Summary
כאן, אנו מתארים את היישום של התאוששות מימדי תלת מימדי לאחר photobleaching (3D-FRAP) לניתוח של צומת הפער התלוי תלוי של מירנה. בניגוד לשיטות מיושמות בדרך כלל, 3D-FRAP מאפשר כימות של העברה בין תאית של RNAs קטנים בזמן אמת, עם רזולוציה גבוהה ספטיו- temporal.
Abstract
קטן RNAs antisense, כמו מירנה ו siRNA, לשחק תפקיד חשוב בפיזיולוגיה הסלולר פתולוגיה, יתר על כן, ניתן להשתמש סוכני טיפולית לטיפול במספר מחלות. הפיתוח של אסטרטגיות חדשות וחדשניות עבור טיפול מירנה / siRNA מבוסס על ידע נרחב של המנגנונים הבסיסיים. נתונים אחרונים מראים כי RNAs קטנים מוחלפים בין התאים בצורה תלויה בצומת הפער, ובכך גורם להשפעות גנטיות של הגן בתא הנמען. טכניקות ביולוגיות מולקולריות וניתוח cytometric זרימה משמשים בדרך כלל כדי ללמוד את חילופי בין תאיים של מירנה. עם זאת, שיטות אלה אינם מספקים רזולוציה גבוהה טמפורלית, אשר הכרחי כאשר לומדים את הפער השטף פער של מולקולות. לכן, כדי לחקור את ההשפעה של מירנה / siRNA כמו מולקולות איתות בין תאיים, כלים חדשים נדרשים שיאפשר ניתוח של אלה RNAs קטנים ברמה התאית. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את apPlication של התאוששות פלואורסצנטי תלת מימדי לאחר photobleaching (3D-FRAP) מיקרוסקופ כדי להבהיר את צומת הפער תלוי החליפין של מולקולות מירנה בין תאים לבביים. חשוב לציין, זה פשוט ולא פולשני לחיות הדמיה גישה הדמיה מאפשרת הדמיה וכימות של shuttling פער junctional של RNAs קטן שכותרתו fluorescently בזמן אמת, עם רזולוציה גבוהה ברזולוציה זמן. הנתונים המתקבלים על ידי 3D-FRAP מאשרים מסלול חדש של רגולציה גנים בין תאיים, כאשר RNA קטנים פועלים כמולקולות איתות בתוך הרשת הבין-תאית.
Introduction
קטנים RNAs noncoding הם שחקנים חשובים בתחום הרגולציה הגן הסלולרי. מולקולות אלה מורכבים 20-25 נוקליאוטידים כי לאגד mRNA מטרה מסוימת, המוביל לחסימה של תרגום או ל mRNA השפלה 1 , 2 . תהליך הרגולציה הגנטית שנעשה על ידי RNA קטנים, כגון מירנה ו siRNA, הוא מנגנון שמרני מאוד שנמצא במינים שונים רבים 3 . בפרט, מולקולות מירנה הם בעלי חשיבות מכרעת למגוון של תהליכים פיזיולוגיים, כולל התפשטות, דיפרנציאציה, התחדשות 4 , 5 . בנוסף, dysregulation הביטוי מירנה מיוחסת להפרעות פתולוגיות רבות. מקביל, miRNAs הוכחו להיות מתאים כמו סמנים ביולוגיים לאבחון כמו סוכני טיפולית עבור טיפול גנטי 6 , 7
צמתים הפער (GJs) הם מבנים חלבונים מיוחדים בקרום פלזמה של שני תאים סמוכים המאפשרים חילופי diffusional של מולקולות עם משקל מולקולרי של עד 1 kD. הם הוכחו כחשובים להתפתחות רקמות, דיפרנציאציה, מוות לתאים והפרעות פתולוגיות כגון סרטן או מחלות לב וכלי דם 8 , 9 , 10 . מספר מולקולות תוארו כמי שמסוגלות לחצות את ערוצי ה- GJ, כולל יונים, מטבוליטים ונוקליאוטידים. מעניין, GJs נמצאו גם לספק מסלול לתנועה בין תאיים של RNA קטנים 11 , 12 . לפיכך, miRNAs יכול לפעול לא רק בתוך התא שבו הם מיוצרים, אלא גם בתוך תאים הנמען. זה מדגיש את התפקיד של miRNAs במערכת interducellular transduction האות. יחד עם זאת, הנתונים להפגיןכי פער תקשורת intertellular פער קשורה קשר הדוק לתפקוד מירנה. בגלל ההשפעה המשמעותית של מירנה ו GJs על הומאוסטזיס רקמות, פתולוגיה, ואבחון, הבנה מקיפה של הפונקציה של GJs ואת הדינמיקה הבין תאיים הקשורים מירנה יעזור להבהיר את המנגנונים של מחלות מבוססות מירנה לפתח אסטרטגיות חדשות עבור טיפולים מירנה.
