorio y una máscara facial.
1. Disección de Manduca sexta para revelar los nervios maxilares y la SEZ
- Elija una polilla apropiada de cada sexo basándose en las siguientes características: tres días después de la eclosión con un aspecto general sano (las alas deben estar completamente extendidas y la trompa y las antenas deben estar intactas).
- Coloque la polilla individualmente en una taza de plástico para el transporte.
- Inserte la polilla en un tubo de polipropileno.
Precaución: Recomendamos realizar este paso en una campana extractora para evitar que las balanzas en polvo de la polilla se propaguen.- El tubo debe ser ligeramente más largo que el cuerpo de la polilla ( Figura 1A ). El tubo se puede fabricar cortando un tubo de polipropileno de 15 ml. <Li> Empuje la polilla hasta que la cabeza quede expuesta e inserte papel de seda empastado en el otro extremo del tubo para ayudar a mantener la polilla inmóvil ( Figura 1A ).
- Un chorro de aire se puede hacer conectando una jeringa (1 ml con una aguja, ID alrededor de 1,4 mm, con la punta afilada eliminado) a una fuente de aire a presión.
Nota: Después de quitar el cabello se pueden realizar todos los pasos siguientes fuera de la campana extractora de humos.
- En una placa de petri, use arcilla de modelado para construir una base triangular de aproximadamente 7 cm de largo, 2,5 cm de altura ( Figura 1B ).
Figura 1 : Preparación de la cámara de disección para Manduca . ( A ) Una polilla está contenida en un tubo. La cabeza está expuesta en un extremo, mientras que el otro extremo está taponado con papel de seda. ( B ) Se muestra una cámara de disección hecha de una placa petri y una arcilla de modelado. La parte dorsal de la cabeza está hacia arriba. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- Proteja las antenas y la trompa.
- Prepare 3 tubos pequeños cortando una punta de pipeta (puntas amarillas, 1-200 μL) con una cuchilla de afeitar en 3 piezas de aproximadamente 0,5 cm de longitud. El diámetro interno debe ser lo suficientemente grande como para que la antena y la probóscide puedan ajustarse perfectamente.
- Prepare un ganchoDoblando un alambre (22 AWG, de unos 7 cm de largo). Extienda la probóscide de la polilla y luego insértela en uno de los tubos pequeños tirándolo con el gancho de alambre hasta que el tubo alcance la parte proximal de la trompa.
- Asegure el tubo pequeño con cera de batik firme (usando, por ejemplo, una cera eléctrica dental para fundir y dirigir la cera) a la parte dorsal de la cabeza de la polilla cápsula ( Figura 2A izquierda).
- Coloque cada antena en un tubo y asegure los tubos con cera batik como se muestra en la Figura 2A (izquierda). Tenga cuidado de no dañar las antenas con la cera caliente.
- Estabilizar el cerebro contra el movimiento cortando los músculos que cubren la superficie anterior del cerebro ( es decir, el músculo bucal del compresor).
- Bajo el microscopio de disección, utilice tijeras de microdisección o un mini-hacha formada a partir de una cuchilla de afeitar pegada a un palillo para abrir la cápsula de la cabeza por makUn pequeño corte justo debajo de la trompa ( Figura 2A , inserto superior izquierdo).
- Utilice tijeras de microdisección para cortar el músculo compresor bucal (para las ilustraciones vea la referencia 25 ). Como el músculo no es fácilmente visible, se recomienda la siguiente prueba conductual para confirmar que se ha cortado.
- Diluir la sacarosa en agua destilada para conseguir una solución 1 M.
- Utilice una pipeta para entregar aproximadamente 200 μl de solución de sacarosa a los 2/3 distales de la probóscide y observe la probóscide durante 5 min. Si el músculo se cortó correctamente el insecto no debe ser capaz de extender o mover la trompa.
- Aplique una capa de cera batik derretida para sellar la abertura en la cápsula de la cabeza.
- Voltear el insecto por lo que el lado ventral de la cápsula de la cabeza es ahora hacia arriba.
- Para perfundir solución salina durante y después del procedimiento de disección construir una taza de cera alrededor del lado ventral de la cabeza usinG la cera eléctrica: Bajo un microscopio de disección, empiece a construir la taza aplicando la primera fila de cera a lo largo de la parte delantera de la cabeza, moviéndose hacia la parte posterior. Mantenga los tubos de probóscide y antenas dentro de la copa ( Figura 2A a la derecha).
