Summary
Her beskriver vi anvendelsen av tredimensjonal fluorescensgjenoppretting etter photobleaching (3D-FRAP) for analysen av gapforbindelsesavhengig shuttling av miRNA. I motsetning til vanlige anvendte metoder, tillater 3D-FRAP kvantifisering av intercellulær overføring av små RNA i sanntid, med høy spatio-temporal oppløsning.
Abstract
Små antisense-RNAer, som miRNA og siRNA, spiller en viktig rolle i cellulær fysiologi og patologi, og kan dessuten brukes som terapeutiske midler ved behandling av flere sykdommer. Utviklingen av nye, innovative strategier for miRNA / siRNA-terapi er basert på omfattende kunnskap om de underliggende mekanismer. Nylige data antyder at små RNAer utveksles mellom celler i en gapsknapsavhengig måte, og derved fremkaller genregulerende effekter i mottakercellen. Molekylærbiologiske teknikker og strømningscytometrisk analyse brukes ofte til å studere intercellulær utveksling av miRNA. Imidlertid gir disse metodene ikke høy tidsmessig oppløsning, noe som er nødvendig når man studerer gapforbindelsesflommen av molekyler. Derfor, for å undersøke virkningen av miRNA / siRNA som intercellulære signalmolekyler, er det behov for nye verktøy som vil tillate analyse av disse små RNAene på mobilnivå. Den nåværende protokollen beskriver apPlication av tredimensjonal fluorescensgjenoppretting etter photobleaching (3D-FRAP) mikroskopi for å belyse gapet avstandsavhengig utveksling av miRNA-molekyler mellom hjerteceller. Viktig er at denne enkle og ikke-invasive levendecellebildingsmetoden tillater visualisering og kvantifisering av gapforbindelsesskjutingen av fluorescensmerkede små RNA i sanntid, med høy spatio-temporal oppløsning. Dataene som er oppnådd ved hjelp av 3D-FRAP, bekrefter en ny fremgangsmåte for intercellulær genregulering, hvor små RNA'er fungerer som signalmolekyler i det intercellulære nettverket.
Introduction
Små ikke-kodende RNA er viktige aktører innen cellegeneregulering. Disse molekylene er sammensatt av 20-25 nukleotider som binder til et bestemt målmRNA, som fører til blokkering av oversettelse eller til mRNA-nedbrytning 1 , 2 . Genreguleringsprosessen som utføres av små RNA, som miRNA og siRNA, er en svært konsentrert mekanisme som har blitt funnet i mange forskjellige arter 3 . Spesielt er miRNA-molekyler av avgjørende betydning for en rekke fysiologiske prosesser, inkludert spredning, differensiering og regenerering 4 , 5 . I tillegg tilskrives dysreguleringen av miRNA-ekspresjon til mange patologiske forstyrrelser. Tilsvarende har miRNAer blitt vist å være egnet som biomarkører for diagnose og som terapeutiske midler for genterapi 6 , 7
Gap junctions (GJ) er spesialiserte proteinkonstruksjoner i plasmamembranen til to tilstøtende celler som tillater diffusjonsutveksling av molekyler med en molekylvekt på opptil 1 kD. De har vist seg å være viktige for vevsutvikling, differensiering, celledød og patologiske forstyrrelser som kreft eller kardiovaskulær sykdom 8 , 9 , 10 . Flere molekyler er blitt beskrevet som værende i stand til å krysse GJ-kanaler, inkludert ioner, metabolitter og nukleotider. Interessant, ble også GJs funnet å gi en vei for intercellulær bevegelse av små RNAer 11 , 12 . Dermed kan miRNAs ikke bare fungere i cellen der de er produsert, men også innenfor mottakerceller. Dette fremhever rollen som miRNAer i det intercellulære signaltransduksjonssystemet. Samtidig viser dataeneAt gapet mellomliggende intercellulær kommunikasjon er nært knyttet til miRNA-funksjonen. På grunn av den betydelige effekten av miRNA og GJ på vevshemostase, patologi og diagnose, vil en omfattende forståelse av GJs funksjon og den relaterte intercellulære dynamikken til miRNA bidra til å avklare mekanismene til miRNA-baserte sykdommer og utvikle nye strategier for MiRNA terapier.
Avhengig av omfanget av gapforbindelseskoblingen kan overføringen av miRNA-molekyler mellom celler være en meget rask prosess. Derfor kreves en metodikk som tillater visualisering og kvantifisering av den hurtige intercellulære bevegelsen av disse regulatoriske signalmolekylene. Vanligvis har strømningscytometri og molekylærbiologiske teknikker blitt anvendt for å demonstrere shuttling av små RNAer 11 , 12 , 13 , 14 . Imidlertid, i motsetning til FRAP-mikroberKopi, disse tilnærmingene mangler høy temporal oppløsning, som er obligatorisk når man analyserer utveksling av miRNA via GJs. Videre er FRAP-mikroskopi mindre invasiv og representerer derfor en kraftig og ny levende cellediagnostikkteknikk for å evaluere den GJ-avhengige molekylutvekslingen i flere celletyper 15 , 16 , 17 .
