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Biology

गैप जंक्शन-आश्रित का विश्लेषण 3 डी-फ्रेप माइक्रोस्कोपी के साथ miRNA का स्थानांतरण

Published: June 19, 2017 doi: 10.3791/55870
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), 2Department of Cardiac Surgery, University of Rostock, 3Department of Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty, University of Rostock

Summary

यहां, हम मेरियन आरएनए के अंतराल जंक्शन-आधारित शटलिंग के विश्लेषण के लिए फोटोबलीचिंग (3 डी-एफआरएपी) के बाद त्रि-आयामी प्रतिदीप्ति वसूली के आवेदन का वर्णन करते हैं। आमतौर पर लागू किए जाने वाले तरीकों के विपरीत, 3D-FRAP, वास्तविक समय में छोटे आरएनए के अंतरण हस्तांतरण की मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है, जिसमें उच्च स्थान-अस्थायी संकल्प शामिल हैं।

Abstract

सेलुलर फिजियोलॉजी और पैथोलॉजी में एक छोटी सी एंटीसेन्स आरएनए, जैसे एमआईआरएनए और सीआरएनए, एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, इसके अलावा, कई रोगों के उपचार में चिकित्सीय एजेंटों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। MiRNA / siRNA चिकित्सा के लिए नई, अभिनव रणनीतियों का विकास अंतर्निहित तंत्रों के व्यापक ज्ञान पर आधारित है। हाल के आंकड़ों से पता चलता है कि छोटे आरएनए एक अंतर जंक्शन-निर्भर तरीके से कोशिकाओं के बीच आदान-प्रदान किया जाता है, जिससे प्राप्तकर्ता सेल में जीन नियामक प्रभाव उत्पन्न होता है। आणविक जैविक तकनीकों और प्रवाह साइटेमेट्रिक विश्लेषण आमतौर पर miRNA के अंतःविषय विनिमय का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है। हालांकि, इन तरीकों से उच्च अस्थायी संकल्प नहीं मिलता है, जो आवश्यक है जब अणुओं के अंतराल जंक्शन प्रवाह का अध्ययन करते हैं। इसलिए, miRNA / siRNA के प्रभाव को जांचने के लिए कोशिकीय संकेतन अणुओं के रूप में, उपन्यास उपकरण आवश्यक हैं जो सेलुलर स्तर पर इन छोटे आरएनए के विश्लेषण के लिए अनुमति देगा। वर्तमान प्रोटोकॉल एपी का वर्णन करता हैहृदय कोशिकाओं के बीच miRNA अणुओं के अंतराल जंक्शन-आश्रित विनिमय को स्पष्ट करने के लिए फोटोबलीचिंग (3 डी-एफआरएपी) माइक्रोस्कोपी के बाद तीन-आयामी प्रतिदीप्ति वसूली का संकल्प महत्वपूर्ण बात यह है कि इस सीधी और गैर-इनवेसिव लाइव-सेल इमेजिंग दृष्टिकोण वास्तविक समय में फ्लोरोसेंटली लेबल वाले छोटे आरएनए के अंतराल को जोड़ते हुए दृश्यमान और मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है, उच्च स्थान-अस्थायी संकल्प के साथ। 3D-FRAP द्वारा प्राप्त आंकड़ों में अंतरण जीन विनियमन के एक नये मार्ग की पुष्टि होती है, जहां छोटे आरएनए कोशिकीय नेटवर्क के भीतर संकेत अणुओं के रूप में कार्य करते हैं।

Introduction

सेलुलर जीन विनियमन में छोटे गैर-कोडिंग आरएनए महत्वपूर्ण खिलाड़ी हैं। ये अणु 20-25 न्युक्लिओटिड्स से बना होते हैं जो एक विशिष्ट लक्ष्य एमआरएनए से जुड़े होते हैं, जिससे अनुवाद की रुकावट या एमआरएनए विघटन 1 , 2 हो । छोटे आरएनए, जैसे कि miRNA और सीआरएनए द्वारा जीन विनियामक प्रक्रिया, एक बहुत ही संरक्षित तंत्र है जो कई अलग-अलग प्रजातियों में पाया गया है 3 विशेष रूप से, प्रसार, भेदभाव और पुनर्जन्म 4 , 5 सहित विभिन्न प्रकार की शारीरिक प्रक्रियाओं के लिए miRNA अणु महत्वपूर्ण महत्व के हैं। इसके अलावा, miRNA अभिव्यक्ति के dysregulation कई रोग विकारों के लिए जिम्मेदार है। इसी प्रकार, miRNA को रोग निदान के लिए बायोमार्कर के रूप में और जीन थेरेपी 6 , 7 के लिए चिकित्सीय एजेंट के रूप में उपयुक्त माना गया है

गैप जंक्शन (जीजे) दो आसन्न कोशिकाओं के प्लाज्मा झिल्ली में विशेष प्रोटीन संरचनाएं हैं जो 1 केडी तक के आणविक भार वाले अणुओं के विलय का आदान-प्रदान करते हैं। वे ऊतक के विकास, भेदभाव, सेल की मृत्यु और कैंसर या हृदय रोग 8 , 9 , 10 जैसे रोग विकारों के लिए महत्वपूर्ण साबित हुए हैं। कई अणुओं को जीजे चैनलों को पार करने में सक्षम होने के रूप में वर्णित किया गया है, जिसमें आयन, चयापचयों, और न्यूक्लियोटाइड शामिल हैं। दिलचस्प बात यह है कि, जीजे भी छोटे आरएनए 11 , 12 के द्विपक्षीय आंदोलन के लिए एक मार्ग प्रदान करने के लिए मिले थे। इस प्रकार, miRNA केवल उस कक्ष के भीतर ही कार्य कर सकते हैं जिसमें वे उत्पन्न होते हैं, लेकिन प्राप्तकर्ता कोशिकाओं के भीतर भी। यह इंटरसेल्युलर सिग्नल ट्रांसडक्शन सिस्टम में miRNA की भूमिका को रेखांकित करता है। उसी समय, डेटा का प्रदर्शन होता हैउस अंतराल के जंक्शन जंक्शन से संप्रेषक संचार को मीरएनए समारोह से निकट से जुड़ा हुआ है। टिशू होमोस्टेसिस, पैथोलॉजी, और निदान पर miRNA और जीजे के महत्वपूर्ण प्रभाव की वजह से, जीजे के कार्य की व्यापक समझ और miRNA की संबंधित गतिवर्ती गति को miRNA- आधारित रोगों के तंत्रों को स्पष्ट करने और नई रणनीति विकसित करने में मदद मिलेगी MiRNA चिकित्सा