- Continúe construyendo la taza hacia fuera y hacia arriba hasta que alcance el nivel de los ojos.
- Use una pinza para tomar uno de los dos palpos labiales, luego colóquelo en el lado y asegúrelo en la taza de cera mediante la adición de más cera derretida. Haga lo mismo con el otro palp maxilar ( Figura 2A derecha).
- Selle las aberturas en la taza y los tubos de cera.
Nota: En este paso se utiliza epoxy porque ayuda a sellar fácilmente los huecos en la cera y los tubos, y evita cualquier daño causado por el calor a las antenas y la probóscide.- Utilice un palillo de dientes para mezclar epoxi binario en un plato de mezcla de plástico. Conservar el plato de mezcla.
- Utilice el palillo de dientes para aplicarCapa de epoxi hacia el exterior y el interior de la copa ( Figura 2B ).
- Llenar el espacio vacío de los tubos que contienen la probóscide y las antenas con epoxi, y llenar la parte del tubo de polipropileno que rodea el cuello con suficiente epoxi para mantener firmemente en su lugar ( Figura 2B ).
- Dejar secar el epoxi durante aproximadamente 20 min. Para comprobar esto, pruebe el epoxi que queda en el plato de mezcla de plástico para asegurar que es sólido y ya no es pegajoso.
- Llene la taza de cera con solución salina fisiológica Manduca 28 y espere un par de minutos para asegurarse de que no hay fugas. Si una fuga es visible, intente sellarla aplicando más cera caliente y / o epoxi.
Figura 2 : Preparación de Manduca </ Em> para la disección. ( A ) Las antenas y trompas están protegidas dentro de pequeños tubos hechos de puntas de pipeta cortadas en tres piezas de aproximadamente 0,5 cm de longitud. (Panel izquierdo, imagen grande) Los tubos se aseguran con cera batik derretida aplicada alrededor de la parte dorsal de la cabeza. (Panel izquierdo, inserción) Para retirar el músculo compresor bucal, se abre el lado dorsal de la cápsula de la cabeza haciendo un pequeño corte como se indica por la línea punteada en la imagen grande. (Panel derecho) Se construye una taza de cera alrededor del lado ventral de la cabeza como un depósito para solución salina perfundida durante el procedimiento de disección y los experimentos de registro. ( B ) Se utiliza epoxi para sellar espacios entre la base de la copa de cera y la parte dorsal de la cabeza (panel izquierdo) y entre la cera y los tubos que contienen las antenas y probóscide, incluyendo las aberturas de los tubos ). Haga clic aquí tO ver una versión más grande de esta figura.
- Bajo el microscopio de disección, utilice tijeras de microdisección para cortar los palpos labiales.
- Use tijeras de microdisección o un mini-hacha para abrir el lado ventral de la cápsula de la cabeza haciendo cuatro cortes: dos cortes a lo largo de la cutícula que rodea cada ojo de atrás hacia delante, un corte en la cutícula a lo largo de la parte posterior de la cabeza, Y un corte en la cutícula a lo largo del frente de la cabeza cerca de la probóscide ( Figura 3A ).
- Suavemente tire de la cutícula con fórceps de micro-disección para exponer el cerebro.
- Mediante el uso de dos pinzas afiladas de microdisección, retire lenta y cuidadosamente el tejido graso y la tráquea que cubre la SEZ. Evite cualquier daño al cerebro o nervios (por ejemplo, nervio maxilar, nervio óptico, conector cervical). Enjuague el cerebro reemplazando con frecuencia la solución salina, y ajuste la luz con frecuencia para mejorar la visibilidad. Nota: Esta puede ser la parte más crítica de los diSsection; Es fácil dañar inadvertidamente el nervio maxilar tirándolo o aplastándolo.
Nota: En este punto la SEZ y los nervios maxilares deben ser claramente visibles ( Figura 3B -3C ). Sin embargo, el cerebro y los nervios maxilares están cubiertos por una vaina delgada. - Para quitar la vaina, reemplace la solución salina en la taza de cera con 10% (p / v) de colagenasa / disasa disuelta en solución salina y déjela en su lugar durante 5 min. Luego, después de enjuagar el cerebro varias veces con solución salina, retire suavemente la vaina con fórceps de microdisección superfinos tirando de la vaina desde la SEZ a través de los nervios maxilares.
