Summary
Aqui, descrevemos a aplicação da recuperação de fluorescência tridimensional após o fotobleaching (3D-FRAP) para a análise do deslocamento dependente da junção de miARN. Em contraste com os métodos comumente aplicados, o 3D-FRAP permite a quantificação da transferência intercelular de pequenos RNAs em tempo real, com alta resolução espaço-temporal.
Abstract
Os pequenos ARNs antisentidos, como o miARN e o siRNA, desempenham um papel importante na fisiologia celular e na patologia e, além disso, podem ser utilizados como agentes terapêuticos no tratamento de diversas doenças. O desenvolvimento de novas estratégias inovadoras para a terapia com miARN / siRNA é baseado em um amplo conhecimento dos mecanismos subjacentes. Dados recentes sugerem que os pequenos RNAs são trocados entre as células de uma maneira dependente da junção de lacunas, induzindo os efeitos reguladores de genes na célula receptora. Técnicas biológicas moleculares e análise citométrica de fluxo são comumente usadas para estudar a troca intercelular de miARN. No entanto, esses métodos não fornecem alta resolução temporal, o que é necessário ao estudar o fluxo juncional de gap das moléculas. Portanto, para investigar o impacto do miARN / siRNA como moléculas de sinalização intercelular, são necessárias novas ferramentas que permitirão a análise desses pequenos RNAs no nível celular. O presente protocolo descreve o apPlicação da recuperação de fluorescência tridimensional após microscopia de fotoblanqueamento (3D-FRAP) para elucidar a troca de moléculas de miARN entre as células cardíacas dependentes da junção gap. É importante ressaltar que esta abordagem direta e não invasiva de imagens de células vivas permite a visualização e quantificação do deslocamento de junção de RNA pequenos com marcação fluorescente em tempo real, com alta resolução espaço-temporal. Os dados obtidos por 3D-FRAP confirmam uma nova via de regulação de genes intercelulares, onde os pequenos RNAs atuam como moléculas de sinalização dentro da rede intercelular.
Introduction
Os pequenos RNAs não codificados são jogadores importantes na regulação de genes celulares. Estas moléculas são compostas por 20-25 nucleótidos que se ligam a um mRNA alvo específico, levando ao bloqueio da tradução ou à degradação mRNA 1 , 2 . O processo de regulação de genes realizado por pequenos RNAs, como o miARN e siRNA, é um mecanismo altamente conservado que foi encontrado em muitas espécies diferentes 3 . Em particular, as moléculas de miARN são de importância crucial para uma variedade de processos fisiológicos, incluindo proliferação, diferenciação e regeneração 4 , 5 . Além disso, a desregulação da expressão de miARN é atribuída a muitas doenças patológicas. Correspondentemente, os miRNAs demonstraram ser adequados como biomarcadores para o diagnóstico e como agentes terapêuticos para terapia genética 6 , 7
As junções de abertura (GJs) são estruturas de proteínas especializadas na membrana plasmática de duas células adjacentes que permitem a troca difusional de moléculas com um peso molecular de até 1 kD. Eles mostraram ser importantes para o desenvolvimento de tecidos, diferenciação, morte celular e distúrbios patológicos, como câncer ou doença cardiovascular 8 , 9 , 10 . Várias moléculas foram descritas como capazes de atravessar canais GJ, incluindo íons, metabólitos e nucleotídeos. Curiosamente, GJs também foram encontrados para fornecer um caminho para o movimento intercelular de pequenos RNAs 11 , 12 . Assim, os miRNAs podem atuar não apenas dentro da célula em que são produzidos, mas também dentro das células receptoras. Isso destaca o papel dos miRNAs no sistema de transdução de sinal intercelular. Ao mesmo tempo, os dados demonstramEssa comunicação intercelular juncional gap está intimamente ligada à função miRNA. Devido ao impacto significativo do miARN e do GJ na homeostase, na patologia e no diagnóstico de tecido, uma compreensão abrangente da função dos GJ e da dinâmica intercelular relacionada do miARN ajudará a esclarecer os mecanismos das doenças baseadas em miARN e a desenvolver novas estratégias para Terapias de miRNA.
