Summary
Здесь мы описываем применение трехмерного восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (3D-FRAP) для анализа зависимого от щелевого перехода челнока miRNA. В отличие от общепринятых методов, 3D-FRAP позволяет количественно определять межклеточный перенос малых РНК в реальном времени с высоким пространственно-временным разрешением.
Abstract
Малые антисмысловые РНК, такие как miRNA и siRNA, играют важную роль в клеточной физиологии и патологии и, более того, могут быть использованы в качестве терапевтических агентов для лечения нескольких заболеваний. Разработка новых инновационных стратегий терапии miRNA / siRNA основана на обширном знании основных механизмов. Недавние данные свидетельствуют о том, что небольшие РНК обмениваются между клетками в зависимом от щелевого соединения образом, тем самым индуцируя регуляторные эффекты гена в клетке-реципиенте. Молекулярно-биологические методы и проточный цитометрический анализ обычно используются для изучения межклеточного обмена miRNA. Однако эти методы не обеспечивают высокого временного разрешения, что необходимо при изучении щелевого взаимодействия молекул. Поэтому для исследования влияния miRNA / siRNA в качестве межклеточных сигнальных молекул необходимы новые инструменты, которые позволят проанализировать эти небольшие РНК на клеточном уровне. В настоящем протоколе описывается ap(3D-FRAP) микроскопии для выяснения взаимозависимого обмена молекул miRNA между сердечными клетками. Важно отметить, что этот простой и неинвазивный подход к визуализации живых клеток позволяет визуализировать и количественно измерять щелевую синхронизацию флуоресцентно меченных малых РНК в реальном времени с высоким пространственно-временным разрешением. Данные, полученные 3D-FRAP, подтверждают новый путь регуляции межклеточного гена, где небольшие РНК действуют как сигнальные молекулы внутри межклеточной сети.
Introduction
Малые некодирующие РНК являются важными игроками в регуляции клеточных генов. Эти молекулы состоят из 20-25 нуклеотидов, которые связываются с специфической мишенью-мРНК, что приводит к блокировке трансляции или деградации мРНК 1 , 2 . Процесс регуляции генов, осуществляемый малыми РНК, такими как miRNA и siRNA, является высококонсервативным механизмом, который был обнаружен у многих разных видов 3 . В частности, молекулы miRNA имеют решающее значение для различных физиологических процессов, включая пролиферацию, дифференцировку и регенерацию 4 , 5 . Кроме того, дисрегуляция экспрессии miRNA объясняется многими патологическими нарушениями. Соответственно, miRNAs были признаны пригодными в качестве биомаркеров для диагностики и в качестве терапевтических агентов для генной терапии 6 , 7
Разрывные соединения (GJ) являются специализированными белковыми структурами в плазматической мембране двух смежных клеток, которые позволяют диффузионный обмен молекулами с молекулярной массой до 1 кД. Было показано, что они важны для развития тканей, дифференцировки, гибели клеток и патологических нарушений, таких как рак или сердечно-сосудистые заболевания 8 , 9 , 10 . Несколько молекул описаны как способные пересекать GJ-каналы, включая ионы, метаболиты и нуклеотиды. Интересно, что ГД также были найдены, чтобы обеспечить путь для межклеточного движения малых РНК 11 , 12 . Таким образом, miRNAs могут действовать не только внутри клетки, в которой они производятся, но также и внутри клеток-реципиентов. Это подчеркивает роль miRNAs в межклеточной системе трансдукции сигнала. В то же время данные демонстрируютЭта щелевая межклеточная связь тесно связана с функцией miRNA. Из-за значительного воздействия miRNA и GJ на гомеостаз, патологию и диагностику тканей, всестороннее понимание функции GJs и связанной с ними межклеточной динамики miRNA поможет прояснить механизмы заболеваний, основанных на miRNA, и разработать новые стратегии для MiRNA-терапии.
В зависимости от степени щелевого взаимодействия, передача молекул miRNA между клетками может быть очень быстрым процессом. Поэтому требуется методология, позволяющая визуализировать и количественно определять быстрое межклеточное перемещение этих регулирующих сигнальных молекул. Как правило, проточная цитометрия и молекулярно-биологические методы были применены для демонстрации челночного движения небольших РНК 11 , 12 , 13 , 14 . Однако, в отличие от микроскопов FRAPКопии, эти подходы не имеют высокого временного разрешения, что является обязательным при анализе обмена miRNA через GJs. Кроме того, микроскопия FRAP менее инвазивна и поэтому представляет собой мощный и новый метод визуализации живых клеток для оценки GJ-зависимого обмена молекулами в нескольких типах клеток 15 , 16 , 17 .