अंतराल जंक्शन जंक्शन के आधार पर, कोशिकाओं के बीच miRNA अणुओं का स्थानांतरण एक बहुत तेजी से प्रक्रिया हो सकता है। इसलिए, एक पद्धति जो इन नियामक संकेतों के अणुओं के त्वरित मध्यवर्ती आंदोलन के दृश्य और मात्रा का ठहराव की अनुमति देती है। आम तौर पर, छोटे आरएनए 11 , 12 , 13 , 14 की शटलिंग को प्रदर्शित करने के लिए प्रवाह कोशिकामितीय और आणविक जैविक तकनीकों को लागू किया गया है। हालांकि, FRAP माइक्रोज़ के विपरीतप्रतिलिपि, इन तरीकों के उच्च अस्थायी संकल्प की कमी है, जो जीजे के माध्यम से miRNA के आदान-प्रदान का विश्लेषण करते समय अनिवार्य है। इसके अलावा, FRAP माइक्रोस्कोपी कम आक्रामक है और इसलिए कई सेल प्रकार 15 , 16 , 17 में अणुओं के जीजे-आश्रित विनिमय का मूल्यांकन करने के लिए एक शक्तिशाली और उपन्यास लाइव-सेल इमेजिंग तकनीक का प्रतिनिधित्व करता है।

यहां, हम कार्डियोयोमोसाइट्स के बीच miRNA शटलिंग का मूल्यांकन करने के लिए 3D-FRAP के आवेदन का विस्तृत वर्णन करते हुए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इस प्रयोजन के लिए, कार्डियोयोमोसाइट्स fluorescently लेबल miRNA के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे इस miRNA के साथ चिह्नित एक सेल को फोटोब्लिच किया गया था, और आसन्न कोशिकाओं से अंतर जंक्शन रिहायर्न्जियल miRNA एक समय-निर्भर तरीके से दर्ज किया गया था। एफआरएपी प्रयोगों के उच्च अस्थायी संकल्प से जीवित कोशिकाओं के बीच miRNA और siRNA के अंतरण हस्तांतरण के सटीक मूल्यांकन के लिए गतिज अध्ययन करने की संभावना प्रदान की जाती है। Moreoदेखें, चूंकि छोटे आरएनए को अलग-अलग कैनेटीक्स के साथ अलग-अलग तंत्रों के माध्यम से विमर्श किया जा सकता है, FRAP माइक्रोस्कोपी इस बात को स्पष्ट करने में मदद कर सकता है कि जीजे किस प्रकार संबंधित शटलिंग प्रक्रियाओं में शामिल हैं 18 । इसके अलावा, जीजे पारगम्यता में शारीरिक और रोग परिवर्तनों की जांच के लिए 3 डी-एफआरएपी का इस्तेमाल किया जा सकता है और छोटे आरएनए ट्रांसफर 15 , 1 9 पर इसका असर।

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Protocol

रोस्टॉक यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर के जानवरों के देखभाल के लिए नैतिक दिशानिर्देशों के अनुसार, इस प्रोटोकॉल में नवजात चूहों को शामिल किया गया था।

1. सेल कल्चर डिश की तैयारी और कार्डियोमायोसाइट संस्कृति के लिए माध्यम

  1. पीबीएस में 0.1% जिलेटिन के साथ एक कोशिका संस्कृति प्लेट को कोट करें और 37 डिग्री सेल्सियस के लिए 4 घंटे या 4 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात रखें। जिलेटिन निकालें और इसे बाँझ लामिना वायु प्रवाह के नीचे सूखने की अनुमति दें।
  2. डीएमईएम के 50 एमएल के 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस) के साथ सेल संस्कृति माध्यम तैयार करें। 37 डिग्री सेल्सियस से पहले इसे गरम करें

2. नवजात Cardiomyocytes के अलगाव

  1. बाँझ कैंची के साथ शिरच्छेद करके नवजात शिशु (1-2 दिन पुराने) बलिदान और छाती के साथ छाती को खोलें। संदंश का उपयोग करते हुए दिल को निकालना जबकि थोड़ा छाती को एक साथ दबाने पर और हृदय को 24-अच्छी तरह से प्लेट में रखकर बर्फ-ठंडे एचबीएसएस युक्त(सीए 2+ और एमजी 2+ के बिना)
  2. बाँझ संदंश का उपयोग कर गैर-कार्डियाक ऊतक और बड़े जहाजों को निकालें बर्फ के ठंडे एचबीएसएस युक्त 1.5 एमएल ट्यूब में दिल को साफ करें। एंजाइमीय पाचन के लिए प्रति ट्यूब अधिकतम 5 दिल का प्रयोग करें।
  3. छोटी सी कैंची के साथ दिमाग को 0.5 से 1 मिमी टुकड़ों तक छोडो।
  4. 1 एमएल माइक्रोलिपर पिपेट का उपयोग करके एचबीएसएस की आकांक्षा / इसके अतिरिक्त एचबीएसएस के साथ कमजोर दिल को धो लें। एंजाइम जोड़ने से पहले पूरी तरह से एचबीएसएस निकालें।
  5. नवजात दिलों के एंजाइमिक पाचन के लिए, एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग करें और निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें (सामग्री की तालिका देखें) 37 डिग्री सेल्सियस पर 35 मिनट एंजाइम्स के साथ incubating जबकि हर 5 मिनट कीमा बनाया हुआ दिल युक्त ट्यूब शेक
  6. नॉन-लेक्टीड सेल कल्चर व्यंजन पर सेल निलंबित कोशिकाओं जिसमें 1.5-2 घंटे के लिए सेल कल्चर मिडिया शामिल है, गैर-कार्डियोयोमायसाइट अंश के अनुपालन की अनुमति देना। एक उच्च शुद्धता अगर इस चरण को दोहराएंकार्डियोमायोसाइट्स की आवश्यकता है। अगर वांछित, आगे की संस्कृति गैर कार्डियोमायसाइट अंश
    नोट: 15 दिल के सेल निलंबन के लिए, पूर्व-चढ़ाना कदम 75 सेमी ² सेल संस्कृति फ्लास्क पर किया जा सकता है। आमतौर पर, ~ 5 x 10 5 कोशिकाएं एक नवजात हृदय से प्राप्त होती हैं।
  7. सतह पर तैरने वाले को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब और 300 मिनट में 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र में ले लीजिए कोशिका संस्कृति माध्यम के 1 एमएल में कोशिकाओं को फिर से खोलें
  8. एक Neubauer चेंबर हेमोसाइटोमीटर के साथ कोशिकाओं की गणना करें, या एक समान विधि का उपयोग करें।
  9. प्लेट 3 एक्स 10 5 कोशिकाओं / सेमी ² के घनत्व के साथ 6 अच्छी तरह प्लेटों पर अलग कार्डियओमायसाइट्स। 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 में रात भर सेते हैं।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, इस बिंदु पर कोशिकाओं को भी ट्रांसफ़ेक्ट किया जा सकता है हालांकि, इलेक्ट्रोपायर के अधीन होने से पहले एक दिन के लिए कोशिकाओं को सुसंस्कृत किया गया था जब वृद्धि की व्यवहार्यता देखी गई थी।

