Summary
Her beskriver vi anvendelsen af tredimensionel fluorescensgenvinding efter photobleaching (3D-FRAP) til analysen af den mellemrumsafhængige pendling af miRNA. I modsætning til almindeligt anvendte metoder tillader 3D-FRAP kvantificering af den intercellulære overførsel af små RNA'er i realtid med høj spatio-temporal opløsning.
Abstract
Små antisense-RNA'er, som miRNA og siRNA, spiller en vigtig rolle i cellulær fysiologi og patologi og kan desuden anvendes som terapeutiske midler til behandling af flere sygdomme. Udviklingen af nye, innovative strategier for miRNA / siRNA-terapi er baseret på en omfattende viden om de underliggende mekanismer. Nylige data tyder på, at små RNA'er udveksles mellem celler på en gabsforbindelsesafhængig måde og derved inducerer genregulerende virkninger i recipientcellen. Molekylærbiologiske teknikker og flowcytometrisk analyse anvendes almindeligt til at studere intercellulær udveksling af miRNA. Imidlertid tilvejebringer disse metoder ikke høj tidsmæssig opløsning, hvilket er nødvendigt, når man studerer gab-forbindelsesfluxet af molekyler. Derfor, for at undersøge virkningen af miRNA / siRNA som intercellulære signalmolekyler, er der brug for nye værktøjer, som vil muliggøre analysen af disse små RNA'er på cellulært niveau. Den foreliggende protokol beskriver apPlication af tredimensionel fluorescensgenvinding efter photobleaching (3D-FRAP) mikroskopi for at belyse kløften forbindelsesafhængig udveksling af miRNA molekyler mellem hjerteceller. Det er vigtigt, at denne ligefremme og ikke-invasive levendecellebilledfremgangsmåde gør det muligt at visualisere og kvantificere mellemrumskrydsningen af fluorescensmærkede små RNA'er i realtid med høj spatio-temporal opløsning. Dataene opnået ved 3D-FRAP bekræfter en ny vej af intercellulær genregulering, hvor små RNA'er virker som signalmolekyler inden for det intercellulære netværk.
Introduction
Små ikke-kodende RNA'er er vigtige aktører inden for cellegeneregulering. Disse molekyler er sammensat af 20-25 nukleotider, som binder til et specifikt mål-mRNA, hvilket fører til blokering af translation eller til mRNA-nedbrydning 1 , 2 . Genreguleringsprocessen, der gennemføres af små RNA'er, såsom miRNA og siRNA, er en stærkt bevaret mekanisme, som er blevet fundet i mange forskellige arter 3 . Især miRNA-molekyler er af afgørende betydning for en række fysiologiske processer, herunder proliferation, differentiering og regenerering 4 , 5 . Derudover tilskrives dysreguleringen af miRNA-ekspression mange patologiske lidelser. Tilsvarende har miRNA'er vist sig at være egnet som biomarkører til diagnose og som terapeutiske midler til genterapi 6 , 7
Gap junctions (GJs) er specialiserede proteinkonstruktioner i plasmamembranen af to tilstødende celler, der tillader diffusionsudveksling af molekyler med en molekylvægt på op til 1 kD. De har vist sig at være vigtige for vævsudvikling, differentiering, celledød og patologiske lidelser såsom cancer eller kardiovaskulær sygdom 8 , 9 , 10 . Flere molekyler er blevet beskrevet som værende i stand til at krydse GJ-kanaler, herunder ioner, metabolitter og nukleotider. Interessant blev GJs også fundet at tilvejebringe en vej til den intercellulære bevægelse af små RNA'er 11 , 12 . Således kan miRNA'er virke ikke kun inden for cellen, hvori de fremstilles, men også inden for modtagerceller. Dette fremhæver rollen som miRNA'er i det intercellulære signaltransduktionssystem. Samtidig viser dataeneAt den mellemliggende intercellulære kommunikation mellem kløften er tæt forbundet med miRNA-funktionen. På grund af den betydelige virkning af miRNA og GJ på vævshomostase, patologi og diagnose vil en omfattende forståelse af GJs funktion og den relaterede intercellulære dynamik i miRNA bidrage til at klarlægge mekanismerne for miRNA-baserede sygdomme og udvikle nye strategier for MiRNA terapier.
Afhængig af omfanget af mellemrumskobling kan overførslen af miRNA-molekyler mellem celler være en meget hurtig proces. Derfor kræves en metode, der muliggør visualisering og kvantificering af den hurtige intercellulære bevægelse af disse regulatoriske signalmolekyler. Almindeligvis er flowcytometri og molekylærbiologiske teknikker blevet anvendt til at demonstrere shuttling af små RNA'er 11 , 12 , 13 , 14 . Men i modsætning til FRAP-mikroberKopi, disse tilgange mangler høj tidsmæssig opløsning, hvilket er obligatorisk, når man analyserer udvekslingen af miRNA via GJs. Desuden er FRAP-mikroskopi mindre invasiv og repræsenterer derfor en kraftfuld og ny live-cellebilledteknik til at evaluere den GJ-afhængige molekylveksling i flere celletyper 15 , 16 , 17 .
