Summary
Qui descriviamo l'applicazione del recupero di fluorescenza tridimensionale dopo la fotopolimerizzazione (3D-FRAP) per l'analisi della shuttling di miRNA dipendente dalla giunzione di giunzione. In contrasto con i metodi comunemente applicati, il 3D-FRAP consente la quantificazione del trasferimento intercellulare di piccoli RNA in tempo reale, con un'elevata risoluzione spaziatura temporale.
Abstract
I piccoli RNA antisensivi, come miRNA e siRNA, svolgono un ruolo importante nella fisiologia cellulare e nella patologia e, inoltre, possono essere utilizzati come agenti terapeutici nel trattamento di diverse malattie. Lo sviluppo di nuove strategie innovative per la miRNA / siRNA terapia si basa su una vasta conoscenza dei meccanismi sottostanti. Recenti dati suggeriscono che piccoli RNAs siano scambiati tra le cellule in un modo di dipendenza dalla giunzione gap, inducendo quindi effetti regolatori genetici nella cellula ricevente. Le tecniche biologiche molecolari e l'analisi citometrica a flusso sono comunemente utilizzate per studiare lo scambio intercellulare di miRNA. Tuttavia, questi metodi non forniscono una elevata risoluzione temporale, che è necessaria quando si studia il flusso junctional gap delle molecole. Pertanto, per studiare l'impatto di miRNA / siRNA come molecole di segnalazione intercellulare, sono necessari nuovi strumenti che consentiranno l'analisi di questi piccoli RNA a livello cellulare. Il presente protocollo descrive l'apPlicazione del recupero tridimensionale di fluorescenza dopo la microscopia fotoblaccante (3D-FRAP) per chiarire lo scambio di giunzioni dipendente dalle molecole di miRNA tra le cellule cardiache. Importante, questo approccio semplice e non invasivo di immagini viva-cellule consente la visualizzazione e la quantificazione del gap junctional shuttling di piccoli RNA a fluorescenza etichettati in tempo reale, con un'elevata risoluzione spaziatura temporale. I dati ottenuti da 3D-FRAP confermano un nuovo percorso di regolazione delle cellule intercellulari, dove i piccoli RNA agiscono come molecole di segnalazione all'interno della rete intercellulare.
Introduction
I piccoli RNA non codificanti sono importanti attori nella regolazione del gene cellulare. Queste molecole sono composte da 20-25 nucleotidi che si legano ad un specifico mRNA bersaglio, portando al blocco della traduzione o al degradazione mRNA 1 , 2 . Il processo di regolazione del gene intrapreso da piccoli RNA, come miRNA e siRNA, è un meccanismo altamente conservato che è stato trovato in molte specie diverse 3 . In particolare, le molecole di miRNA sono di cruciale importanza per una varietà di processi fisiologici, compresa la proliferazione, la differenziazione e la rigenerazione 4 , 5 . Inoltre, la disregolazione dell'espressione miRNA è attribuita a molti disturbi patologici. Correlativamente, i miRNAs sono stati dimostrati essere adatti come biomarkers per la diagnosi e come agenti terapeutici per la terapia genica 6 , 7
Le giunzioni di Gap (GJs) sono strutture proteiche specializzate nella membrana plasmatica di due cellule adiacenti che consentono lo scambio diffusionale di molecole con un peso molecolare fino a 1 kD. Sono stati dimostrati importanti per lo sviluppo del tessuto, la differenziazione, la morte cellulare e le patologie patologiche come il cancro o le malattie cardiovascolari 8 , 9 , 10 . Molte molecole sono state descritte come in grado di attraversare canali GJ, ioni, metaboliti e nucleotidi. È interessante notare che anche GJs hanno fornito un percorso per il movimento intercellulare di piccoli RNA 11 , 12 . Così, miRNAs possono agire non solo all'interno della cellula in cui vengono prodotte, ma anche all'interno di cellule riceventi. Ciò evidenzia il ruolo dei miRNA nel sistema di trasduzione di segnali intercellulari. Allo stesso tempo, i dati dimostranoTale interconnessione junctional intercellulare è strettamente legata alla funzione miRNA. A causa dell'impatto significativo di miRNA e GJ sull'omeostasi tissutale, la patologia e la diagnosi, una comprensione completa della funzione dei GJ e delle relative dinamiche intercellulari del miRNA contribuirà a chiarire i meccanismi delle malattie basate su miRNA e sviluppare nuove strategie per MiRNA terapie.