फ्लोरोसेंटली लेबल वाले miRNA के साथ अभिकर्मक

  1. के पूर्ववाटर सेल संस्कृति माध्यम (चरण 1.2 देखें) से 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान या समकक्ष डिवाइस में।
  2. RNase- मुक्त बाँझ पानी में फ्लोरोसेंट miRNA के 20 सुक्ष्ममापी स्टॉक समाधान तैयार करें।
  3. 90 एमएम ना 2 एचपीओ 4 , 90 एमएम एनएएच 2 पीओ 4 , 5 एमएम केएलएल, 10 एमएम एमजीसीएल 2 , और 10 एमएम सोडियम सीसीटीक युक्त पीएचएच को समायोजित करने के लिए इलेक्ट्रॉफ़ोरेज बफर तैयार करें; इलेक्ट्रोफ़ोरेशन बफर कई महीनों तक -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  4. 5 मिनट के लिए 0.05% ट्रिप्सिन का उपयोग करके संस्कृति पकवान से कोशिकाओं को अलग करें सेल संस्कृति माध्यम जोड़कर ट्रिप्सिन को निष्क्रिय करें
  5. एक Neubauer चेंबर हेमोसाइटोमीटर के साथ कोशिकाओं की गणना करें, या एक समान विधि का उपयोग करें। 10 मिनट के लिए 300 xg में कोशिकाओं को अपकेंद्रित्र
  6. प्रति 100 μL प्रति 4 x 10 5 कोशिकाओं की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए इलेक्ट्रोप्लोरेशन बफर में कोशिकाओं को फिर से खोलें।
  7. एक ट्यूब में फ्लोरोसेंट miRNA (अंतिम एकाग्रता: 0.25 माइक्रोन) के साथ सेल निलंबन के 100 μL मिलाएं औरएक इलेक्ट्रोपायर क्यूवेट में मिश्रण लोड करें।
    1. सेल प्रकार पर निर्भर करता है, एमआरएनए की उचित मात्रा का अनुभव।
  8. "जी -09 9 " प्रोग्राम का उपयोग करके एक इलेक्ट्रोपायरेशन डिवाइस (सामग्री की सारणी देखें) का उपयोग करके इलेक्ट्रोपायर का प्रदर्शन करें।
  9. पूर्व गर्म सेल संस्कृति माध्यम के 500 μL जोड़ें और पूरे सेल निलंबन (4 x 10 5 कोशिकाओं) को 4-अच्छी तरह से ग्लास-नीचे चैंबर स्लाइड के एक कन्फेक्शन में स्थानांतरित करें। संस्कृति 5 दिन सीओ 2 वायुमंडल में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 दिन के लिए कोशिकाओं।
    नोट: FRAP विश्लेषण के लिए, ~ 80% की एक सेल घनत्व इष्टतम है। लेबल वाले miRNA के अभिकर्मक को विशेष रूप से इलेक्ट्रोपायरन का उपयोग करने के लिए किया जाना चाहिए। चूंकि लेबल वाले miRNA अणुओं के समरूप वितरण FRAP माप के लिए फायदेमंद है, अभिकर्मक-आधारित अभिकर्मक की सिफारिश नहीं की जाती है।

4. 3 डी-एफआरपी माइक्रोस्कोपी आवेदन (3 दिन)

  1. माइक्रोस्कोप इनक्यूबेटर को 37 डिग्री तक गर्म करें; सी और एफओपी मापन से कम से कम 2 घंटे confocal सूक्ष्मदर्शी प्रणाली पर स्विच एक थर्मल संतुलन स्थापित करने के लिए और बहाव की संभावना कम करने के लिए। यदि संभव हो तो, 5% सीओ 2 वायुमंडल बनाए रखें।
  2. मंच नमूना धारक में कक्ष स्लाइड डालें।
  3. 570-680 एनएम की एक पहचान सीमा के साथ, 1.4 लीटर तेल उद्देश्य (400 एक्स बढ़ाई) और कम लेजर पावर पर 561-एनएम लेजर उत्तेजना प्रकाश का उपयोग करके ट्रांसफ़ेक्ट कार्डियोमोओसाइट्स के क्लस्टर का पता लगाएं।
    नोट: एफआरपी सेटिंग्स की परिभाषा, छवि अधिग्रहण, और विश्लेषण माइक्रोस्कोप-विशिष्ट सॉफ्टवेयर (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग किया गया था।
  4. "सेटअप प्रबंधक" में "ज़-स्टैक," "टाइम सीरीज़," "ब्लिचिंग," और "क्षेत्र" बटन सक्रिय करें।
  5. FRAP मापदंडों को परिभाषित करें
    1. "अधिग्रहण विधि" मेनू में छवि अधिग्रहण सेटिंग्स को परिभाषित करें "फ्रेम आकार"4; 512 x 512 के लिए, 1 से "रेखा चरण" और <1 सेकंड के लिए "स्कैन समय"
    2. "चैनल" मेनू में, न्यूनतम लेजर उत्तेजना से अधिकतम प्रतिदीप्ति प्राप्त करने के लिए लेजर पावर, ऑफसेट, और सेटिंग्स प्राप्त करना ( जैसे, लेजर पावर: 1-5%); तीव्रता संतृप्ति से बचने के लिए समायोजित करें "पिनहोल आकार" को 2 माइक्रोन तक सेट करें
    3. अगला, "क्षेत्र" मेनू में, "ROI ड्राइंग टूल" चुनें और लक्ष्य सेल, संदर्भ कक्ष और पृष्ठभूमि क्षेत्र को चिह्नित करने के लिए कर्सर का उपयोग करें। यदि आवश्यक हो, तो फोटोबलीचिंग के लिए कई लक्ष्य कोशिकाओं का चयन करें।
    4. "ब्लीचिंग" मेनू में फोटोबलीचिंग सेटिंग समायोजित करें ( जैसे, पुनरावृत्त: 9-14, फोटोबलीचिंग के लिए लेजर शक्ति: 100%, छवि अधिग्रहण का अंतराल: 60 एस, चक्र: 15)। 3 प्रारंभिक स्कैन के बाद विरंजन की शुरुआत को परिभाषित करें।
    5. "ज़-स्टैक" मेनू में, कोशिकाओं की मोटाई के आधार पर, z- स्टैक अधिग्रहण की सीमा निर्धारित करें। "संख्या ओ समायोजित करेंच जेड-परतें "से 12 - 15
    6. एफएआरपी प्रयोग शुरू करें और प्रतिदीप्ति वसूली रिकॉर्ड करें
      नोट: चूंकि एक FRAP प्रयोग की सेटिंग्स सेल प्रकार, फ्लोरोसेंट डाई और माइक्रोस्कोप सिस्टम पर निर्भर करती है, इसलिए FRAP के लिए इष्टतम पैरामीटर निर्धारित करने के लिए पायलट प्रयोग करना सर्वोत्तम है। प्रारंभिक प्रतिदीप्ति तीव्रता को कम से कम 50% कम करने के लिए विरंजन पर्याप्त होना चाहिए। आमतौर पर, हर 30-60 सेकंड तक प्रतिदीप्ति वसूली दर्ज की जानी चाहिए, जब तक कि पठार चरण तक नहीं पहुंचा जा सकता है।