- Comience a perfundir la taza de cera con solución salina fresca. Coloque el tubo de una línea de goteo salina en la taza de cera y asegúrelo allí con cera derretida.
HigoUre 3 : Procedimiento de disección de Manduca . ( A ) Los palpos labiales eliminados, la cápsula de la cabeza se abre haciendo cuatro cortes como se indica por la línea punteada. ( B ) Imagen magnificada del cerebro después de abrir la cápsula de la cabeza y extraer el tejido graso y la tráquea, permitiendo la visualización de los nervios maxilares (MxNs) y la zona subesofágica (SEZ, término que se refiere al área del cerebro bajo el cerebro). esófago). Los nervios maxilares transportan los axones de las neuronas receptoras gustativas (GRNs) en la trombosis hacia la SEZ. ( C ) Un esquema de un cerebro Manduca . Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. Sistema de suministro de Tastant
- El sistema de suministro de sabor se compone de cuatro elementos principales: la fuente de agua, el colector de sabor, el sensor de color y el sitio que contiene laProbóscide, todos conectados a un tubo de plástico rígido ( Figura 4A -4B ). Para construir este sistema, siga los pasos que se muestran en la Figura 4B . Utilice un tubo de plástico rígido de unos 6 cm de longitud (ID 0,3 cm).
- Utilice un hierro de soldar para hacer un pequeño agujero en el tubo donde se va a colocar la trompa ( Figura 4A -4B ).
- Para asegurarse de que las trompas de diferentes animales se colocan siempre en el mismo lugar, coloque el material de cribado plástico (malla, tamaño de agujero de aproximadamente 0,1 cm) en el tubo ( Figura 4A -4B ). Con una cuchilla de afeitar o una herramienta giratoria, corte el tubo rígido unos 5 mm por encima del agujero del probóscide. Coloque la malla entre las dos piezas de tubo. Asegure la malla y vuelva a conectar los tubos mediante la aplicación de epoxi en el exterior de los tubos. Dejar secar el epoxi durante aproximadamente 20 min.
- Para el suministro de saborizante utilice unaSistema de perfusión con tantos tubos de sabor como sea necesario, unidos a un colector (véase más adelante). Utilice el hierro de soldar para hacer un pequeño agujero en el tubo rígido alrededor de 1 cm por encima de la malla. Inserte el tubo de salida del sistema de perfusión (ID 0.86 mm) en el tubo rígido y fíjelo allí aplicando epoxi ( Figura 4A -4B ).
- Utilice una bomba peristáltica para suministrar un flujo constante (~ 40 ml / min) de agua destilada. Conéctelo con tubo de silicona al tubo rígido ( Figura 4A -4C ). Conecte el otro lado del tubo rígido a otro tubo de silicio para dirigir la salida a un contenedor de residuos grande ( Figura 4A -4C ).
- Para suministrar el saborizante, inyecte aire comprimido en el colector del sistema de perfusión. Esto puede lograrse, por ejemplo, utilizando una bomba neumática (10 psi) controlada por una entrada de pulso de voltaje temporizado para inyectar aire comprimido en el manifol D que contiene el saborizante deseado. Un pulso de 1s expulsa aproximadamente 0,5 ml de saborizante.
3. Preparación del Tastante y Monitoreo de la Entrega del Tastante
- Diluir el saborizante en agua destilada hasta la concentración deseada. Tenga en cuenta que el saborizante se diluirá más por la corriente de agua. Se midió la concentración final que alcanzó la probóscide como el 77% de la concentración inicial (ver referencias 10 , 29 ).
- Agregue un tinte alimentario artificial a cada solución tostante para permitir determinar el momento preciso con el que el tostante pasa sobre la trompa. Se encontró que el colorante verde (ver lista de materiales ) al 0,05% p / v no activa los GRN de Manduca .
- Utilice un sensor de color (ver Tabla 1) para detectar el colorante de los alimentos en las soluciones de sabor. Utilice un soldador para hacer un agujero adyacente a la malla ya 0,5 cm por debajo del tubo de salida del sistema de perfusión ( S = "xfig"> Figura 4A - 4B). Conecte el sensor al tubo rígido y asegúrelo allí aplicando epoxy en el exterior.
- Registre la salida de voltaje del sensor de color como una señal analógica junto con señales fisiológicas (vea la sección 4). La señal de voltaje del sensor de color puede amplificarse usando un amplificador de CC conectado al sensor ( Figura 4A ).