A seconda dell'ampiezza del giunto junctional gap, il trasferimento di molecole di miRNA tra le cellule può essere un processo molto rapido. Pertanto, è necessaria una metodologia che consente la visualizzazione e la quantificazione del rapido movimento intercellulare di queste molecole di segnalazione normativa. Comunemente, sono state applicate citometrie di flusso e tecniche molecolari biologiche per dimostrare la shuttling di piccoli RNA 11 , 12 , 13 , 14 . Tuttavia, a differenza di FRAP microsCopia, questi approcci non hanno una elevata risoluzione temporale, che è obbligatoria quando si analizza lo scambio di miRNA attraverso GJs. Inoltre, la microscopia FRAP è meno invasiva e quindi rappresenta una potente e innovativa tecnica di imaging a cellule vive per valutare lo scambio di molecole di GJ-dipendenti in diversi tipi di cellule 15 , 16 , 17 .
Qui presentiamo un protocollo dettagliato che descrive l'applicazione di 3D-FRAP per valutare il flusso di miRNA tra i cardiomiociti. A questo scopo, i cardiomiociti sono stati trasfettati con miRNA a fluorescenza. Una cellula contrassegnata con questo miRNA è stata fotoblificata e il ritorno di miRNA giunzionale differenziale dalle cellule adiacenti è stato registrato in modo dipendente dal tempo. L'elevata risoluzione temporale degli esperimenti FRAP offre la possibilità di eseguire studi cinetici per la precisa valutazione del trasferimento intercellulare di miRNA e siRNA tra le cellule viventi. MoreoVisto che i piccoli RNA possono essere scambiati attraverso meccanismi diversi con cinetica molto diverse, la microscopia FRAP può contribuire a chiarire la misura in cui i GJs sono coinvolti nei rispettivi processi di spostamento 18 . Inoltre, 3D-FRAP può essere utilizzato per indagare le alterazioni fisiologiche e patologiche della permeabilità di GJ e il suo impatto sul piccolo trasferimento di RNA 15 , 19 .
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Protocol
Tutte le fasi di questo protocollo che coinvolgono topi neonatali sono stati eseguiti per le linee guida etiche per la cura degli animali del Centro medico universitario di Rostock.
1. Preparazione dei piatti della cultura cellulare e del mezzo per la cultura cardiomiocitaria
- Applicare una piastra di coltura cellulare con gelatina 0,1% in PBS e incubare a 37 ° C per 4 ore oa 4 ° C per una notte. Rimuovere la gelatina e lasciarlo asciugare sotto il flusso laminare aria sterile.
- Preparare il mezzo di coltura cellulare composto da 50 ml di DMEM integrato con 10% di siero fetale fetale (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina (P / S). Pre-riscaldare a 37 ° C.
2. Isolamento dei cardiomiociti neonatali
- Sacrificare i topi neonatali (1-2 giorni) con decapitazione con forbici sterili e aprire il torace lungo lo sterno. Rimuovere il cuore con le pinze mentre leggermente premendo il torace insieme e trasferire il cuore in una piastra da 24 pozzetti contenenti HBSS ghiacciata(Senza Ca 2+ e Mg 2+ ).
- Togliere i tessuti non cardiaci e le più grandi vaschette con pinze sterili. Trasferire i cuori puliti in un tubo da 1,5 ml contenente HBSS ghiacciato. Utilizzare un massimo di 5 cuori per tubo per la digestione enzimatica.
- Mince i cuori con piccole forbici in pezzi da <0,5 a 1 mm³.
- Lavare il cuore macinato con HBSS due volte per aspirazione / aggiunta di HBSS usando una pipetta da 1 ml di microlitro. Rimuovere completamente l'HBSS prima di aggiungere gli enzimi.
- Per la digestione enzimatica dei cuori neonatali, utilizzare un kit disponibile in commercio e seguire il protocollo del produttore (vedere la tabella dei materiali ). Agitare il tubo contenente i cuori macinati ogni 5 min mentre incubando con gli enzimi a 37 ° C per 35 minuti.