Her presenterer vi en detaljert protokoll som beskriver anvendelsen av 3D-FRAP for å vurdere miRNA shuttling mellom kardiomyocytter. For dette formål ble kardiomyocytter transfektert med fluorescensmerket miRNA. En celle merket med denne miRNA ble photobleached, og gap-junctional miRNA re-tilstrømning fra tilstøtende celler ble registrert på en tidsavhengig måte. Den høye temporale oppløsningen av FRAP-eksperimenter gir muligheten til å utføre kinetiske studier for den nøyaktige evalueringen av intercellulær overføring av miRNA og siRNA mellom levende celler. MoreoVer, da små RNAer kan utveksles via forskjellige mekanismer med svært forskjellig kinetikk, kan FRAP-mikroskopi bidra til å avklare i hvilken grad GJ er involvert i respektive shuttling-prosesser 18 . I tillegg kan 3D-FRAP brukes til å undersøke fysiologiske og patologiske endringer i GJ-permeabilitet og dens innvirkning på liten RNA-overføring 15 , 19 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle trinn i denne protokollen som involverer neonatalmus ble utført pr. Etiske retningslinjer for dyrepleie av Rostock Universitets medisinske senter.
1. Fremstilling av cellekulturretter og medium for kardiomyocytkultur
- Coat en cellekulturplate med 0,1% gelatin i PBS og inkuber ved 37 ° C i 4 timer eller ved 4 ° C over natten. Fjern gelatinen og la den tørke under steril laminar luftstrøm.
- Forbered cellekulturmedium sammensatt av 50 ml DMEM tilsatt 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin (P / S). Forvar det til 37 ° C.
2. Isolering av neonatale kardiomyocytter
- Offer neonatale mus (1-2 dager) ved halshuggning med steril saks og åpne brystet langs brystbenet. Fjern hjertet ved hjelp av pincet mens du trykker litt på thoraxen sammen og overfører hjertet til en brønn med 24 brønner som inneholder iskaldt HBSS(Uten Ca 2+ og Mg 2+ ).
- Fjern ikke-hjertevev og større kar med sterile pincett. Overfør rensede hjerter til et 1,5 ml rør som inneholder iskaldt HBSS. Bruk maksimalt 5 hjerter per rør for enzymatisk fordøyelse.
- Hakk hjerter med liten sakse i <0,5 til 1 mm3 stykker.
- Vask hakkede hjerter med HBSS to ganger ved aspirasjon / tilsetning av HBSS ved hjelp av en 1 ml mikroliter pipette. Fjern HBSS helt før du legger til enzymer.
- For enzymatisk fordøyelse av neonatal hjerter, bruk et kommersielt tilgjengelig sett og følg produsentens protokoll (se Materialetabellen ). Rist røret som inneholder hakkede hjerter hvert 5. minutt mens inkubering med enzymer ved 37 ° C i 35 min.
- Frø-suspenderte celler på ikke-belagte cellekulturretter inneholdende cellekulturmedium i 1,5-2 timer for å tillate adhesjon av ikke-kardiomyocytfraksjonen. Gjenta dette trinnet hvis det er høy renhetAv kardiomyocytter er nødvendig. Hvis ønskelig, viderekultur den ikke-kardiomyocyttfraksjonen.
MERK: For en cellesuspensjon av 15 hjerter, kan forpletteringstrinnet utføres på 75 cm2 cellekulturkolber. Vanligvis oppnås ~ 5 x 105 celler fra ett neonatal hjerte. - Samle supernatanten i et 15 ml konisk rør og sentrifuger i 10 minutter ved 300 x g. Resuspender cellene i 1 ml cellekulturmedium.
- Telle cellene med et Neubauer-kammerhemocytometer, eller bruk en ekvivalent metode.
- Plate-isolerte kardiomyocytter på 6-brønnsplater med en tetthet på 3 x 10 5 celler / cm2. Inkubér cellene over natten ved 37 ° C og 5% CO2.
MERK: Eventuelt kan også celler transfekteres på dette punktet. Imidlertid ble økt levedyktighet observert når cellene ble dyrket i en dag før de ble utsatt for elektroporasjon.
3. Transfeksjon med fluorescensmerket merket miRNA
- pre-Varmcellekulturmedium (se trinn 1.2) til 37 ° C i et vannbad eller en ekvivalent anordning.