- Asegúrese de que el sensor de color esté funcionando suministrando el saborizante y registrando la salida de voltaje del sensor. La señal obtenida por el colorante debe exceder el nivel de ruido.
- Ajuste el caudal de agua constante para hacer que la señal esté lo más cerca posible del cuadrado posible.
Nota: Al entregar múltiples tastantes en secuencia, tenga en cuenta que el primer ensayo con un nuevo saborizante consistirá en una mezcla del téster nuevo y anterior. Por esta razón, no analizamos estos primeros ensayos.
- Ajuste el caudal de agua constante para hacer que la señal esté lo más cerca posible del cuadrado posible.
Figura 4 : Sistema de suministro de Tastant. ( A ) Esquema del aparato usado para suministrar y monitorizar pulsos cronometrados de saborizantes a la probóscide del animal. Los principales componentes del sistema se indican con números rojos. Un flujo constante de agua destilada se mantiene a través de la trompa mediante una bomba peristáltica conectada con tubo de silicona al tubo de plástico rígido (1) donde se va a colocar la trompa (6). Los agentes de sabor que contienen una pequeña cantidad de colorante libre de sabor se suministran usando un sistema de perfusión de 16 canales presurizado. Los depósitos que contienen los tastantes están conectados a un colector (2) que está unido al tubo rígido, por encima del agujero donde se va a colocar la trompa (5). El aire comprimido de una bomba neumática se inyecta en el sistema de perfusión para suministrar rápidamente un saborizante, con tiempo controlado por software personalizado. UNEl sensor de color (3) se utiliza para supervisar la entrega del saborizante. El sensor está conectado al tubo rígido adyacente a la probóscide y por debajo de la salida del sistema de perfusión de saborizante. La señal de voltaje del sensor de color es amplificada por un amplificador de CC. El trazo rojo en la inserción adyacente al amplificador ilustra una señal de color registrada utilizando un software de adquisición de datos personalizado; El rápido aumento y disminución de la señal reflejan la llegada y el lavado del saborizante, respectivamente. La probóscide de la polilla se coloca en un agujero (5) situado justo debajo del sensor de color. Se coloca una malla (4) por encima del agujero para asegurar que las trompas de diferentes animales estén siempre situadas en el mismo lugar. El otro lado del tubo rígido está conectado a otro tubo de silicio para dirigir la salida a un recipiente de residuos (7). ( B ) Imagen que muestra los elementos principales del sistema de suministro del saborizante conectados al tubo de plástico rígido, que se indican con los números rojos como se muestra en el panel A: el agua(2), el sensor de color (3), la malla (4) y el orificio donde se va a insertar la trompa (5), todos conectados a un tubo de plástico rígido (1) . ( C ) Se muestra la colocación de la preparación Manduca en la disposición. El t2 / 3 distal de la probóscide de la polilla se introduce en el orificio (5) en el tubo de plástico rígido (1). La probóscide se asegura en su lugar con cera dental y epoxi como se muestra en la inserción. La entrada de agua al tubo rígido y su salida a un contenedor de residuos se indican mediante los números 6 y 7, respectivamente. El número 2 indica la tubería de salida del colector de saborizante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
4. Registro de Tetrodos Extracelular para Monitorear la Actividad Evocada por el Tastante de GRNs
- Coloque la preparación de la polilla en una plataforma bajo un estereomicroscopio en un vibr( Figura 4C ).
- Coloque los dos tercios distales de la trompa de la polilla en el tubo rígido del sistema de suministro de saborizante ( Figura 2B ). Para hacer esto, extienda la probóscide de la polilla y luego insértela en el agujero del tubo rígido empujándola suavemente a través con la ayuda de una pinza de vendaje. Selle la probóscide en su lugar con cera dental suave y luego una capa de epoxi para evitar fugas ( Figura 4C , entrada).
- Conecte la línea de perfusión salina a la cápsula de la cabeza y ajuste el flujo de perfusión a una velocidad constante de aproximadamente 0,04 l / h.
- Sumerja un electrodo de tierra ( es decir, un alambre de plata clorado) en el baño de solución salina ( Figura 5A ).
- Utilice un tetrodo de alambre retorcido hecho a la medida construido siguiendo el procedimiento de fabricación descrito en 30 (se sugieren 4 hilos de electrodos para lograr unidades bien aisladas y para encajar enel nervio). Antes del experimento, aplique electrodo el electrodo siguiendo los pasos descritos en 30 .