- Le cellule sospese seminano su piastre di coltura di cellule non rivestite contenenti medium di coltura cellulare per 1,5-2 h per consentire l'aderenza della frazione non cardiomiocitaria. Ripetere questo passaggio se un'alta purezzaDei cardiomiociti è necessaria. Se lo si desidera, coltivare ulteriormente la frazione non cardiomiocitaria.
NOTA: Per una sospensione cellulare di 15 cuori, la fase di pre-placcatura può essere eseguita su colpi di coltura da 75 cm². Di solito, ~ 5 x 10 5 cellule sono ottenute da un cuore neonatale. - Raccogliere il surnatante in un tubo conico da 15 ml e centrifugare per 10 min a 300 x g. Risospendere le cellule in 1 ml di terreno di coltura cellulare.
- Contare le cellule con un emocitometro della camera Neubauer, oppure utilizzare un metodo equivalente.
- Il piatto ha isolato i cardiomiociti su piatti a 6 pozzetti con una densità di 3 x 10 5 cellule / cm². Incubare le cellule durante la notte a 37 ° C e 5% CO 2 .
NOTA: Facoltativamente, le cellule possono anche essere trasfettate a questo punto. Tuttavia, è stata osservata una maggiore vitalità quando le cellule sono state coltivate per un giorno prima di essere sottoposte ad elettroporazione.
3. Trasfezione con miRNA fluorescente
- Pre-(Vedi punto 1.2) a 37 ° C in un bagno d'acqua o in un dispositivo equivalente.
- Preparare una soluzione di 20 μM di miRNA fluorescente in acqua sterile senza RNasi.
- Preparare il tampone di elettroporazione contenente 90 mM Na 2 HPO 4 , 90 mM NaH 2 PO 4 , 5 mM KCl, 10 mM MgCl2 e 10 mM di sodio succinato e regolare il pH a 7,2; Il buffer di elettroporazione può essere conservato a -20 ° C per diversi mesi.
- Staccare le cellule dal piatto di coltura utilizzando 0,05% di trysina per 5 min. Inattivare la tripsina aggiungendo il mezzo di coltura cellulare.
- Contare le cellule con un emocitometro della camera Neubauer, oppure utilizzare un metodo equivalente. Centrifugare le cellule a 300 xg per 10 min.
- Resuspendere le cellule nel tampone di elettroporazione per ottenere una concentrazione di 4 x 10 5 cellule per 100 μL.
- Mescolare 100 μL di sospensione cellulare con miRNA fluorescente (concentrazione finale: 0,25 μM) in un tubo eCaricare la miscela in una cuvetta di elettroporazione.
- Determinare empiricamente la quantità appropriata di miRNA, a seconda del tipo di cellula.
- Effettuare l'elettroporazione usando un dispositivo di elettroporazione (vedi tabella dei materiali ), usando il programma "G-009".
- Aggiungere 500 μl di mezzo di coltura cellulare pre-riscaldato e trasferire l'intero sospensione cellulare (4 x 10 5 cellule) in un pozzetto di uno scivolo a 4 pozzetti in vetro. Coltivare le cellule per 1 giorno a 37 ° C in atmosfera di CO 2 di 5%.
NOTA: per l'analisi FRAP, una densità di cella di ~ 80% è ottimale. La trasfezione del miRNA etichettato dovrebbe essere eseguita esclusivamente utilizzando elettroporazione. Poiché la distribuzione omogenea di molecole di miRNA etichettate è utile per la misura FRAP, non è raccomandata la trasfezione basata su reagenti.
4. Applicazione della microscopia 3D-FRAP (Day 3)
- Riscaldare l'incubatore del microscopio a 37 °; C e accendere il sistema microscopio confocale almeno 2 ore prima della misura FRAP per stabilire un equilibrio termico e diminuire la possibilità di deriva. Se possibile, mantenere un'atmosfera al 5% di CO 2 .
- Inserire la diapositiva della camera nel supporto campione.
- Trovare un gruppo di cardiomiociti trasfettati utilizzando un obiettivo 1.4 NA di petrolio (ingrandimento 400X) e una luce di eccitazione laser da 561 nm a bassa potenza laser, con un range di rilevamento di 570-680 nm.