Her præsenterer vi en detaljeret protokol, der beskriver anvendelsen af 3D-FRAP for at vurdere miRNA shuttling mellem cardiomyocytter. Til dette formål blev kardiomyocytter transficeret med fluorescensmærkede miRNA. En celle mærket med denne miRNA blev photobleached, og gap-forbindelses-miRNA-tilstrømningen fra tilstødende celler blev registreret på en tidsafhængig måde. Den høje temporale opløsning af FRAP-eksperimenter giver mulighed for at udføre kinetiske undersøgelser for den præcise evaluering af den intercellulære overførsel af miRNA og siRNA mellem levende celler. MoreoEftersom små RNA'er kan udveksles via forskellige mekanismer med meget forskellig kinetik, kan FRAP-mikroskopi bidrage til at præcisere, i hvilket omfang GJ'er er involveret i de respektive shuttling-processer 18 . Derudover kan 3D-FRAP bruges til at undersøge fysiologiske og patologiske ændringer i GJ-permeabilitet og dens indvirkning på små RNA-overførsler 15 , 19 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle trin i denne protokol, der involverer neonatale mus, blev udført pr. De etiske retningslinjer for dyrepleje af Rostock University Medical Center.
1. Fremstilling af cellekulturretter og medium til kardiomyocytkultur
- Coat en cellekulturplade med 0,1% gelatine i PBS og inkuber ved 37 ° C i 4 timer eller ved 4 ° C natten over. Fjern gelatinen og lad det tørre under steril laminar luftstrøm.
- Forbered cellekulturmedium sammensat af 50 ml DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin (P / S). Forvarm den til 37 ° C.
2. Isolering af neonatale kardiomyocytter
- Offer neonatale mus (1-2 dage gamle) ved halshugning med steril saks og åben brystet langs brystbenet. Fjern hjertet ved hjælp af pincet, mens du trykker let på thoraxen og overfører hjertet til en 24-brønds plade indeholdende iskold HBSS(Uden Ca 2+ og Mg 2+ ).
- Fjern ikke-hjertevæv og større skibe ved hjælp af sterile pincet. Overfør rensede hjerter i et 1,5 ml rør indeholdende iskold HBSS. Brug maksimalt 5 hjerter per rør til enzymatisk fordøjelse.
- Hæld hjerterne med små sakse i <0,5 til 1 mm3 stykker.
- Vask de hakkede hjerter med HBSS to gange ved aspiration / tilsætning af HBSS ved anvendelse af en 1 ml mikroliter pipette. Fjern HBSS helt inden tilsætning af enzymerne.
- Til enzymatisk fordøjelse af neonatale hjerter, brug et kommercielt tilgængeligt kit og følg producentens protokol (se Materialetabellen ). Ryst røret indeholdende de hakkede hjerter hvert 5. minut, mens inkubering med enzymer ved 37 ° C i 35 min.
- Frøhæmmede celler på ikke-overtrukne cellekulturskåle indeholdende cellekulturmedium i 1,5-2 timer for at muliggøre vedhæftningen af den ikke-kardiomyocytfraktion. Gentag dette trin hvis en høj renhedAf kardiomyocytter er nødvendig. Om ønsket, dyrker den ikke-kardiomyocytfraktion yderligere.
BEMÆRK: For en celle suspension af 15 hjerter kan præplateringstrinnet udføres på 75 cm2 cellekulturkolber. Normalt opnås ~ 5 x 105 celler fra et neonatalt hjerte. - Opsaml supernatanten i et 15 ml konisk rør og centrifuger i 10 minutter ved 300 x g. Resuspender cellerne i 1 ml cellekulturmedium.
- Tæl cellerne med et Neubauer-kammer-hæmocytometer, eller brug en tilsvarende metode.
- Platte isolerede kardiomyocytter på 6-brønds plader med en tæthed på 3 x 10 5 celler / cm2. Inkuber cellerne natten over ved 37 ° C og 5% CO2.
BEMÆRK: Eventuelt kan celler også transficeres på dette tidspunkt. Imidlertid blev øget levedygtighed observeret, når cellerne blev dyrket en dag før de blev udsat for elektroporation.
3. Transfektion med fluorescensmærket miRNA
- pre-Varmcellekulturmedium (se trin 1.2) til 37 ° C i et vandbad eller en tilsvarende indretning.
- Forbered en 20 μM stamopløsning af fluorescerende miRNA i RNase-frit sterilt vand.