- Utilice un micromanipulador manual para posicionar el tetrodo cerca del nervio maxilar. Avance el tetrodo hasta que comience a entrar en el nervio ( Figura 5 ).
- Espere al menos 10 minutos después de colocar el tetrodo para permitir que se estabilice dentro del nervio antes de grabar.
- Amplifique la señal (3000x) y utilice un filtro de paso de banda entre 0,3-6 kHz. Adquiera la señal a una frecuencia de muestreo de 40 kHz utilizando un software de adquisición de datos.
- Después de terminar el experimento coloque la preparación de polilla en el congelador.
Figura 5 : Grabación de Tetrodos de GRNs. ( A , imagen grande) Un micromanipulador se utiliza para pEncaje el tetrodo de alambre retorcido en el nervio maxilar (MxN) para registrar la actividad de GRNs. Un electrodo de tierra de cloruro de plata se coloca en el baño de solución salina como se muestra. ( A , inserción) Una imagen ampliada del cerebro que muestra el tetrodo en el nervio maxilar. También se indica la zona subesofágica (SEZ). ( B ) Un esquema de un cerebro Manduca orientado como en A. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Representative Results
La actividad de los GRN se puede registrar usando un electrodo de tetrodo extracelular antes, durante y después de la liberación del saborizante ( Figura 6A y 6C ). La Figura 6A (paneles central e inferior) muestra trazas de voltaje filtradas (300-6.000 Hz) registradas por cada uno de los cuatro cables colocados en el nervio maxilar, donde se pueden observar señales de amplitudes diferentes que reflejan potenciales de acción (flechas). Se suministró un pulso de 1 s de saborizante (sacarosa 1 M) 2s después del comienzo del experimento; El inicio y el desplazamiento del estımulo fueron monitorizados por el sensor de color ( Figura 6A , panel superior). El saborizante indujo picos que se pueden observar en cada uno de los cuatro canales ( Figura 6A , panel del medio). GRNs se pueden identificar y distinguir de los mecanosensores (no se muestra aquí) cuando responden a algunos tastantes y no otros Para identificar y aislar las respuestas neuronales individuales de las grabaciones de tetrodos, se realizó la clasificación de picos fuera de línea utilizando un conjunto de funciones personalizadas basadas en los métodos de Pouzat 31 y Kleinfeld 32 , 33 (estos métodos se describen en estas citas 10 , 29 ). La Figura 6B muestra un ejemplo de clasificación por punta aplicada a los datos mostrados en la Figura 6A , en la que se encontraron tres unidades bien aisladas. Las gráficas ráster de la Figura 6C representan respuestas de las tres unidades aisladas en la Figura 6B a seis tastantes diferentes (sacarosa 1 M, maltosa y NaCl, 100 mM de cafeína y 10 mM de berberina y lobelina) entregados en secuencia (4 ensayosS / tastant se muestran). Como se muestra en la Figura 6C , los GRNs grabados tienen diferentes niveles de actividad basal, que van desde silenciosa (GRNs 1) a baja o moderada (GRN 2 y 3). Después del inicio del saborizante, los GRN muestran diversos patrones de actividad y exhiben una selectividad diferente a los saborizantes. Por ejemplo, GRN 1 respondió sólo a la sacarosa, mientras que GRN 2 respondió a la maltosa y NaCl con la explosión de picos y lobeline con spiking sólo en el inicio del estímulo. Además, algunas respuestas están bloqueadas al momento del estímulo ( por ejemplo, la respuesta GRN 1 a la sacarosa), mientras que otras respuestas duran más que la duración del estímulo ( por ejemplo, la respuesta GRN 3 a la berberina) o contienen tanto componentes excitadores como inhibidores GRN 2 respuestas a NaCl y sacarosa). Para más información sobre las diversas sensibilidades y los patrones de actividad de los GRN, véase la referencia 10 . Figura 7 ]. Los trazos de voltaje en la caja verde en el Panel A se registraron intracelularmente a partir de GRN 1 durante 5 ensayos consecutivos de presentación de sacarosa y las mismas respuestas se muestran como tramas ráster en el panel B. (Obsérvese que este tipo de respuesta coincide con el obtenido con tetródos y Mostrado en la Figura 6C ). GRN 2, registrado con electrodos intracelulares afilados, muestra un patrón de respuesta más amplio. 