NOTA: La definizione delle impostazioni FRAP, l'acquisizione di immagini e l'analisi sono state eseguite usando un software specifico per microscopio (vedere la tabella dei materiali ). - Attivare i pulsanti "z-Stack", "Time Series", "Bleaching" e "Regions" nella "Gestione installazioni".
- Definire i parametri FRAP.
- Definire le impostazioni di acquisizione immagini nel menu "Acquisizione" impostando "la dimensione del fotogramma4; A 512 x 512, "passo linea" a 1 e "tempo di scansione" a <1 s.
- Nel menu "Canali", regolare le impostazioni di potenza laser, offset e guadagno per ottenere la massima fluorescenza dalla minima eccitazione laser ( ad esempio, potenza laser: 1-5%); Regolare per evitare la saturazione dell'intensità. Impostare la "dimensione pinhole" a 2 μm.
- Quindi, nel menu "Regioni", selezionare lo strumento di disegno ROI e utilizzare il cursore per contrassegnare la cella di destinazione, la cella di riferimento e l'area di sfondo. Se necessario, selezionare diverse celle di destinazione per la fotobillatura.
- Regolare le impostazioni di fotolibrazione nel menu "Bleaching" ( ad esempio, iterazioni: 9-14, potenza laser per fotolibrazione: 100%, intervallo di acquisizione di immagini: 60 s, cicli: 15). Definire l'inizio dello sbiancamento dopo 3 scansioni iniziali.
- Nel menu "z-Stack", definire i limiti per l'acquisizione z-stack, a seconda dello spessore delle celle. Regolare il "numero oF z-strati "a 12 - 15.
- Avviare l'esperimento FRAP e registrare il recupero della fluorescenza.
NOTA: poiché le impostazioni di un esperimento FRAP dipendono dal tipo di cella, dal colorante fluorescente e dal sistema di microscopio, è meglio eseguire esperimenti pilota per determinare i parametri ottimali per FRAP. La schiaratura deve essere sufficiente per ridurre l'intensità iniziale di fluorescenza di almeno il 50%. In genere, il recupero di fluorescenza deve essere registrato ogni 30-60 s fino alla fase di plateau.
5. Analisi dei dati
- Crea proiezioni massime delle z-stack acquisite e ottiene i valori di intensità della fluorescenza delle cellule bersaglio sbiancate, della cella di riferimento e dello sfondo. Utilizzando il software specifico per microscopio, fare clic su "Elaborazione" → "Proiezione di intensità massima" → selezionare file → "Applica".
- In alternativa, utilizzare uno strumento di analisi dell'immagine equivalente (
- In alternativa, utilizzare uno strumento di analisi dell'immagine equivalente (
- Copiare i dati di intensità della fluorescenza in tutti i punti di tempo dalla cella di destinazione, lo sfondo e la cella di riferimento in un foglio di calcolo.
- Sottrarre l'intensità della priorità bassa e l'intensità della cella di riferimento dai valori di intensità della cella di destinazione per correggere la fotobillatura causata durante il processo di acquisizione. Eseguire le correzioni delle celle di riferimento e di riferimento per ogni punto temporale.
- Normalizzare i dati FRAP corretti all'intensità di fluorescenza iniziale prima dello sbiancamento dividendo ogni valore dalla fluorescenza iniziale.
- Per ottenere le curve FRAP, impostare la linea di base all'intensità di fluorescenza immediatamente dopo la candeggina sottraendo i valori di intensità di ogni punto temporale.
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Representative Results
Qui presentiamo la microscopia 3D-FRAP come una tecnica non invasiva per studiare la distanza di giunzione giunzionale del miRNA fluorescente nei cardiomiociti neonatali. I cardiomiociti isolati hanno rivelato il tipico pattern di α-actina striato e contenevano grandi placche di Cx43 lungo i bordi delle cellule cellulari ( Figura 1A , frecce bianche), che hanno permesso l'elevato flusso intercellulare delle molecole. La purezza dei cardiomiociti isolati è stata valutata con la quantificazione microscopica delle cellule α-actinina positive. Sebbene alcune cellule non cardiomiocitiche (cellule α-actinina negative) erano presenti nella coltura, i cardiomiociti neonatali rappresentavano il tipo di cellula principale dopo l'isolamento (79,62 ± 3,68%, figura 1B ).
