Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Analyse van de Gap Junction-afhankelijke Transfer van miRNA met 3D-FRAP Microscopy

doi: 10.3791/55870 Published: June 19, 2017

Summary

Hier beschrijven we de toepassing van driedimensionale fluorescentie herstel na photobleaching (3D-FRAP) voor de analyse van de gap-junction-afhankelijke shuttling van miRNA. In tegenstelling tot veelgebruikte methoden, maakt 3D-FRAP het mogelijk om de intercellulaire overdracht van kleine RNA's in realtime te kwantificeren, met een hoge spatio-temporale resolutie.

Abstract

Kleine antisense RNA's, zoals miRNA en siRNA, spelen een belangrijke rol in cellulaire fysiologie en pathologie en kunnen bovendien gebruikt worden als therapeutische middelen bij de behandeling van verschillende aandoeningen. De ontwikkeling van nieuwe, innovatieve strategieën voor miRNA / siRNA therapie is gebaseerd op een uitgebreide kennis van de onderliggende mechanismen. Recente gegevens suggereren dat kleine RNA's tussen cellen worden uitgewisseld op een kloppende koppelingsafhankelijke wijze, waardoor genregulerende effecten in de ontvangercel worden geïnduceerd. Moleculaire biologische technieken en flow cytometrische analyse worden vaak gebruikt om de intercellulaire uitwisseling van miRNA te bestuderen. Deze methoden bieden echter geen hoge temporale resolutie, die nodig is bij het bestuderen van de kloofverbindingsflux van moleculen. Daarom, om de impact van miRNA / siRNA als intercellulaire signaalmoleculen te onderzoeken, zijn er nieuwe tools nodig die de analyse van deze kleine RNA's op het cellulaire niveau mogelijk maken. Het onderhavige protocol beschrijft de apPlicatie van driedimensionale fluorescentieherstel na photobleaching (3D-FRAP) microscopie om de kloofverbinding-afhankelijke uitwisseling van miRNA moleculen tussen hartcellen te verduidelijken. Belangrijk is dat deze eenvoudige en niet-invasieve live-cel beeldvorming benadering het visualiseren en kwantificeren van de gap junctionele shuttling van fluorescent gelabelde kleine RNA's in real time, met een hoge spatio-temporale resolutie. De gegevens verkregen door 3D-FRAP bevestigen een nieuwe route van intercellulaire genregulatie, waarbij kleine RNA's fungeren als signaalmoleculen in het intercellulaire netwerk.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Kleine niet-codering-RNA's zijn belangrijke spelers in cellulaire genregulatie. Deze moleculen zijn samengesteld uit 20-25 nucleotiden die binden aan een specifiek doelmRNA, wat leidt tot de blokkering van de translatie of tot mRNA-afbraak 1 , 2 . Het genregulerende proces dat wordt uitgevoerd door kleine RNA's, zoals miRNA en siRNA, is een zeer geconserveerd mechanisme dat in veel verschillende soorten 3 is gevonden. In het bijzonder zijn miRNA moleculen van cruciaal belang voor een verscheidenheid aan fysiologische processen, waaronder proliferatie, differentiatie en regeneratie 4 , 5 . Daarnaast wordt de dysregulatie van miRNA expressie toegeschreven aan veel pathologische aandoeningen. Overeenkomstig is aangetoond dat miRNAs geschikt zijn als biomarkers voor diagnose en als therapeutische middelen voor gentherapie 6 , 7

Gap junctions (GJs) zijn gespecialiseerde eiwitstructuren in het plasmamembraan van twee aangrenzende cellen die de diffusieuitwisseling van moleculen met een molecuulgewicht van tot 1 kD mogelijk maken. Ze zijn aangetoond dat ze belangrijk zijn voor weefselontwikkeling, differentiatie, celdood en pathologische stoornissen zoals kanker of hart- en vaatziekten 8 , 9 , 10 . Verscheidene moleculen zijn beschreven om GJ kanalen te kunnen overschrijden, met inbegrip van ionen, metabolieten en nucleotiden. Interessant, werden ook GJs gevonden om een ​​weg te geven voor de intercellulaire beweging van kleine RNA's 11 , 12 . Zo kunnen miRNAs niet alleen handelen in de cel waarin ze worden geproduceerd, maar ook binnen de ontvanger cellen. Dit wijst op de rol van miRNAs in het intercellulaire signaaltransductiesysteem. Tegelijkertijd tonen de gegevens aanDie kloof intercellulaire communicatie is nauw verbonden met de miRNA functie. Door de significante invloed van miRNA en GJ's op homeostase, pathologie en diagnose van het weefsel, zal een uitgebreid begrip van de functie van GJ's en de daarmee verband houdende intercellulaire dynamiek van miRNA de mechanismen van miRNA-gebaseerde aandoeningen verduidelijken en nieuwe strategieën ontwikkelen voor MiRNA therapieën.

Afhankelijk van de mate van gap junctionele koppeling kan de overdracht van miRNA moleculen tussen cellen een zeer snel proces zijn. Daarom is een methodologie die het visualiseren en kwantificeren van de snelle intercellulaire beweging van deze regulerende signaalmoleculen mogelijk maakt. In het algemeen zijn stromingscytometrie en moleculaire biologische technieken toegepast om de shuttling van kleine RNA's 11 , 12 , 13 , 14 aan te tonen . Echter, in tegenstelling tot FRAP microsKopiëren, deze benaderingen ontbreken hoge temporale resolutie, die verplicht is bij het analyseren van de uitwisseling van miRNA via GJs. Bovendien is FRAP microscopie minder invasieve en vertegenwoordigt daarom een ​​krachtige en nieuwe live-cell imaging techniek om de GJ-afhankelijke uitwisseling van moleculen in verschillende celtypen 15 , 16 , 17 te evalueren.