5. डेटा विश्लेषण

  1. अधिग्रहीत जेड स्टैक के अधिकतम अनुमान तैयार करें और प्रक्षालित लक्ष्य कोशिकाओं, संदर्भ कक्ष, और पृष्ठभूमि के प्रतिदीप्ति तीव्रता मान प्राप्त करें। माइक्रोस्कोप-विशिष्ट सॉफ़्टवेयर का उपयोग करना, "प्रसंस्करण" → "अधिकतम तीव्रता प्रक्षेपण" पर क्लिक करें → फ़ाइल चुनें → "लागू करें"।
    1. वैकल्पिक रूप से, समतुल्य छवि विश्लेषण उपकरण का उपयोग करें (
  2. प्रतिलिपि तीव्रता डेटा की प्रतिलिपि लक्ष्य सेल, पृष्ठभूमि, और संदर्भ कक्ष से सभी समय बिंदुओं पर स्प्रेडशीट में कॉपी करें।
    1. अधिग्रहण प्रक्रिया के दौरान फोटोबलिंग के लिए सही लक्ष्य सेल के तीव्रता मूल्यों से पृष्ठभूमि की तीव्रता और संदर्भ कक्ष की तीव्रता घटाएं। प्रत्येक समय बिंदु के लिए पृष्ठभूमि और संदर्भ सेल सुधार करें।
    2. प्रारंभिक प्रतिदीप्ति द्वारा प्रत्येक मूल्य को विभाजित करके विरंजन से पहले प्रारंभिक प्रतिदीप्ति तीव्रता के लिए सही FRAP डेटा को सामान्य करें।
    3. FRAP घटता प्राप्त करने के लिए, प्रत्येक समय बिंदु के तीव्रता मूल्यों से घटाकर ब्लीच के तुरंत बाद प्रतिदीप्ति तीव्रता के लिए आधार रेखा सेट करें।

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Representative Results

यहां, हम 3 डी-फ्रेप माइक्रोस्कोपी को नवजात शिष्ट-हृदय कार्डियेट्स के भीतर फ्लोरोसेंट मीरएनए के अंतराल जंक्शन-शटलिंग के अध्ययन के लिए गैर-इनवेसिव तकनीक के रूप में पेश करते हैं। अलग-अलग कार्डियोमोओसाइट्स ने ठेठ धारीदार α-एक्टिनिन पैटर्न का पता लगाया और सेल-सेल बॉर्डर्स ( चित्रा 1 ए , व्हाइट एरोहेड) के साथ सीएक्स 43 के बड़े सजीले टुकड़े निहित हैं, जो अणुओं के उच्च मध्यवर्ती प्रवाह के लिए अनुमति देते हैं। पृथक कार्डियोमोओसाइट्स की शुद्धता को α-एक्टिनिन-पॉजिटिव कोशिकाओं के सूक्ष्म मात्रा में मात्रा के आधार पर मूल्यांकन किया गया था। हालांकि कुछ गैर कार्डिओयोमायसाइट्स (α-एक्टिनिन-नकारात्मक कोशिकाएं) संस्कृति में मौजूद थीं, नवजात कार्डियोमोसाइटोइट अलगाव (79.62 ± 3.68%; चित्रा 1 बी ) के बाद प्रमुख सेल प्रकार का प्रतिनिधित्व करते हैं।

MiRNA के अंतर जंक्शन एक्सचेंज की जांच के लिए, कोशिकाओं को फ्लोरोसेंटली लेबल वाले miRNA के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। हाथीCtroporation कोशिकाओं को miRNA अणुओं को देने के लिए पसंद की विधि है, क्योंकि यह उच्च अभिकर्मक दक्षता और ट्रांसफ़ेक्ट यौगिकों के समरूप वितरण सुनिश्चित करता है, जो कि FRAP विश्लेषण के लिए अनिवार्य है। हमारे प्रयोगात्मक सेटअप में, हमने ~ 45% की अभिकर्मक क्षमता हासिल की, जैसा कि प्रवाह साइटोमेट्री ( चित्रा 2 ए ) द्वारा निर्धारित किया गया था। एफआरएपी के लिए कार्डियोमोसाइट्स की तैयारी संस्कृति प्लेट, इलेक्ट्रोप्रोरेज, और चैम्बर स्लाइड्स पर पुन: अटैचमेंट से अलग-थलग होती है। एक फ्लो साइटेमेट्रिक लाइव / डेड परख से पता चला है कि अधिकांश कोशिकाओं ने उच्च व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया है, जो अंतर जंक्शन संचार संबंधी विश्लेषण ( चित्रा 2 बी ) का विश्लेषण करते समय महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, सेल घनत्व एक महत्वपूर्ण पैरामीटर है जो FRAP परिणाम को प्रभावित करता है। इष्टतम FRAP माप के लिए, कोशिकाओं को सेल क्लस्टर्स के गठन और कोशिकाओं के बीच कार्यात्मक अंतर जंक्शनों की स्थापना के लिए ~ 80% की घनत्व के साथ वरीयता दी जानी चाहिए ( चित्रा2 सी)

FRAP विश्लेषण के लिए, लक्ष्य कोशिकाओं को एक सेल क्लस्टर के भीतर चुना जाता है और 100% लेजर पावर के साथ फोटोब्लैच किया जाता है, जिससे चयनित कोशिकाओं ( चित्रा 3 ए , ब्लीच) में कम miRNA प्रतिदीप्ति बढ़ जाता है। इसके बाद, प्रक्षालित कोशिकाओं से प्रक्षालित क्षेत्र में miRNA के हस्तांतरण की कल्पना करने के लिए प्रतिदीप्ति वसूली दर्ज की गई है। चूंकि 13 मिनट के बाद प्रतिदीप्ति वसूली के पठार चरण पर पहुंच गया था, इसलिए इस समय अवधि का उपयोग एफआरएपी प्रयोगों में छवि अधिग्रहण के लिए किया गया था। परिमाणित आंकड़ों के मात्रात्मक विश्लेषण और सामान्यकरण ने 20% की औसत वसूली दिखायी। आंकड़ों से यह भी पता चला है कि एफआरएपी माइक्रोस्कोपी उच्च अस्थायी संकल्प के साथ मीरएनएनए की तेजी से रिकॉर्डिंग की अनुमति देता है। डाई गुणों के आधार पर, अधिग्रहण मापदंडों को अस्थायी संकल्प को और बढ़ाने के लिए बदला जा सकता है।