Per esaminare lo scambio junctional gap di miRNA, le cellule sono state trasfettate con miRNA fluorescente etichettato. EleLa ctroporazione è il metodo di scelta per la fornitura di molecole di miRNA alle cellule, in quanto garantisce un'elevata efficienza di trasfezione e la distribuzione omogenea di composti transfettati, obbligatoria per l'analisi FRAP. Nella nostra configurazione sperimentale, abbiamo raggiunto un'efficacia di trasfezione del ~ 45%, come determinato dalla citometria a flusso ( Figura 2A ). La preparazione dei cardiomiociti per FRAP include il distacco dalla piastra di coltura, l'elettroporazione e il reinserimento in diapositive a camera. Un test di flusso / citometria citometrica a flusso ha rivelato che la maggior parte delle cellule ha dimostrato un'elevata vitalità, che è importante quando si analizza la comunicazione giunzionale junctional ( Figura 2B ). Inoltre, la densità cellulare è un parametro fondamentale che influenza i risultati di FRAP. Per ottimizzare le misurazioni di FRAP, le cellule devono essere seminate con una densità di ~ 80% per consentire la formazione di cluster di cellule e la creazione di giunzioni funzionali di gap tra le celle ( Figura2C).
Per l'analisi FRAP, le cellule bersaglio vengono selezionate in un cluster di cellule e vengono fotopolimerizzate con il potere laser al 100%, portando a ridurre la fluorescenza miRNA nelle cellule selezionate ( figura 3A , candeggina). Successivamente, il recupero di fluorescenza viene registrato per visualizzare il trasferimento di miRNA da cellule adiacenti nella zona sbiancata. Poiché la fase di plateau del recupero di fluorescenza è stata raggiunta dopo 13 minuti, questo periodo di tempo è stato utilizzato per l'acquisizione di immagini negli esperimenti FRAP. L'analisi quantitativa e la normalizzazione dei dati acquisiti hanno mostrato un recupero medio del 20%. I dati hanno anche dimostrato che la microscopia FRAP consente la rapida registrazione della shuttling miRNA con elevata risoluzione temporale. A seconda delle proprietà di tintura, i parametri di acquisizione possono essere modificati per aumentare ulteriormente la risoluzione temporale.
L'utilizzo di 3D-FRAP consenteIl confronto di permeabilità di GJ a miRNA in condizioni diverse. Per dimostrarlo, abbiamo indotto una sconvolta di Cx43 mediata da siRNA, portando ad una ridotta espressione di proteine ( Figura 3C ) e l'inibizione della comunicazione giunzionale junctional. Di conseguenza, il recupero di fluorescenza è stato ridotto di oltre il 50%, indicando che l'efficienza del trasferimento di miRNA dipende fortemente dall'entità del giunzione junctional tra le cellule ( figura 3B , Cx43). Per confermare che il recupero di fluorescenza riflette il passaggio del miRNA fluorescente con etichettatura, piuttosto che il distacco Dy547-tag, abbiamo anche acquisito i dati FRAP per la colorazione calceina ( Figura 3D ). Calceina ha un peso molecolare paragonabile a quello di Dy547 e quindi possiede una simile dinamica di trasferimento. Contrariamente al recupero di fluorescenza di miRNA etichettato con Dy547, la calceina ha dimostrato un aumento dello scambio junctional gap, indicando che il tag Dy547S non staccato dalla molecola miRNA ( Figura 3D ).
Le condizioni di messa a fuoco stabili sono obbligatorie durante un esperimento di FRAP, soprattutto quando vengono effettuate misure a lungo termine. Rispetto alle applicazioni 2D, il 3D-FRAP può compensare la potenziale drift di messa a fuoco. Come mostrato in Figura 4 , anche piccole modifiche di messa a fuoco influenzano la corretta rilevazione del segnale di fluorescenza di miRNA quando viene utilizzato un solo livello 2D per l'esperimento FRAP ( Figura 4B ). Al contrario, per il 3D-FRAP, viene registrato un intero z-stack della cella di destinazione e le proiezioni massime vengono sottoposte ad analisi dei dati ( Figura 4A ). L'impatto della deriva di fuoco su una curva normalizzata di intensità di fluorescenza è rappresentato in Figura 4C . Mentre il recupero di fluorescenza aumenta costantemente nel tempo in 3D-FRAP, l'acquisizione di 2D-FRAP determina un declinoF il segnale di fluorescenza.