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol waarin de toepassing van 3D-FRAP wordt beschreven om miRNA shuttling tussen cardiomyocyten te beoordelen. Hiervoor werden cardiomyocyten getransfecteerd met fluorescent gelabelde miRNA. Een cel gemarkeerd met dit miRNA werd gefabriceerd, en de gap-junctionele miRNA re-instroom van aangrenzende cellen werd op tijdsafhankelijke wijze geregistreerd. De hoge temporale resolutie van FRAP-experimenten biedt de mogelijkheid kinetische studies uit te voeren voor de nauwkeurige evaluatie van de intercellulaire overdracht van miRNA en siRNA tussen levende cellen. MoreoVer, omdat kleine RNA's kunnen worden uitgewisseld via verschillende mechanismen met zeer verschillende kinetica, kan FRAP-microscopie bijdragen tot het verduidelijken van de mate waarin GJ's betrokken zijn bij de respectieve shuttling-processen 18 . Daarnaast kan 3D-FRAP worden gebruikt om fysiologische en pathologische veranderingen in GJ permeabiliteit te onderzoeken en de invloed ervan op kleine RNA transfer 15 , 19 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle stappen in dit protocol waarbij neonatale muizen werden betrokken, werden uitgevoerd volgens de ethische richtlijnen voor dierenzorg van het Rostock University Medical Center.

1. Bereiding van celcultuurschotels en het medium voor cardiomyocytcultuur

  1. Bedek een celkweekplaat met 0,1% gelatine in PBS en incubeer gedurende 4 uur bij 37 ° C of bij 4 ° C. Verwijder de gelatine en laat het drogen onder de steriele laminaire luchtstroom.
  2. Bereid celcultuurmedium op dat uit 50 ml DMEM wordt aangevuld met 10% foetaal boviene serum (FBS) en 1% penicilline / streptomycine (P / S). Voorverwarmen tot 37 ° C.

2. Isolatie van neonatale cardiomyocyten

  1. Ontbied neonatale muizen (1-2 dagen oud) door decapitatie met steriele schaar en open de borst langs het sternum. Verwijder het hart met behulp van tang, terwijl u de thorax een beetje duwt en het hart overbrengt in een 24-putjesplaat die ijskoud HBSS bevat(Zonder Ca 2+ en Mg 2+ ).
  2. Verwijder niet-cardiale weefsel en grotere vaten met behulp van steriele tang. Breng schoongemaakte harten over in een 1,5 ml buis die ijskoud HBSS bevat. Gebruik maximaal 5 hartjes per buis voor enzymatische spijsvertering.
  3. Knip de harten met kleine scharen in <0,5 tot 1 mm³ stukken.
  4. Was de gehakte harten met HBSS tweemaal door aspiratie / toevoeging van HBSS met een 1 ml microliterpipet. Verwijder de HBSS volledig voordat u de enzymen toevoegt.
  5. Voor de enzymatische vertering van neonatale harten, gebruik een in de handel verkrijgbare kit en volg het protocol van de fabrikant (zie de tabel van materialen ). Schud de buis die de gehakte hartjes elke 5 minuten bevat, terwijl gedurende 35 minuten met enzymen bij 37 ° C worden geïncubeerd.
  6. Zaadophangende cellen op niet-gecoate celkweekschalen die celkweekmedium bevatten gedurende 1,5-2 uur om de adhesie van de niet-cardiomyocytfractie toe te staan. Herhaal deze stap als een hoge zuiverheidVan cardiomyocyten is nodig. Desgewenst kweek de non-cardiomyocytfractie verder.
    OPMERKING: Voor een celsuspensie van 15 harten kan de preplateringstap worden uitgevoerd op 75 cm² celkweekflessen. Meestal worden ~ 5 x 10 5 cellen verkregen uit een neonataal hart.
  7. Verzamel de supernatant in een 15 ml conische buis en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 300 x g. Resuspendeer de cellen in 1 ml celcultuurmedium.
  8. Tel de cellen met een Neocauer chamber hemocytometer, of gebruik een equivalente methode.
  9. Plaat geïsoleerde cardiomyocyten op 6-putjes platen met een dichtheid van 3 x 10 5 cellen / cm². Incubeer de cellen gedurende de nacht bij 37 ° C en 5% CO2.
    OPMERKING: Optioneel kunnen cellen op dit moment ook worden getransfecteerd. Echter, verhoogde levensvatbaarheid werd waargenomen toen de cellen één dag werden gekweekt voordat ze onderworpen werden aan elektroporatie.