- Fremstil elektroporationsbuffer indeholdende 90 mM Na2HP04, 90 mM NaH2P04, 5 mM KCl, 10 mM MgCl2 og 10 mM natriumsuccinat og juster pH til 7,2; Elektroporationsbuffer kan opbevares ved -20 ° C i adskillige måneder.
- Fjern cellerne fra dyrkningsskålen under anvendelse af 0,05% trypsin i 5 minutter. Inaktivere trypsinet ved at tilføje cellekulturmedium.
- Tæl cellerne med et Neubauer-kammer-hæmocytometer, eller brug en tilsvarende metode. Centrifuger cellerne ved 300 xg i 10 minutter.
- Resuspender cellerne i elektroporationsbuffer for at opnå en koncentration på 4 x 10 5 celler pr. 100 μl.
- Bland 100 μl cellesuspension med fluorescerende miRNA (slutkoncentration: 0,25 μM) i et rør ogIndlæs blandingen i en elektroporationskuvette.
- Bestem empirisk den passende mængde miRNA afhængigt af celletype.
- Udfør elektroporation ved hjælp af en elektroporationsanordning (se Materialetabellen ) ved hjælp af "G-009" -programmet .
- Tilsæt 500 μl forvarmet cellekulturmedium og overfør hele celle suspensionen (4 x 10 5 celler) til en brønd i et 4-brønd glasbundet kammerglas. Kultur cellerne i 1 dag ved 37 ° C i en 5% CO 2 atmosfære.
BEMÆRK: For FRAP-analyse er en celletæthed på ~ 80% optimal. Transfektionen af mærket miRNA bør udelukkende udføres under anvendelse af elektroporation. Da den homogene distribution af mærkede miRNA-molekyler er gavnlig for FRAP-måling, anbefales ikke reagensbaseret transfektion.
4. Anvendelse af 3D-FRAP-mikroskopi (dag 3)
- Opvarm mikroskop inkubatoren til 37 °; C og tænd det konfokale mikrosystem mindst 2 timer før FRAP måling for at etablere en termisk ligevægt og mindske muligheden for drift. Hold om muligt en 5% CO 2 atmosfære.
- Sæt kammerrullen ind i sceneprøveholderen.
- Find en klynge af transficerede kardiomyocytter ved hjælp af et 1,4 NA-oliemål (400X forstørrelse) og 561 nm laser excitationslys ved lav laserkraft, med et detekteringsområde på 570-680 nm.
BEMÆRK: Definitionen af FRAP-indstillinger, billedopsamlingen og analysen blev udført ved hjælp af mikroskopspecifik software (se Materialebordet ). - Aktivér "Z-Stack", "Tidsserie", "Bleaching" og "Regions" knapper i "Setup Manager."
- Definer FRAP parametrene.
- Definer indstillingerne for billedoptagelse i menuen "Acquisition Mode" ved at indstille "rammeformat4; Til 512 x 512, "linjetrin" til 1 og "scanningstid" til <1 s.
- I menuen "Kanaler" skal du justere laserstrømmen, forskydningen og opnå indstillinger for at opnå maksimal fluorescens fra minimal laser excitation ( f.eks. Laser effekt: 1-5%); Juster for at undgå intensitetsmætning. Indstil "pinhole størrelse" til 2 μm.
- Derefter skal du vælge "ROI-tegningsværktøj" i menuen "Regioner" og bruge markøren til at markere målcellen, referencecellen og baggrundsområdet. Vælg om nødvendigt flere målceller til fotobleaching.
- Juster fotobelægningsindstillingerne i menuen "Bleaching" ( f.eks. Iterationer: 9-14, laserstrøm til fotobildning: 100%, interval for billedindsamling: 60 s, cyklusser: 15). Definer begyndelsen af blegning efter 3 første scanninger.
- I menuen "z-Stack" defineres grænserne for z-stack-opkøb afhængigt af cellens tykkelse. Juster "nummer oF z-lag "til 12-15.
- Start FRAP-eksperimentet og registrer fluorescensgenvindingen.
BEMÆRK: Da indstillingerne for et FRAP-eksperiment afhænger af celletypen, det fluorescerende farvestof og mikroskopsystemet, er det bedst at udføre pilotforsøg for at bestemme de optimale parametre for FRAP. Blegning skal være tilstrækkelig til at reducere den oprindelige fluorescensintensitet med mindst 50%. Typisk bør fluorescensgenvinding registreres hver 30-60 s, indtil platåfasen er nået.
5. Data analyse
- Opret maksimale fremskrivninger af de tilkøbte z-stabler og opnå fluorescensintensitetsværdier af de blegede målceller, referencecellen og baggrunden. Brug mikroskopspecifik software ved at klikke på "Behandling" → "Maksimal intensitetsprojektion" → vælg fil → "Anvend."