Figura 6: Resultados representativos de las grabaciones del nervio maxilar con tetródos extracelulares. ( A ) Se muestran trazas de voltaje filtradas (300-6.000 Hz) registradas por cada uno de los cuatro alambres en el nervio maxilar (panel del medio). Se aplicó un pulso de 1 s de saborizante durante el periodo de tiempo indicado por sombreado rojo en el panel central. El inicio y el desplazamiento del estímulo fueron monitorizados por el sensor de color como se indica por la traza de voltaje rojo en el panel superior, y se indica en el panel central por el área sombreada en rojo. Las líneas horizontales punteadas indican +50 (arriba), 0 (medio) y -50 (parte inferior) μV. Se muestra una ampliación de las trazas de voltaje bruto correspondientes al área dentro de las líneas punteadas verticales (panel inferior). Ejemplos de picos están indicados por las flechas. ( B ) Ejemplo de clasificación por punta aplicada a los datos mostrados en el panel A. Las formas de onda registradas en cada uno de los cuatro hilos extracelulares (1-4) arE identificado con tres GRN diferentes (unidades 1-3) que contribuyen a las señales grabadas. Se muestran eventos individuales (líneas finas coloreadas) y la media (línea negra gruesa) para las tres unidades. Hay que tener en cuenta una serie de criterios estadísticos para identificar con fiabilidad las unidades independientes utilizando el método de clasificación por punta (véanse las referencias 10 , 29 ). ( C ) Gráficos ráster que representan respuestas de las tres unidades aisladas a una secuencia de seis tastantes diferentes (se muestran 4 ensayos / saborizante). El periodo de tiempo de suministro de saborizante (1 s) se indica por el área sombreada en rojo. Las concentraciones de társidos fueron 1 M (sacarosa, maltosa, NaCl), 100 mM (cafeína) y 10 mM (berberina y lobelina). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Lass = "xfigimg" src = "/ files / ftp_upload / 55868 / 55868fig7.jpg" />
Figura 7 : Grabaciones intracelulares de los axones de GRN. ( A , panel de la caja verde) Trazas de voltaje registradas de un GRN con electrodos intracelulares de cristal afilado (resistencia de 80 - 120 MΩ) colocados en el nervio maxilar, provocados por 5 estímulos consecutivos con 1 M de sacarosa (Suc). ( B ) Gráficos ráster de las respuestas de dos GRNs, incluyendo las respuestas mostradas en el panel A (panel de caja verde), a dos tastantes diferentes entregados secuencialmente (color de fuente gris 100 mM, 1 M de color de fuente negro) registrados con electrodos intracelulares de vidrio afilado Colocado en el nervio maxilar (se muestran 7 ensayos / saborizante y 3 ensayos / agua). El tiempo de entrega de Tastant está indicado por zonas con sombra roja en ambos paneles. El inicio y el desplazamiento del estímulo fueron monitorizados por el sensor de color, como se indica por los trazos de voltaje rojo en la parte inferior de cada panel.Es / ftp_upload / 55868 / 55868fig7large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
Los métodos aquí descritos permiten las grabaciones in vivo de un animal relativamente simple, Manduca sexta , para caracterizar la actividad de GRNs múltiples seleccionados al azar durante largas duraciones (durante más de 2 h), antes, durante y después del parto de saborizante. Estos métodos también permiten la entrega rápida y secuencial de estímulos tastantes múltiples con control temporal preciso, ventajas que son útiles para estudiar los mecanismos neuronales subyacentes a la representación del saborizante. Este protocolo se ha utilizado para estudiar cómo las respuestas de GRNs a los tastants se transforman cuando se transmiten a sus neuronas objetivo postsinápticas ( por ejemplo, en la SEZ) mediante la monitorización de GRNs simultáneamente conectados monosinápticamente interneuronas [ 10] . Además, estos métodos pueden adaptarse a las necesidades del experimentador, permitiendo la ejecución de paradigmas complejos para estudiar aspectos fundamentales de la codificación gustativa.