בהתאם להיקף של צימוד genctional הפער, העברת מולקולות מירנה בין התאים יכול להיות תהליך מהיר מאוד. לכן, מתודולוגיה המאפשרת הדמיה וכימות של תנועה בין תאנית מהירה של אלה מולקולות איתות רגולציה נדרשת. בדרך כלל, cytometry זרימה וטכניקות ביולוגיות מולקולריות יושמו כדי להדגים את shuttleling של RNAs קטנים 11 , 12 , 13 , 14 . עם זאת, בניגוד micros FRAPלהעתיק, גישות אלה חסרים ברזולוציה טמפורלית גבוהה, אשר חובה בעת ניתוח החליפין של מירנה באמצעות GJs. יתר על כן, מיקרוסקופ FRAP הוא פולשני פחות ולכן מייצג חזק ורומנטי לחיות הדמיה תא טכניקה כדי להעריך את חילופי GJ תלויי של מולקולות במספר סוגי תאים 15 , 16 , 17 .
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט המתאר את היישום של 3D-FRAP להעריך מירנה shuttling בין cardiomyocytes. לשם כך, cardiomyocytes היו transfected עם מירנה שכותרתו fluorescently. תא מסומן עם miRNA זה היה photobleached, ואת הפער פער miRNA מחדש של תאים סמוכים נרשמה באופן תלוי זמן. רזולוציה גבוהה של הניסויים FRAP מציע את האפשרות לבצע מחקרים קינטיים להערכה מדויקת של העברה בין תאיים של מירנה ו siRNA בין תאים חיים. מורוVer, כמו RNAs קטן ניתן להחליף באמצעות מנגנונים שונים עם קינטיקה שונה מאוד, מיקרוסקופ FRAP יכול לעזור להבהיר את מידת ההשתתפות של GJs בתהליכים Shuttleling בהתאמה 18 . בנוסף, 3D-FRAP ניתן להשתמש כדי לחקור שינויים פיזיולוגיים ופתולוגיים בחדירות GJ ואת השפעתה על העברת RNA קטן 15 , 19 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השלבים בפרוטוקול זה מעורבים עכברים בילודים בוצעו לפי הנחיות אתיות לטיפול בבעלי חיים של המרכז הרפואי אוניברסיטת רוסטוק.
1. הכנת של תרבות תאים צלחות בינונית לתרבות cardiomyocyte
- מעיל צלחת תרבות התא עם ג 'לטין 0.1% ב PBS ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות או 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. הסר את הג'לטין ולאפשר לו להתייבש תחת זרימת אוויר סטרילית למינרית.
- הכינו בינוני תרבות התא מורכב 50 מ"ל של DMEM בתוספת 10% בסרום שור עוברית (FBS) ו 1% פניצילין / סטרפטומיצין (P / S). טרום חם עד 37 מעלות צלזיוס.
2. בידוד של Cardiomyocytes neonatal
- להקריב עכברים neonatal (1-2 ימים) על ידי עריפת ראש עם מספריים סטריליים ולפתוח את החזה לאורך החזה. הסר את הלב באמצעות מלקחיים בזמן לחיצה קלה על החזה יחד ולהעביר את הלב לתוך צלחת 24-היטב המכיל HBSS קר כקרח(ללא Ca 2 + ו Mg 2 + ).
- הסר רקמות לא לב וכלי גדול באמצעות מלקחיים סטרילית. העברת לבבות לנקות לתוך צינור 1.5 מ"ל המכיל HBSS קר כקרח. השתמש מקסימום של 5 לבבות לכל צינור לעיכול אנזימטי.
- מינס את הלבבות עם מספריים קטנים לתוך <0.5 ל 1 מ"מ חתיכות.
- לשטוף את לבבות טחון עם HBSS פעמיים על ידי שאיפה / תוספת של HBSS באמצעות פיפטה 1-מ"ל microliter. הסר את HBSS לחלוטין לפני הוספת האנזימים.
- לקבלת עיכול אנזימטי של לבבות ילודים, להשתמש בערכה זמינה מסחרית ופעל פרוטוקול של היצרן (ראה טבלה של חומרים ). לנער את הצינור המכיל לבבות טחון כל 5 דקות תוך דוגרים עם אנזימים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 35 דקות.
- זרעים מושעה על תאים שאינם מצופים בתרבות תאים המכיל בינוני תרבות התא עבור 1.5-2 שעות כדי לאפשר את הדבקות של חלק cardiomyocyte שאינם. חזור על שלב זה אם טוהר גבוהשל cardiomyocytes יש צורך. אם תרצה, עוד התרבות את השבר שאינם cardiomyocyte.
הערה: עבור ההשעיה התא של 15 לבבות, צעד מראש ציפוי יכול להתבצע על 75 ס"מ ² צלוחיות תרבות התא. בדרך כלל, ~ 5 x 10 5 תאים מתקבלים בלב אחד neonatal. - איסוף supernatant בצינור חרוטי 15 מ"ל ו צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 300 x גרם. Resuspend התאים 1 מ"ל של המדיום תרבות התא.
- לספור את התאים עם hemocytometer Neubauer קאמרית, או להשתמש בשיטה המקבילה.
- צלחת cardiomyocytes מבודד על 6 צלחות היטב עם צפיפות של 3 x 10 5 תאים / ס"מ ². דגירה התאים לילה ב 37 מעלות צלזיוס 5% CO 2 .
הערה: לחלופין, תאים יכולים גם להיות transfected בשלב זה. עם זאת, גדל הכדאיות נצפתה כאשר התאים היו מתורבת במשך יום אחד לפני היותו נתון electroporation.