3. Transfectie met Fluorescently Labeled miRNA

  1. Pre-Warm celcultuurmedium (zie stap 1.2) tot 37 ° C in een waterbad of een equivalente inrichting.
  2. Bereid een 20 μM voorraadoplossing van fluorescerende miRNA in RNase-vrij steriel water op.
  3. Bereid elektroporatiebuffer die 90 mM Na 2 HPO 4 , 90 mM NaH 2 PO 4 , 5 mM KCl, 10 mM MgCl2 en 10 mM natriumsuccinaat bevat en stel de pH op op 7,2; Elektroporatiebuffer kan gedurende meerdere maanden bij -20 ° C worden opgeslagen.
  4. Verwijder de cellen uit de kweekschotel met behulp van 0,05% trypsine gedurende 5 minuten. Inactiveer het trypsine door het toevoegen van celcultuurmedium.
  5. Tel de cellen met een Neocauer chamber hemocytometer, of gebruik een equivalente methode. Centrifugeer de cellen bij 300 xg gedurende 10 minuten.
  6. Resuspendeer de cellen in elektroporatiebuffer om een ​​concentratie van 4 x 10 5 cellen per 100 μl te verkrijgen.
  7. Meng 100 μL cel suspensie met fluorescerende miRNA (uiteindelijke concentratie: 0,25 μM) in een buis enLaad het mengsel in een elektroporatiecuvette.
    1. Bepaal empirisch de juiste hoeveelheid miRNA, afhankelijk van het celtype.
  8. Voer elektroporatie uit met behulp van een elektroporatieapparaat (zie de Tabel van Materialen ), met behulp van het programma "G-009".
  9. Voeg 500 μl voorverwarmd celkweekmedium toe en draag de volledige cel suspensie (4 x 10 5 cellen) in een putje van een 4-putjes glazen bodem kamerglijbaan. Cultuur de cellen gedurende 1 dag bij 37 ° C in een 5% CO 2 atmosfeer.
    OPMERKING: voor de FRAP-analyse is een celdichtheid van ~ 80% optimaal. De transfectie van gelabelde miRNA moet uitsluitend worden uitgevoerd met behulp van elektroporatie. Aangezien de homogene verdeling van gemerkte miRNA-moleculen gunstig is voor FRAP-meting, is reagentgebaseerde transfectie niet aanbevolen.

4. Toepassing 3D-FRAP Microscopie (Dag 3)

  1. Warm de microscoop-incubator op tot 37 °; C en schakel het confocale microscoop systeem minstens 2 uur in voor FRAP meting om een ​​thermisch evenwicht vast te stellen en om de mogelijkheid van drift te verminderen. Indien mogelijk, houd een 5% CO 2 atmosfeer in stand.
  2. Steek de kamerschuif in de podiummonsterhouder.
  3. Zoek een cluster getransfecteerde cardiomyocyten met behulp van een 1,4 NA-olie doel (400X vergroting) en 561 nm laser excitatie licht bij lage laser vermogen, met een detectiebereik van 570-680 nm.
    OPMERKING: De definitie van FRAP-instellingen, de opname van het beeld en de analyse werden uitgevoerd met behulp van microscoopspecifieke software (zie de Tabel van Materialen ).
  4. Activeer de "z-stack", "Time Series", "Bleaching" en "Regions" knoppen in de "Setup Manager."
  5. Definieer de FRAP parameters.
    1. Definieer de instellingen voor het maken van beelden in het menu 'Acquisitie modus' door de 'kaderformaat' in te stellen4; Tot 512 x 512, de "lijnstap" naar 1 en de "scantijd" naar <1 s.
    2. In het menu 'Kanalen', instel de laservermogen, verstel en installeer de maximale fluorescentie van minimale laser excitatie ( bijv. Laservermogen: 1-5%); Pas op om de intensiteit van de verzadiging te vermijden. Stel de "pinhole size" in op 2 μm.
    3. Vervolgens selecteert u in het menu 'Regio' het 'ROI-tekenprogramma' en gebruik de cursor om de doelcel, de referentiecel en het achtergrondgebied te markeren. Selecteer indien nodig meerdere doelcellen voor fotobladen.
    4. Pas de fotoboekinstellingen aan in het "Bleaching" menu ( bijv. Iteraties: 9-14, laservermogen voor fotoboeken: 100%, interval van beeldverwerving: 60 s, cycli: 15). Definieer het begin van het bleken na 3 eerste scans.
    5. In het menu "z-stack" definieer je de limieten voor z-stack-acquisitie, afhankelijk van de dikte van de cellen. Pas het "nummer o aanF z-lagen "tot 12-15.
    6. Begin het FRAP-experiment en teken het fluorescentieherstel op.
      OPMERKING: Aangezien de instellingen van een FRAP-experiment afhankelijk zijn van het celtype, de fluorescerende kleurstof en het microscoopsysteem, is het het beste om proefproeven uit te voeren om de optimale parameters voor FRAP te bepalen. Bleken moet voldoende zijn om de initiële fluorescentie-intensiteit met ten minste 50% te verminderen. Typisch moet de fluorescentieherstelling elke 30-60 s worden geregistreerd tot de plateaufase is bereikt.