Cuando empieceEn nuestros estudios, un problema técnico que a veces tuvimos que solucionar fue la incapacidad de detectar las señales de clavado del nervio maxilar con los cables del tetrodo. Las posibles causas de esto son diversas, ya que el protocolo de disección es un desafío, y alguna práctica es necesaria para obtener una buena preparación. En primer lugar, durante la disección de la polilla los nervios maxilares son fáciles de dañar, especialmente durante la eliminación de la envoltura que rodea el tejido nervioso. En segundo lugar, si la vaina no se retira completamente, los cables del tetrodo pueden no ser capaces de acceder al nervio. En ambos casos, comenzar una nueva preparación es a menudo la manera más fácil de resolver estos problemas. En tercer lugar, puede haber un problema con los cables de tetrodo. Esto se puede comprobar midiendo la impedancia de los alambres que debe ser ~ 270 kΩ en 1kHz. Si el valor de la impedancia es superior a 300 kΩ, aplique los hilos metálicos con oro para obtener la impedancia deseada (véase la referencia 30 ). En cuarto lugar, un equipo puede estar mal conectadoO mal comportamiento.
Otro posible problema es que se registran señales de picos, pero la (s) neurona (s) no responden a los tastantes. Esto podría ser debido a que las neuronas registradas son insensibles al conjunto de tastantes entregados. Además, es importante tener en cuenta que además de los axones de GRNs, el nervio maxilar también lleva fibras mecanosensoriales. Por lo tanto, es posible grabar de las neuronas mechanosensory en lugar de, o en adición a, GRNs. Sin embargo, el sistema de suministro de saborizante está diseñado para proporcionar un aporte mecánico constante a lo largo del experimento, haciendo improbable que las respuestas a un saborizante sean confundidas por las respuestas al componente mecánico de su suministro. Las neuronas que responden a algunos pero no a otros tastantes, o de diferentes maneras a diferentes tastantes, se pueden clasificar inequívocamente como GRNs. Recomendamos el uso de tostantes recién diluidos para evitar variaciones en la concentración o composición del saborizante debido a la degradación o evaporación del compuestoDel disolvente. También recomendamos limpiar el sistema con regularidad para evitar la contaminación del tubo y / o obstrucciones.
Otro posible problema técnico es una relación señal-ruido desventajosa. Este problema puede resolverse a menudo mediante la renovación o el ajuste de la posición del electrodo de tierra del baño. Otras soluciones pueden requerir blindaje y minimizar la longitud de cada conexión eléctrica en el aparato.
Por último, es importante señalar que el análisis correcto de los datos obtenidos mediante grabaciones de tetrodos requiere una cuidadosa clasificación por punta. Encontramos que los métodos completamente automatizados son generalmente inadecuados. Recomendamos familiarizarse con la literatura de clasificación de espigas antes de analizar los datos de tetrodo 10 , 29 , 31 , 32 , 33 .
Alternativas a nuestra disecciónTocol puede ser utilizado. Aquí se describe una disección a través de la parte ventral de la cabeza de la polilla, que proporciona acceso a los nervios maxilares y SEZ, pero también es posible acceder a estas estructuras por disección a través del lado dorsal. Encontramos que la preparación del lado dorsal no es óptima para hacer grabaciones de estas estructuras gustativas debido a su ubicación profunda, pero esta preparación ofrece la ventaja de permitir grabaciones de estructuras de orden superior, como el cuerpo de hongo, un área que ha sido asociada con multi - integración sensorial, aprendizaje asociativo y procesamiento de la memoria 34 . Nos hemos centrado en el uso de electrodos de tetrodo para grabar desde el nervio maxilar, pero, como hemos ilustrado, también se pueden utilizar electrodos afilados intracelulares estándar para este propósito. Además, ambas técnicas se pueden combinar para realizar grabaciones simultáneas de múltiples áreas cerebrales [ 10] . La literatura de neurociencia ofrece muchos ejemplos de iNvertebrados que han demostrado ser herramientas poderosas para revelar los principios fundamentales del procesamiento sensorial, como la codificación olfativa, que se aplican tanto a los insectos como a los vertebrados 35 , 36 , 37 , 38 , 39 . Esperamos que nuestros métodos lleven a nuevos conocimientos fundamentales sobre la codificación gustativa.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por una subvención intramural de NIH-NICHD a MS Agradecemos a G. Dold y T. Talbot de la NIH-NIMH Instrumentation Core Facility para la asistencia con el diseño del sistema de suministro de saborizante.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection and Specimen Preparation | |||