- Lag en 20 μM stamløsning av fluorescerende miRNA i RNase-fri sterilt vann.
- Forbered elektroporasjonsbuffer inneholdende 90 mM Na 2 HPO 4 , 90 mM NaH 2 PO 4 , 5 mM KCl, 10 mM MgCl2 og 10 mM natriumsuksinat og juster pH til 7,2; Elektroporasjonsbuffer kan lagres ved -20 ° C i flere måneder.
- Løsne cellene fra kulturretten ved å bruke 0,05% trypsin i 5 minutter. Inaktiver trypsinet ved å tilsette cellekulturmedium.
- Telle cellene med et Neubauer-kammerhemocytometer, eller bruk en ekvivalent metode. Sentrifuger cellene ved 300 xg i 10 minutter.
- Resuspender cellene i elektroporasjonsbuffer for å oppnå en konsentrasjon på 4 x 10 5 celler per 100 ul.
- Bland 100 μl cellesuspensjon med fluorescerende miRNA (sluttkonsentrasjon: 0,25 μM) i et rør ogLast inn blandingen i en elektroporasjonskuvette.
- Bestem empirisk riktig mengde miRNA, avhengig av celletype.
- Utfør elektroporering ved hjelp av en elektroporasjonsanordning (se Materialebordet ) ved hjelp av "G-009" -programmet .
- Tilsett 500 μl forvarmet celledyrkningsmedium og overfør hele cellesuspensjonen (4 x 10 5 celler) til en brønn i en 4-brønn glassbunnkammerdisplay. Kultur cellene i 1 dag ved 37 ° C i en 5% CO 2 atmosfære.
MERK: For FRAP-analyse er en celletetthet på ~ 80% optimal. Transfeksjonen av merket miRNA bør utelukkende utføres ved hjelp av elektroporasjon. Siden den homogene distribusjonen av merkede miRNA-molekyler er gunstig for FRAP-måling, anbefales ikke reagensbasert transfeksjon.
4. Bruk av 3D-FRAP-mikroskopi (dag 3)
- Varm opp mikroskop inkubatoren til 37 °; C og slå på det konfokale mikroskopsystemet minst 2 timer før FRAP-måling for å opprette en termisk likevekt og for å redusere muligheten for drift. Ved mulig opprettholde en 5% CO 2 atmosfære.
- Sett kammerglasset inn i trinnprøveholderen.
- Finn en klynge av transfekterte kardiomyocytter ved hjelp av et 1,4 NA-oljemål (400X forstørrelse) og 561 nm laser excitasjonslys ved lav laserkraft, med et deteksjonsområde på 570-680 nm.
MERK: Definisjonen av FRAP-innstillinger, bildeoppkjøpet og analysen ble gjort ved hjelp av mikroskopspesifikk programvare (se Materialebordet ). - Aktiver "Z-Stack", "Time Series", "Bleaching" og "Regions" -knappene i "Setup Manager."
- Definer FRAP parametrene.
- Definer innstillinger for bildeoppkjøp i menyen "Oppkjøpsmodus" ved å angi "rammestørrelse4; Til 512 x 512, "linjetrinn" til 1 og "skannetid" til <1 s.
- På menyen "Kanaler", juster laserkraften, forskyvningen, og få innstillinger for å oppnå maksimal fluorescens fra minimal laserekspensasjon ( f.eks. Laserkraft: 1-5%); Juster for å unngå intensitetsmetning. Sett "pinhole size" til 2 μm.
- Deretter velger du "ROI-tegneverktøy" i menyen "Regioner" og bruker markøren til å markere målcellen, referansecellen og bakgrunnsområdet. Hvis nødvendig, velg flere målceller for fotoblekking.
- Juster fotoblekkinnstillingene i "Bleaching" -menyen ( f.eks. Iterasjoner: 9-14, laserstrøm for fotoblekking: 100%, bildeoppkjøpsintervall: 60 s, sykluser: 15). Definer begynnelsen av bleking etter 3 første skanninger.
- I menyen "z-Stack" definerer du grensen for z-stack-oppkjøp, avhengig av cellens tykkelse. Juster "tallet oF z-lag "til 12-15.
- Start FRAP-eksperimentet og registrer fluorescensgjenoppretting.
MERK: Siden innstillingene til et FRAP-eksperiment er avhengig av celletypen, det fluorescerende fargestoffet og mikroskopesystemet, er det best å utføre pilotforsøk for å bestemme de optimale parametrene for FRAP. Bleking bør være tilstrekkelig til å redusere den første fluorescensintensiteten med minst 50%. Vanligvis bør fluorescensutvinning registreres hver 30-60 s til platåfasen er nådd.