Dependendo da extensão do acoplamento juncional gap, a transferência de moléculas de miARN entre as células pode ser um processo muito rápido. Portanto, é necessária uma metodologia que permita a visualização e quantificação do movimento intercelular rápido dessas moléculas de sinalização regulatória. Comumente, as técnicas de citometria de fluxo e biologia molecular foram aplicadas para demonstrar o transporte de pequenos RNAs 11 , 12 , 13 , 14 . No entanto, ao contrário dos micros FRAPCopiar, essas abordagens não possuem alta resolução temporal, o que é obrigatório ao analisar a troca de miRNA via GJs. Além disso, o microscópio FRAP é menos invasivo e, portanto, representa uma poderosa e nova técnica de imagem de células vivas para avaliar a troca dependente de GJ de moléculas em vários tipos de células 15 , 16 , 17 .
Aqui, apresentamos um protocolo detalhado descrevendo a aplicação de 3D-FRAP para avaliar a transferência de miARN entre cardiomiócitos. Para este fim, os cardiomiócitos foram transfectados com miARN marcado fluorescentemente. Uma célula marcada com este miRNA foi fotobleached, e o reentensign de miARN juncional de junção de células adjacentes foi registrado de maneira dependente do tempo. A alta resolução temporal de experiências FRAP oferece a possibilidade de realizar estudos cinéticos para a avaliação precisa da transferência intercelular de miARN e siARN entre células vivas. MoreoComo os pequenos RNAs podem ser trocados através de mecanismos diferentes com cinética altamente diferente, o microscópio FRAP pode ajudar a esclarecer até que ponto os GJs estão envolvidos nos respectivos processos de shuttling 18 . Além disso, 3D-FRAP pode ser usado para investigar alterações fisiológicas e patológicas na permeabilidade GJ e seu impacto na transferência de RNA pequena 15 , 19 .
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Protocol
Todas as etapas neste protocolo envolvendo ratos neonatais foram realizadas de acordo com as diretrizes éticas para o cuidado de animais do Centro Médico da Universidade Rostock.
1. Preparação de pratos de cultura de células e do meio para cultura de cardiomiócitos
- Revestir uma placa de cultura de células com 0,1% de gelatina em PBS e incubar a 37 ° C durante 4 h ou a 4 ° C durante a noite. Remova a gelatina e deixe secar sob fluxo de ar laminar esterilizado.
- Prepare o meio de cultura celular composto por 50 mL de DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina (P / S). Pré-aquecer até 37 ° C.
2. Isolamento de cardiomiócitos neonatais
- Sacrifique ratos neonatais (1-2 dias de idade) por decapitação com tesoura esterilizada e abra o tórax ao longo do esterno. Remova o coração usando fórceps enquanto pressiona ligeiramente o tórax em conjunto e transfira o coração para uma placa de 24 poços contendo HBSS gelado(Sem Ca 2 + e Mg 2+ ).
- Remova o tecido não cardíaco e vasos maiores usando pinça estéril. Transferir corações limpos para um tubo de 1,5 mL contendo HBSS gelado. Use um máximo de 5 corações por tubo para digestão enzimática.
- Corte os corações com pequenas tesouras em <0,5 a 1 mm³ de peças.
- Lave os corações picados com HBSS duas vezes por aspiração / adição de HBSS usando uma pipeta de 1 ml de microlitros. Remova o HBSS completamente antes de adicionar as enzimas.
- Para a digestão enzimática de corações neonatais, use um kit comercialmente disponível e siga o protocolo do fabricante (veja a Tabela de Materiais ). Agite o tubo contendo os corações picados cada 5 min enquanto incuba com enzimas a 37 ° C durante 35 min.
- Células suspensas de sementes em pratos de cultura celular não revestidos contendo meio de cultura celular durante 1,5-2 h para permitir a aderência da fração não cardiomicítica. Repita este passo se uma alta purezaDos cardiomiócitos é necessária. Se desejado, aprofundar a fração não cardiomiócita.
NOTA: Para uma suspensão celular de 15 corações, o passo de pré-revestimento pode ser realizado em frascos de cultura de células de 75 cm2. Normalmente, 5 x 10 5 células são obtidas de um coração neonatal. - Recolher o sobrenadante em um tubo cônico de 15 mL e centrifugar durante 10 min a 300 x g. Ressuspender as células em 1 mL de meio de cultura de células.
- Contar as células com um hemocitômetro da câmara de Neubauer, ou usar um método equivalente.
- Cardiomiócitos isolados em placa em placas de 6 poços com uma densidade de 3 x 10 5 células / cm². Incubar as células durante a noite a 37 ° C e 5% de CO 2 .
NOTA: Opcionalmente, as células também podem ser transfectadas neste ponto. No entanto, a viabilidade aumentada foi observada quando as células foram cultivadas durante um dia antes de serem submetidas à eletroporação.
3. Transfecção com miARN com etiqueta fluorescente
- Pré-Meio de cultura de células quentes (ver passo 1.2) a 37 ° C num banho de água ou num dispositivo equivalente.
- Prepare uma solução de reserva de 20 μM de miARN fluorescente em água estéril isenta de RNase.
- Prepare um tampão de eletroporação contendo Na2HPO4 90 mM, NaH2PO4 90 mM, KCl 5 mM, MgCl2 10 mM e succinato de sódio 10 mM e ajuste o pH para 7,2; O buffer de eletroporação pode ser armazenado a -20 ° C por vários meses.
- Descarte as células do prato de cultura usando 0,05% de tripsina por 5 min. Inactive a tripsina pela adição de meio de cultura de células.
- Contar as células com um hemocitômetro da câmara de Neubauer, ou usar um método equivalente. Centrifugar as células a 300 xg por 10 min.
- Ressuspender as células no tampão de eletroporação para obter uma concentração de 4 x 10 5 células por 100 μL.
- Misture 100 μL de suspensão celular com miARN fluorescente (concentração final: 0,25 μM) em um tubo eColoque a mistura em uma cuvete de eletroporação.
- Determinar empiricamente a quantidade apropriada de miARN, dependendo do tipo de célula.
- Execute eletroporação usando um dispositivo de eletroporação (veja a Tabela de Materiais ), usando o programa "G-009".
- Adicione 500 μL de meio de cultura de células pré-aquecido e transfira a suspensão de células inteiras (4 x 10 5 células) para dentro de um poço de um escorredor de câmara de fundo de vidro de 4 poços. Cultive as células durante 1 dia a 37 ° C numa atmosfera de CO2 a 5%.
NOTA: Para análise de FRAP, uma densidade celular de ~ 80% é otimizada. A transfecção de miARN marcado deve ser realizada exclusivamente por eletroporação. Uma vez que a distribuição homogênea de moléculas de miARN marcadas é benéfica para a medição de FRAP, a transfecção baseada em reagente não é recomendada.
4. Aplicando o Microscópio 3D-FRAP (Dia 3)
- Aquecer a incubadora do microscópio até 37 °; C e ligar o sistema de microscópio confocal pelo menos 2 h antes da medição de FRAP para estabelecer um equilíbrio térmico e diminuir a possibilidade de deriva. Se possível, mantenha uma atmosfera de CO2 de 5%.
- Insira a câmara no porta-amostras do palco.
- Encontre um conjunto de cardiomiócitos transfectados usando um objetivo de óleo de 1,4 NA (aumento de 400 x) e luz de excitação laser de 561 nm com baixa potência de laser, com uma faixa de detecção de 570-680 nm.
NOTA: A definição das configurações do FRAP, a aquisição da imagem e a análise foram feitas usando o software específico do microscópio (veja a Tabela de Materiais ). - Ative os botões "z-Stack", "Time Series", "Blanqueamento" e "Regiões" no "Gerenciador de Configuração".
- Defina os parâmetros FRAP.
- Defina as configurações de aquisição de imagem no menu "Modo de Compra", definindo o "tamanho do quadro"4; Para 512 x 512, o "passo da linha" para 1, e o "tempo de digitalização" para <1 s.
- No menu "Canais", ajuste as configurações de potência, deslocamento e gancho do laser para obter a máxima fluorescência da excitação mínima do laser ( por exemplo, potência do laser: 1-5%); Ajuste para evitar saturação de intensidade. Defina o "tamanho do pinhole" para 2 μm.
- Em seguida, no menu "Regiões", selecione a "ferramenta de desenho ROI" e use o cursor para marcar a célula alvo, a célula de referência e a área de fundo. Se necessário, selecione várias células alvo para fotoblanquear.
- Ajuste as configurações de fotobloco no menu "Branqueamento" ( por exemplo, iterações: 9-14, potência do laser para fotoblanqueamento: 100%, intervalo de aquisição de imagem: 60 s, ciclos: 15). Defina o início do branqueamento após 3 exames iniciais.
- No menu "z-Stack", defina os limites para a aquisição da pilha z, dependendo da espessura das células. Ajuste o "número oF z-layers "para 12-15.
- Comece o experimento FRAP e registre a recuperação de fluorescência.
NOTA: Uma vez que as configurações de um experimento FRAP dependem do tipo de célula, do corante fluorescente e do sistema de microscópio, é melhor realizar experiências piloto para determinar os parâmetros ótimos para FRAP. O branqueamento deve ser suficiente para reduzir a intensidade de fluorescência inicial em pelo menos 50%. Normalmente, a recuperação de fluorescência deve ser registrada a cada 30-60 s até atingir a fase do platô.
5. Análise de dados
- Crie projeções máximas das pilhas z adquiridas e obtenha valores de intensidade de fluorescência das células alvo branqueadas, a célula de referência e o plano de fundo. Usando o software específico do microscópio, clique em "Processar" → "Projeção de intensidade máxima" → selecione o arquivo → "Aplicar".
- Alternativamente, use uma ferramenta equivalente de análise de imagem (
- Alternativamente, use uma ferramenta equivalente de análise de imagem (
- Copie os dados de intensidade de fluorescência em todos os pontos de tempo da célula alvo, o plano de fundo e a célula de referência em uma planilha.
- Subtrair a intensidade de fundo e a intensidade da célula de referência dos valores de intensidade da célula alvo para corrigir o fotobloco causado durante o processo de aquisição. Execute as correcções de células de fundo e referência para cada ponto de tempo.
- Normalize os dados de FRAP corrigidos para a intensidade de fluorescência inicial antes do branqueamento, dividindo cada valor pela fluorescência inicial.
- Para obter as curvas FRAP, defina a linha de base para a intensidade de fluorescência imediatamente após o branqueador, subtraindo-se dos valores de intensidade de cada ponto do tempo.
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Representative Results
Aqui, apresentamos a microscopia 3D-FRAP como uma técnica não-invasiva para estudar o deslocamento juncional do miARN fluorescente nos cardiomiócitos neonatais. Os cardiomiócitos isolados revelaram o típico padrão de α-aletina estriada e continham grandes placas de Cx43 ao longo das bordas das células celulares ( Figura 1A , pontas de flecha brancas), o que permitiu o alto fluxo intercelular de moléculas. A pureza dos cardiomiócitos isolados foi avaliada pela quantificação microscópica de células positivas a α-actina. Embora alguns não cardiomiócitos (células α-actina-negativas) estejam presentes na cultura, os cardiomiócitos neonatais representaram o maior tipo de células após o isolamento (79,62 ± 3,68%; Figura 1B ).
Para investigar a troca de junção gap do miARN, as células foram transfectadas com miARN marcado fluorescentemente. EleA ctroporação é o método de escolha para administrar moléculas de miARN às células, pois garante uma alta eficiência de transfecção e a distribuição homogênea de compostos transfectados, o que é obrigatório para análise de FRAP. Em nossa configuração experimental, conseguimos uma eficiência de transfecção de ~ 45%, conforme determinado pela citometria de fluxo ( Figura 2A ). A preparação de cardiomiócitos para FRAP inclui desprendimento da placa de cultura, eletroporação e re-fixação em lâminas de câmara. Um teste de citometria de fluxo vivo / morte revelou que a maioria das células demonstrou alta viabilidade, o que é importante ao analisar a comunicação juncional gap ( Figura 2B ). Além disso, a densidade celular é um parâmetro crucial que afeta os resultados do FRAP. Para medidas ideais de FRAP, as células devem ser semeadas com uma densidade de ~ 80% para permitir a formação de aglomerados de células e o estabelecimento de junções de espaço funcional entre as células ( figura2C).
Para a análise de FRAP, as células-alvo são selecionadas dentro de um cluster de células e são fotovelas com 100% de potência do laser, levando a fluorescência de miARN reduzida nas células selecionadas ( Figura 3A , alvejante). Posteriormente, a recuperação de fluorescência é registrada para visualizar a transferência de miARN de células adjacentes para a área branqueada. Uma vez que a fase do platô da recuperação de fluorescência foi alcançada após 13 min, este intervalo de tempo foi utilizado para a aquisição de imagens nas experiências de FRAP. A análise quantitativa e a normalização dos dados adquiridos mostraram uma recuperação média de 20%. Os dados também demonstraram que a microscopia FRAP permite a gravação rápida do deslocamento de miRNA com alta resolução temporal. Dependendo das propriedades do corante, os parâmetros de aquisição podem ser alterados para aumentar ainda mais a resolução temporal.
O uso de 3D-FRAP permiteA comparação da permeabilidade GJ ao miARN em diferentes condições. Para demonstrar isso, induziamos um knockdown mediado por siRNA de Cx43, levando à redução da expressão protéica ( Figura 3C ) e à inibição da comunicação juncional gap. Como resultado, a recuperação de fluorescência foi reduzida em mais de 50%, indicando que a eficiência da transferência de miARN depende fortemente da extensão do acoplamento juncional gap entre as células ( Figura 3B , Cx43 knockdown). Para confirmar que a recuperação de fluorescência reflete a passagem do miARN marcado fluorescentemente, em vez da etiqueta Dy547 destacada, também adquirimos dados de FRAP para tintura de calceína ( Figura 3D ). Calcein tem um peso molecular comparável ao da Dy547 e, portanto, possui uma dinâmica de transferência semelhante. Em contraste com a recuperação de fluorescência do miARN marcado com Dy547, a calceína demonstrou troca aumentada de junção gap, indicando que a marca Dy547 iNão está separado da molécula miRNA ( Figura 3D ).
Condições de foco estável são obrigatórias ao longo de um experimento de FRAP, especialmente quando são realizadas medições de longo prazo. Em comparação com as aplicações 2D, o 3D-FRAP pode compensar a potencial deriva do foco. Conforme mostrado na Figura 4 , mesmo as ligeiras mudanças de foco afetam a detecção adequada do sinal de fluorescência do miARN quando apenas uma única camada 2D é usada para o experimento FRAP ( Figura 4B ). Em contraste, para 3D-FRAP, uma pilha z inteira da célula alvo é gravada e as projeções máximas são submetidas à análise de dados ( Figura 4A ). O impacto da deriva de foco em curvas normalizadas de intensidade de fluorescência é retratado na Figura 4C . Enquanto a recuperação de fluorescência aumenta de forma constante ao longo do tempo em 3D-FRAP, a aquisição de 2D-FRAP resulta em declínio oF o sinal de fluorescência.
Além da compensação das mudanças de foco, o 3D-FRAP também fornece dados espaciais da troca juncional de lacunas do miARN. A Figura 5 mostra uma renderização de superfície 3D de um experimento FRAP. Comparado com as projeções máximas, a aquisição de pilhas z pode ser usada para criar reconstruções em 3D para investigar a localização e mobilidade do miARN dentro das células ( Figura 5 ). A co-rotulação com organelas permitirá a investigação do envolvimento de outros componentes celulares na transferência de miARN.
Figura 1: Imagens Microscópicas Representativas de Cardiomiócitos Neonatais Isolados. ( A ) O microscópio de iluminação estruturada mostra a alta expressão de Cx43, que se acumula em grande pLaques nas fronteiras celulares (cabeças de seta). A formação pronunciada de GJs com células adjacentes permite uma ampla troca de pequenas moléculas, incluindo o miARN. Barra de escala = 20 μm ( B ) Pureza de cardiomiócitos isolados. O rotulagem da a-aletina demonstra que os cardiomiócitos representam o maior tipo de células após o isolamento. Barra de escala = 50 μm. As células foram coradas com anticorpos anti-Cx43 (verde) e anti-α-actina (vermelho). Os núcleos foram visualizados usando DAPI (azul). Uma descrição da microscopia de iluminação estruturada e rotulagem imunológica é fornecida em publicações anteriores 20 . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Eficiência de Transfecção, Viabilidade E densidade celular da cultura de cardiomiócitos neonatais. ( A ) A citometria de fluxo revelou que a eletroporação miR547 resultou em uma eficiência de transfecção de ~ 45%. ( B ) Viabilidade celular de cardiomiócitos utilizados para FRAP. Após isolamento, eletroporação e reconexão, os cardiomiócitos foram submetidos a coloração de células vivas e mortas e demonstrou alta viabilidade celular. ( C ) Imagem microscópica de cardiomiócitos transfectados com mir547 preparados para microscopia FRAP. Uma densidade celular de 80-90% garante a formação pronunciada de contatos de célula-célula junção gap. Barra de escala = 50 μm. Um método para a análise de citometria de fluxo de eficiência de transfecção e coloração de viabilidade é mencionado nas publicações anteriores 20 , 21 . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Troca de miARN dependente de GJ em cardiomiócitos neonatais. ( A ) Imagens representativas de um experimento FRAP. Após a transfecção com o miARN marcado, as células-alvo dentro de um agrupamento de células são fotoblachadas por um forte pulso a laser (pre-bleach versus blanqueador). Dependendo da extensão do acoplamento juncional do intervalo, o influxo de junção gap do miARN das células adjacentes resulta em intensidade de fluorescência aumentada nas células alvo branqueadas (pós-lixiviação t = 3, 6, 9 e 13 min). Barra de escala = 20 μm ( B ) A análise quantitativa dos dados de FRAP adquiridos mostra uma recuperação de fluorescência de 20% após 13 min. Para confirmar o envolvimento GJs na transferência intercelular do miARN, foi realizado um knockdown cx43, levando a uma forte diminuição da recuperação de fluorescência (50%). ( C ) Imunossinção com anti-Cx43Anticorpo e microscopia confocal subsequente demonstram a eficiência do knockdown Cx43 no nível de proteína. Barra de escala = 50 μm. ( D ) A comparação dos dados de FRAP de miR547 e corante de calceína mostra as diferentes dinâmicas de transferência. O menor peso molecular da calceína resultou em uma maior recuperação de fluorescência em comparação com as moléculas de miARN marcadas com dy547. As curvas FRAP resumem os dados de n ≥56 células, mostradas como média ± SEM. A análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de dois sentidos, seguido do teste post hoc de Bonferroni (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Compensação de Desvio de Foco usando Microscopia 3D-FRAP. (
Figura 5: Renderização de superfície 3D de uma experiência 3D-FRAP. (Esquerda) Projeções máximas de uma medida de FRAP. A célula fotovelavel (quadro vermelho) demonstra um aumento na intensidade de fluorescência devido à transferência de miARN de células adjacentes. (Direito) As pilhas z adquiridas da mesma célula fotovelada (vermelha) foram submetidas à renderização de superfície 3D para visualizar a distribuição espacial do miARN. Barra de escala = 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Os miRNAs são atores-chave na fisiologia celular e demonstraram que atuam como moléculas de sinalização usando-entre outros - GJs como um caminho para a troca intercelular 11 , 12 , 22 . O protocolo atual apresenta uma técnica de imagem de células vivas in vitro para caracterizar esta rodovia dependente de GJ usando miARNs fluorescentes dentro dos clusters celulares.
O protocolo foi desenvolvido em cardiomiócitos como um sistema de modelo celular. No entanto, esta abordagem pode ser aplicada a vários tipos de células se a eletroporação for um método adequado para a transfecção de miRNA. Além da troca célula a célula, a técnica apresentada também é adequada para investigar a mobilidade intracelular das moléculas de miARN ( por exemplo, para a identificação de possíveis mecanismos de transporte dentro da célula) 23 , 24 .
"A investigação da transferência de miARN por microscopia FRAP requer moléculas de miARN marcadas de forma fluorescente ( Figura 2 ). Como a rotulagem de miARNs celulares específicos não é viável, somente o miARN marcado e exógeno pode ser usado para 3D-FRAP para analisar sua mobilidade intercelular Nos nossos experimentos, as células foram transfectadas com miARN de 250 nM. Esta concentração foi muito maior em comparação com condições fisiológicas, onde o nível de miARN varia de 10 a 50,000 moléculas por célula 27,28. Essas baixas concentrações não podem ser usadas em experimentos de FRAP, Como um certo nível de moléculas de miARN fluorescentes é necessária para obter um sinal de fluorescência suficiente e para garantir a discriminação adequada entre a fluorescência de fundo e o miARN marcado fluorescentemente. Dependendo do sistema de imagem confocal e das propriedades do corante, o uso de concentrações de miARN a baixa -nM gama deve ser viável para ensaios FRAP. </ P>Diferentes técnicas são comumente aplicadas para estudar a transferência de miARN intercelular, incluindo citometria de fluxo, PCR e ensaios repórter de luciferase 12 , 13 . Esses métodos detectam o deslocamento de miARN com baixa resolução temporal ( ou seja, horas a dias). Em contraste, a microscopia 3D-FRAP permite a visualização e quantificação da transferência de miARN e mobilidade em tempo real. Além dos contatos de células celulares juncionais gap, o deslocamento intercelular de miARN também é mediado por outros mecanismos, como os exossomos 18 , 29 , 30 . Somente o 3D-FRAP fornece resolução temporal suficientemente alta para discriminar a transferência juncional exossomal e gap. Assim, permite uma investigação específica sobre o efeito direto da permeabilidade GJ na sinalização de miARN sob diferentes condições patológicas ou fisiológicas ( FiguRe 2).
Recomendamos o uso de 3D-FRAP, que é superior ao padrão 2D-FRAP, pois fornece dados mais precisos sobre transferência de miARN dependente de GJ. As medidas 3D-FRAP incluem todo o volume de células, o que é importante quando se utilizam tipos de células em grandes quantidades. Além disso, pode compensar mudanças de foco ou movimentos celulares, que demonstraram que prejudicam significativamente a recuperação de fluorescência em 2D-FRAP ( Figura 3 ). Finalmente, a gravação de pilhas z em experimentos 3D-FRAP fornece a possibilidade de obter informações espaciais, o que não é viável quando apenas uma única camada 2D é usada para a análise de intensidades de fluorescência ( Figura 3B ).
Uma vez que a recuperação de fluorescência é dependente do influxo de miARN de células adjacentes, o número de células conectadas à célula branqueada é crítico e deve ser semelhante em diferentes medidas para obter dados confiáveis. Portanto, é necessária uma alta densidade celularD para garantir a formação de aglomerados celulares mais adequados para análise de FRAP. Além disso, experiências preliminares devem ser realizadas para selecionar condições de branqueamento leve ( isto é, potência do laser, tempo de branqueamento e configurações de digitalização) para evitar efeitos fototóxicos causados por uma alta intensidade do laser 25 , 26 . Isso também ajudará a reduzir o foto-brilho que ocorre durante o processo de aquisição.
Apesar das limitações, nossos dados mostram que o 3D-FRAP é uma poderosa ferramenta para avaliar o papel dos miRNAs como moléculas de sinalização dentro de uma rede celular. O impacto da composição de conexina na transferência de miRNA ou a permeabilidade seletiva de GJs para miARNs específicos podem ser abordados com a quantificação direta da eficiência de transporte. O 3D-FRAP pode fornecer informações importantes para melhorar o desenvolvimento de novas terapias com miARN e siRNA, como, por exemplo, definindo condições adequadas que facilitem a distribuiçãoN de RNAs pequenos através da rede GJ 31 , 32 .
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Disclosures
Os autores declaram não haver conflito de interesses.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo Ministério Federal da Educação e Pesquisa da Alemanha (FKZ 0312138A e FKZ 316159), o Estado Mecklemburgo-Pomerânia Ocidental com Fundos Estruturais da UE (ESF / IVWM-B34-0030 / 10 e ESF / IVBM-B35-0010 / 12), o DFG (DA1296-1) e a Fundação Alemã do Coração (F / 01/12). Além disso, o RD é suportado pelo Programa FORUN do Centro Médico da Universidade Rostock (889001), a Fundação DAMP e o BMBF (VIP + 00240).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| neonatal NMRI mice | Charles River | ||
| Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | 0.1% solution in PBS, sterilized |
| PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
| Dulbecco´s modified medium | Pan Biotech | P04-03550 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 U/mL, 100µg/mL |
| Fetal bovine serum | Pan Biotech | P30-3306 | |
| Cell culture plastic | TPP | ||
| Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | 88281 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 88281 | included in primary cardiomyocyte isolation kit |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| miRIDIAN Dy547 labeled microRNA Mimic | Dharmacon | CP-004500-01-05 | dissolve in RNAse free water, stock solution 20µM |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S3139 | |
| Sodium phosphate dibasic | Carl Roth | T877.2 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium chloride | Serva | 28305.01 | |
| Sodium succinate | Carl Roth | 3195.1 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA solution | Merck | L2153 | |
| 4-well- Glass bottom chamber slides | IBIDI | 80827 | coat with 0.1% gelatin solution |
| Amaxa Nucleofector II | Lonza | program G-009 was used for Electroporation | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Excel software | Microsoft | ||
| α-actinin antibody | Abcam | ab9465 | dilution 1:200 |
| Connexin43 antibody | Santa Cruz | sc-9059 | dilution 1:200 |
| goat anti-mouse Alexa 594 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11005 | dilution 1:300 |
| goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11034 | dilution 1:300 |
| Connexin43 siRNA | Thermo Fisher Scientific | AM16708 ID158724 | final concentration 250 nM |
| Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
| DAPI nuclear stain | Thermo Scientific | D1306 |
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