Здесь мы приводим подробный протокол, описывающий применение 3D-FRAP для оценки транскрипции miRNA между кардиомиоцитами. С этой целью кардиомиоциты трансфицировали флуоресцентно меченной миРНК. Клетка, отмеченная этой miRNA, была фотоэлементами, и повторный приток межклеточной миРНК из смежных клеток регистрировался зависящим от времени образом. Высокое временное разрешение экспериментов FRAP дает возможность проводить кинетические исследования для точной оценки межклеточного переноса miRNA и siRNA между живыми клетками. MoreoVer, так как небольшие РНК могут быть обменены с помощью разных механизмов с сильно различной кинетикой, FRAP-микроскопия может помочь выяснить, в какой степени ГД участвуют в соответствующих процессах челночного процесса. Кроме того, 3D-FRAP можно использовать для исследования физиологических и патологических изменений проницаемости GJ и его влияния на перенос малых РНК 15 , 19 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все этапы этого протокола с участием неонатальных мышей были выполнены в соответствии с этическими принципами ухода за животными в Медицинском центре Университета Ростока.
1. Приготовление блюд для клеточной культуры и среды для культуры кардиомиоцитов
- Нанесите культуральную пластинку для клеток с 0,1% желатина в PBS и инкубируйте при 37 ° C в течение 4 часов или при 4 ° C в течение ночи. Удалите желатин и дайте ему высохнуть при стерильном ламинарном потоке воздуха.
- Подготовьте среду для культивирования клеток, состоящую из 50 мл DMEM, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина (P / S). Подогрейте его до 37 ° C.
2. Выделение неонатальных кардиомиоцитов
- Пожертвуйте неонатальных мышей (1-2 дня) путем обезглавливания стерильными ножницами и откройте сундук вдоль грудины. Удалите сердце, используя щипцы, слегка прижимая грудную клетку и перенося сердце в 24-луночный планшет, содержащий ледяную HBSS(Без Ca 2+ и Mg 2+ ).
- Удалите несердечную ткань и более крупные сосуды, используя стерильные щипцы. Перенесите очищенные сердца в пробирку объемом 1,5 мл, содержащую ледяную HBSS. Используйте максимум 5 сердец на пробирку для ферментативного переваривания.
- Наполните сердца маленькими ножницами в <0,5 до 1 мм³ штук.
- Вымойте измельченные сердца с помощью HBSS два раза путем аспирации / добавления HBSS с использованием пипетки с микролитом объемом 1 мл. Перед добавлением ферментов полностью удалите HBSS.
- Для ферментативного расщепления новорожденных сердец используйте коммерчески доступный комплект и следуйте протоколу производителя (см. Таблицу материалов ). Встряхивайте пробирку, содержащую измельченные сердца каждые 5 мин, при инкубации с ферментами при 37 ° С в течение 35 мин.
- Семена взвешенных клеток на не покрытых оболочкой клеточных культурах, содержащих среду для культивирования клеток, в течение 1,5-2 ч, чтобы обеспечить прилипание некардиомиоцитарной фракции. Повторите этот шаг, если высокая чистотаКардиомиоцитов. При желании дополнительно культивируют фракцию, не являющуюся кардиомиоцитом.
ПРИМЕЧАНИЕ. Для клеточной суспензии из 15 сердец этап предварительной обработки может быть выполнен на колбах для культивирования клеток размером 75 см2. Как правило, ~ 5 × 10 5 клеток получают из одного неонатального сердца. - Собирают супернатант в 15 мл конической пробирке и центрифугируют в течение 10 мин при 300 х g. Ресуспендируют клетки в 1 мл среды для культивирования клеток.
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра камеры Нойбауэра или используйте эквивалентный метод.
- Пластинчатые кардиомиоциты на 6-луночных планшетах с плотностью 3 × 10 5 клеток / см². Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 ° С и 5% СО 2 .
ПРИМЕЧАНИЕ. При необходимости клетки также могут быть трансфицированы в этот момент. Однако повышенная жизнеспособность наблюдалась, когда клетки культивировали в течение одного дня, прежде чем подвергали электропорации.
3. Трансфекция флуоресцентной меткой miRNA
- пред-(См. Шаг 1.2) до 37 ° C на водяной бане или эквивалентном устройстве.
- Подготовьте 20 мкМ исходный раствор флуоресцентной miRNA в свободной от RNase стерильной воде.