5. Dataanalyse
- Opprett maksimale fremskrivninger av de overførte z-stabler og oppnå fluorescensintensitetsverdier av de blekerte målcellene, referansecellen og bakgrunnen. Bruk mikrospesifikke programvare, klikk på "Behandling" → "Maksimal intensitetsprojeksjon" → velg fil → "Apply."
- Alternativt kan du bruke et tilsvarende bildeanalyseringsverktøy (
- Alternativt kan du bruke et tilsvarende bildeanalyseringsverktøy (
- Kopier fluorescensintensitetsdataene til alle tidspunkter fra målcellen, bakgrunnen og referansecellen i et regneark.
- Trekk bakgrunnsintensiteten og intensiteten til referansecellen fra intensitetsverdiene til målcellen for å korrigere for photobleaching forårsaket under oppkjøpsprosessen. Utfør bakgrunns- og referansecellejusteringer for hvert tidspunkt.
- Normaliser de korrigerte FRAP-dataene til den innledende fluorescensintensiteten før bleking ved å dividere hver verdi ved den første fluorescensen.
- For å oppnå FRAP-kurver, sett grunnlinjen til fluorescensintensiteten umiddelbart etter bleken ved å trekke fra intensitetsverdiene til hvert tidspunkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her presenterer vi 3D-FRAP-mikroskopi som en ikke-invasiv teknikk for å studere gapforbindelseshastlingen av fluorescerende miRNA innen neonatal kardiomyocytter. De isolerte kardiomyocyttene avslørte det typiske striated a-actinin mønsteret og inneholdt store plakker av Cx43 langs cellecellegrensene ( Figur 1A , hvite pilehoder) som tillot den høye intercellulære flux av molekyler. Renheten av isolerte kardiomyocytter ble vurdert ved mikroskopisk kvantifisering av a-actinin-positive celler. Selv om noen ikke-kardiomyocytter (a-actinin-negative celler) var tilstede i kulturen, representerte neonatal kardiomyocytter hovedcelletypen etter isolering (79,62 ± 3,68%, Figur 1B ).
For å undersøke gapforbindelsesutvekslingen av miRNA ble celler transfektert med fluorescensmerket miRNA. EleCtroporation er metoden for å levere miRNA molekyler til celler, da det sikrer en høy transfeksjonseffektivitet og den homogene distribusjonen av transfekterte forbindelser, som er obligatorisk for FRAP-analyse. I vår eksperimentelle oppsett oppnådde vi en transfeksjonseffektivitet på ~ 45%, som bestemt av strømningscytometri ( figur 2A ). Utarbeidelsen av kardiomyocytter for FRAP inkluderer frigjøring fra kulturplaten, elektroporasjon og gjenfesting på kammerglidene. En strømningscytometrisk live / dødsanalyse viste at flertallet av celler viste høy levedyktighet, noe som er viktig når man analyserer gapforbindelseskommunikasjon ( figur 2B ). Videre er celletettheten en avgjørende parameter som påvirker FRAP-resultatene. For optimal FRAP målinger bør cellene frøes med en tetthet på ~ 80% for å tillate dannelse av celleklynger og etablering av funksjonelle gapskryss mellom celler ( Figur2C).
For FRAP-analyse velges målceller i en celleklynge og koples med 100% laserkraft, noe som fører til redusert miRNA-fluorescens i de valgte cellene ( figur 3A , blekemiddel). Deretter registreres fluorescensutvinning for å visualisere overføringen av miRNA fra tilstøtende celler inn i det bleke området. Siden platåfasen av fluorescensutvinningen ble nådd etter 13 minutter, ble dette tidsrom brukt til bildeoppkjøp i FRAP-eksperimentene. Kvantitativ analyse og normalisering av de oppkjøpte dataene viste en gjennomsnittlig utvinning på 20%. Dataene viste også at FRAP-mikroskopi muliggjør rask opptak av miRNA shuttling med høy temporal oppløsning. Avhengig av fargestoffene, kan oppkjøpsparametrene endres for å øke temporal oppløsning ytterligere.
Bruken av 3D-FRAP gjør det muligSammenligningen av GJ permeabilitet til miRNA under forskjellige forhold. For å demonstrere dette induserte vi en siRNA-mediert knockdown av Cx43, noe som førte til redusert proteinekspresjon ( Figur 3C ) og inhibering av gapforbindelseskommunikasjon. Som et resultat ble fluorescensutvinningen redusert med mer enn 50%, hvilket indikerer at effektiviteten av miRNA-overføring er sterkt avhengig av omfanget av gapforbindelseskobling mellom celler ( Figur 3B , Cx43-knockdown). For å bekrefte at fluorescensutvinningen reflekterer passasjen av det fluorescensmerkede miRNA, i stedet for den frittliggende Dy547-taggen, oppnådde vi også FRAP-data for calcein-fargestoff ( Figur 3D ). Calcein har en molekylvekt som er sammenlignbar med den for Dy547 og har således lignende overføringsdynamikk. I motsetning til fluorescensutvinningen av Dy547-merket miRNA demonstrerte calcein økt gapforbindelsesutveksling, hvilket indikerer at Dy547-taggen iEr ikke løsrevet fra miRNA molekylet ( Figur 3D ).