3. transfection עם מירנה fluorescently תווית
- מִרֹאשׁ-בינוני תרבות תאים חמים (ראה שלב 1.2) ל 37 מעלות צלזיוס באמבט מים או מכשיר מקביל.
- הכן פתרון מניות 20 מיקרומטר של מירנה ניאון במים סטרילי ללא RNase.
- הכן חיץ electroporation המכיל 90 מ"מ Na 2 HPO 4 , 90 מ"מ NaH 2 PO 4 , 5 מ"מ KCl, 10 מ"מ MgCl 2 , ו 10 מ"מ נתרן succinate ולהתאים את ה- pH 7.2; חיץ electroporation ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס במשך מספר חודשים.
- לנתק את התאים מהצלחת תרבות באמצעות 0.05% טריפסין במשך 5 דקות. להשבית את טריפסין על ידי הוספת בינוני תרבית תאים.
- לספור את התאים עם hemocytometer Neubauer קאמרית, או להשתמש בשיטה המקבילה. צנטריפוגה התאים ב XG 300 במשך 10 דקות.
- Resuspend התאים במאגר electroporation להשיג ריכוז של 4 x 10 5 תאים לכל 100 μL.
- מערבבים 100 μL ההשעיה התא עם מירנה ניאון (ריכוז סופי: 0.25 מיקרומטר) בצינור ולטעון את התערובת לתוך קובט electroporation.
- אמפירי לקבוע את הכמות המתאימה של מירנה, בהתאם לסוג התא.
- בצע electroporation באמצעות מכשיר electroporation (ראה טבלה של חומרים ), באמצעות "G-009" התוכנית.
- הוסף 500 μL של מדיום מראש חימם תרבות תאים ולהעביר את ההשעיה התא כולו (4 x 10 5 תאים) לתוך באר של שקופיות קאמרית 4-היטב זכוכית התחתונה. תרבות התאים ליום 1 ב 37 מעלות צלזיוס באווירה 5% CO 2 .
הערה: עבור ניתוח FRAP, צפיפות התא של ~ 80% הוא אופטימלי. Transfection של מירנה שכותרתו צריכה להתבצע אך ורק באמצעות electroporation. מאז ההפצה הומוגנית של מולקולות מירנה שכותרתו מועיל למדידת FRAP, transfection מגיב מבוסס לא מומלץ.
4. החלת 3D-FRAP מיקרוסקופית (יום 3)
- לחמם את החממה מיקרוסקופ ל 37 מעלות; C ו לעבור על מערכת מיקרוסקופ confocal לפחות 2 שעות לפני המדידה FRAP להקים שיווי משקל תרמי כדי להקטין את האפשרות להיסחף. אם אפשר, לשמור על 5% CO 2 אווירה.
- הכנס את השקופית קאמרית למחזיק מדגם הבמה.
- מצא אשכול של cardiomyocytes transfected באמצעות המטרה שמן 1.4 NA (הגדלה 400X) ו 561 ננומטר אור עירור לייזר על כוח לייזר נמוך, עם טווח זיהוי של 570-680 ננומטר.
הערה: ההגדרה של הגדרות FRAP, רכישת התמונה, והניתוח נעשו באמצעות תוכנה ספציפית מיקרוסקופ (ראה טבלה של חומרים ). - הפעל את "Z-Stack", "Time Series", "Bleaching", ו "אזורים" לחצנים "מנהל ההתקנה".
- הגדר את הפרמטרים FRAP.
- הגדר את הגדרות רכישת התמונה בתפריט "מצב רכישה" על ידי הגדרת "גודל המסגרת4; כדי 512 x 512, "צעד השורה" ל 1, ואת "זמן סריקה" כדי <1 s.
- בתפריט "ערוצים", להתאים את כוח הלייזר, לקזז, ולהשיג הגדרות כדי לקבל הקרינה מקסימלית מ עירור לייזר מינימלי ( למשל, כוח לייזר: 1-5%); להתאים כדי להימנע מרוויה בעוצמה. הגדר את "גודל חריר" עד 2 מיקרומטר.
- הבא, בתפריט "אזורים", בחר את "כלי ציור ROI" ולהשתמש הסמן כדי לסמן את התא היעד, תא התייחסות, ואת אזור הרקע. אם נדרש, בחר מספר תאים היעד photobleaching.
- התאם את הגדרות photobleaching בתפריט "הלבנה" ( לדוגמה, איטרציות: 9-14, כוח לייזר עבור photobleaching: 100%, מרווח של רכישת התמונה: 60 s, מחזורים: 15). הגדר את ההתחלה של הלבנה לאחר 3 סריקות ראשוניות.
- בתפריט "z- מחסנית", להגדיר את הגבולות של z- מחסנית הרכישה, בהתאם לעובי של התאים. התאם את "מספר oF z- שכבות "ל 12 - 15.
- הפעל את הניסוי FRAP ולתעד את ההתאוששות הקרינה.