- Подготовьте буфер для электропорации, содержащий 90 мМ Na 2 HPO 4 , 90 мМ NaH 2 PO 4 , 5 мМ KCl, 10 мМ MgCl 2 и 10 мМ сукцинат натрия и доведите pH до 7,2; Буфер электропорации можно хранить при -20 ° C в течение нескольких месяцев.
- Отсоедините клетки от культуральной чашки, используя 0,05% трипсина в течение 5 мин. Инактивируйте трипсин, добавив среду для культивирования клеток.
- Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра камеры Нойбауэра или используйте эквивалентный метод. Центрифугировать клетки при 300 мкг в течение 10 мин.
- Ресуспендируют клетки в буфере для электропорации, чтобы получить концентрацию 4 × 10 5 клеток на 100 мкл.
- Смешайте 100 мкл клеточной суспензии с флуоресцентной miRNA (конечная концентрация: 0,25 мкМ) в пробирке иЗагружают смесь в кювету электропорации.
- Эмпирически определите соответствующее количество miRNA, в зависимости от типа клетки.
- Выполните электропорацию с помощью устройства электропорации (см. Таблицу материалов ), используя программу «G-009».
- Добавьте 500 мкл предварительно нагретой клеточной культуральной среды и перенесите целую клеточную суспензию (4 × 10 5 клеток) в лунку 4-луночного стекла со стеклянным дном. Культуру клеток в течение 1 дня при 37 ° С в атмосфере 5% CO 2 .
ПРИМЕЧАНИЕ. Для анализа FRAP плотность клеток ~ 80% является оптимальной. Трансфекцию меченой miRNA следует выполнять исключительно электропорацией. Поскольку гомогенное распределение меченых молекул miRNA выгодно для измерения FRAP, трансфекция на основе реагентов не рекомендуется.
4. Применение микроскопии 3D-FRAP (3-й день)
- Разогрейте микроскоп-инкубатор до 37 °C и включите систему конфокального микроскопа не менее чем за 2 часа до измерения FRAP, чтобы установить тепловое равновесие и уменьшить вероятность дрейфа. Если возможно, поддерживайте 5% СО 2 -ную атмосферу.
- Вставьте камеру в держатель образца образца.
- Найдите кластер трансфицированных кардиомиоцитов с использованием масляного объектива 1,4 NA (увеличение 400X) и лазера с возбуждением 561 нм при низкой мощности лазера с диапазоном обнаружения 570-680 нм.
ПРИМЕЧАНИЕ. Определение настроек FRAP, получение изображений и анализ проводились с использованием программного обеспечения для микроскопа (см. Таблицу материалов ). - Активируйте кнопки «z-Stack», «Time Series», «Bleaching» и «Regions» в «Setup Manager».
- Определите параметры FRAP.
- Определите настройки получения изображения в меню «Режим сбора данных», установив «размер кадра4; До 512 x 512, «шаг линии» до 1 и «время сканирования» до <1 с.
- В меню «Каналы» отрегулируйте настройки мощности, смещения и усиления лазера, чтобы получить максимальную флуоресценцию от минимального лазерного возбуждения ( например, мощность лазера: 1-5%); Отрегулируйте, чтобы избежать насыщения интенсивности. Установите «размер отверстия» до 2 мкм.
- Затем в меню «Регионы» выберите «Инструмент рисования ROI» и используйте курсор для отметки целевой ячейки, контрольной ячейки и области фона. При необходимости выберите несколько целевых ячеек для фотообесцвечивания.
- Отрегулируйте параметры фотообесцвечивания в меню «Отбеливание» ( например, итерации: 9-14, мощность лазера для фотообесцвечивания: 100%, интервал получения изображения: 60 с, циклы: 15). Определите начало отбеливания после трех начальных сканирований.
- В меню «z-Stack» определите пределы для сбора z-стека в зависимости от толщины ячеек. Отрегулируйте «число oF z-layers "до 12 - 15.
- Запустите эксперимент FRAP и зарегистрируйте восстановление флуоресценции.
ПРИМЕЧАНИЕ. Поскольку настройки эксперимента FRAP зависят от типа ячейки, флуоресцентного красителя и системы микроскопа, лучше всего провести экспериментальные эксперименты для определения оптимальных параметров для FRAP. Отбеливание должно быть достаточным, чтобы уменьшить начальную интенсивность флуоресценции не менее чем на 50%. Как правило, восстановление флуоресценции следует регистрировать каждые 30-60 с до достижения фазы плато.
5. Анализ данных
- Создайте максимальные проекции полученных z-стеков и получите значения интенсивности флуоресценции отбеленных клеток-мишеней, контрольной ячейки и фона. Используя программное обеспечение, специфичное для микроскопа, нажмите «Обработка» → «Максимальная проекция интенсивности» → выберите файл → «Применить».