5. Data-analyse

  1. Creëer maximale projecties van de verworven z-stapels en geef fluorescentie-intensiteitswaarden van de gebleekte doelcellen, de referentiecel en de achtergrond. Met behulp van microscoopspecifieke software klikt u op 'Verwerking' → 'Maximale intensiteitsprojectie' → selecteer bestand → 'Toepassen'.
    1. Als alternatief gebruik je een equivalent beeldanalyse tool (
  2. Kopieer de fluorescentie-intensiteitsgegevens op alle tijdstippen van de doelcel, de achtergrond en de referentiecel in een spreadsheet.
    1. Trek de achtergrondintensiteit en de intensiteit van de referentiecel af van de intensiteitswaarden van de doelcel om te corrigeren voor fotobakken die tijdens het acquisitieproces worden veroorzaakt. Voer achtergrond- en referentiecorrecties uit voor elk tijdstip.
    2. Normaliseer de gecorrigeerde FRAP-gegevens op de initiële fluorescentie-intensiteit voor het bleken door elke waarde te verdelen door de eerste fluorescentie.
    3. Om de FRAP-curven te verkrijgen, stel de basislijn op de fluorescentie-intensiteit direct na het bleken door de intensiteitswaarden van elk tijdstip af te trekken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hier presenteren we 3D-FRAP microscopie als een niet-invasieve techniek om de gap junctionele shuttling van fluorescerende miRNA te bestuderen binnen neonatale cardiomyocyten. De geïsoleerde cardiomyocyten onthulden het typische gestreepte α-actininepatroon en bevatten grote plaques van Cx43 langs de celcelgrenzen ( Figuur 1A , witte pijlpunten), die de hoge intercellulaire flux van moleculen toonden. De zuiverheid van geïsoleerde cardiomyocyten werd beoordeeld door de microscopische kwantificering van a-actinine-positieve cellen. Hoewel sommige non-cardiomyocyten (a-actinine-negatieve cellen) aanwezig waren in de cultuur, vertegenwoordigde neonatale cardiomyocyten het grote celtype na isolatie (79,62 ± 3,68%; Figuur 1B ).

Om de gap junctionele uitwisseling van miRNA te onderzoeken, werden cellen getransfecteerd met fluorescent gemerkt miRNA. EleCtroporation is de methode van keuze om miRNA moleculen naar cellen te leveren, omdat het een hoge transfectie-efficiëntie en de homogene verdeling van getransfecteerde verbindingen waarborgt, is verplicht voor FRAP-analyse. In onze experimentele opstelling realiseerde we een transfectie-efficiëntie van ~ 45%, zoals bepaald door flowcytometrie ( Figuur 2A ). De bereiding van cardiomyocyten voor FRAP omvat loslating van de kweekplaat, elektroporatie en herbevestiging op kamerglijbanen. Een flow cytometrische live / dead assay bleek dat de meerderheid van de cellen een hoge levensvatbaarheid heeft aangetoond, wat belangrijk is bij het analyseren van gap junctionele communicatie ( Figuur 2B ). Bovendien is celdichtheid een cruciale parameter die de FRAP-resultaten beïnvloedt. Voor optimale FRAP-metingen dienen cellen met een dichtheid van ~ 80% te zaaien om de vorming van celclusters mogelijk te maken en de oprichting van functionele kloofverbindingen tussen cellen ( figuur2C).

Voor FRAP analyse worden doelcellen geselecteerd in een celgroep en worden ze met 100% laservermogen gefotografeerd, wat resulteert in verminderde miRNA-fluorescentie in de geselecteerde cellen ( Figuur 3A , bleekmiddel). Vervolgens wordt fluorescentieherstel opgenomen om de overdracht van miRNA van aangrenzende cellen naar het gebleekte gebied te visualiseren. Aangezien de plateaufase van het fluorescentieherstel na 13 minuten werd bereikt, werd deze tijdspanne gebruikt voor beeldverwerving in de FRAP-experimenten. Kwantitatieve analyse en normalisatie van de verworven gegevens vertoonde een gemiddeld herstel van 20%. De gegevens hebben ook aangetoond dat FRAP microscopie de snelle opname van miRNA shuttling mogelijk maakt met hoge temporale resolutie. Afhankelijk van de kleurstofeigenschappen kunnen de verwervingsparameters worden gewijzigd om de temporale resolutie verder te verhogen.

Het gebruik van 3D-FRAP maakt het mogelijkDe vergelijking van GJ doorlaatbaarheid bij miRNA onder verschillende omstandigheden. Om dit te demonstreren hebben we een siRNA-gemedieerde knockdown van Cx43 geïnduceerd, wat leidde tot een verminderde eiwituitdrukking ( Figuur 3C ) en de remming van gap-junctionele communicatie. Als gevolg hiervan werd fluorescentieherstel met meer dan 50% verminderd, wat aangeeft dat de efficiëntie van miRNA-overdracht sterk afhankelijk is van de mate van gap-junctionele koppeling tussen cellen ( Figuur 3B , Cx43-knockdown). Om te bevestigen dat het fluorescentieherstel de doorgang van het fluorescent gelabelde miRNA weerspiegelt, in plaats van de losstaande Dy547-tag, hebben we ook FRAP-gegevens verkregen voor calceine-kleurstof ( Figuur 3D ). Calcein heeft een molecuulgewicht vergelijkbaar met die van Dy547 en bezit derhalve een soortgelijke transferdynamiek. In tegenstelling tot het fluorescentieherstel van Dy547-gemerkt miRNA, bleek calceine verhoogde gap junctionele uitwisseling, wat aangeeft dat de Dy547-tag iS niet losgemaakt van het miRNA molecuul ( Figuur 3D ).