הערה: מאז ההגדרות של ניסוי FRAP תלויים בסוג התא, צבע ניאון, ואת מערכת המיקרוסקופ, עדיף לבצע ניסויים טייס כדי לקבוע את הפרמטרים האופטימליים עבור FRAP. הלבנה צריך להיות מספיק כדי להפחית את עוצמת הקרינה הראשונית על ידי לפחות 50%. בדרך כלל, התאוששות פלואורסצנטי צריך להיות מוקלט כל 30-60 s עד שלב הרמה הוא הגיע.
5. ניתוח נתונים
- יצירת תחזיות מקסימום של z- ערימות שנרכשו ולקבל ערכים עוצמת הקרינה של תאים היעד מולבן, תא התייחסות, ואת הרקע. באמצעות תוכנה ספציפית מיקרוסקופ, לחץ על "עיבוד" → "מקסימום עוצמת הקרנה" → בחר קובץ → "החל".
- לחלופין, השתמש בכלי ניתוח תמונה מקביל (
- לחלופין, השתמש בכלי ניתוח תמונה מקביל (
- העתק את נתוני עוצמת הקרינה בכל נקודות הזמן מתא המטרה, הרקע ותא הייחוס לגיליון אלקטרוני.
- הפחת את עוצמת הרקע ואת עוצמת התא התייחסות מערכי האינטראקציה של תא המטרה לתקן photobleaching שנגרם במהלך תהליך הרכישה. לבצע רקע ותיקונים התא התייחסות עבור כל נקודת זמן.
- לנרמל את הנתונים FRAP מתוקן על עוצמת הקרינה הראשונית לפני הלבנה על ידי חלוקת כל ערך על ידי הקרינה הראשונית.
- כדי להשיג עקומות FRAP, להגדיר את הבסיס לעוצמת הקרינה מיד לאחר אקונומיקה על ידי הפחתת מערכי העוצמה של כל נקודת זמן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
כאן, אנו מציגים 3D-FRAP מיקרוסקופית כמו טכניקה לא פולשנית ללמוד את הפער junctional הפער של מירנה ניאון בתוך cardiomyocytes בילוד. Cardiomyocytes מבודד חשף דפוס אופייני α actinin מבודד והכיל לוחות גדולים של Cx43 לאורך גבולות התא תא ( איור 1A , ראשי חץ לבנים), אשר אפשרה השטף בין תאיים גבוהה של מולקולות. טוהר cardiomyocytes מבודד הוערך על ידי כימות מיקרוסקופית של תאים α-actinin חיובי. למרות כמה cardiomyocytes שאינם cardiomyocytes (α-actinin שלילי תאים) היו נוכחים בתרבות, cardiomyocytes neonatal ייצג את סוג התא העיקרי לאחר בידוד (79.62 ± 3.68%, איור 1 ב ).
כדי לחקור את הפער junctional הפער של מירנה, תאים היו transfected עם מירנה שכותרתו fluorescently. EleCtroporation היא שיטה של בחירה כדי לספק מולקולות miRNA לתאים, כפי שהוא מבטיח יעילות transfection גבוהה ההפצה הומוגנית של תרכובות transfected, אשר חובה על ניתוח FRAP. בשנת ההתקנה ניסיוני שלנו, השגנו יעילות transfection של ~ 45%, כפי שנקבע על ידי cytometry זרימה ( איור 2 א ). הכנת cardiomyocytes עבור FRAP כולל ניתוק מהצלחת תרבות, electroporation, ואת המצורפת מחדש על שקופיות קאמרית. זרימת cytometric חי / assay מת גילה כי רוב התאים הוכיחו כדאיות גבוהה, אשר חשוב בעת ניתוח תקשורת פער הפער ( איור 2 ב ). יתר על כן, צפיפות התאים הוא פרמטר חיוני המשפיע על תוצאות FRAP. עבור מדידות FRAP אופטימלי, תאים צריך להיות seeded עם צפיפות של 80% ~ כדי לאפשר את היווצרות של אשכולות התא ואת הקמתה של צומת פער תפקודית בין תאים ( איור2C).
עבור ניתוח FRAP, תאים היעד נבחרים בתוך אשכול התא הם photobleached עם כוח לייזר 100%, המוביל מופחת הקרינה מירנה בתאים שנבחרו ( איור 3 א , אקונומיקה). לאחר מכן, התאוששות פלואורסצנטי נרשם לדמיין את העברת מירנה מתאי סמוכים לתוך האזור מולבן. מאז שלב הרמה של ההתאוששות הקרינה הושג לאחר 13 דקות, טווח זמן זה שימש לרכישת תמונות בניסויים FRAP. ניתוח כמותי ונורמליזציה של הנתונים שנרכשו הראו התאוששות ממוצעת של 20%. הנתונים הראו גם כי מיקרוסקופ FRAP מאפשר הקלטה מהירה של מירנה shuttleling עם רזולוציה טמפורלית גבוהה. בהתאם למאפיינים צבע, פרמטרים הרכישה ניתן לשנות כדי להגדיל את רזולוציה הזמני.