Oltre alla compensazione dei cambiamenti di messa a fuoco, 3D-FRAP fornisce anche dati spaziali dello scambio junctional di miRNA. La Figura 5 mostra una rappresentazione superficiale 3D di un esperimento FRAP. Rispetto alle proiezioni massime, l'acquisizione di z-stack può essere usata per creare ricostruzioni 3D per indagare la localizzazione e la mobilità delle miRNA all'interno delle cellule ( Figura 5 ). La co-etichettatura con gli organelli consentirà di indagare sul coinvolgimento di altri componenti cellulari nel trasferimento di miRNA.
Figura 1: Immagini microscopiche rappresentative di cardiomiociti neonatali isolati. ( A ) La microscopia strutturata di illuminazione mostra l'alta espressione di Cx43, che si accumula in grande pLecche ai bordi delle cellule cellule (frecce). La formazione pronunciata di GJ con cellule adiacenti consente un ampio scambio di piccole molecole, tra cui miRNA. Barra di scala = 20 μm ( B ) Purezza dei cardiomiociti isolati. L'etichettatura di α-actinin dimostra che i cardiomiociti rappresentano il tipo di cellula principale dopo l'isolamento. Barra di scala = 50 μm. Le cellule sono state macchiate con anticorpi anti-Cx43 (verde) e anti-α-actinina (rosso). I nuclei sono stati visualizzati utilizzando DAPI (blu). Una descrizione di microscopia strutturata di illuminazione e di etichettatura immunologica è fornita in una pubblicazione precedente 20 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Efficienza e vitalità della trasfezione , E la densità cellulare della cultura cardiomyocita neonatale. ( A ) La citometria di flusso ha rivelato che l'elettroporazione miR547 ha portato ad un'efficacia di trasfezione di ~ 45%. ( B ) vitalità cellulare dei cardiomiociti utilizzati per FRAP. Dopo l'isolamento, l'elettroporazione e il riattacco, i cardiomiociti sono stati sottoposti a macchie di cellule vive e morte e hanno dimostrato un'elevata stabilità cellulare. ( C ) Immagine microscopica dei cardiomiociti trasfettati mir547 preparati per la microscopia FRAP. Una densità di cellule del 80-90% garantisce la forte formazione di contatti delle cellule cellulare giunzionali. Barra di scala = 50 μm. Un metodo per l'analisi citometrica a flusso dell'efficienza di trasfezione e la colorazione della vitalità è menzionata nelle pubblicazioni precedenti 20 , 21 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Scambio GJ-dipendente di miRNA nei cardiomiociti neonatali. ( A ) Immagini rappresentative di un esperimento FRAP. Dopo la trasfezione con il miRNA etichettato, le cellule target all'interno di un cluster di cellule vengono fotopolimerizzate da un forte impulso laser (pre-bleach contro candeggina). A seconda dell'ampiezza del giunto junctional, il flusso giunzionale di miRNA da cellule adiacenti determina una maggiore intensità di fluorescenza nelle cellule bersaglio sbiancate (post-candeggina t = 3, 6, 9 e 13 min). Barra di scala = 20 μm ( B ) L'analisi quantitativa dei dati FRAP acquisiti mostra un recupero di fluorescenza del 20% dopo 13 minuti. Per confermare il coinvolgimento del GJs nel trasferimento intercellulare di miRNA, è stata eseguita una cedola di cx43, portando ad una forte diminuzione del recupero di fluorescenza (50%). ( C ) Immunostaining con anti-Cx43L'anticorpo e la successiva microscopia confocale dimostrano l'efficacia del cedro di Cx43 a livello proteico. Barra di scala = 50 μm. ( D ) Il confronto dei dati FRAP di miR547 e colorante di calceina mostra le diverse dinamiche di trasferimento. Il peso molecolare più piccolo della calceina ha determinato un aumento del recupero di fluorescenza rispetto alle molecole miRNA taggate con dy547. Le curve FRAP riassumono i dati delle cellule n ≥56, mostrate come la media ± SEM. L'analisi statistica è stata effettuata usando ANOVA a due vie seguita dal test post-hoc di Bonferroni (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Compensazione della drift di fuoco utilizzando la microscopia 3D-FRAP. (