Stabiele focusomstandigheden zijn verplicht tijdens een FRAP-experiment, vooral wanneer langetermijnmetingen worden uitgevoerd. In vergelijking met 2D applicaties kan 3D-FRAP compenseren voor mogelijke focusdrift. Zoals blijkt uit Figuur 4 , beïnvloeden zelfs lichte focus veranderingen de juiste detectie van het fluorescentie signaal van miRNA wanneer slechts een enkele 2D laag wordt gebruikt voor het FRAP experiment ( Figuur 4B ). In tegenstelling hiermee wordt voor 3D-FRAP een hele z-stapel van de doelcel opgenomen en worden maximale projecties onderworpen aan data-analyse ( Figuur 4A ). De invloed van de focusdrift op een genormaliseerde fluorescentie-intensiteitskurven is afgebeeld in figuur 4C . Terwijl fluorescentieherhaling gestaag stijgt in de tijd in 3D-FRAP, resulteert 2D-FRAP acquisitie in een daling oF het fluorescentie signaal.

Naast de compensatie van focuswijzigingen, biedt 3D-FRAP ook ruimtelijke gegevens van de gap junctionele uitwisseling van miRNA. Figuur 5 toont een 3D-oppervlakweergave van een FRAP-experiment. Vergeleken met maximale projecties kan de overname van z-stacks worden gebruikt om 3D-reconstructies te maken om de lokalisatie en mobiliteit van miRNA in cellen te onderzoeken ( Figuur 5 ). Co-labeling met organellen zal het mogelijk maken om onderzoek te doen naar de betrokkenheid van andere cellulaire componenten bij miRNA-overdracht.

Figuur 1
Figuur 1: Representatieve Microscopische Beelden van Geïsoleerde Neonatale Cardiomyocyten. ( A ) Gestructureerde verlichtingsmicroscopie toont de hoge expressie van Cx43, die in grote pLaques op cel-cel grenzen (arrowheads). De uitgesproken vorming van GJ's met aangrenzende cellen zorgt voor een uitgebreide uitwisseling van kleine moleculen, waaronder miRNA. Schaalbalk = 20 μm ( B ) Zuiverheid van geïsoleerde cardiomyocyten. Etikettering van a-actinine demonstreert dat cardiomyocyten het grote celtype na isolatie vertegenwoordigen. Schaalbalk = 50 μm. Cellen werden gekleurd met anti-Cx43 (groen) en anti-a-actinine antilichamen (rood). Nucleus werd gevisualiseerd met behulp van DAPI (blauw). Een beschrijving van gestructureerde verlichtingsmicroscopie en immunologische etikettering is in een eerdere publicatie 20 verschaft. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: Transfectie-efficiëntie, levensvatbaarheid , En celdichtheid van neonatale cardiomyocytcultuur. ( A ) Flowcytometrie onthulde dat miR547 elektroporatie resulteerde in een transfectie-efficiëntie van ~ 45%. ( B ) Cel levensvatbaarheid van cardiomyocyten gebruikt voor FRAP. Na isolatie, elektroporatie en reattachment werden cardiomyocyten onderworpen aan levende en dode celkleuring en bleek hoge cel levensvatbaarheid. ( C ) Microscopisch beeld van mir547-getransfecteerde cardiomyocyten bereid voor FRAP microscopie. Een celdichtheid van 80-90% zorgt voor de uitgesproken vorming van gap-junctionele cel-celcontacten. Schaalbalk = 50 μm. Een werkwijze voor de flowcytometrische analyse van transfectie-efficiëntie en levensvatbaarheidsverf is genoemd in eerdere publicaties 20 , 21 . Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Ontent "voor: keep-together.within-page =" 1 "> Figuur 3
Figuur 3: GJ-afhankelijke uitwisseling van miRNA bij neonatale cardiomyocyten. ( A ) Representatieve beelden van een FRAP-experiment. Na transfectie met gelabelde miRNA worden targetcellen in een celcluster gefotografeerd door een sterke laserpuls (prebleek versus bleekmiddel). Afhankelijk van de mate van gap junctionele koppeling, leidt de kloofverbinding tussen miRNA van aangrenzende cellen tot verhoogde fluorescentie-intensiteit in de gebleekte targetcellen (na bleekmiddel t = 3, 6, 9 en 13 min). Schaalstang = 20 μm ( B ) Kwantitatieve analyse van verkregen FRAP-gegevens laat een fluorescentieherstel zien van 20% na 13 minuten. Om de betrokkenheid GJ's in de intercellulaire overdracht van miRNA te bevestigen, werd een cx43-knockdown uitgevoerd, wat resulteerde in een sterke afname van fluorescentieherstel (50%). ( C ) Immunostaining met anti-Cx43Antilichaam en daaropvolgende confocale microscopie demonstreert de efficiëntie van de Cx43 knockdown op het eiwitniveau. Schaalbalk = 50 μm. ( D ) Vergelijking van de FRAP data van miR547 en calcein kleurstof tonen de verschillende transfer dynamics. Het kleiner molecuulgewicht calceine resulteerde in een verhoogd fluorescentie herstel in vergelijking met dy547-gemerkte miRNA moleculen. FRAP-curven samenvatten de gegevens van n ≥56 cellen, weergegeven als gemiddelde ± SEM. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van twee-weg ANOVA gevolgd door de posthoc-test van Bonferroni (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001). Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4: Compensatie van Focus Drift met 3D-FRAP Microscopy. ( B ) Representatieve beelden van een fotobakse cel (rode lijn) tonen de invloed van de focusdrift op de fluorescentie-intensiteit tijdens 3D- en 2D-FRAP-experimenten. ( A ) In 3D-FRAP worden z-stapels opgenomen voor elk tijdstip, en maximale projecties worden gebruikt voor data-analyse, die voor focusdrift correctie maakt. Schaalbalk = 20 μm. ( B ) In tegenstelling, voor 2D-FRAP, wordt slechts een enkele 2D-laag onderworpen aan data-analyse. Zo wordt de totale fluorescentie-intensiteit diepgaand verminderd door veranderingen in de focus. Schaalbalk = 20 μm. ( C ) Representatieve genormaliseerde fluorescentie-intensiteitskrommen van 3D- en 2D-FRAP-experimenten geven aan dat het sterke effect van focusdrift op fluorescentieherstel is en de voordelen van 3D-acquisitie tonen bij het bestuderen van intercellulaire miRNA shuttling. Klik hier om een ​​grotere versie van th te zienIs figuur.