- Alternativt kan du bruge et tilsvarende billedanalyseværktøj (
- Alternativt kan du bruge et tilsvarende billedanalyseværktøj (
- Kopier fluorescensintensitetsdataene på alle tidspunkter fra målcellen, baggrunden og referencecellen til et regneark.
- Subtrahere baggrundsintensiteten og intensiteten af referencecellen fra målcelleets intensitetsværdier for at korrigere for photobleaching forårsaget under overtagelsesprocessen. Udfør baggrunds- og referencecellekorrektioner for hvert tidspunkt.
- Normaliser de korrigerede FRAP-data til den oprindelige fluorescensintensitet før blegning ved at dividere hver værdi ved den indledende fluorescens.
- For at opnå FRAP-kurver indstilles basislinjen til fluorescensintensiteten umiddelbart efter blegemiddelet ved at subtrahere fra intensitetsværdierne for hvert tidspunkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her præsenterer vi 3D-FRAP-mikroskopi som en ikke-invasiv teknik til at studere gapforbindelseshukling af fluorescerende miRNA inden for neonatale kardiomyocytter. De isolerede kardiomyocytter afslørede det typiske striberede a-actinin-mønster og indeholdt store plaques af Cx43 langs cellecellekanterne ( Figur 1A , hvide pilehoveder), hvilket tillod den høje intercellulære flux af molekyler. Renheden af isolerede kardiomyocytter blev vurderet ved mikroskopisk kvantificering af a-actinin-positive celler. Selv om nogle ikke-kardiomyocytter (a-actinin-negative celler) var til stede i kulturen, repræsenterede neonatale kardiomyocytter hovedcelletypen efter isolering (79,62 ± 3,68%, Figur 1B ).
For at undersøge mellemrumsudvekslingen af miRNA blev celler transficeret med fluorescensmærkede miRNA. EleCtroporation er den metode, der vælges til at levere miRNA molekyler til celler, da det sikrer en høj transfektionseffektivitet og den homogene distribution af transficerede forbindelser, hvilket er obligatorisk for FRAP-analyse. I vores eksperimentelle opsætning opnåede vi en transfektionseffektivitet på ~ 45%, som bestemt ved flowcytometri ( Figur 2A ). Fremstillingen af kardiomyocytter til FRAP omfatter frigørelse fra kulturpladen, elektroporation og re-fastgørelse på kammerglas. Et flowcytometrisk levende / dødt assay afslørede, at størstedelen af celler viste høj levedygtighed, hvilket er vigtigt, når man analyserer mellemrumskommunikation ( Figur 2B ). Endvidere er celletæthed en afgørende parameter, der påvirker FRAP-resultater. For optimale FRAP målinger bør celler udsås med en tæthed på ~ 80% for at tillade dannelse af celleklynger og etablering af funktionelle gapforbindelser mellem celler ( Figur2C).
Til FRAP-analyse udvælges målceller inden for en celleklynge og lyseres med 100% laserkraft, hvilket fører til reduceret miRNA-fluorescens i de valgte celler ( Figur 3A , blegemiddel). Efterfølgende registreres fluorescensgenvinding for at visualisere overførslen af miRNA fra tilstødende celler i det blegede område. Da platåfasen af fluorescensgenvindingen blev nået efter 13 minutter, blev dette tidsrum brugt til image-opkøb i FRAP-eksperimenterne. Kvantitativ analyse og normalisering af de erhvervede data viste en gennemsnitlig genvinding på 20%. Dataene viste også, at FRAP-mikroskopi muliggør hurtig registrering af miRNA shuttling med høj temporal opløsning. Afhængig af farvestoffets egenskaber kan opkøbsparametre ændres for yderligere at øge den midlertidige opløsning.
Brugen af 3D-FRAP muliggørSammenligningen af GJ permeabilitet med miRNA under forskellige betingelser. For at demonstrere dette inducerede vi en siRNA-medieret knockdown af Cx43, hvilket førte til reduceret proteinekspression ( Figur 3C ) og inhiberingen af gapforbindelseskommunikation. Som resultat heraf blev fluorescensgenvinding reduceret med mere end 50%, hvilket indikerer, at effektiviteten af miRNA-overførslen er stærkt afhængig af omfanget af mellemrumskobling mellem celler ( Figur 3B , Cx43-nedbrydning). For at bekræfte, at fluorescensgenvindingen afspejler passagen af det fluorescensmærkede miRNA, snarere end det løsrivne Dy547-tag, erhvervede vi også FRAP-data til calceinfarvestof ( Figur 3D ). Calcein har en molekylvægt, der er sammenlignelig med den for Dy547 og har således lignende overførselsdynamik. I modsætning til fluorescensgenvinding af Dy547-mærket miRNA demonstrerede calcein øget mellemrumsudveksling, hvilket tyder på, at Dy547-mærket iS ikke løsrevet fra miRNA molekylet ( Figur 3D ).