- В качестве альтернативы используйте инструмент анализа эквивалентного изображения (
- В качестве альтернативы используйте инструмент анализа эквивалентного изображения (
- Скопируйте данные интенсивности флуоресценции во все моменты времени из ячейки-мишени, фона и контрольной ячейки в электронную таблицу.
- Вычтите интенсивность фона и интенсивность эталонной ячейки из значений интенсивности ячейки-мишени, чтобы исправить фотообесцвечивание, вызванное в процессе получения. Выполните коррекцию фоновой и опорной ячейки для каждой временной точки.
- Нормализовать скорректированные данные FRAP до начальной интенсивности флуоресценции перед отбеливанием путем деления каждого значения на начальную флуоресценцию.
- Чтобы получить кривые FRAP, установите базовую линию на интенсивность флуоресценции сразу после отбеливателя путем вычитания из значений интенсивности каждой временной точки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Здесь мы представляем 3D-FRAP-микроскопию как неинвазивную методику для изучения щелевого взаимодействия с флуоресцентной miRNA в неонатальных кардиомиоцитах. Выделенные кардиомиоциты выявили типичную полосатую структуру α-актинина и содержали большие бляшки Cx43 вдоль границ клеточных ячеек ( рис. 1A , белые наконечники стрел), что давало высокий межклеточный поток молекул. Чистоту изолированных кардиомиоцитов оценивали по микроскопической количественной оценке α-актининоположительных клеток. Хотя в культуре присутствовали некоторые некардиомиоциты (α-актининоотрицательные клетки), кардиомиоциты новорожденных представляли собой основной тип клеток после выделения (79,62 ± 3,68%, фиг. 1B ).
Чтобы исследовать щелевой обменный обмен miRNA, клетки трансфицировали флуоресцентно мечеными miRNA. EleCroroporation - это метод выбора для доставки молекул miRNA в клетки, поскольку он обеспечивает высокую эффективность трансфекции и гомогенное распределение трансфецированных соединений, что является обязательным для анализа FRAP. В нашей экспериментальной установке мы достигли эффективности трансфекции ~ 45%, как определено проточной цитометрией ( рис. 2А ). Подготовка кардиомиоцитов для FRAP включает отрыв от культуральной пластины, электропорацию и повторное присоединение к камерным слайдам. Цитометрический анализ живого / мертвого протока показал, что большинство клеток демонстрируют высокую жизнеспособность, что важно при анализе связи с развязкой ( рисунок 2B ). Более того, плотность клеток является критическим параметром, который влияет на результаты FRAP. Для оптимальных измерений FRAP клетки должны быть засеяны с плотностью ~ 80%, чтобы обеспечить образование кластеров клеток и установление функциональных щелевых соединений между ячейками ( рис.2С).
Для анализа FRAP клетки-мишени выбираются внутри кластера клеток и отбрасываются фотоэлементом со 100% -ной мощностью лазера, что приводит к уменьшению флуоресценции miRNA в выбранных клетках ( фиг. 3A , отбеливатель). Затем регистрируют восстановление флуоресценции для визуализации переноса miRNA из соседних клеток в отбеленную область. Поскольку фаза плато восстановления флуоресценции была достигнута через 13 минут, этот временной интервал использовался для получения изображения в экспериментах FRAP. Количественный анализ и нормализация полученных данных показали среднее восстановление на 20%. Данные также продемонстрировали, что микроскопия FRAP позволяет быстро регистрировать челнок с miRNA с высоким временным разрешением. В зависимости от свойств красителя параметры сбора могут быть изменены для дальнейшего увеличения временного разрешения.
Использование 3D-FRAP позволяетСравнение GJ-проницаемости с miRNA в разных условиях. Чтобы продемонстрировать это, мы индуцировали siRNA-опосредованный нокдаун Cx43, что привело к уменьшению экспрессии белка ( фиг. 3C ) и ингибированию связи с развязкой. В результате восстановление флуоресценции было снижено более чем на 50%, что указывает на то, что эффективность переноса miRNA сильно зависит от степени щелевой связи между клетками ( рис. 3B , нокдаун Cx43). Чтобы подтвердить, что восстановление флуоресценции отражает прохождение флуоресцентно меченой miRNA, а не отсоединенный Dy547-тег, мы также приобрели данные FRAP для кальцеинового красителя ( рисунок 3D ). Кальцеин имеет молекулярную массу, сравнимую с молекулярной массой Dy547 и, таким образом, обладает аналогичной динамикой переноса. В отличие от восстановления флуоресценции меченой по Dy547 miRNA, кальцеин продемонстрировал увеличение обменного обмена, что указывает на то, что тег Dy547 iS не отделяется от молекулы miRNA ( рис. 3D ).