השימוש של 3D-FRAP מאפשראת ההשוואה של חדירות GJ כדי מירנה בתנאים שונים. כדי להדגים זאת, אנו המושרה מציאת siRNA בתיווך של Cx43, המוביל ביטוי חלבון מופחת ( איור 3 ג ) ואת העיכוב של תקשורת פער הפער. כתוצאה מכך, התאוששות הקרינה הופחת על ידי יותר מ 50%, המציין כי היעילות של העברת מירנה תלויה במידה רבה על מידת צימוד ג'ונקציונלי הפער בין התאים ( איור 3 ב , Cx43 מציאה). כדי לאשר את ההתאוששות הקרינה משקף את המעבר של מירנה שכותרתו fluorescently, ולא תווית Dy547 מנותקת, אנחנו גם רכשו נתונים FRAP עבור צבע calcein ( איור 3D ). Calcein יש משקל מולקולרי דומה לזה של Dy547 ובכך להחזיק דינמיקה העברה דומה. בניגוד התאוששות פלואורסצנטי של מירנה Dy547 שכותרתו, Calcein הפגינו חילופי פער הפער גדל, המציין כי Dy547 תג iS לא מנותקת מ מולקולת מירנה ( איור 3D ).
תנאי המיקוד היציב הם חובה בכל ניסוי FRAP, במיוחד כאשר מדידות לטווח ארוך מבוצעות. בהשוואה ליישומים דו-ממדיים, 3D-FRAP יכול לפצות על סחיפה ממוקדת פוטנציאלית. כפי שמוצג בתרשים 4 , אפילו שינויים קלים להתמקד משפיעים על גילוי נאות של האות הקרינה של מירנה כאשר רק שכבה אחת 2D משמש לניסוי FRAP ( איור 4 ב ). לעומת זאת, עבור 3D-FRAP, z- מחסנית שלמה של תא היעד נרשם, ואת התחזיות המקסימליות נתונים לנתוני ניתוח ( איור 4 א ). ההשפעה של ההתמקדות להתמקד על עקומות הקרינה מנורמל בעוצמה מתואר באיור 4C . בעוד ההתאוששות הקרינה עולה בהתמדה עם הזמן בתלת מימד 3D, FRAP, 2-FRAP תוצאות הרכישה ירידה oF האות הקרינה.
לצד הפיצוי של השינויים להתמקד, 3D-FRAP גם מספק נתונים מרחביים של חילופי הפער junctional של מירנה. איור 5 מציג עיבוד תלת מימדי של ניסוי FRAP. לעומת תחזיות מקסימלית, רכישת z- ערימות ניתן להשתמש כדי ליצור שחזור 3D לחקור את לוקליזציה וניידות של מירנה בתוך תאים ( איור 5 ). שיתוף תיוג עם organelles יאפשר לחקור את מעורבותם של רכיבים סלולריים אחרים בהעברת מירנה.
איור 1: נציג תמונות מיקרוסקופיות של Cardiomyocytes מבודדים neonatal. ( א ) מיקרוסקופ תאורה מובנית מראה את הביטוי הגבוה של Cx43, אשר מצטבר גדול pלולים בגבולות תא (ראשי חץ). היווצרות בולטת של GJs עם תאים סמוכים מאפשר חילופי נרחב של מולקולות קטנות, כולל מירנה. בר סולם = 20 מיקרומטר ( B ) טוהר cardiomyocytes מבודדים. תיוג של α- actinin מוכיח כי cardiomyocytes מייצגים את סוג התא העיקרי לאחר בידוד. סולם בר = 50 מיקרומטר. תאים היו מוכתמים נוגדנים נגד Cx43 (ירוק) ו אנטי אקטין α (actinin) (אדום). גרעינים היו דמיינו באמצעות DAPI (כחול). תיאור של מיקרוסקופ תאורה מובנה תיוג אימונולוגי מסופק בפרסומים קודמים 20 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: יעילות Transfection, כדאיות , ואת צפיפות תאים של Cardiomyocyte הילוד neonatal. ( A ) cytometry זרימה גילה כי electroporation miR547 הביא יעילות transfection של ~ 45%. ( B ) כדאיות התא של cardiomyocytes המשמש FRAP. לאחר בידוד, electroporation, reattachment, cardiomyocytes היו נתונים לחיות מכתים תאים מתים הפגינו כדאיות התא גבוהה. ( ג ) תמונה מיקרוסקופית של mir547 transiected cardiomyocytes מוכן מיקרוסקופ FRAP. צפיפות תאים של 80-90% מבטיחה את היווצרות מובהק של פער תאים תאים תאיים פער. סולם בר = 50 מיקרומטר. שיטה לניתוח זרימת cytometric של יעילות transfection מכתים הכדאיות מוזכר בפרסומים קודמים 20 , 21 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: GJ תלויי החליפין של מירנה ב Cardiomyocytes neonatal. ( א ) נציג תמונות של ניסוי FRAP. לאחר transfection עם מירנה שכותרתו, תאים היעד בתוך אשכול התא הם photobleached על ידי דופק לייזר חזק (מראש אקונומיקה לעומת אקונומיקה). בהתאם לגודל של צימוד junctional הפער, זרם פער ג 'ינקטי של מירנה מתאי תאים סמוכים גדל עוצמת הקרינה בתאי היעד מולבן (שלאחר אקונומיקה לא = 3, 6, 9, ו 13 דקות). בר סולם = 20 מיקרומטר ( ב ) ניתוח כמותי של הנתונים שנרכשו FRAP מראה התאוששות הקרינה של 20% לאחר 13 דקות. כדי לאשר את מעורבות GJs בהעברה בין תאיים של מירנה, בוצע מציצה cx43, המוביל לירידה חזקה של התאוששות הקרינה (50%). ( ג ) Immunostaining עם אנטי Cx43נוגדן ומיקרוסקופ confocal הבא להדגים את היעילות של מציאת Cx43 ברמת החלבון. סולם בר = 50 מיקרומטר. ( D ) השוואה של נתוני FRAP של miR547 וצבע calcein להראות את הדינמיקה העברת שונים. המשקל המולקולרי קטן יותר של calcein הביא התאוששות פלואורסצנטי מוגבר לעומת מולקולות dR547 מתויג מירנה. עקומות FRAP מסכמות את הנתונים של n 56 תאים, כפי שמוצג הממוצע ± SEM. הניתוח הסטטיסטי נעשה באמצעות ANOVA דו-כיווני ואחריו הבדיקה הפוסט-הוקית של Bonferroni (* P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: פיצוי סחיפה להתמקד באמצעות מיקרוסקופיה 3D-FRAP. (
איור 5: עיבוד משטח תלת-ממדי של ניסוי תלת-ממדי של FRAP. (משמאל) מקסימום תחזיות של מדידה FRAP. תא photobleached (מסגרת אדומה) מדגים עלייה בעוצמת הקרינה עקב העברת מירנה מתאי סמוכים. (מימין) שנרכשו z- ערימות של תא photobleached אותו (אדום) היו כפופים עיבוד 3D משטח לדמיין את החלוקה המרחבית של מירנה. סולם בר = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MiRNAs הם שחקני מפתח בפיזיולוגיה הסלולרית והוצגו כמולקולות איתות באמצעות שימוש - בין היתר - GJs כנתיב עבור חילופי בין תאיים 11 , 12 , 22 . הפרוטוקול הנוכחי מציג במבחנה לחיות תאים תא הדמיה טכניקה לאפיין את זה Shifting GJ תלויי באמצעות miRNAs ניאון בתוך אשכולות התא.
הפרוטוקול פותח על cardiomyocytes כמו מערכת מודל התא. עם זאת, גישה זו יכולה להיות מיושמת על מספר סוגי תאים אם electroporation היא שיטה מתאימה transfection מירנה. בנוסף חילופי תאים לתא, הטכניקה המוצגת מתאימה גם לחקור את ניידות תאיים של מולקולות מירנה ( למשל, לזיהוי של מנגנוני תחבורה אפשריים בתוך התא) 23 , 24 .
תוכן "> החקירה של העברת מירנה על ידי מיקרוסקופ FRAP דורש מולקולות מתויגות fluorescently מירנה ( איור 2 ). כמו תיוג של miRNAs הסלולר מסוים אינו ריאלי, רק אקסוגני, הציג מירנה שכותרתו ניתן להשתמש עבור 3D-FRAP לנתח ניידות בין תאית שלה בניסויים שלנו, התאים היו transfected עם מירנה 250 ננומטר.הריכוז הזה היה גבוה בהרבה בהשוואה לתנאים פיזיולוגיים, שבו רמת מירנה נע בין 10 ל 50,000 מולקולות לתא 27 , 28. ריכוזים נמוכים כאלה לא ניתן להשתמש בניסויים FRAP, כמו רמה מסוימת של מולקולות פלואורסצנטי מירנה נדרש להשיג אות הקרינה מספיק כדי להבטיח את ההפליה הראויה בין הקרינה רקע ו מירנה שכותרתו fluorescently.F עם זאת, בהתאם למערכת הדמיה confocal ואת המאפיינים צבע, השימוש בריכוז מירנה ב נמוך -NM טווח צריך להיות ריאלי עבור מבחני FRAP/ P>טכניקות שונות מוחלים בדרך כלל ללמוד העברת מירנה בין תאיים, כולל cytometry זרימה, PCR, מבחני לוציפראז 12 , 13 . שיטות אלה לזהות miRNA shuttling עם רזולוציה הזמני נמוך ( כלומר, שעות עד ימים). לעומת זאת, 3D-FRAP מיקרוסקופ מאפשר הדמיה וכימות של העברת מירנה וניידות בזמן אמת. בנוסף פער הפונקציה תאים תא genctional, את התזוזה בין תאיים של מירנה מתווכת גם על ידי מנגנונים אחרים, כגון exosomes 18 , 29 , 30 . רק 3D-FRAP מספק רזולוציה טמפורלית גבוהה מספיק כדי להפלות בין אקסוסומלית העברת פער ג 'נטו. לפיכך, הוא מאפשר חקירה ספציפית את ההשפעה הישירה של חדירות GJ על איתות מירנה בתנאים פתולוגיים או פיזיולוגיים שונים ( Figuמחדש 2).