Stabile fokusforhold er obligatoriske i et FRAP-eksperiment, især når der udføres langsigtede målinger. Sammenlignet med 2D-applikationer kan 3D-FRAP kompensere for potentiel fokusdrift. Som vist i figur 4 påvirker selv små fokusændringer den korrekte påvisning af fluorescenssignalet for miRNA, når kun et enkelt 2D-lag anvendes til FRAP-eksperimentet ( figur 4B ). I modsætning til 3D-FRAP registreres en hel z-stak af målcellen, og maksimale fremskrivninger udsættes for dataanalyse ( figur 4A ). Virkningen af fokusdrift på en normaliseret fluorescensintensitetskurver er afbildet i figur 4C . Mens fluorescensgenoprettelsen stiger støt over tid i 3D-FRAP, resulterer 2D-FRAP-erhvervelsen i et fald oF fluorescenssignalet.
Udover kompensationen for fokusændringer tilvejebringer 3D-FRAP også rumlige data for gapforbindelsesudvekslingen af miRNA. Figur 5 viser en 3D-overfladegengivelse af et FRAP-eksperiment. Sammenlignet med maksimale fremskrivninger kan opkøb af z-stabler bruges til at skabe 3D-rekonstruktioner for at undersøge lokalisering og mobilitet af miRNA i celler ( figur 5 ). Co-mærkning med organeller vil muliggøre undersøgelse af inddragelse af andre cellulære komponenter i miRNA overførsel.
Figur 1: Repræsentative mikroskopiske billeder af isolerede neonatale kardiomyocytter. ( A ) Struktureret belysningsmikroskopi viser den høje ekspression af Cx43, som akkumuleres i stor pLaques ved celleceller grænser (arrowheads). Den udtalte dannelse af GJ'er med tilstødende celler muliggør en omfattende udveksling af små molekyler, herunder miRNA. Skalbjælke = 20 μm ( B ) Renhed af isolerede kardiomyocytter. Mærkning af a-actinin demonstrerer, at kardiomyocytter repræsenterer hovedcelletypen efter isolation. Målestang = 50 μm. Celler blev farvet med anti-Cx43 (grøn) og anti-a-actinin antistoffer (rød). Nuclei blev visualiseret ved anvendelse af DAPI (blå). En beskrivelse af struktureret belysningsmikroskopi og immunologisk mærkning er tilvejebragt i en tidligere publikation 20 . Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Transfektionseffektivitet, levedygtighed , Og celledensitet af neonatal kardiomyocytkultur. ( A ) Flowcytometri viste, at miR547 elektroporation resulterede i en transfektionseffektivitet på ~ 45%. ( B ) Cellebærbarhed af cardiomyocytter anvendt til FRAP. Efter isolering, elektroporation og genpåføring blev kardiomyocytter udsat for levende og dødcellefarvning og demonstreret højcelle-levedygtighed. ( C ) Mikroskopisk billede af mir547-transficerede cardiomyocytter fremstillet til FRAP-mikroskopi. En celletæthed på 80-90% sikrer den udprægede dannelse af gab-forbindelsescelle-cellekontakter. Målestang = 50 μm. En fremgangsmåde til flowcytometrisk analyse af transfektionseffektivitet og levedygtighedsfarvning er nævnt i tidligere publikationer 20 , 21 . Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: GJ-afhængig udveksling af miRNA i neonatale kardiomyocytter. ( A ) Repræsentative billeder af et FRAP-eksperiment. Efter transfektion med mærket miRNA, lyseres målceller i en celleklynge af en stærk laserpuls (præblemerende versus blegemiddel). Afhængig af omfanget af gapforbindelseskoblingen resulterer gapforbindelsesstrømningen af miRNA fra hosliggende celler i forøget fluorescensintensitet i de blegede målceller (efterblegemiddel t = 3, 6, 9 og 13 minutter). Skalbjælke = 20 μm ( B ) Kvantitativ analyse af overførte FRAP-data viser en fluorescensgenvinding på 20% efter 13 minutter. For at bekræfte involverings-GJ'erne i den intercellulære overførsel af miRNA blev en cx43 knockdown udført, hvilket førte til et kraftigt fald i fluorescensgenvinding (50%). ( C ) Immunostaining med anti-Cx43Antistof og efterfølgende konfokalmikroskopi demonstrerer effektiviteten af Cx43-knockdownen på proteinniveauet. Målestang = 50 μm. ( D ) Sammenligning af FRAP data fra miR547 og calcein farvestof viser den forskellige overførselsdynamik. Den mindre molekylvægt af calcein resulterede i en forøget fluorescensgenvinding sammenlignet med dy547-mærket miRNA-molekyler. FRAP kurver opsummerer dataene for n ≥56 celler, vist som middel ± SEM. Statistisk analyse blev udført ved anvendelse af tovejs-ANOVA efterfulgt af Bonferronis post-hoc-test (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Kompensation af Fokusdrift ved hjælp af 3D-FRAP-mikroskopi. (
Figur 5: 3D-overfladegengivelse af et 3D-FRAP-eksperiment. (Venstre) Maksimale fremskrivninger af en FRAP måling. Den fotoblegede celle (rød ramme) demonstrerer en stigning i fluorescensintensitet på grund af miRNA-overførsel fra tilstødende celler. (Højre) Erhvervede z-stabler af den samme fotoblebagede celle (rød) blev udsat for 3D overfladegengivelse for at visualisere den rumlige fordeling af miRNA. Skalbjælke = 20 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MiRNA'er er nøgleaktører i cellulær fysiologi og blev vist til at fungere som signalmolekyler ved at anvende-blandt andet -GJ'er som en vej for intercellulær udveksling 11 , 12 , 22 . Den nuværende protokol præsenterer en in vitro levende cellebilledteknik for at karakterisere denne GJ-afhængige pendling ved anvendelse af fluorescerende miRNA'er i celleklynger.