3D-FRAP का उपयोग करने में सक्षम बनाता हैविभिन्न स्थितियों के तहत जीएम पारगम्यता की तुलना में miRNA की तुलना। इसे प्रदर्शित करने के लिए, हमने सीएक्स 43 की सीआरएनए-मध्यस्थता वाली पछाड़ना प्रेरित किया, जिससे कम प्रोटीन अभिव्यक्ति ( चित्रा -3 सी ) और अंतराल जंक्शन संचार संबंधी अवरोध का कारण हो गया। नतीजतन, प्रतिदीप्ति वसूली 50% से अधिक कम हो जाती है, यह दर्शाता है कि miRNA स्थानांतरण की दक्षता कोशिकाओं ( चित्रा 3 बी , सीएक्स 43 पछाड़ना) के बीच अंतराल जंक्शन जंक्शन के आधार पर जोरदार निर्भर है। पुष्टि करने के लिए कि प्रतिदीप्ति वसूली, अलग डीवाय 547-टैग की बजाय फ्लोरोसेंटली लेबल वाले miRNA के पारित होने को दर्शाती है, हमने कैल्सेन डाई ( चित्रा 3 डी ) के लिए FRAP डेटा भी हासिल कर लिया है। कैलेसिन में डीयू 547 की तुलना में एक आणविक भार है और इस प्रकार इस तरह की ट्रांसफर गतिशीलता होती है। डीआई 547-लेबिल किए गए miRNA की प्रतिदीप्ति वसूली के विपरीत, कैल्सेन ने वृद्धि हुई अंतर जंक्शन एक्सचेंज का प्रदर्शन किया, यह दर्शाता है कि Dy547 टैग IMiRNA अणु ( चित्रा 3 डी ) से अलग नहीं है।

एक FRAP प्रयोग के दौरान स्थिर फोकस स्थितियां अनिवार्य हैं, खासकर जब दीर्घ-अवधि का माप किया जाता है। 2 डी अनुप्रयोगों की तुलना में, 3 डी-एफआरएपी संभावित फ़ोकस बहाव के लिए क्षतिपूर्ति कर सकता है जैसा कि चित्रा 4 में दिखाया गया है, यहां तक ​​कि मामूली फोकस में बदलाव miRNA के प्रतिदीप्ति संकेत के उचित पता को प्रभावित करते हैं जब FRAP प्रयोग ( चित्रा 4 बी ) के लिए केवल एक ही 2 डी परत का उपयोग किया जाता है। इसके विपरीत, 3D-FRAP के लिए, लक्षित सेल का एक संपूर्ण z स्टैक रिकॉर्ड किया जाता है, और अधिकतम अनुमान डेटा विश्लेषण ( चित्रा 4 ए ) के अधीन हैं। सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति-तीव्रता घटता पर फोकस प्रवाह का प्रभाव चित्र 4 सी में दर्शाया गया है। जबकि प्रतिदीप्ति वसूली समय-समय पर तेजी से 3 डी-फ्रेड में बढ़ जाती है, 2 डी-एफआरपी अधिग्रहण के परिणामों में गिरावट आई हैएफ प्रतिदीप्ति संकेत

फ़ोकस बदलावों के मुआवजे के अलावा, 3 डी-एफआरएपी भी आईआरएनए के अंतराल जंक्शन जंक्शन के स्थानिक डेटा प्रदान करता है। चित्रा 5 में एफएआरपी प्रयोग की एक 3D सतह का पता चलता है। अधिकतम अनुमानों के मुकाबले, जेड-स्टैक के अधिग्रहण को सेल्योरिकेशन और कोशिकाओं के भीतर miRNA की गतिशीलता की जांच के लिए 3 डी पुनर्निर्माण बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ( चित्रा 5 )। ऑर्गेनेल के साथ सह-लेबलिंग, miRNA स्थानांतरण में अन्य सेलुलर घटकों की भागीदारी की जांच करने की अनुमति देगा।

आकृति 1
चित्रा 1: अलग-अलग नवजात कार्डियोमायोसाइट्स के प्रतिनिधि सूक्ष्म छवियाँ ( ए ) संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी सीएक्स 43 की उच्च अभिव्यक्ति दर्शाती है, जो बड़े पी में जमा होती हैसेल-सेल बॉर्डर्स (एरोहेड्स) पर लैक्स आसन्न कोशिकाओं के साथ जीजे का स्पष्ट गठन, miRNA सहित छोटे अणुओं का व्यापक आदान प्रदान करता है स्केल बार = 20 माइक्रोन ( बी ) पृथक कार्डियोयोमोओसाइट्स की शुद्धता Α-actinin लेबलिंग दर्शाता है कि अलगाव के बाद कार्डियोमोसाइट्स प्रमुख सेल प्रकार का प्रतिनिधित्व करते हैं। स्केल बार = 50 माइक्रोन कोशिकाओं को विरोधी-सीएक्स 43 (हरा) और एंटी-एना-एक्टिनिन एंटीबॉडी (लाल) के साथ दाग गया। नाभिक डीएपीआई (नीला) का उपयोग करके दृश्यमान थे। संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी का विवरण और प्रतिरक्षाविज्ञान लेबलिंग पिछले प्रकाशनों में प्रदान की गई है 20 इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2: अभिकर्मक दक्षता, व्यवहार्यता , और नवजात कार्डियोमायोसाइट संस्कृति के सेल घनत्व। ( ए ) फ्लो साइटैटमेट्री ने बताया कि miR547 इलेक्ट्रोप्लॉशन के परिणामस्वरूप ~ 45% की अभिकर्मक क्षमता ( बी ) एफआरएपी के लिए इस्तेमाल कार्डिय्योमोसाइट्स की सेल व्यवहार्यता अलगाव, इलेक्ट्रोपोरेशन और रीटैक्टमेंट के बाद, कार्डिओयोमायसाइट्स को जीवित और मृत सेल स्नेगिंग के अधीन किया गया और उच्च सेल व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया। ( सी ) एफआरपी माइक्रोस्कोपी के लिए तैयार मीर 547-ट्रांसफ़ेक्ट कार्डियोयोमोसाइट्स की सूक्ष्म छवि। 80-90% की एक सेल घनत्व अंतर जंक्शन जंक्शन जंक्शन सेल सेल संपर्कों के स्पष्ट गठन सुनिश्चित करता है। स्केल बार = 50 माइक्रोन अभिकर्मक दक्षता के प्रवाह cytometric विश्लेषण और व्यवहार्यता धुंधला के लिए एक विधि पिछले प्रकाशन 20 , 21 में वर्णित है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