Figura 5: Rendering della superficie 3D di un esperimento 3D-FRAP. (Sinistra) Proiezioni massime di una misura FRAP. La cellula fotocolorata (cornice rossa) dimostra un aumento dell'intensità di fluorescenza dovuta al trasferimento di miRNA da cellule adiacenti. (Destra) Gli z-stack acquistati della stessa cellula fotopolimerizzata (rossa) sono stati sottoposti a rendering superficiale 3D per visualizzare la distribuzione spaziale del miRNA. Barra di scala = 20 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
MiRNAs sono attori chiave della fisiologia cellulare e sono stati dimostrati di agire come molecole di segnalazione utilizzando, tra gli altri, GJs come percorso per lo scambio intercellulare 11 , 12 , 22 . Il protocollo attuale presenta una tecnica di imaging in vivo in vitro per caratterizzare questa shuttling dipendente dal GJ utilizzando miRNA fluorescenti all'interno dei cluster di cellule.
Il protocollo è stato sviluppato su cardiomiociti come sistema di modelli cellulare. Tuttavia, questo approccio può essere applicato a più tipi di cellule se l'elettroporazione è un metodo adatto per la transfezione miRNA. Oltre allo scambio di cellule a cellule, la tecnica presentata è anche idonea a studiare la mobilità intracellulare di molecole di miRNA ( ad esempio, per l'identificazione di possibili meccanismi di trasporto all'interno della cellula) 23 , 24 .
"L'analisi del trasferimento di miRNA da parte della microscopia FRAP richiede molecole di miRNA a fluorescenza tagliate ( Figura 2 ) Poiché l'etichettatura di miRNA cellulari specifici non è fattibile, solo il miRNA etichettato introdotto esogeno può essere utilizzato per 3D-FRAP per analizzare la sua mobilità intercellulare Nei nostri esperimenti, le cellule sono state trasfettate con miRNA da 250 nm, con una concentrazione molto più elevata rispetto alle condizioni fisiologiche, dove il livello miRNA varia da 10 a 50.000 molecole per cella 27 , 28. Tali basse concentrazioni non possono essere utilizzate negli esperimenti FRAP, In quanto un certo livello di molecole di miRNA fluorescenti è necessario per ottenere un segnale di fluorescenza sufficiente e per assicurare la corretta discriminazione tra la fluorescenza di fondo e il miRNA fluorescente con etichettatura. Tuttavia, a seconda del sistema di imaging confocale e delle proprietà del colorante, l'uso di concentrazioni di miRNA a basso -nM dovrebbe essere possibile per i test FRAP. </ P>Diverse tecniche sono comunemente applicate allo studio del trasferimento di miRNA intercellulare, compresa la citometria a flusso, i PCR e i reporter dei luciferasi 12 , 13 . Questi metodi rivelano la navigazione miRNA con bassa risoluzione temporale ( ossia, ore al giorno). Al contrario, la microscopia 3D-FRAP consente la visualizzazione e la quantificazione del trasferimento di miRNA e della mobilità in tempo reale. Oltre ai contatti delle cellule cellulare giunzionali, il flusso intercellulare di miRNA è anche mediato da altri meccanismi, come gli esosomi 18 , 29 , 30 . Solo 3D-FRAP fornisce una risoluzione temporale sufficientemente elevata per discriminare tra il trasferimento junctional esosomale e il gap. Così permette di effettuare un'indagine specifica sull'effetto diretto della permeabilità di GJ sulla segnalazione di miRNA in diverse condizioni patologiche o fisiologiche (FiguRe 2).