אנו ממליצים על שימוש 3D-FRAP, אשר עדיף על 2-FRAP קונבנציונאלי, כפי שהוא מספק נתונים מדויקים יותר על העברת מירנה GJ תלוי. 3D-FRAP מדידות כוללות את נפח התא כולו, אשר חשוב כאשר משתמשים בתאים בתפזורת גדולה. בנוסף, הוא יכול לפצות שינויים להתמקד או תנועות התא, אשר הוכחו כדי לפגוע באופן משמעותי התאוששות הקרינה 2D-FRAP ( איור 3 ). לבסוף, הקלטה של z- ערימות בניסויים 3D-FRAP מספק את האפשרות לקבל מידע מרחבי, אשר אינו ריאלי כאשר רק שכבה אחת 2D משמש לניתוח של עוצמות הקרינה ( איור 3 ב ).
מאז ההתאוששות הקרינה תלויה הזרימה של מירנה מתאי סמוכים, מספר התאים המחוברים תא מולבן הוא קריטי חייב להיות דומה על פני מדידות שונות כדי לקבל נתונים אמינים. לכן, צפיפות תא גבוהה היא דורשתD כדי להבטיח את היווצרות של אשכולות הסלולר המתאים ביותר לניתוח FRAP. יתר על כן, ניסויים ראשוניים חייבים להתבצע כדי לבחור תנאי הלבנה קלה ( כלומר, כוח לייזר, זמן הלבנה, הגדרות סריקה), כדי למנוע תופעות phototoxic שנגרם על ידי עוצמת לייזר גבוהה 25 , 26 . זה גם יעזור להפחית את photobleaching המתרחשת במהלך תהליך הרכישה.
למרות המגבלות, הנתונים שלנו מראים כי 3D-FRAP הוא כלי רב עוצמה כדי להעריך את התפקיד של miRNAs כמו מולקולות איתות בתוך הרשת הסלולרית. ההשפעה של הרכב connexin על מירנה shuttleling או חדירות סלקטיבית של GJs עבור miRNAs ספציפיים ניתן לטפל עם כימות ישירה של יעילות התחבורה. 3D-FRAP יכול לספק מידע חשוב כדי לשפר את הפיתוח של טיפולים חדשים שמציעות miRNA ו siRNA, כגון על ידי הגדרת תנאים נאותים להקל על distributioN של RNA קטנים באמצעות רשת GJ 31 , 32 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אינם מכריזים על ניגוד עניינים.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי משרד החינוך הפדרלי ומחקר גרמניה (FKZ 0312138A ו FKZ 316159), המדינה מקלנבורג-מערב פומרניה עם האיחוד האירופי מבנית קרנות (ESF / IVWM-B34-0030 / 10 ו ESF / IVBM-B35-0010 / 12), DFG (DA1296-1), ואת הלב הגרמני קרן (F / 01/12). בנוסף, RD נתמך על ידי תוכנית FORUN של המרכז הרפואי של אוניברסיטת רוסטוק (889001), קרן DAMP ו- BMBF (VIP + 00240).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| neonatal NMRI mice | Charles River | ||
| Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | 0.1% solution in PBS, sterilized |
| PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
| Dulbecco´s modified medium | Pan Biotech | P04-03550 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 U/mL, 100µg/mL |
| Fetal bovine serum | Pan Biotech | P30-3306 | |
| Cell culture plastic | TPP | ||
| Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | 88281 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 88281 | included in primary cardiomyocyte isolation kit |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| miRIDIAN Dy547 labeled microRNA Mimic | Dharmacon | CP-004500-01-05 | dissolve in RNAse free water, stock solution 20µM |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S3139 | |
| Sodium phosphate dibasic | Carl Roth | T877.2 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium chloride | Serva | 28305.01 | |
| Sodium succinate | Carl Roth | 3195.1 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA solution | Merck | L2153 | |
| 4-well- Glass bottom chamber slides | IBIDI | 80827 | coat with 0.1% gelatin solution |
| Amaxa Nucleofector II | Lonza | program G-009 was used for Electroporation | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Excel software | Microsoft | ||
| α-actinin antibody | Abcam | ab9465 | dilution 1:200 |
| Connexin43 antibody | Santa Cruz | sc-9059 | dilution 1:200 |
| goat anti-mouse Alexa 594 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11005 | dilution 1:300 |
| goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11034 | dilution 1:300 |
| Connexin43 siRNA | Thermo Fisher Scientific | AM16708 ID158724 | final concentration 250 nM |
| Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
| DAPI nuclear stain | Thermo Scientific | D1306 |
References
- Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell. 136 (4), 642-655 (2009).
- Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Grimm, D. Small silencing RNAs: state-of-the-art. Adv Drug Deliv Rev. 61 (9), 672-703 (2009).
- Raghunathan, S., Patel, B. M. Therapeutic implications of small interfering RNA in cardiovascular diseases. Fundam Clin Pharmacol. 27 (1), 1-20 (2013).
- Sluijter, J. P. G. MicroRNAs in Cardiovascular Regenerative Medicine: Directing Tissue Repair and Cellular Differentiation. ISRN Vasc Med. , 1-16 (2013).
- Li, M., Zhang, J. Circulating MicroRNAs: Potential and Emerging Biomarkers for Diagnosis of Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases. Biomed Res Int. , 1-9 (2015).
- Romaine, S. P. R., Tomaszewski, M., Condorelli, G., Samani, N. J. MicroRNAs in cardiovascular disease: an introduction for clinicians. Heart. 101 (12), 921-928 (2015).