Ontent "fo: keep-together.within-page =" 1 "> चित्र तीन
चित्रा 3: नवजात कार्डियोमायसाइट्स में जीआरए-एमआरएनए पर निर्भर एक्सचेंज। ( ए ) एफएआरपी प्रयोग की प्रतिनिधि छविएं लेबल किए गए miRNA के साथ अभिकर्मक के बाद, एक सेल क्लस्टर के भीतर लक्ष्य कोशिकाओं को एक मजबूत लेजर पल्स (पूर्व-ब्लीच बनाम ब्लीच) के द्वारा फोटोब्लिच किया गया है। अंतराल जंक्शन जंक्शन के आधार पर, आसन्न कोशिकाओं से miRNA के अंतराल जंक्शन जंक्शन के परिणामस्वरूप प्रक्षालित लक्ष्य कोशिकाओं में वृद्धि प्रतिदीप्ति तीव्रता का परिणाम होता है (बाद में ब्लीच टी = 3, 6, 9, और 13 मिनट)। स्केल बार = 20 माइक्रोन ( बी ) अधिग्रहीत FRAP डेटा का मात्रात्मक विश्लेषण 13 मिनट के बाद 20% की एक प्रतिदीप्ति वसूली दिखाता है। MiRNA के अंतरसूत्रिक स्थानांतरण में भागीदारी जीजे की पुष्टि करने के लिए, एक सीएक्स43 पछाड़ना किया गया, जिससे प्रतिदीप्ति वसूली (50%) की मजबूत कमी आई। ( सी ) विरोधी के साथ immunostaining Cx43एंटीबॉडी और बाद में confocal माइक्रोस्कोपी प्रोटीन स्तर पर Cx43 पछाड़ना की दक्षता प्रदर्शित करता है। स्केल बार = 50 माइक्रोन ( डी ) miR547 और कैल्सेन डाई के FRAP डेटा की तुलना अलग-अलग स्थानांतरण गतिशीलता दिखाती है। कैल्सीन के छोटे आणविक भार में डी 5 5 9-टैग मीरएनएनए अणुओं की तुलना में वृद्धि हुई प्रतिदीप्ति वसूली हुई। FRAP घटता एन ≥56 कोशिकाओं के डेटा को संक्षेप में दर्शाता है, जो कि ± एसईएम के रूप में दिखाया गया है बोनफोरोनि के बाद-हॉक टेस्ट (* पी <0.05, ** पी <0.01, *** पी <0.001) के बाद दो-तरफ़ा एनोवा का प्रयोग करके सांख्यिकीय विश्लेषण किया गया था। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4: फोकस बहाव का मुआवजा 3D-FRAP माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए। ( बी ) एक फोटोबलाइक्टेड सेल (लाल रेखा) की प्रतिनिधि छवियां 3D- और 2D-FRAP प्रयोगों के दौरान प्रतिदीप्ति तीव्रता पर फ़ोकस फ़िसल के प्रभाव का प्रदर्शन करती हैं। ( ए ) 3D-FRAP में, प्रत्येक समय-बिंदु के लिए ज़-स्टैक रिकॉर्ड किए जाते हैं, और अधिकतम अनुमानों का उपयोग डेटा विश्लेषण के लिए किया जाता है, जो फ़ोकस फ़िसल के लिए ठीक होता है। स्केल बार = 20 माइक्रोन ( बी ) इसके विपरीत, 2 डी-फ्रेड के लिए, सिर्फ एक 2 डी-परत डेटा विश्लेषण के अधीन है। इस प्रकार, समग्र प्रतिदीप्ति तीव्रता ध्यान में परिवर्तन से गहराई से कम हो जाती है। स्केल बार = 20 माइक्रोन ( सी ) प्रतिनिधि सामान्यीकृत प्रतिदीप्ति-3 डी और 2 डी-एफआरएपी प्रयोगों की प्रतिदीप्ति घटता प्रतिदीप्ति वसूली पर फोकस बहाव के मजबूत प्रभाव को इंगित करता है और इंटरसेबल्यूलर miRNA शट्लिंग का अध्ययन करते समय 3 डी अधिग्रहण के लाभ दिखाता है। वें का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करेंआंकड़ा है

चित्रा 5
चित्रा 5: 3D-FRAP प्रयोग के 3D सतह का प्रतिपादन। (बाएं) एक FRAP माप के अधिकतम अनुमानों। फोटोबलिचड सेल (लाल फ्रेम) आसन्न कोशिकाओं से miRNA स्थानांतरण के कारण प्रतिदीप्ति तीव्रता में वृद्धि को दर्शाता है। (दाएं) एक ही फोटोबलाइक्टेड सेल (लाल) के अधिग्रहीत जेड-स्टैक को मीरएनए के स्थानिक वितरण की कल्पना करने के लिए 3 डी सफ़ल रेंडरिंग के अधीन किया गया था। स्केल बार = 20 माइक्रोन इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

सेलियन फिजियोलॉजी में एमआईआरएनए प्रमुख खिलाडी हैं और इनके बीच- दूसरे शब्दों में - जीजेएस इंटरसेल्यूलर एक्सचेंज 11 , 12 , 22 के लिए एक मार्ग के रूप में उपयोग करके संकेत अणुओं के रूप में कार्य करने के लिए दिखाए गए थे। वर्तमान प्रोटोकॉल में सेल क्लस्टर के अंदर फ्लोरोसेंट मीरएनए का उपयोग करके इस जीजे-आश्रित शटलिंग को चिह्नित करने के लिए इन विट्रो लाइव-सेल इमेजिंग तकनीक को प्रस्तुत किया गया है।

एक सेल मॉडल प्रणाली के रूप में कार्डिय्योमोसाइट्स पर प्रोटोकॉल विकसित किया गया था। हालांकि, इस दृष्टिकोण को कई सेल प्रकारों पर लागू किया जा सकता है यदि इलेक्ट्राप्लावरी miRNA अभिकर्मक के लिए उपयुक्त विधि है सेल-टू-सेल एक्सचेंज के अतिरिक्त, प्रस्तुत तकनीक miRNA अणुओं के इंट्रासेल्युलर गतिशीलता की जांच के लिए भी उपयुक्त है ( उदाहरण के लिए, सेल के भीतर संभावित परिवहन तंत्र की पहचान के लिए) 23 , 24 ।

सामग्री "> FRAP माइक्रोस्कोपी द्वारा miRNA हस्तांतरण की जांच के लिए फ्लोरोसेंटली टैग किए गए miRNA अणुओं ( चित्रा 2 ) की आवश्यकता होती है। विशिष्ट सेल्युलर miRNA के लेबलिंग संभव नहीं है, केवल एक्सोजेनेशन लेबल की गई miRNA को 3 डी-फ्रेड के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जिससे इसकी गतिवर्धक गतिशीलता का विश्लेषण किया जा सके हमारे प्रयोगों में, कोशिकाओं को 250 एनएम मीरएनए के साथ ट्रांसफ़ेक्ट किया गया था। यह एकाग्रता शारीरिक स्थितियों की तुलना में बहुत अधिक थी, जहां आईआरएनए स्तर सेल 27 , 28 प्रति 10 से 50,000 अणुओं के बीच होता है। ऐसे कम सांद्रता का प्रयोग FRAP प्रयोगों में नहीं किया जा सकता, एक निश्चित स्तर के फ्लोरोसेंट miRNA अणुओं को एक पर्याप्त प्रतिदीप्ति संकेत प्राप्त करने और पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति और फ्लोरोसेंटली लेबल वाले miRNA के बीच उचित भेदभाव सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है। हालांकि, confocal इमेजिंग सिस्टम और डाई गुणों के आधार पर, कम पर miRNA सांद्रता का उपयोग एफएमआर एनासन के लिए एनएम रेंज व्यवहार्य होनी चाहिए/ P>