| Polypropylene tube, 15 mL Falcon | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Needle, Short bevel, 19 G x 1 - 1/2" | MONOJET | 888200144 | For applying air to remove the hair from the moth. |
| Modeling Clay-Van Aken Plastalina | DickBlick | 33268 | |
| Petri dish -100 x 15 mm | VWR International | 89000-304 | |
| Pipette tip (1 - 200 µL) | USA Scientific | 1111-0806 | |
| Razor blade | Techni Edge | TE05-071 | |
| 22 AWG standard hookup wire | AlphaWire | 1551 | For inserting the proboscis into the pippete tip. |
| Batik wax | Jacquard | 7946000 | |
| Electric waxer | Almore International | 66000 | |
| Stereo Myscroscope | Leica | MZ75 | |
| Dumont #1 forceps (coarse) | World Precision Instruments | 500335 | For removing fat and non-nervous tissue. |
| Dumont #5 titanium forceps (fine) | World Precision Instruments | 14096 | For removing fat and non-nervous tissue. |
| Dumont #5SF forceps (super-fine) | World Precision Instruments | 500085 | For desheathing the nervous tissue. |
| Vannas scissors (fine) | World Precision Instruments | 500086 | For removing the cuticle. |
| Collagenase/Dispase | Sigma-Aldrich | 11097113001 | |
| Epoxy | Permatex | 84101 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline Perfusion System | |||
| Extension set with rate flow regulator | B Braun Medical Inc. | V5200 | |
| IV administration set with Y injection site | B Braun Medical Inc. | V1402 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tastant Delivery System | |||
| White Translucent Nylon Tubing OD 1/4", ID 1/8" | Small Parts Inc. | B001JJT4SA | Rigid tube that connects the four main elements of the system. |
| Soldering iron | Circuit Specialists | ZD200BK | |
| Rotary tool-Dremel | Dremel | 4200 | |
| Polypropylene mesh, hole size (hole size 0.1 x 0.13 cm) | Industrial Netting | XN5170 | For ensuring that the probosises of different animals are placed in the same location. |
| Pressurized 16-Channel perfusion system | Bioscience Tools | PS-16H | For tastant delivery. This system includes pinch valves, tubing, manifold, solution cylinders, valve controller and fitting accessories. |
| Polypropylene tubing, ID 0.034", ID 0.050" | Becton, Dickinson & Co | 427421 | Output tube from the perfusion system. |
| Pneumatic PicoPump | World Precision Instruments | SYS-PV820 | For controlling the output channel of the perfusion system. |
| Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card | National Instruments | LabVIEW 2011 | To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor. |
| Compulab 3 Manostat peristaltic pump | Sigma | P1366 | For pumping water. |
| Silicone tubing, ID 1/16" OD 1/8" | Cole-Parmer | WU-95802-02 | To connect the water source to the peristaltic pump tubing, and the outlet tube of the pump to the rigid tube of the delivery system. |
| Color sensor-digital fiber optic sensor | Keyence | FS-V31M | For monitoring tastant delivery. |
| Color sensor-reflective fiber unit | Keyence | FU35-FZ | To connect the color sensor device. |
| Dental periphery Wax | Henry-Schein Dental | 6652151 | To secure the proboscis into the rigid tube. |
| Two 3.7 L containers | To provide water to the system, and to recollect the water waste. | ||
| Fast green FCF | Sigma | F7258 | |
| Dressing forceps 25.5 cm | WPI | 500364 | To introduce moth proboscis into the proboscis hole in the rigid tube. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Electrophysiology Equipment | |||
| D.C. amplifier | Brown-Lee | 440 | |
| Lamp | Schott | Schott Fostec Light Source DCR 2 | |
| Manual micromanipulator | Leica | micromanipulator | To precisely insert the tetrodes into the animal's brain. The manipulator has to allow fine and coarse movements in x, y and z axis. |
| Stereomicroscope | Leica | MZ75 | |
| Vibration-isolation table (MICRO-g lab table) | TMC | 63-541 | |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2014 | |
| 16-channle pre-amplifier and amplifier | 16 Channel MA-800 Amplifier System | B.E.S 2013 | |
| Computer | Dell | optiplex 780 | The following are the minimum recommended requirements. RAM: 3.32 GHz, 3GB. Processor: Intel Core 2 Duo. Graphic card: integrated Intel GMA X4500. |
| Data acquisition software system, LabVIEW PCI-MIO-16E-4 DAQ card | National Instruments | LabVIEW 2011 | To control the pico pump for tastant delivery and to record the signals from the color sensor and electrode. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tastants | |||
| KAc | Sigma-Aldrich | P5708 | |
| LiCl | Sigma-Aldrich | L9650 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 73575 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 |
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