- Maes, M., Crespo Yanguas,, Willebrords, S., Cogliati, J., Vinken, B., M, Connexin and pannexin signaling in gastrointestinal and liver disease. Transl Res. 166 (4), 332-343 (2015).
- Michela, P., Velia, V., Aldo, P., Ada, P. Role of connexin 43 in cardiovascular diseases. Eur. J. Pharmacol. 768, 71-76 (2015).
- Naus, C. C., Laird, D. W. Implications and challenges of connexin connections to cancer. Nat Rev Cancer. 10 (6), 435-441 (2010).
- Hong, X., Sin, W. C., Harris, A. L., Naus, C. C. Gap junctions modulate glioma invasion by direct transfer of microRNA. Oncotarget. 6 (17), Available from: http://www.impactjournals.com/oncotarget 15566-15577 (2015).
- Lee, H. K. H., et al. Mesenchymal stem cells deliver synthetic microRNA mimics to glioma cells and glioma stem cells and inhibit their cell migration and self-renewal. Oncotarget. 4 (2), 346-361 (2013).
- Katakowski, M., Buller, B., Wang, X., Rogers, T., Chopp, M. Functional microRNA is transferred between glioma cells. Cancer Res. 70 (21), 8259-8263 (2010).
- Zong, L., Zhu, Y., Liang, R., Zhao, H. -B. Gap junction mediated miRNA intercellular transfer and gene regulation: A novel mechanism for intercellular genetic communication. Sci Rep. 6, 19884 (2016).
- Yum, S. W., Zhang, J., Scherer, S. S. Dominant connexin26 mutants associated with human hearing loss have trans-dominant effects on connexin30. Neurobiol Dis. 38 (2), 226-236 (2010).
- Kuzma-Kuzniarska, M., Yapp, C., Pearson-Jones, T. W., Jones, A. K., Hulley, P. A. Functional assessment of gap junctions in monolayer and three-dimensional cultures of human tendon cells using fluorescence recovery after photobleaching. J Biomed Opt. 19 (1), 15001 (2013).
- Lemcke, H., Nittel, M. -L., Weiss, D. G., Kuznetsov, S. A. Neuronal differentiation requires a biphasic modulation of gap junctional intercellular communication caused by dynamic changes of connexin43 expression. Eur J Neurosci. 38 (2), 2218-2228 (2013).
- Lemcke, H., Steinhoff, G., David, R. Gap junctional shuttling of miRNA - A novel pathway of intercellular gene regulation and its prospects in clinical application. Cell Signal. 27 (12), 2506-2514 (2015).
- Lemcke, H., Kuznetsov, S. A. Involvement of connexin43 in the EGF/EGFR signalling during self-renewal and differentiation of neural progenitor cells. Cell Signal. 25 (12), 2676-2684 (2013).
- Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 98, 117-127 (2016).
- Laupheimer, M., et al. Selective Migration of Subpopulations of Bone Marrow Cells along an SDF-1 α and ATP Gradient. Bone Marrow Res. , 1-10 (2014).
- Zhang, S., Wang, Q., Liu, L., Hong, X., Zhang, Y., Tao, L. Gap junctions enhance the antiproliferative effect of microRNA-124-3p in glioblastoma cells. J Cell Physiol Physiol. 230 (10), 2476-2488 (2015).
- Vasilescu, C., Tanase, M., Dragomir, M., Calin, G. A. From mobility to crosstalk. A model of intracellular miRNAs motion may explain the RNAs interaction mechanism on the basis of target subcellular localization. Math Biosci. 280, 50-61 (2016).
- Pitchiaya, S., Androsavich, J. R., Walter, N. G. Intracellular single molecule microscopy reveals two kinetically distinct pathways for microRNA assembly. EMBO Rep. 13 (8), 709-715 (2012).
- Heinze, K. G., Costantino, S., De Koninck, P., Wiseman, P. W. Beyond photobleaching, laser illumination unbinds fluorescent proteins. J Phys Chem B. 113 (15), 5225-5233 (2009).
- Jou, M. J., Jou, S. B., Guo, M. J., Wu, H. Y., Peng, T. I. Mitochondrial reactive oxygen species generation and calcium increase induced by visible light in astrocytes. Ann N Y Acad Sci. 1011, 45-56 (2004).
- Dong, H., Lei, J., Ding, L., Wen, Y., Ju, H., Zhang, X. MicroRNA: Function, detection, and bioanalysis. Chem Rev. 113 (8), 6207-6233 (2013).
- Liang, Y., Ridzon, D., Wong, L., Chen, C. Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues. BMC Genomics. 8 (1), 166 (2007).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat Commun. 2, 282 (2011).
- Squadrito, M. L., et al. Endogenous RNAs Modulate MicroRNA Sorting to Exosomes and Transfer to Acceptor Cells. Cell Rep. 8, 1432-1446 (2014).
- Zhang, B., Farwell, M. A. microRNAs: a new emerging class of players for disease diagnostics and gene therapy. J Cell Mol Med. 12 (1), 3-21 (2008).
- Chen, Y., Gao, D. -Y., Huang, L. In vivo delivery of miRNAs for cancer therapy: Challenges and strategies. Adv Drug Deliv Rev. 81C, 128-141 (2015).