Raccomandiamo l'utilizzo di 3D-FRAP, che è superiore al convenzionale 2D-FRAP, poiché fornisce dati più precisi sul trasferimento miRNA dipendente da GJ. Le misurazioni 3D-FRAP includono l'intero volume della cella, importante quando si utilizzano tipi di celle di grandi dimensioni. Inoltre, è in grado di compensare i cambiamenti di messa a fuoco oi movimenti delle cellule, che hanno dimostrato di pregiudicare in modo significativo il recupero di fluorescenza in 2D-FRAP ( Figura 3 ). Infine, la registrazione di z-stack negli esperimenti 3D-FRAP offre la possibilità di ottenere informazioni spaziali, che non è possibile quando solo un solo livello 2D viene utilizzato per l'analisi delle intensità di fluorescenza ( Figura 3B ).
Poiché il recupero di fluorescenza dipende dall'afflusso di miRNA da cellule adiacenti, il numero di cellule connesse alla cella sbiancata è critico e deve essere simile in diverse misurazioni per ottenere dati affidabili. Pertanto, è necessaria una densità di cella elevataD per garantire la formazione di cluster cellulari più idonei per l'analisi FRAP. Inoltre, devono essere eseguiti esperimenti preliminari per selezionare le condizioni di candeggio lieve ( cioè potenza laser, tempo di candeggio e impostazioni di scansione) per evitare effetti fototossici causati da un'elevata intensità laser 25 , 26 . Ciò contribuirà inoltre a ridurre la fotolibrazione che si verifica durante il processo di acquisizione.
Nonostante i limiti, i nostri dati dimostrano che 3D-FRAP è un potente strumento per valutare il ruolo dei miRNA come molecole di segnalazione all'interno di una rete cellulare. L'impatto della composizione della connexina sul flusso di miRNA o della permeabilità selettiva di GJs per miRNA specifiche può essere affrontato con la quantificazione diretta dell'efficienza del trasporto. 3D-FRAP può fornire informazioni importanti per migliorare lo sviluppo di nuove terapie con MIRNA e siRNA, come definendo condizioni adeguate che facilitino il distributioN di piccoli RNA attraverso la rete GJ 31 , 32 .
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Disclosures
Gli autori dichiarano assenza di conflitto di interesse.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero Federale dell'Istruzione e della Ricerca Germania (FKZ 0312138A e FKZ 316159), lo Stato Meclemburgo-Pomerania Occidentale con i Fondi Strutturali dell'UE (ESF / IVWM-B34-0030 / 10 e ESF / IVBM-B35-0010 / 12), il DFG (DA1296-1) e la Fondazione tedesca del cuore (F / 01/12). Inoltre, RD è supportato dal programma FORUN di Rostock University Medical Center (889001), dalla Fondazione DAMP e dal BMBF (VIP + 00240).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| neonatal NMRI mice | Charles River | ||
| Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | 0.1% solution in PBS, sterilized |
| PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
| Dulbecco´s modified medium | Pan Biotech | P04-03550 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 U/mL, 100µg/mL |
| Fetal bovine serum | Pan Biotech | P30-3306 | |
| Cell culture plastic | TPP | ||
| Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | 88281 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 88281 | included in primary cardiomyocyte isolation kit |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| miRIDIAN Dy547 labeled microRNA Mimic | Dharmacon | CP-004500-01-05 | dissolve in RNAse free water, stock solution 20µM |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S3139 | |
| Sodium phosphate dibasic | Carl Roth | T877.2 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium chloride | Serva | 28305.01 | |
| Sodium succinate | Carl Roth | 3195.1 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA solution | Merck | L2153 | |
| 4-well- Glass bottom chamber slides | IBIDI | 80827 | coat with 0.1% gelatin solution |
| Amaxa Nucleofector II | Lonza | program G-009 was used for Electroporation | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Excel software | Microsoft | ||
| α-actinin antibody | Abcam | ab9465 | dilution 1:200 |
| Connexin43 antibody | Santa Cruz | sc-9059 | dilution 1:200 |
| goat anti-mouse Alexa 594 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11005 | dilution 1:300 |
| goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11034 | dilution 1:300 |
| Connexin43 siRNA | Thermo Fisher Scientific | AM16708 ID158724 | final concentration 250 nM |
| Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
| DAPI nuclear stain | Thermo Scientific | D1306 |
References
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