प्रवाह तकनीक, पीसीआर और ल्यूइफेरेज़ रिपोर्टर एशेज 12 , 13 सहित इंटरसेल्युलर miRNA स्थानांतरण का अध्ययन करने के लिए विभिन्न तकनीकों को सामान्यतः लागू किया जाता है। ये विधियां कम अस्थायी संकल्प ( यानी, घंटों से दिन) के साथ miRNA शटलिंग का पता लगाती हैं। इसके विपरीत, 3D-FRAP माइक्रोस्कोपी वास्तविक समय में miRNA हस्तांतरण और गतिशीलता के विज़ुअलाइज़ेशन और मात्रा के लिए अनुमति देता है अंतराल जंक्शन जंक्शन सेल सेल संपर्कों के अतिरिक्त, miRNA के अंतःस्रावी शटल को अन्य तंत्रों द्वारा मध्यस्थित किया जाता है, जैसे एक्सोसोम 18 , 2 9 , 30 । केवल 3 डी-एफआरपी एक्सोसोमल और गैप जंक्शन जंक्शन स्थानांतरण के बीच भेदभाव करने के लिए पर्याप्त उच्च अस्थायी संकल्प प्रदान करता है। इस प्रकार, यह विभिन्न रोगों या शारीरिक स्थितियों ( आईडीई के तहत miRNA सिग्नल पर जीजे पारगम्यता के प्रत्यक्ष प्रभाव में विशिष्ट जांच की अनुमति देता हैपुनः 2)

हम 3D-FRAP का उपयोग करने की सलाह देते हैं, जो पारंपरिक 2 डी-एफआरपी से बेहतर है, क्योंकि यह जीजे-आश्रित मीरएनए ट्रांसफर पर अधिक सटीक डेटा प्रदान करता है। 3D- FRAP माप में पूरे सेल वॉल्यूम शामिल होता है, जो बड़े-बड़े सेल प्रकारों का उपयोग करते समय महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, यह फ़ोकस परिवर्तन या सेल आंदोलनों को भरपाई कर सकता है, जो 2 डी-फ्रेड ( चित्रा 3 ) में प्रतिदीप्ति वसूली को महत्वपूर्ण रूप से खराब करने के लिए दिखाया गया था। अंत में, 3D-FRAP प्रयोगों में जेड-स्टैक की रिकॉर्डिंग स्थानिक जानकारी प्राप्त करने की संभावना प्रदान करती है, जो संभव नहीं है, जब प्रतिदीप्ति तीव्रता ( चित्रा 3 बी ) के विश्लेषण के लिए केवल एक एकल 2 डी परत का उपयोग किया जाता है।

चूंकि प्रतिदीप्ति वसूली आसन्न कोशिकाओं से miRNA के प्रवाह पर निर्भर होती है, ब्लीच किए सेल से जुड़ी कोशिकाओं की संख्या महत्वपूर्ण है और भरोसेमंद डेटा प्राप्त करने के लिए विभिन्न मापों में समान होना चाहिए। इसलिए, एक उच्च कोशिका घनत्व की आवश्यकता होती हैडी FRAP विश्लेषण के लिए सबसे उपयुक्त सेलुलर समूहों के गठन सुनिश्चित करने के लिए। इसके अलावा, उच्च लेजर तीव्रता 25 , 26 के कारण फोटोटोक्सिक प्रभावों से बचने के लिए हल्के विरंजन शर्तों ( यानी, लेजर शक्ति, विरंजन समय और स्कैन सेटिंग्स) का चयन करने के लिए प्रारंभिक प्रयोग किया जाना चाहिए। यह अधिग्रहण प्रक्रिया के दौरान होने वाली फोटोबलीचिंग को कम करने में भी मदद करेगा।

सीमाओं के बावजूद, हमारे डेटा से पता चलता है कि 3D-FRAP एक सेलुलर नेटवर्क के भीतर संकेतन अणुओं के रूप में miRNA की भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है। आईएनएनएनए शेटलिंगिंग या विशिष्ट मीरानों के लिए जीजे की चयनात्मक पारगम्यता पर कनेक्शन की प्रभाव का प्रभाव परिवहन दक्षता की प्रत्यक्ष मात्रा का ठहराव के साथ संबोधित किया जा सकता है। 3 डी-एफआरएआर miRNA और siRNA की विशेषता वाले नए चिकित्सा के विकास में महत्वपूर्ण जानकारी प्रदान कर सकती है, जैसे कि उचित परिस्थितियों को परिभाषित करके, जो वितरक की सुविधा प्रदान करते हैंजीजे नेटवर्क 31 , 32 के माध्यम से छोटे आरएनए के एन।

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Disclosures

ऑथर ने किसी हित संघर्ष की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

यह काम शिक्षा और अनुसंधान संघीय संघ (FKZ 0312138 ए और एफकेजेड 31615 9) के संघीय मंत्रालय द्वारा समर्थित था, यूरोपीय संघ के स्ट्रक्चरल फंड्स (ईएसएफ / IVWM-B34-0030 / 10 और ईएसएफ़ / आईवीबीएम-बी 35-0010 / एमएपी) के साथ राज्य मैक्लेनबर्ग-पश्चिमी पोमेरानिया 12), डीएफजी (डीए 12 9 6), और जर्मन हार्ट फाउंडेशन (एफ / 01/12)। इसके अतिरिक्त, आरडी को रॉस्टॉक यूनिवर्सिटी मेडिकल सेंटर (88 9 001), डीएएमपी फाउंडेशन और बीएमबीएफ (वीआईपी + 00240) के फोर्न प्रोग्राम द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
neonatal NMRI mice Charles River
Gelatin Sigma Aldrich G7041 0.1% solution in PBS, sterilized
PBS Pan Biotech P04-53500
Dulbecco´s modified medium Pan Biotech P04-03550
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 100 U/mL, 100µg/mL
Fetal bovine serum Pan Biotech P30-3306
Cell culture plastic TPP
Primary Cardiomyocyte Isolation Kit Thermo Fisher Scientific 88281
HBSS Thermo Fisher Scientific 88281 included in primary cardiomyocyte isolation kit
Trypan blue Thermo Fisher Scientific 15250061
miRIDIAN Dy547 labeled microRNA Mimic Dharmacon CP-004500-01-05 dissolve in RNAse free water, stock solution 20µM
Sodium phosphate monobasic Sigma S3139
Sodium phosphate dibasic Carl Roth T877.2
Potassium chloride Sigma P9333
Magnesium chloride Serva 28305.01
Sodium succinate Carl Roth 3195.1
0.05% Trypsin/EDTA solution Merck L2153
4-well- Glass bottom chamber slides IBIDI 80827 coat with 0.1% gelatin solution
Amaxa Nucleofector II Lonza program G-009 was used for Electroporation 
LSM 780 ELYRA PS.1 system Zeiss
Excel software Microsoft
α-actinin antibody Abcam ab9465 dilution 1:200
Connexin43 antibody Santa Cruz sc-9059 dilution 1:200
goat anti-mouse Alexa 594 antibody Thermo Fisher Scientific A-11005 dilution 1:300
goat anti-rabbit Alexa 488 antibody Thermo Fisher Scientific A-11034 dilution 1:300
Connexin43 siRNA Thermo Fisher Scientific AM16708 ID158724 final concentration 250 nM
Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher Scientific L10119
CellTrace Calcein Red-Orange Thermo Scientific C34851
DAPI nuclear stain Thermo Scientific D1306