Stabile fokusforhold er obligatoriske i løpet av et FRAP-eksperiment, spesielt når langsiktige målinger utføres. Sammenlignet med 2D-applikasjoner, kan 3D-FRAP kompensere for potensiell fokusdrift. Som vist i figur 4 påvirker selv små fokusendringer riktig deteksjon av fluorescenssignalet til miRNA når bare et enkelt 2D-lag brukes til FRAP-eksperimentet ( figur 4B ). I motsetning til 3D-FRAP registreres en hel z-stabel av målcellen, og maksimale fremskrivninger blir utsatt for dataanalyse ( figur 4A ). Effekten av fokusdrift på en normalisert fluorescens-intensitetskurver er vist i figur 4C . Mens fluorescensutvinning øker jevnt over tid i 3D-FRAP, oppnår 2D-FRAP-oppkjøpet en nedgang oF fluorescenssignalet.
Ved siden av kompensasjonen for fokusendringer, gir 3D-FRAP også romlige data for gap-bytteutvekslingen av miRNA. Figur 5 viser en 3D-overflategengivelse av et FRAP-eksperiment. Sammenliknet med maksimale fremskrivninger, kan oppkjøpet av z-stabler brukes til å lage 3D-rekonstruksjoner for å undersøke lokalisering og mobilitet av miRNA i celler ( figur 5 ). Co-merking med organeller vil tillate undersøkelse av involvering av andre cellulære komponenter i miRNA-overføring.
Figur 1: Representative mikroskopiske bilder av isolerte neonatale kardiomyocytter. ( A ) Strukturert belysningsmikroskopi viser det høye uttrykket for Cx43, som akkumuleres i stor pLaques ved celle-celle grenser (arrowheads). Den utprøvde dannelsen av GJ med tilstøtende celler muliggjør en omfattende utveksling av små molekyler, inkludert miRNA. Skalbjelke = 20 μm ( B ) Renhet av isolerte kardiomyocytter. Merking av a-aktinin demonstrerer at kardiomyocytter representerer hovedcelletypen etter isolering. Skalbjelke = 50 μm. Celler ble farget med anti-Cx43 (grønn) og anti-a-actinin antistoffer (rød). Nuclei ble visualisert ved bruk av DAPI (blå). En beskrivelse av strukturert belysningsmikroskopi og immunologisk merking er gitt i en tidligere publikasjon 20 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Transfeksjonseffektivitet, levedyktighet , Og celledensitet av neonatal kardiomyocytkultur. ( A ) Flowcytometri viste at miR547 elektroporation resulterte i en transfeksjonseffektivitet på ~ 45%. ( B ) Cellivarabilitet av kardiomyocytter anvendt for FRAP. Etter isolering, elektroporasjon og reattachment ble kardiomyocytter underkastet levende og dødcellefarging og demonstrert høycelle-levedyktighet. ( C ) Mikroskopisk bilde av mir547-transfekterte kardiomyocytter preparert for FRAP-mikroskopi. En celletetthet på 80-90% sikrer den utprøvde dannelsen av gapforbindelsescellen-cellekontakter. Skalbjelke = 50 μm. En fremgangsmåte for strømningscytometrisk analyse av transfeksjonseffektivitet og levedyktighetsfarging er nevnt i tidligere publikasjoner 20 , 21 . Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: GJ-avhengig utveksling av miRNA i neonatale kardiomyocytter. ( A ) Representative bilder av et FRAP-eksperiment. Etter transfeksjon med merket miRNA, blir målceller i en celleklynger photobleached av en sterk laserpuls (preblek versus blekemiddel). Avhengig av omfanget av gapforbindelseskoblingen resulterer gapforbindelsesinnstrømningen av miRNA fra tilstøtende celler i økt fluorescensintensitet i de bleket målceller (etter blekemiddel t = 3, 6, 9 og 13 min). Skalbjelke = 20 μm ( B ) Kvantitativ analyse av overførte FRAP-data viser en fluorescensutvinning på 20% etter 13 minutter. For å bekrefte involverings-GJ i intercellulær overføring av miRNA ble en cx43 knockdown utført, noe som førte til en sterk reduksjon av fluorescensgjenvinning (50%). ( C ) Immunostaining med anti-Cx43Antistoff og påfølgende konfokalmikroskopi demonstrerer effektiviteten av Cx43-knockdownen på proteinnivået. Skalbjelke = 50 μm. ( D ) Sammenligning av FRAP-dataene for miR547 og calcein-fargestoff viser den forskjellige overføringsdynamikken. Den mindre molekylvekten av calcein resulterte i økt fluorescensutvinning sammenlignet med dy547-merkede miRNA-molekyler. FRAP kurver oppsummerer dataene for n ≥56 celler, vist som gjennomsnittet ± SEM. Statistisk analyse ble utført ved bruk av toveis ANOVA etterfulgt av Bonferronis post-hoc-test (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Kompensasjon av fokusdrift ved hjelp av 3D-FRAP-mikroskopi. (