Стабильные фокусные условия являются обязательными во время эксперимента FRAP, особенно при длительных измерениях. По сравнению с 2D-приложениями 3D-FRAP может компенсировать потенциальный дрейф фокуса. Как показано на рисунке 4 , даже небольшие изменения фокуса влияют на правильное обнаружение сигнала флуоресценции miRNA, когда для эксперимента FRAP используется только один 2D-слой ( рисунок 4B ). Напротив, для 3D-FRAP записывается весь z-стек ячейки-мишени, а максимальные проекции подвергаются анализу данных ( рисунок 4A ). Влияние дрейфа фокуса на нормированные кривые интенсивности флуоресценции показано на рисунке 4C . В то время как восстановление флуоресценции неуклонно возрастает с течением времени в 3D-FRAP, результаты 2D-FRAP приводят к снижению oF - сигнал флуоресценции.
Помимо компенсации изменений фокуса, 3D-FRAP также предоставляет пространственные данные о раздельном обменном обмене miRNA. На рисунке 5 показан 3D-рендеринг FRAP-эксперимента. По сравнению с максимальными проекциями приобретение z-стеков может быть использовано для создания 3D-реконструкций для исследования локализации и мобильности miRNA в клетках ( рис. 5 ). Совместная маркировка органеллами позволит исследовать участие других клеточных компонентов в переносе miRNA.
Рисунок 1: Типичные микроскопические изображения изолированных кардиомиоцитов новорожденных. ( A ) Структурная осветительная микроскопия показывает высокую экспрессию Cx43, которая накапливается в больших pЛаки на границах клеточных ячеек (наконечники стрел). Выраженное образование генов с соседними клетками позволяет осуществлять обширный обмен небольшими молекулами, включая miRNA. Шкала шкалы = 20 мкм ( B ) Чистота изолированных кардиомиоцитов. Маркировка α-актинина демонстрирует, что кардиомиоциты представляют собой основной тип клеток после выделения. Шкала шкалы = 50 мкм. Клетки окрашивали анти-Cx43 (зеленым) и анти-α-актининовым антителом (красный). Ядра были визуализированы с использованием DAPI (синий). Описание структурированной осветительной микроскопии и иммунологической маркировки представлено в предыдущих публикациях 20 . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Эффективность трансфекции, жизнеспособность , И плотность клеток культуры новорожденных кардиомиоцитов. ( A ) Потоковая цитометрия показала, что электропорация miR547 приводила к эффективности трансфекции ~ 45%. ( B ) Жизнеспособность клеток кардиомиоцитов, используемых для FRAP. После изоляции, электропорации и повторного прикрепления кардиомиоциты подвергались окрашиванию живыми и мертвыми клетками и демонстрировали высокую жизнеспособность клеток. ( C ) Микроскопическое изображение трансфецированных mir547 кардиомиоцитов, полученных для микроскопии FRAP. Плотность клеток 80-90% обеспечивает ярко выраженное образование щелевых контактных клеток. Шкала шкалы = 50 мкм. Метод проточного цитометрического анализа эффективности трансфекции и окраски жизнеспособности упоминается в предыдущих публикациях 20 , 21 . Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: GJ-зависимый обмен miRNA в кардиомиоцитах новорожденных. ( A ) Репрезентативные изображения эксперимента FRAP. После трансфекции меченой миРНК клетки-мишени в клеточном кластере подвергаются фотоэлементам с помощью сильного лазерного импульса (до отбеливания и отбеливания). В зависимости от степени щелевого взаимодействия соединение щелевого взаимодействия miRNA из смежных клеток приводит к увеличению интенсивности флуоресценции в отбеленных клетках-мишенях (после отбеливания t = 3, 6, 9 и 13 мин). Шкала шкалы = 20 мкм ( B ). Количественный анализ полученных данных FRAP показывает восстановление флуоресценции 20% через 13 мин. Чтобы подтвердить участие GJ в межклеточном переносе miRNA, был проведен нокдаун cx43, что привело к сильному снижению восстановления флуоресценции (50%). ( C ) Иммуноокрашивание анти-Cx43Антитела и последующей конфокальной микроскопии демонстрируют эффективность нокдауна Cx43 на уровне белка. Шкала шкалы = 50 мкм. ( D ) Сравнение данных FRAP miR547 и кальцеинового красителя показывает разную динамику переноса. Более низкая молекулярная масса кальцеина приводила к увеличению регенерации флуоресценции по сравнению с молекулами miRNA, меченными dy547. Кривые FRAP суммируют данные n ≥56 клеток, показанные как среднее ± SEM. Статистический анализ проводили с использованием двухстороннего ANOVA с последующим постходовым тестом Бонферрони (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Компенсация фокуса при использовании 3D-FRAP-микроскопии. (
Рисунок 5: 3D-визуализация 3D-FRAP-эксперимента. (Слева) Максимальные выходы измерения FRAP. Фотоэлементная ячейка (красная рамка) демонстрирует увеличение интенсивности флуоресценции из-за переноса miRNA из соседних клеток. (Справа) Приобретенные z-стеки той же фотообесцвеченной ячейки (красный) были подвергнуты 3D-визуализации поверхности, чтобы визуализировать пространственное распределение miRNA. Шкала шкалы = 20 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MiRNAs являются ключевыми игроками в клеточной физиологии и, как было показано, действуют как сигнальные молекулы, используя, среди прочего, GJ как путь межклеточного обмена 11 , 12 , 22 . Текущий протокол представляет собой метод визуализации живых клеток in vitro, чтобы охарактеризовать этот GJ-зависимый челночный с использованием флуоресцентных miRNAs в клеточных кластерах.
Протокол был разработан на кардиомиоцитах в качестве системы клеточной модели. Однако этот подход может быть применен к нескольким типам клеток, если электропорация является подходящим методом трансфекции miRNA. В дополнение к обмену между клетками представленная методика также подходит для исследования внутриклеточной подвижности молекул miRNA ( например, для идентификации возможных механизмов транспорта внутри клетки) 23 , 24 .
Содержание »> Исследование переноса miRNA с помощью FRAP-микроскопии требует флуоресцентно меченых молекул miRNA ( рисунок 2 ). Поскольку маркировка специфических клеточных миРНК не представляется возможной, для 3D-FRAP можно использовать только экзогенную введенную меченую миРНК для анализа ее межклеточной подвижности В наших экспериментах клетки трансфецировали 250 мкМ miRNA.Эта концентрация была намного выше по сравнению с физиологическими условиями, где уровень miRNA колеблется от 10 до 50000 молекул на клетку 27 , 28. Такие низкие концентрации не могут быть использованы в экспериментах FRAP, Так как определенный уровень флуоресцентных молекул miRNA необходим для получения достаточного сигнала флуоресценции и для обеспечения надлежащей дискриминации фоновой флуоресценции и флуоресцентно меченной миРНК. Однако в зависимости от конфокальной системы визуализации и свойств красителя использование концентраций miRNA при низких -NM диапазон должен быть осуществим для анализа FRAP. </ Р>Различные методы обычно применяются для изучения межклеточной миграции miRNA, включая проточную цитометрию, ПЦР и референс-анализы люциферазы 12 , 13 . Эти методы обнаруживают трансляцию miRNA с низким временным разрешением ( т. Е. От часов до дней). Напротив, 3D-FRAP-микроскопия позволяет визуализировать и количественно определять перенос miRNA и мобильность в реальном времени. В дополнение к щелевым контактным клеточным контактам межклеточный челнок miRNA также опосредуется другими механизмами, такими как экзосомы 18 , 29 , 30 . Только 3D-FRAP обеспечивает достаточно высокое временное разрешение для различения экзосомального и щелевого перехода. Таким образом, это позволяет провести конкретное исследование прямого влияния проницаемости GJ на сигнализацию miRNA в различных патологических или физиологических условиях ( FiguRe 2).
Мы рекомендуем использовать 3D-FRAP, который превосходит обычный 2D-FRAP, поскольку он дает более точные данные о GJ-зависимой передаче miRNA. Измерения 3D-FRAP включают в себя весь объем ячейки, что важно при использовании типов массивов большой массы. Кроме того, он может компенсировать изменения фокусировки или движения клеток, которые, как было показано, значительно ухудшают восстановление флуоресценции в 2D-FRAP ( рисунок 3 ). Наконец, запись z-стеков в 3D-FRAP-экспериментах дает возможность получить пространственную информацию, что невозможно, если для анализа интенсивности флуоресценции используется только один 2D-слой ( рисунок 3B ).
Поскольку восстановление флуоресценции зависит от притока miRNA из соседних клеток, количество клеток, связанных с отбеленной клеткой, является критическим и должно быть одинаковым для разных измерений для получения надежных данных. Поэтому требуется высокая плотность клетокD для обеспечения формирования клеточных кластеров, наиболее подходящих для анализа FRAP. Кроме того, необходимо провести предварительные эксперименты, чтобы выбрать мягкие условия отбеливания ( то есть мощность лазера, время отбеливания и настройки сканирования), чтобы избежать фототоксических эффектов, вызванных высокой интенсивностью лазера 25 , 26 . Это также поможет уменьшить фотообесцвечивание, которое происходит во время процесса приобретения.