Protokollen blev udviklet på cardiomyocytter som et cellemodelsystem. Denne fremgangsmåde kan imidlertid anvendes på flere celletyper, hvis elektroporation er en egnet metode til miRNA-transfektion. Udover cell-til-celleudveksling er den præsenterede teknik også egnet til at undersøge intracellulær mobilitet af miRNA-molekyler ( fx til identifikation af mulige transportmekanismer i cellen) 23 , 24 .
Indhold "> Undersøgelsen af miRNA-overførsel ved hjælp af FRAP-mikroskopi kræver fluorescensmærkede miRNA-molekyler ( Figur 2 ). Da mærkning af specifikke cellulære miRNA ikke er mulig, kan kun exogent indført mærket miRNA anvendes til 3D-FRAP til at analysere dets intercellulære mobilitet . I vores eksperimenter blev celler transficeret med 250 nM miRNA. Denne koncentration var meget højere sammenlignet med fysiologiske tilstande, hvor miRNA-niveauet varierer fra 10 til 50.000 molekyler pr. Celle 27 , 28. Sådanne lave koncentrationer kan ikke anvendes i FRAP-eksperimenter, Da et bestemt niveau af fluorescerende miRNA-molekyler er nødvendigt for at opnå et tilstrækkeligt fluorescenssignal og for at sikre den korrekte diskrimination mellem baggrundsfluorescens og fluorescensmærkede miRNA. Imidlertid afhænger af det konfokale billeddannelsessystem og farvestoffets egenskaber anvendelsen af miRNA-koncentrationer ved lav -nM-rækkevidde skal være muligt for FRAP-analyser. </ P>Forskellige teknikker anvendes almindeligt til at studere intercellulær miRNA-overførsel, herunder flowcytometri, PCR og luciferase reporter assays 12 , 13 . Disse metoder registrerer miRNA shuttling med lav temporal opløsning ( dvs. timer til dage). I modsætning hertil giver 3D-FRAP-mikroskopi mulighed for visualisering og kvantificering af miRNA-overførsel og mobilitet i realtid. Udover gab-junctionelle cellecellekontakter medieres også intercellulær shuttling af miRNA af andre mekanismer, såsom eksosomer 18 , 29 , 30 . Kun 3D-FRAP giver tilstrækkelig høj tidsmæssig opløsning til at diskriminere mellem eksosomal og mellemrumsovergang. Det giver således mulighed for specifik undersøgelse af den direkte virkning af GJ-permeabilitet på miRNA-signalering under forskellige patologiske eller fysiologiske tilstande ( FiguRe 2).
Vi anbefaler brug af 3D-FRAP, som er bedre end konventionel 2D-FRAP, da det giver mere præcise data om GJ-afhængig miRNA-overførsel. 3D-FRAP målinger omfatter hele cellevolumenet, hvilket er vigtigt, når der anvendes storformet celletyper. Desuden kan det kompensere fokusændringer eller cellebevægelser, som viste sig at svække fluorescensgenopretningen betydeligt i 2D-FRAP ( Figur 3 ). Endelig giver optagelsen af z-stabler i 3D-FRAP-eksperimenter mulighed for at opnå rumlig information, hvilket ikke er muligt, når kun et enkelt 2D-lag anvendes til analyse af fluorescensintensiteter ( figur 3B ).