Figur 5: 3D-overflateutførelse av et 3D-FRAP-eksperiment. (Venstre) Maksimale fremskrivninger av en FRAP måling. Den photobleached cellen (rød ramme) demonstrerer en økning i fluorescensintensitet på grunn av miRNA-overføring fra tilstøtende celler. (Høyre) Ervervede z-stabler av samme fotoblebagede celle (rød) ble utsatt for 3D overflategengivelse for å visualisere den romlige fordeling av miRNA. Skalbjelke = 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MiRNAs er sentrale aktører i cellefysiologi og ble vist å fungere som signalmolekyler ved å bruke-blant annet -GJs som en vei for intercellulær utveksling 11 , 12 , 22 . Den nåværende protokollen presenterer en in vitro levendecellebildeteknikk for å karakterisere denne GJ-avhengige shuttling ved bruk av fluorescerende miRNAer i celleklynger.
Protokollen ble utviklet på kardiomyocytter som et cellemodelsystem. Denne tilnærmingen kan imidlertid anvendes på flere celletyper dersom elektroporasjon er en egnet metode for miRNA-transfeksjon. I tillegg til celle-til-celleutveksling er den presenterte teknikken også egnet til å undersøke intracellulær mobilitet av miRNA-molekyler (for eksempel for identifisering av mulige transportmekanismer i cellen) 23 , 24 .
Innhold "> Undersøkelsen av miRNA-overføring med FRAP-mikroskopi krever fluorescensmerkede miRNA-molekyler ( Figur 2 ). Ettersom merking av spesifikke cellulære miRNAer ikke er mulig, kan bare eksogent introdusert merket miRNA brukes til 3D-FRAP for å analysere intercellulær mobilitet . I våre eksperimenter ble celler transfektert med 250 nM miRNA. Denne konsentrasjonen var mye høyere i forhold til fysiologiske forhold, hvor miRNA-nivået varierer fra 10 til 50 000 molekyler pr. Celle 27 , 28. Slike lave konsentrasjoner kan ikke brukes i FRAP-eksperimenter, Som et visst nivå av fluorescerende miRNA-molekyler er nødvendig for å oppnå et tilstrekkelig fluorescenssignal og for å sikre en riktig diskriminering mellom bakgrunnsfluorescens og fluorescensmerket miRNA. Imidlertid, avhengig av det konfokale imaging-systemet og fargestoffene, er bruk av miRNA-konsentrasjoner ved lav -nM-rekkevidde bør være mulig for FRAP-analyser. </ P>Ulike teknikker blir ofte brukt for å studere intercellulær miRNA-overføring, inkludert strømningscytometri, PCR og luciferase reporter assays 12 , 13 . Disse metodene oppdager miRNA shuttling med lav temporal oppløsning ( dvs. timer til dager). I motsetning tillater 3D-FRAP mikroskopi visualisering og kvantifisering av miRNA overføring og mobilitet i sanntid. I tillegg til gap-forbindelsescellete-cellekontakter blir også intercellulær shuttling av miRNA mediert av andre mekanismer, som eksosomer 18 , 29 , 30 . Bare 3D-FRAP gir tilstrekkelig høy tidsmessig oppløsning å diskriminere mellom eksosomal og gapoverføring. Dermed tillater det spesifikk undersøkelse av den direkte effekten av GJ permeabilitet på miRNA signalering under forskjellige patologiske eller fysiologiske forhold (FiguRe 2).
Vi anbefaler bruk av 3D-FRAP, som er bedre enn vanlig 2D-FRAP, da det gir mer nøyaktige data om GJ-avhengig miRNA-overføring. 3D-FRAP målinger inkluderer hele cellevolumet, noe som er viktig når du bruker storlastcelletyper. I tillegg kan det kompensere fokusendringer eller cellebevegelser, som viste seg å svekke fluorescensegenskapen betydelig i 2D-FRAP ( Figur 3 ). Til slutt gir opptak av z-stabler i 3D-FRAP-eksperimenter muligheten til å oppnå romlig informasjon, noe som ikke er mulig når bare et enkelt 2D-lag brukes til analyse av fluorescensintensiteter ( figur 3B ).
Siden fluorescensutvinning er avhengig av tilstrømningen av miRNA fra tilstøtende celler, er antall celler koblet til den bleke cellen kritisk og må være lik over forskjellige målinger for å oppnå pålitelige data. Derfor krever en høy celletetthetD for å sikre dannelsen av celleklynger som er mest egnet for FRAP-analyse. Videre må det foretas foreløpige eksperimenter for å velge milde blekningsforhold ( dvs. laserkraft, blekingstid og skanneinnstillinger) for å unngå fototoxiske effekter forårsaket av høy laserintensitet 25 , 26 . Dette vil også bidra til å redusere photobleaching som oppstår under oppkjøpsprosessen.
Til tross for begrensningene viser våre data at 3D-FRAP er et kraftig verktøy for å evaluere rollen som miRNAs som signalmolekyler i et mobilnettet. Virkningen av connexinsammensetning på miRNA shuttling eller selektiv permeabilitet av GJs for spesifikke miRNAs kan adresseres med direkte kvantifisering av transporteffektivitet. 3D-FRAP kan gi viktig informasjon for å forbedre utviklingen av nye terapier med miRNA og siRNA, for eksempel ved å definere riktige forhold som letter distribusjonenN av små RNAer via GJ-nettverket 31 , 32 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Forbundsdepartementet for utdanning og forskning Tyskland (FKZ 0312138A og FKZ 316159), staten Mecklenburg-Vorpommern med EUs strukturfond (ESF / IVWM-B34-0030 / 10 og ESF / IVBM-B35-0010 / 12), DFG (DA1296-1), og German Heart Foundation (F / 01/12). I tillegg støttes RD av FORUN-programmet til Rostock University Medical Center (889001), DAMP Foundation, og BMBF (VIP + 00240).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| neonatal NMRI mice | Charles River | ||
| Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | 0.1% solution in PBS, sterilized |
| PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
| Dulbecco´s modified medium | Pan Biotech | P04-03550 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 U/mL, 100µg/mL |
| Fetal bovine serum | Pan Biotech | P30-3306 | |
| Cell culture plastic | TPP | ||
| Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | 88281 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 88281 | included in primary cardiomyocyte isolation kit |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| miRIDIAN Dy547 labeled microRNA Mimic | Dharmacon | CP-004500-01-05 | dissolve in RNAse free water, stock solution 20µM |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S3139 | |
| Sodium phosphate dibasic | Carl Roth | T877.2 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium chloride | Serva | 28305.01 | |
| Sodium succinate | Carl Roth | 3195.1 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA solution | Merck | L2153 | |
| 4-well- Glass bottom chamber slides | IBIDI | 80827 | coat with 0.1% gelatin solution |
| Amaxa Nucleofector II | Lonza | program G-009 was used for Electroporation | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Excel software | Microsoft | ||
| α-actinin antibody | Abcam | ab9465 | dilution 1:200 |
| Connexin43 antibody | Santa Cruz | sc-9059 | dilution 1:200 |
| goat anti-mouse Alexa 594 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11005 | dilution 1:300 |
| goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11034 | dilution 1:300 |
| Connexin43 siRNA | Thermo Fisher Scientific | AM16708 ID158724 | final concentration 250 nM |
| Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
| DAPI nuclear stain | Thermo Scientific | D1306 |
References
- Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell. 136 (4), 642-655 (2009).
- Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Grimm, D. Small silencing RNAs: state-of-the-art. Adv Drug Deliv Rev. 61 (9), 672-703 (2009).
- Raghunathan, S., Patel, B. M. Therapeutic implications of small interfering RNA in cardiovascular diseases. Fundam Clin Pharmacol. 27 (1), 1-20 (2013).
- Sluijter, J. P. G. MicroRNAs in Cardiovascular Regenerative Medicine: Directing Tissue Repair and Cellular Differentiation. ISRN Vasc Med. , 1-16 (2013).
- Li, M., Zhang, J. Circulating MicroRNAs: Potential and Emerging Biomarkers for Diagnosis of Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases. Biomed Res Int. , 1-9 (2015).
- Romaine, S. P. R., Tomaszewski, M., Condorelli, G., Samani, N. J. MicroRNAs in cardiovascular disease: an introduction for clinicians. Heart. 101 (12), 921-928 (2015).
- Maes, M., Crespo Yanguas,, Willebrords, S., Cogliati, J., Vinken, B., M, Connexin and pannexin signaling in gastrointestinal and liver disease. Transl Res. 166 (4), 332-343 (2015).
- Michela, P., Velia, V., Aldo, P., Ada, P. Role of connexin 43 in cardiovascular diseases. Eur. J. Pharmacol. 768, 71-76 (2015).
- Naus, C. C., Laird, D. W. Implications and challenges of connexin connections to cancer. Nat Rev Cancer. 10 (6), 435-441 (2010).
- Hong, X., Sin, W. C., Harris, A. L., Naus, C. C. Gap junctions modulate glioma invasion by direct transfer of microRNA. Oncotarget. 6 (17), Available from: http://www.impactjournals.com/oncotarget 15566-15577 (2015).
- Lee, H. K. H., et al. Mesenchymal stem cells deliver synthetic microRNA mimics to glioma cells and glioma stem cells and inhibit their cell migration and self-renewal. Oncotarget. 4 (2), 346-361 (2013).
- Katakowski, M., Buller, B., Wang, X., Rogers, T., Chopp, M. Functional microRNA is transferred between glioma cells. Cancer Res. 70 (21), 8259-8263 (2010).
- Zong, L., Zhu, Y., Liang, R., Zhao, H. -B. Gap junction mediated miRNA intercellular transfer and gene regulation: A novel mechanism for intercellular genetic communication. Sci Rep. 6, 19884 (2016).
- Yum, S. W., Zhang, J., Scherer, S. S. Dominant connexin26 mutants associated with human hearing loss have trans-dominant effects on connexin30. Neurobiol Dis. 38 (2), 226-236 (2010).
- Kuzma-Kuzniarska, M., Yapp, C., Pearson-Jones, T. W., Jones, A. K., Hulley, P. A. Functional assessment of gap junctions in monolayer and three-dimensional cultures of human tendon cells using fluorescence recovery after photobleaching. J Biomed Opt. 19 (1), 15001 (2013).
- Lemcke, H., Nittel, M. -L., Weiss, D. G., Kuznetsov, S. A. Neuronal differentiation requires a biphasic modulation of gap junctional intercellular communication caused by dynamic changes of connexin43 expression. Eur J Neurosci. 38 (2), 2218-2228 (2013).
- Lemcke, H., Steinhoff, G., David, R. Gap junctional shuttling of miRNA - A novel pathway of intercellular gene regulation and its prospects in clinical application. Cell Signal. 27 (12), 2506-2514 (2015).
- Lemcke, H., Kuznetsov, S. A. Involvement of connexin43 in the EGF/EGFR signalling during self-renewal and differentiation of neural progenitor cells. Cell Signal. 25 (12), 2676-2684 (2013).
- Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 98, 117-127 (2016).
- Laupheimer, M., et al. Selective Migration of Subpopulations of Bone Marrow Cells along an SDF-1 α and ATP Gradient. Bone Marrow Res. , 1-10 (2014).
- Zhang, S., Wang, Q., Liu, L., Hong, X., Zhang, Y., Tao, L. Gap junctions enhance the antiproliferative effect of microRNA-124-3p in glioblastoma cells. J Cell Physiol Physiol. 230 (10), 2476-2488 (2015).
- Vasilescu, C., Tanase, M., Dragomir, M., Calin, G. A. From mobility to crosstalk. A model of intracellular miRNAs motion may explain the RNAs interaction mechanism on the basis of target subcellular localization. Math Biosci. 280, 50-61 (2016).
- Pitchiaya, S., Androsavich, J. R., Walter, N. G. Intracellular single molecule microscopy reveals two kinetically distinct pathways for microRNA assembly. EMBO Rep. 13 (8), 709-715 (2012).
- Heinze, K. G., Costantino, S., De Koninck, P., Wiseman, P. W. Beyond photobleaching, laser illumination unbinds fluorescent proteins. J Phys Chem B. 113 (15), 5225-5233 (2009).
- Jou, M. J., Jou, S. B., Guo, M. J., Wu, H. Y., Peng, T. I. Mitochondrial reactive oxygen species generation and calcium increase induced by visible light in astrocytes. Ann N Y Acad Sci. 1011, 45-56 (2004).
- Dong, H., Lei, J., Ding, L., Wen, Y., Ju, H., Zhang, X. MicroRNA: Function, detection, and bioanalysis. Chem Rev. 113 (8), 6207-6233 (2013).
- Liang, Y., Ridzon, D., Wong, L., Chen, C. Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues. BMC Genomics. 8 (1), 166 (2007).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat Commun. 2, 282 (2011).
- Squadrito, M. L., et al. Endogenous RNAs Modulate MicroRNA Sorting to Exosomes and Transfer to Acceptor Cells. Cell Rep. 8, 1432-1446 (2014).
- Zhang, B., Farwell, M. A. microRNAs: a new emerging class of players for disease diagnostics and gene therapy. J Cell Mol Med. 12 (1), 3-21 (2008).
- Chen, Y., Gao, D. -Y., Huang, L. In vivo delivery of miRNAs for cancer therapy: Challenges and strategies. Adv Drug Deliv Rev. 81C, 128-141 (2015).