Figuur 5
Figuur 5: 3D-oppervlakweergave van een 3D-FRAP-experiment. (Links) Maximale projecties van een FRAP meting. De fotobakse cel (rood kader) demonstreert een toename van de fluorescentie-intensiteit door miRNA-overdracht van aangrenzende cellen. (Rechts) Verworven z-stapels van dezelfde photobleached cel (rood) werden onderworpen aan 3D-oppervlakweergave om de ruimtelijke verdeling van de miRNA te visualiseren. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

MiRNAs zijn belangrijke spelers in cellulaire fysiologie en werden aangetoond als signaalmoleculen door gebruik te maken van oa-GJs als een weg voor intercellulaire uitwisseling 11 , 12 , 22 . Het huidige protocol presenteert een in vitro levende cel imaging techniek om deze GJ-afhankelijke shuttling te karakteriseren met behulp van fluorescerende miRNAs in celclusters.

Het protocol werd ontwikkeld op cardiomyocyten als een celmodel systeem. Deze aanpak kan echter op verschillende celtypes worden toegepast indien elektroporatie een geschikte methode is voor miRNA transfectie. Naast cell-to-cell uitwisseling is de gepresenteerde techniek ook geschikt om de intracellulaire mobiliteit van miRNA moleculen te onderzoeken ( bijv. Voor de identificatie van mogelijke transportmechanismen binnen de cel) 23 , 24 .

Inhoud "> Het onderzoek naar de miRNA-overdracht door FRAP-microscopie vereist fluorescent gemerkte miRNA-moleculen ( Figuur 2 ). Omdat de etikettering van specifieke cellulaire miRNA's niet haalbaar is, kan alleen exogene geïntroduceerde gemarkeerde miRNA worden gebruikt voor 3D-FRAP om zijn intercellulaire mobiliteit te analyseren In onze experimenten werden cellen getransfecteerd met 250-nM miRNA. Deze concentratie was veel hoger dan fysiologische omstandigheden, waarbij het miRNA-niveau varieert van 10 tot 50.000 moleculen per cel 27 , 28. Zulke lage concentraties kunnen niet in FRAP-experimenten worden gebruikt, Aangezien een bepaald niveau van fluorescerende miRNA-moleculen nodig is om een ​​voldoende fluorescentiesignaal te verkrijgen en om de juiste discriminatie tussen achtergrondfluorescentie en fluorescent gemerkt miRNA te waarborgen. Afhankelijk van het confocale beeldvormingssysteem en de kleurstofeigenschappen wordt echter het gebruik van miRNA-concentraties bij lage -nM-bereik zou haalbaar zijn voor FRAP-analyses. </ P>

Verschillende technieken worden gewoonlijk toegepast om intercellulaire miRNA-overdracht te onderzoeken, met inbegrip van flowcytometrie, PCR en luciferase reporter assays 12 , 13 . Deze methoden detecteren miRNA shuttling met een lage temporale resolutie ( dwz uren tot dagen). In tegenstelling hiermee maakt 3D-FRAP microscopie het mogelijk om in real time visualisatie en kwantificering van miRNA-overdracht en mobiliteit te zien. In aanvulling op kloppende verbindingscelcelcontacten wordt ook de intercellulaire shuttling van miRNA gemedieerd door andere mechanismen, zoals exosomen 18 , 29 , 30 . Alleen 3D-FRAP biedt voldoende hoge tijdelijke resolutie om te onderscheiden tussen exosomale en kloofverbindingen. Zo maakt het mogelijk specifiek onderzoek naar het directe effect van GJ permeabiliteit op miRNA signalering onder verschillende pathologische of fysiologische omstandigheden ( FiguRe 2).

We raden het gebruik van 3D-FRAP aan, die superieur is aan conventionele 2D-FRAP, omdat het meer accurate gegevens geeft over GJ-afhankelijke miRNA-overdracht. 3D-FRAP-metingen omvatten het gehele celvolume, dat belangrijk is bij het gebruik van grootmaatcel-typen. Daarnaast kan het de focusveranderingen of celbewegingen compenseren, die bleek dat het fluorescentieherstel significant verlaagt in 2D-FRAP ( Figuur 3 ). Tenslotte biedt de opname van z-stapels in 3D-FRAP-experimenten de mogelijkheid om ruimtelijke informatie te verkrijgen, die niet haalbaar is wanneer slechts een enkele 2D-laag gebruikt wordt voor de analyse van fluorescentie-intensiteiten ( Figuur 3B ).