Da fluorescensgenvinding er afhængig af tilstrømningen af miRNA fra tilstødende celler, er antallet af celler, der er forbundet til den blegede celle, kritisk og skal være ens på tværs af forskellige målinger for at opnå pålidelige data. Derfor kræves en højcelletæthedD for at sikre dannelsen af cellulære klynger, der er mest egnede til FRAP-analyse. Endvidere skal foreløbige eksperimenter udføres for at vælge milde blegningsforhold ( dvs. laserkraft, blekningstid og scanningsindstillinger) for at undgå fototoxiske effekter forårsaget af en høj laserintensitet 25 , 26 . Dette vil også bidrage til at reducere den fotoblegning, der opstår under opkøbsprocessen.
På trods af begrænsningerne viser vores data, at 3D-FRAP er et kraftfuldt værktøj til evaluering af miRNAs rolle som signalmolekyler inden for et mobilnetværk. Virkningen af connexinsammensætning på miRNA shuttling eller den selektive permeabilitet af GJ'er for specifikke miRNA'er kan adresseres med den direkte kvantificering af transporteffektivitet. 3D-FRAP kan give vigtige oplysninger for at forbedre udviklingen af nye terapier med miRNA og siRNA, som f.eks. Ved at definere de rette forhold, der letter distributionenN af små RNA'er via GJ-netværket 31 , 32 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Forbundsministeriet for Uddannelse og Forskning Tyskland (FKZ 0312138A og FKZ 316159), staten Mecklenburg-Vorpommern med EU's strukturfonde (ESF / IVWM-B34-0030 / 10 og ESF / IVBM-B35-0010 / 12), DFG (DA1296-1), og German Heart Foundation (F / 01/12). Desuden understøttes RD af FORUN-programmet fra Rostock University Medical Center (889001), DAMP Foundation og BMBF (VIP + 00240).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| neonatal NMRI mice | Charles River | ||
| Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | 0.1% solution in PBS, sterilized |
| PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
| Dulbecco´s modified medium | Pan Biotech | P04-03550 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 U/mL, 100µg/mL |
| Fetal bovine serum | Pan Biotech | P30-3306 | |
| Cell culture plastic | TPP | ||
| Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | 88281 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 88281 | included in primary cardiomyocyte isolation kit |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| miRIDIAN Dy547 labeled microRNA Mimic | Dharmacon | CP-004500-01-05 | dissolve in RNAse free water, stock solution 20µM |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S3139 | |
| Sodium phosphate dibasic | Carl Roth | T877.2 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium chloride | Serva | 28305.01 | |
| Sodium succinate | Carl Roth | 3195.1 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA solution | Merck | L2153 | |
| 4-well- Glass bottom chamber slides | IBIDI | 80827 | coat with 0.1% gelatin solution |
| Amaxa Nucleofector II | Lonza | program G-009 was used for Electroporation | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Excel software | Microsoft | ||
| α-actinin antibody | Abcam | ab9465 | dilution 1:200 |
| Connexin43 antibody | Santa Cruz | sc-9059 | dilution 1:200 |
| goat anti-mouse Alexa 594 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11005 | dilution 1:300 |
| goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11034 | dilution 1:300 |
| Connexin43 siRNA | Thermo Fisher Scientific | AM16708 ID158724 | final concentration 250 nM |
| Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
| DAPI nuclear stain | Thermo Scientific | D1306 |
References
- Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell. 136 (4), 642-655 (2009).
- Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Grimm, D. Small silencing RNAs: state-of-the-art. Adv Drug Deliv Rev. 61 (9), 672-703 (2009).
- Raghunathan, S., Patel, B. M. Therapeutic implications of small interfering RNA in cardiovascular diseases. Fundam Clin Pharmacol. 27 (1), 1-20 (2013).
- Sluijter, J. P. G. MicroRNAs in Cardiovascular Regenerative Medicine: Directing Tissue Repair and Cellular Differentiation. ISRN Vasc Med. , 1-16 (2013).
- Li, M., Zhang, J. Circulating MicroRNAs: Potential and Emerging Biomarkers for Diagnosis of Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases. Biomed Res Int. , 1-9 (2015).
- Romaine, S. P. R., Tomaszewski, M., Condorelli, G., Samani, N. J. MicroRNAs in cardiovascular disease: an introduction for clinicians. Heart. 101 (12), 921-928 (2015).
- Maes, M., Crespo Yanguas,, Willebrords, S., Cogliati, J., Vinken, B., M, Connexin and pannexin signaling in gastrointestinal and liver disease. Transl Res. 166 (4), 332-343 (2015).
- Michela, P., Velia, V., Aldo, P., Ada, P. Role of connexin 43 in cardiovascular diseases. Eur. J. Pharmacol. 768, 71-76 (2015).