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References

  1. Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell. 136 (4), 642-655 (2009).
  2. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  3. Grimm, D. Small silencing RNAs: state-of-the-art. Adv Drug Deliv Rev. 61 (9), 672-703 (2009).
  4. Raghunathan, S., Patel, B. M. Therapeutic implications of small interfering RNA in cardiovascular diseases. Fundam Clin Pharmacol. 27 (1), 1-20 (2013).
  5. Sluijter, J. P. G. MicroRNAs in Cardiovascular Regenerative Medicine: Directing Tissue Repair and Cellular Differentiation. ISRN Vasc Med. , 1-16 (2013).
  6. Li, M., Zhang, J. Circulating MicroRNAs: Potential and Emerging Biomarkers for Diagnosis of Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases. Biomed Res Int. , 1-9 (2015).
  7. Romaine, S. P. R., Tomaszewski, M., Condorelli, G., Samani, N. J. MicroRNAs in cardiovascular disease: an introduction for clinicians. Heart. 101 (12), 921-928 (2015).
  8. Maes, M., Crespo Yanguas,, Willebrords, S., Cogliati, J., Vinken, B., M, Connexin and pannexin signaling in gastrointestinal and liver disease. Transl Res. 166 (4), 332-343 (2015).
  9. Michela, P., Velia, V., Aldo, P., Ada, P. Role of connexin 43 in cardiovascular diseases. Eur. J. Pharmacol. 768, 71-76 (2015).
  10. Naus, C. C., Laird, D. W. Implications and challenges of connexin connections to cancer. Nat Rev Cancer. 10 (6), 435-441 (2010).
  11. Hong, X., Sin, W. C., Harris, A. L., Naus, C. C. Gap junctions modulate glioma invasion by direct transfer of microRNA. Oncotarget. 6 (17), Available from: http://www.impactjournals.com/oncotarget 15566-15577 (2015).
  12. Lee, H. K. H., et al. Mesenchymal stem cells deliver synthetic microRNA mimics to glioma cells and glioma stem cells and inhibit their cell migration and self-renewal. Oncotarget. 4 (2), 346-361 (2013).
  13. Katakowski, M., Buller, B., Wang, X., Rogers, T., Chopp, M. Functional microRNA is transferred between glioma cells. Cancer Res. 70 (21), 8259-8263 (2010).
  14. Zong, L., Zhu, Y., Liang, R., Zhao, H. -B. Gap junction mediated miRNA intercellular transfer and gene regulation: A novel mechanism for intercellular genetic communication. Sci Rep. 6, 19884 (2016).
  15. Yum, S. W., Zhang, J., Scherer, S. S. Dominant connexin26 mutants associated with human hearing loss have trans-dominant effects on connexin30. Neurobiol Dis. 38 (2), 226-236 (2010).
  16. Kuzma-Kuzniarska, M., Yapp, C., Pearson-Jones, T. W., Jones, A. K., Hulley, P. A. Functional assessment of gap junctions in monolayer and three-dimensional cultures of human tendon cells using fluorescence recovery after photobleaching. J Biomed Opt. 19 (1), 15001 (2013).
  17. Lemcke, H., Nittel, M. -L., Weiss, D. G., Kuznetsov, S. A. Neuronal differentiation requires a biphasic modulation of gap junctional intercellular communication caused by dynamic changes of connexin43 expression. Eur J Neurosci. 38 (2), 2218-2228 (2013).
  18. Lemcke, H., Steinhoff, G., David, R. Gap junctional shuttling of miRNA - A novel pathway of intercellular gene regulation and its prospects in clinical application. Cell Signal. 27 (12), 2506-2514 (2015).
  19. Lemcke, H., Kuznetsov, S. A. Involvement of connexin43 in the EGF/EGFR signalling during self-renewal and differentiation of neural progenitor cells. Cell Signal. 25 (12), 2676-2684 (2013).
  20. Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 98, 117-127 (2016).
  21. Laupheimer, M., et al. Selective Migration of Subpopulations of Bone Marrow Cells along an SDF-1 α and ATP Gradient. Bone Marrow Res. , 1-10 (2014).
  22. Zhang, S., Wang, Q., Liu, L., Hong, X., Zhang, Y., Tao, L. Gap junctions enhance the antiproliferative effect of microRNA-124-3p in glioblastoma cells. J Cell Physiol Physiol. 230 (10), 2476-2488 (2015).
  23. Vasilescu, C., Tanase, M., Dragomir, M., Calin, G. A. From mobility to crosstalk. A model of intracellular miRNAs motion may explain the RNAs interaction mechanism on the basis of target subcellular localization. Math Biosci. 280, 50-61 (2016).
  24. Pitchiaya, S., Androsavich, J. R., Walter, N. G. Intracellular single molecule microscopy reveals two kinetically distinct pathways for microRNA assembly. EMBO Rep. 13 (8), 709-715 (2012).
  25. Heinze, K. G., Costantino, S., De Koninck, P., Wiseman, P. W. Beyond photobleaching, laser illumination unbinds fluorescent proteins. J Phys Chem B. 113 (15), 5225-5233 (2009).
  26. Jou, M. J., Jou, S. B., Guo, M. J., Wu, H. Y., Peng, T. I. Mitochondrial reactive oxygen species generation and calcium increase induced by visible light in astrocytes. Ann N Y Acad Sci. 1011, 45-56 (2004).
  27. Dong, H., Lei, J., Ding, L., Wen, Y., Ju, H., Zhang, X. MicroRNA: Function, detection, and bioanalysis. Chem Rev. 113 (8), 6207-6233 (2013).
  28. Liang, Y., Ridzon, D., Wong, L., Chen, C. Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues. BMC Genomics. 8 (1), 166 (2007).
  29. Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat Commun. 2, 282 (2011).
  30. Squadrito, M. L., et al. Endogenous RNAs Modulate MicroRNA Sorting to Exosomes and Transfer to Acceptor Cells. Cell Rep. 8, 1432-1446 (2014).
  31. Zhang, B., Farwell, M. A. microRNAs: a new emerging class of players for disease diagnostics and gene therapy. J Cell Mol Med. 12 (1), 3-21 (2008).
  32. Chen, Y., Gao, D. -Y., Huang, L. In vivo delivery of miRNAs for cancer therapy: Challenges and strategies. Adv Drug Deliv Rev. 81C, 128-141 (2015).

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गैप जंक्शन-आश्रित का विश्लेषण 3 डी-फ्रेप माइक्रोस्कोपी के साथ miRNA का स्थानांतरण
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Lemcke, H., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy. J. Vis. Exp. (124), e55870, doi:10.3791/55870 (2017).

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