Несмотря на ограничения, наши данные показывают, что 3D-FRAP является мощным инструментом для оценки роли miRNAs в качестве сигнальных молекул в сотовой сети. Влияние состава коннексина на перенаправление miRNA или селективную проницаемость GJ для конкретных miRNAs можно решить с помощью прямой количественной оценки эффективности транспорта. 3D-FRAP может предоставить важную информацию для улучшения разработки новых методов лечения с использованием miRNA и siRNA, например, путем определения надлежащих условий, которые облегчают распространениеN небольших РНК через сеть GJ 31 , 32 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы объявили, что нет никаких конфликтов интересов.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Федеральным министерством образования и исследований Германии (FKZ 0312138A и FKZ 316159), Государственным Мекленбург-Передняя Померания с Структурными фондами ЕС (ESF / IVWM-B34-0030 / 10 и ESF / IVBM-B35-0010 / 12), DFG (DA1296-1) и Германский сердечный фонд (F / 01/12). Кроме того, RD поддерживается Программой FORUN Медицинского центра Университета Ростока (889001), Фонда DAMP и BMBF (VIP + 00240).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| neonatal NMRI mice | Charles River | ||
| Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | 0.1% solution in PBS, sterilized |
| PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
| Dulbecco´s modified medium | Pan Biotech | P04-03550 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 U/mL, 100µg/mL |
| Fetal bovine serum | Pan Biotech | P30-3306 | |
| Cell culture plastic | TPP | ||
| Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | 88281 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 88281 | included in primary cardiomyocyte isolation kit |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| miRIDIAN Dy547 labeled microRNA Mimic | Dharmacon | CP-004500-01-05 | dissolve in RNAse free water, stock solution 20µM |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S3139 | |
| Sodium phosphate dibasic | Carl Roth | T877.2 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium chloride | Serva | 28305.01 | |
| Sodium succinate | Carl Roth | 3195.1 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA solution | Merck | L2153 | |
| 4-well- Glass bottom chamber slides | IBIDI | 80827 | coat with 0.1% gelatin solution |
| Amaxa Nucleofector II | Lonza | program G-009 was used for Electroporation | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Excel software | Microsoft | ||
| α-actinin antibody | Abcam | ab9465 | dilution 1:200 |
| Connexin43 antibody | Santa Cruz | sc-9059 | dilution 1:200 |
| goat anti-mouse Alexa 594 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11005 | dilution 1:300 |
| goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11034 | dilution 1:300 |
| Connexin43 siRNA | Thermo Fisher Scientific | AM16708 ID158724 | final concentration 250 nM |
| Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
| DAPI nuclear stain | Thermo Scientific | D1306 |
References
- Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell. 136 (4), 642-655 (2009).
- Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Grimm, D. Small silencing RNAs: state-of-the-art. Adv Drug Deliv Rev. 61 (9), 672-703 (2009).
- Raghunathan, S., Patel, B. M. Therapeutic implications of small interfering RNA in cardiovascular diseases. Fundam Clin Pharmacol. 27 (1), 1-20 (2013).
- Sluijter, J. P. G. MicroRNAs in Cardiovascular Regenerative Medicine: Directing Tissue Repair and Cellular Differentiation. ISRN Vasc Med. , 1-16 (2013).
- Li, M., Zhang, J. Circulating MicroRNAs: Potential and Emerging Biomarkers for Diagnosis of Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases. Biomed Res Int. , 1-9 (2015).
- Romaine, S. P. R., Tomaszewski, M., Condorelli, G., Samani, N. J. MicroRNAs in cardiovascular disease: an introduction for clinicians. Heart. 101 (12), 921-928 (2015).
- Maes, M., Crespo Yanguas,, Willebrords, S., Cogliati, J., Vinken, B., M, Connexin and pannexin signaling in gastrointestinal and liver disease. Transl Res. 166 (4), 332-343 (2015).
- Michela, P., Velia, V., Aldo, P., Ada, P. Role of connexin 43 in cardiovascular diseases. Eur. J. Pharmacol. 768, 71-76 (2015).
- Naus, C. C., Laird, D. W. Implications and challenges of connexin connections to cancer. Nat Rev Cancer. 10 (6), 435-441 (2010).