- Naus, C. C., Laird, D. W. Implications and challenges of connexin connections to cancer. Nat Rev Cancer. 10 (6), 435-441 (2010).
- Hong, X., Sin, W. C., Harris, A. L., Naus, C. C. Gap junctions modulate glioma invasion by direct transfer of microRNA. Oncotarget. 6 (17), Available from: http://www.impactjournals.com/oncotarget 15566-15577 (2015).
- Lee, H. K. H., et al. Mesenchymal stem cells deliver synthetic microRNA mimics to glioma cells and glioma stem cells and inhibit their cell migration and self-renewal. Oncotarget. 4 (2), 346-361 (2013).
- Katakowski, M., Buller, B., Wang, X., Rogers, T., Chopp, M. Functional microRNA is transferred between glioma cells. Cancer Res. 70 (21), 8259-8263 (2010).
- Zong, L., Zhu, Y., Liang, R., Zhao, H. -B. Gap junction mediated miRNA intercellular transfer and gene regulation: A novel mechanism for intercellular genetic communication. Sci Rep. 6, 19884 (2016).
- Yum, S. W., Zhang, J., Scherer, S. S. Dominant connexin26 mutants associated with human hearing loss have trans-dominant effects on connexin30. Neurobiol Dis. 38 (2), 226-236 (2010).
- Kuzma-Kuzniarska, M., Yapp, C., Pearson-Jones, T. W., Jones, A. K., Hulley, P. A. Functional assessment of gap junctions in monolayer and three-dimensional cultures of human tendon cells using fluorescence recovery after photobleaching. J Biomed Opt. 19 (1), 15001 (2013).
- Lemcke, H., Nittel, M. -L., Weiss, D. G., Kuznetsov, S. A. Neuronal differentiation requires a biphasic modulation of gap junctional intercellular communication caused by dynamic changes of connexin43 expression. Eur J Neurosci. 38 (2), 2218-2228 (2013).
- Lemcke, H., Steinhoff, G., David, R. Gap junctional shuttling of miRNA - A novel pathway of intercellular gene regulation and its prospects in clinical application. Cell Signal. 27 (12), 2506-2514 (2015).
- Lemcke, H., Kuznetsov, S. A. Involvement of connexin43 in the EGF/EGFR signalling during self-renewal and differentiation of neural progenitor cells. Cell Signal. 25 (12), 2676-2684 (2013).
- Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 98, 117-127 (2016).
- Laupheimer, M., et al. Selective Migration of Subpopulations of Bone Marrow Cells along an SDF-1 α and ATP Gradient. Bone Marrow Res. , 1-10 (2014).
- Zhang, S., Wang, Q., Liu, L., Hong, X., Zhang, Y., Tao, L. Gap junctions enhance the antiproliferative effect of microRNA-124-3p in glioblastoma cells. J Cell Physiol Physiol. 230 (10), 2476-2488 (2015).
- Vasilescu, C., Tanase, M., Dragomir, M., Calin, G. A. From mobility to crosstalk. A model of intracellular miRNAs motion may explain the RNAs interaction mechanism on the basis of target subcellular localization. Math Biosci. 280, 50-61 (2016).
- Pitchiaya, S., Androsavich, J. R., Walter, N. G. Intracellular single molecule microscopy reveals two kinetically distinct pathways for microRNA assembly. EMBO Rep. 13 (8), 709-715 (2012).
- Heinze, K. G., Costantino, S., De Koninck, P., Wiseman, P. W. Beyond photobleaching, laser illumination unbinds fluorescent proteins. J Phys Chem B. 113 (15), 5225-5233 (2009).
- Jou, M. J., Jou, S. B., Guo, M. J., Wu, H. Y., Peng, T. I. Mitochondrial reactive oxygen species generation and calcium increase induced by visible light in astrocytes. Ann N Y Acad Sci. 1011, 45-56 (2004).
- Dong, H., Lei, J., Ding, L., Wen, Y., Ju, H., Zhang, X. MicroRNA: Function, detection, and bioanalysis. Chem Rev. 113 (8), 6207-6233 (2013).
- Liang, Y., Ridzon, D., Wong, L., Chen, C. Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues. BMC Genomics. 8 (1), 166 (2007).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat Commun. 2, 282 (2011).
- Squadrito, M. L., et al. Endogenous RNAs Modulate MicroRNA Sorting to Exosomes and Transfer to Acceptor Cells. Cell Rep. 8, 1432-1446 (2014).
- Zhang, B., Farwell, M. A. microRNAs: a new emerging class of players for disease diagnostics and gene therapy. J Cell Mol Med. 12 (1), 3-21 (2008).
- Chen, Y., Gao, D. -Y., Huang, L. In vivo delivery of miRNAs for cancer therapy: Challenges and strategies. Adv Drug Deliv Rev. 81C, 128-141 (2015).