Aangezien fluorescentieherstel afhankelijk is van de instroom van miRNA van aangrenzende cellen, is het aantal cellen verbonden met de gebleekte cel kritiek en moet over verschillende metingen gelijk zijn om betrouwbare gegevens te verkrijgen. Daarom is een hoge celdichtheid vereistD om de vorming van cellulaire clusters die het meest geschikt zijn voor FRAP analyse te waarborgen. Voorts moeten voorlopige experimenten worden uitgevoerd om lichte bleekomstandigheden ( bijv. Laservermogen, bleek- en scaninstellingen) te selecteren om fototoxische effecten te voorkomen die worden veroorzaakt door een hoge laserintensiteit 25 , 26 . Dit zal ook helpen bij het verminderen van de fotobakking die plaatsvindt tijdens het acquisitieproces.

Ondanks de beperkingen tonen onze gegevens aan dat 3D-FRAP een krachtig instrument is om de rol van miRNAs als signaalmoleculen in een cellulaire netwerk te evalueren. De impact van connexin samenstelling op miRNA shuttling of de selectieve permeabiliteit van GJ's voor specifieke miRNAs kan worden aangepakt met de directe kwantificering van transport efficiëntie. 3D-FRAP kan belangrijke informatie verschaffen om de ontwikkeling van nieuwe therapieën met miRNA en siRNA te verbeteren, zoals door de juiste condities te definiëren die de distributie vergemakkelijkenN van kleine RNA's via het GJ netwerk 31 , 32 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen belangenconflict.

Acknowledgments

Dit werk werd ondersteund door het ministerie van Onderwijs en Onderzoek Duitsland (FKZ 0312138A en FKZ 316159), de staat Mecklenburg-Voor-Pommeren met EU-structuurfondsen (ESF / IVWM-B34-0030 / 10 en ESF / IVBM-B35-0010 / 12), de DFG (DA1296-1) en de German Heart Foundation (F / 01/12). Daarnaast wordt RD ondersteund door het FORUN-programma van Rostock University Medical Center (889001), de DAMP Foundation en de BMBF (VIP + 00240).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
neonatal NMRI mice Charles River
Gelatin Sigma Aldrich G7041 0.1% solution in PBS, sterilized
PBS Pan Biotech P04-53500
Dulbecco´s modified medium Pan Biotech P04-03550
Penicillin/Streptomycin Thermo Fisher Scientific 15140122 100 U/mL, 100µg/mL
Fetal bovine serum Pan Biotech P30-3306
Cell culture plastic TPP
Primary Cardiomyocyte Isolation Kit Thermo Fisher Scientific 88281
HBSS Thermo Fisher Scientific 88281 included in primary cardiomyocyte isolation kit
Trypan blue Thermo Fisher Scientific 15250061
miRIDIAN Dy547 labeled microRNA Mimic Dharmacon CP-004500-01-05 dissolve in RNAse free water, stock solution 20µM
Sodium phosphate monobasic Sigma S3139
Sodium phosphate dibasic Carl Roth T877.2
Potassium chloride Sigma P9333
Magnesium chloride Serva 28305.01
Sodium succinate Carl Roth 3195.1
0.05% Trypsin/EDTA solution Merck L2153
4-well- Glass bottom chamber slides IBIDI 80827 coat with 0.1% gelatin solution
Amaxa Nucleofector II Lonza program G-009 was used for Electroporation 
LSM 780 ELYRA PS.1 system Zeiss
Excel software Microsoft
α-actinin antibody Abcam ab9465 dilution 1:200
Connexin43 antibody Santa Cruz sc-9059 dilution 1:200
goat anti-mouse Alexa 594 antibody Thermo Fisher Scientific A-11005 dilution 1:300
goat anti-rabbit Alexa 488 antibody Thermo Fisher Scientific A-11034 dilution 1:300
Connexin43 siRNA Thermo Fisher Scientific AM16708 ID158724 final concentration 250 nM
Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit Thermo Fisher Scientific L10119
CellTrace Calcein Red-Orange Thermo Scientific C34851
DAPI nuclear stain Thermo Scientific D1306