- Hong, X., Sin, W. C., Harris, A. L., Naus, C. C. Gap junctions modulate glioma invasion by direct transfer of microRNA. Oncotarget. 6 (17), Available from: http://www.impactjournals.com/oncotarget 15566-15577 (2015).
- Lee, H. K. H., et al. Mesenchymal stem cells deliver synthetic microRNA mimics to glioma cells and glioma stem cells and inhibit their cell migration and self-renewal. Oncotarget. 4 (2), 346-361 (2013).
- Katakowski, M., Buller, B., Wang, X., Rogers, T., Chopp, M. Functional microRNA is transferred between glioma cells. Cancer Res. 70 (21), 8259-8263 (2010).
- Zong, L., Zhu, Y., Liang, R., Zhao, H. -B. Gap junction mediated miRNA intercellular transfer and gene regulation: A novel mechanism for intercellular genetic communication. Sci Rep. 6, 19884 (2016).
- Yum, S. W., Zhang, J., Scherer, S. S. Dominant connexin26 mutants associated with human hearing loss have trans-dominant effects on connexin30. Neurobiol Dis. 38 (2), 226-236 (2010).
- Kuzma-Kuzniarska, M., Yapp, C., Pearson-Jones, T. W., Jones, A. K., Hulley, P. A. Functional assessment of gap junctions in monolayer and three-dimensional cultures of human tendon cells using fluorescence recovery after photobleaching. J Biomed Opt. 19 (1), 15001 (2013).
- Lemcke, H., Nittel, M. -L., Weiss, D. G., Kuznetsov, S. A. Neuronal differentiation requires a biphasic modulation of gap junctional intercellular communication caused by dynamic changes of connexin43 expression. Eur J Neurosci. 38 (2), 2218-2228 (2013).
- Lemcke, H., Steinhoff, G., David, R. Gap junctional shuttling of miRNA - A novel pathway of intercellular gene regulation and its prospects in clinical application. Cell Signal. 27 (12), 2506-2514 (2015).
- Lemcke, H., Kuznetsov, S. A. Involvement of connexin43 in the EGF/EGFR signalling during self-renewal and differentiation of neural progenitor cells. Cell Signal. 25 (12), 2676-2684 (2013).
- Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 98, 117-127 (2016).
- Laupheimer, M., et al. Selective Migration of Subpopulations of Bone Marrow Cells along an SDF-1 α and ATP Gradient. Bone Marrow Res. , 1-10 (2014).
- Zhang, S., Wang, Q., Liu, L., Hong, X., Zhang, Y., Tao, L. Gap junctions enhance the antiproliferative effect of microRNA-124-3p in glioblastoma cells. J Cell Physiol Physiol. 230 (10), 2476-2488 (2015).
- Vasilescu, C., Tanase, M., Dragomir, M., Calin, G. A. From mobility to crosstalk. A model of intracellular miRNAs motion may explain the RNAs interaction mechanism on the basis of target subcellular localization. Math Biosci. 280, 50-61 (2016).
- Pitchiaya, S., Androsavich, J. R., Walter, N. G. Intracellular single molecule microscopy reveals two kinetically distinct pathways for microRNA assembly. EMBO Rep. 13 (8), 709-715 (2012).
- Heinze, K. G., Costantino, S., De Koninck, P., Wiseman, P. W. Beyond photobleaching, laser illumination unbinds fluorescent proteins. J Phys Chem B. 113 (15), 5225-5233 (2009).
- Jou, M. J., Jou, S. B., Guo, M. J., Wu, H. Y., Peng, T. I. Mitochondrial reactive oxygen species generation and calcium increase induced by visible light in astrocytes. Ann N Y Acad Sci. 1011, 45-56 (2004).
- Dong, H., Lei, J., Ding, L., Wen, Y., Ju, H., Zhang, X. MicroRNA: Function, detection, and bioanalysis. Chem Rev. 113 (8), 6207-6233 (2013).
- Liang, Y., Ridzon, D., Wong, L., Chen, C. Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues. BMC Genomics. 8 (1), 166 (2007).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat Commun. 2, 282 (2011).
- Squadrito, M. L., et al. Endogenous RNAs Modulate MicroRNA Sorting to Exosomes and Transfer to Acceptor Cells. Cell Rep. 8, 1432-1446 (2014).
- Zhang, B., Farwell, M. A. microRNAs: a new emerging class of players for disease diagnostics and gene therapy. J Cell Mol Med. 12 (1), 3-21 (2008).
- Chen, Y., Gao, D. -Y., Huang, L. In vivo delivery of miRNAs for cancer therapy: Challenges and strategies. Adv Drug Deliv Rev. 81C, 128-141 (2015).