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell. 136, (4), 642-655 (2009).
  2. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, (6669), 806-811 (1998).
  3. Grimm, D. Small silencing RNAs: state-of-the-art. Adv Drug Deliv Rev. 61, (9), 672-703 (2009).
  4. Raghunathan, S., Patel, B. M. Therapeutic implications of small interfering RNA in cardiovascular diseases. Fundam Clin Pharmacol. 27, (1), 1-20 (2013).
  5. Sluijter, J. P. G. MicroRNAs in Cardiovascular Regenerative Medicine: Directing Tissue Repair and Cellular Differentiation. ISRN Vasc Med. 1-16 (2013).
  6. Li, M., Zhang, J. Circulating MicroRNAs: Potential and Emerging Biomarkers for Diagnosis of Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases. Biomed Res Int. 1-9 (2015).
  7. Romaine, S. P. R., Tomaszewski, M., Condorelli, G., Samani, N. J. MicroRNAs in cardiovascular disease: an introduction for clinicians. Heart. 101, (12), 921-928 (2015).
  8. Maes, M., Crespo Yanguas,, Willebrords, S., Cogliati, J., Vinken, B., M, Connexin and pannexin signaling in gastrointestinal and liver disease. Transl Res. 166, (4), 332-343 (2015).
  9. Michela, P., Velia, V., Aldo, P., Ada, P. Role of connexin 43 in cardiovascular diseases. Eur. J. Pharmacol. 768, 71-76 (2015).
  10. Naus, C. C., Laird, D. W. Implications and challenges of connexin connections to cancer. Nat Rev Cancer. 10, (6), 435-441 (2010).
  11. Hong, X., Sin, W. C., Harris, A. L., Naus, C. C. Gap junctions modulate glioma invasion by direct transfer of microRNA. Oncotarget. 6, (17), Available from: http://www.impactjournals.com/oncotarget 15566-15577 (2015).
  12. Lee, H. K. H., et al. Mesenchymal stem cells deliver synthetic microRNA mimics to glioma cells and glioma stem cells and inhibit their cell migration and self-renewal. Oncotarget. 4, (2), 346-361 (2013).
  13. Katakowski, M., Buller, B., Wang, X., Rogers, T., Chopp, M. Functional microRNA is transferred between glioma cells. Cancer Res. 70, (21), 8259-8263 (2010).
  14. Zong, L., Zhu, Y., Liang, R., Zhao, H. -B. Gap junction mediated miRNA intercellular transfer and gene regulation: A novel mechanism for intercellular genetic communication. Sci Rep. 6, 19884 (2016).
  15. Yum, S. W., Zhang, J., Scherer, S. S. Dominant connexin26 mutants associated with human hearing loss have trans-dominant effects on connexin30. Neurobiol Dis. 38, (2), 226-236 (2010).
  16. Kuzma-Kuzniarska, M., Yapp, C., Pearson-Jones, T. W., Jones, A. K., Hulley, P. A. Functional assessment of gap junctions in monolayer and three-dimensional cultures of human tendon cells using fluorescence recovery after photobleaching. J Biomed Opt. 19, (1), 15001 (2013).
  17. Lemcke, H., Nittel, M. -L., Weiss, D. G., Kuznetsov, S. A. Neuronal differentiation requires a biphasic modulation of gap junctional intercellular communication caused by dynamic changes of connexin43 expression. Eur J Neurosci. 38, (2), 2218-2228 (2013).
  18. Lemcke, H., Steinhoff, G., David, R. Gap junctional shuttling of miRNA - A novel pathway of intercellular gene regulation and its prospects in clinical application. Cell Signal. 27, (12), 2506-2514 (2015).
  19. Lemcke, H., Kuznetsov, S. A. Involvement of connexin43 in the EGF/EGFR signalling during self-renewal and differentiation of neural progenitor cells. Cell Signal. 25, (12), 2676-2684 (2013).
  20. Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 98, 117-127 (2016).
  21. Laupheimer, M., et al. Selective Migration of Subpopulations of Bone Marrow Cells along an SDF-1 α and ATP Gradient. Bone Marrow Res. 1-10 (2014).
  22. Zhang, S., Wang, Q., Liu, L., Hong, X., Zhang, Y., Tao, L. Gap junctions enhance the antiproliferative effect of microRNA-124-3p in glioblastoma cells. J Cell Physiol Physiol. 230, (10), 2476-2488 (2015).
  23. Vasilescu, C., Tanase, M., Dragomir, M., Calin, G. A. From mobility to crosstalk. A model of intracellular miRNAs motion may explain the RNAs interaction mechanism on the basis of target subcellular localization. Math Biosci. 280, 50-61 (2016).
  24. Pitchiaya, S., Androsavich, J. R., Walter, N. G. Intracellular single molecule microscopy reveals two kinetically distinct pathways for microRNA assembly. EMBO Rep. 13, (8), 709-715 (2012).
  25. Heinze, K. G., Costantino, S., De Koninck, P., Wiseman, P. W. Beyond photobleaching, laser illumination unbinds fluorescent proteins. J Phys Chem B. 113, (15), 5225-5233 (2009).
  26. Jou, M. J., Jou, S. B., Guo, M. J., Wu, H. Y., Peng, T. I. Mitochondrial reactive oxygen species generation and calcium increase induced by visible light in astrocytes. Ann N Y Acad Sci. 1011, 45-56 (2004).
  27. Dong, H., Lei, J., Ding, L., Wen, Y., Ju, H., Zhang, X. MicroRNA: Function, detection, and bioanalysis. Chem Rev. 113, (8), 6207-6233 (2013).
  28. Liang, Y., Ridzon, D., Wong, L., Chen, C. Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues. BMC Genomics. 8, (1), 166 (2007).
  29. Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat Commun. 2, 282 (2011).
  30. Squadrito, M. L., et al. Endogenous RNAs Modulate MicroRNA Sorting to Exosomes and Transfer to Acceptor Cells. Cell Rep. 8, 1432-1446 (2014).
  31. Zhang, B., Farwell, M. A. microRNAs: a new emerging class of players for disease diagnostics and gene therapy. J Cell Mol Med. 12, (1), 3-21 (2008).
  32. Chen, Y., Gao, D. -Y., Huang, L. In vivo delivery of miRNAs for cancer therapy: Challenges and strategies. Adv Drug Deliv Rev. 81C, 128-141 (2015).
Analyse van de Gap Junction-afhankelijke Transfer van miRNA met 3D-FRAP Microscopy
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lemcke, H., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy. J. Vis. Exp. (124), e55870, doi:10.3791/55870 (2017).More

Lemcke, H., Voronina, N., Steinhoff, G., David, R. Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy. J. Vis. Exp. (124), e55870, doi:10.3791/55870 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter