Summary
Här beskriver vi tillämpningen av tredimensionell fluorescensåterhämtning efter photobleaching (3D-FRAP) för analys av gapförbindelsebärande shuttling av miRNA. I motsats till vanliga tillämpade metoder möjliggör 3D-FRAP kvantifiering av den intercellulära överföringen av små RNA i realtid, med hög spatio-temporal upplösning.
Abstract
Små antisense-RNA, som miRNA och siRNA, spelar en viktig roll i cellfysiologi och patologi och kan dessutom användas som terapeutiska medel vid behandling av flera sjukdomar. Utvecklingen av nya, innovativa strategier för miRNA / siRNA-terapi bygger på en omfattande kunskap om de underliggande mekanismerna. Nyliga data antyder att små RNA utbyts mellan celler på ett klyftkopplingsberoende sätt, vilket därigenom inducerar genregleringseffekter i mottagarcellen. Molekylära biologiska tekniker och flödescytometrisk analys används vanligtvis för att studera intercellulär utbyte av miRNA. Dessa metoder ger emellertid inte hög tidsmässig upplösning, vilket är nödvändigt när man studerar gapförloppsflödet av molekyler. För att undersöka effekten av miRNA / siRNA som intercellulära signalmolekyler behövs därför nya verktyg som möjliggör analys av dessa små RNA på cellulär nivå. Det föreliggande protokollet beskriver apPlication av tredimensionell fluorescensåtervinning efter photobleaching (3D-FRAP) -mikroskopi för att belysa klyftanslutningsberoende utbyte av miRNA-molekyler mellan hjärtceller. Viktigt är att detta enkla och icke-invasiva levande cellbildnings-tillvägagångssätt möjliggör visualisering och kvantifiering av gapförbindelseshanteringen av fluorescensmärkta små RNA i realtid med hög spatio-temporal upplösning. De data som erhållits genom 3D-FRAP bekräftar en ny väg för intercellulär genreglering, där små RNA verkar som signalerande molekyler inom det intercellulära nätverket.
Introduction
Små icke-kodande RNA är viktiga aktörer inom cellulär genreglering. Dessa molekyler är sammansatta av 20-25 nukleotider som binder till ett specifikt målmRNA, vilket leder till blockering av translation eller till mRNA-nedbrytning 1 , 2 . Genregleringsprocessen som genomförs av små RNA, såsom miRNA och siRNA, är en mycket konserverad mekanism som har hittats i många olika arter 3 . I synnerhet är miRNA-molekyler av avgörande betydelse för en mängd olika fysiologiska processer, inklusive proliferation, differentiering och regenerering 4 , 5 . Dessutom tillskrivs dysreguleringen av miRNA-uttryck till många patologiska störningar. På motsvarande sätt har miRNAs visat sig vara lämpliga som biomarkörer för diagnos och som terapeutiska medel för genterapi 6 , 7
Gap junctions (GJ) är specialiserade proteinkonstruktioner i plasmamembranet i två intilliggande celler som tillåter diffusionsbyte av molekyler med en molekylvikt på upp till 1 kD. De har visat sig vara viktiga för vävnadsutveckling, differentiering, celldöd och patologiska störningar som cancer eller kardiovaskulär sjukdom 8 , 9 , 10 . Flera molekyler har beskrivits som förmåga att korsa GJ-kanaler, inklusive joner, metaboliter och nukleotider. Intressant visade sig även GJ att tillhandahålla en väg för den intercellulära rörelsen av små RNA 11 , 12 . Således kan miRNAs agera inte bara inom cellen där de produceras utan även inom mottagarceller. Detta belyser rollen av miRNA i det intercellulära signaltransduktionssystemet. Samtidigt visar dataDen mellanliggande intercellulära kommunikationsgapet är nära kopplat till miRNA-funktionen. På grund av den betydande inverkan av miRNA och GJ på vävnadshomeostas, patologi och diagnos, kommer en övergripande förståelse av GJs funktion och den relaterade intercellulära dynamiken hos miRNA att bidra till att klargöra mekanismerna för miRNA-baserade sjukdomar och att utveckla nya strategier för MiRNA-terapier.
Beroende på omfattningen av gapförbindelsekopplingen kan överföringen av miRNA-molekyler mellan celler vara en mycket snabb process. Därför krävs en metod som möjliggör visualisering och kvantifiering av den snabba intercellulära rörelsen hos dessa regulatoriska signalmolekyler. Vanligtvis har flödescytometri och molekylära biologiska tekniker applicerats för att demonstrera shuttling av små RNA 11 , 12 , 13 , 14 . Men i motsats till FRAP-mikroKopiera, dessa tillvägagångssätt saknar hög temporal upplösning, vilket är obligatoriskt när man analyserar utbytet av miRNA via GJs. Dessutom är FRAP-mikroskopi mindre invasiv och representerar därför en kraftfull och ny levande cellbildnings teknik för att utvärdera den GJ-beroende molekylutbytet i flera celltyper 15 , 16 , 17 .
Här presenterar vi ett detaljerat protokoll som beskriver tillämpningen av 3D-FRAP för att bedöma miRNA shuttling mellan kardiomyocyter. För detta ändamål transfekterades kardiomyocyter med fluorescensmärkta miRNA. En cell märkt med detta miRNA fotograferades och gap-förenings-miRNA-återinflödet från intilliggande celler registrerades på ett tidsberoende sätt. Den höga temporala upplösningen av FRAP-experiment erbjuder möjligheten att utföra kinetiska studier för den exakta utvärderingen av den intercellulära överföringen av miRNA och siRNA mellan levande celler. MoreoEftersom små RNA kan utbytas via olika mekanismer med mycket olika kinetik kan FRAP-mikroskopi bidra till att klargöra i vilken utsträckning GJ är involverade i respektive shuttlingprocesser 18 . Dessutom kan 3D-FRAP användas för att undersöka fysiologiska och patologiska förändringar i GJ-permeabiliteten och dess inverkan på liten RNA-överföring 15 , 19 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla steg i detta protokoll som involverar neonatalmus utfördes enligt de etiska riktlinjerna för djurvård vid Rostock University Medical Center.
1. Framställning av cellodlingsdiskar och medium för kardiomyocytkultur
- Belägga en cellodlingsplatta med 0,1% gelatin i PBS och inkubera vid 37 ° C i 4 h eller vid 4 ° C över natten. Ta bort gelatin och låt det torka under sterilt laminärt luftflöde.
- Beredda cellodlingsmedium sammansatt av 50 ml DMEM kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin / streptomycin (P / S). Förvärm den till 37 ° C.
2. Isolering av neonatala kardiomyocyter
- Uppoffera neonatala möss (1-2 dagar gamla) genom avkapning med steril sax och öppna bröstet längs bröstbenet. Ta bort hjärtat med hjälp av tång medan du trycker bröstkorgen något och överför hjärtat till en 24-brunnsplatta med iskall HBSS(Utan Ca2 + och Mg2 + ).
- Ta bort icke-hjärtvävnad och större kärl med hjälp av sterila tångar. Överför rengjorda hjärtan till ett 1,5 ml rör innehållande iskall HBSS. Använd maximalt 5 hjärtan per rör för enzymatisk uppslutning.
- Minska hjärtan med liten sax i <0,5 till 1 mm3 bitar.
- Tvätta de hakade hjärtan med HBSS två gånger genom aspiration / tillsats av HBSS med en 1 ml mikroliterpipett. Ta bort HBSS helt innan enzymerna tillsätts.
- För enzymatisk uppslutning av neonatalhjärtan, använd ett kommersiellt tillgängligt kit och följ tillverkarens protokoll (se materialet ). Skaka röret innehållande de malet hjärtan var 5: e minut medan inkubering med enzymer vid 37 ° C under 35 min.
- Frö-suspenderade celler på icke-belagda cellodlingsrätter innehållande cellodlingsmedium i 1,5-2 h för att tillåta vidhäftning av den icke-kardiomyocytfraktionen. Upprepa detta steg om en hög renhetAv kardiomyocyter behövs. Om så önskas, vidarekultur den icke-kardiomyocytfraktionen.
ANMÄRKNING: För en cellsuspension av 15 hjärtan kan förpläteringssteget utföras på 75 cm ^ cellodlingskolvar. Vanligtvis erhålls ~ 5 x 10 ^ celler från ett neonatalt hjärta. - Samla supernatanten i ett 15 ml koniskt rör och centrifugera i 10 min vid 300 x g. Resuspendera cellerna i 1 ml cellodlingsmedium.
- Räkna cellerna med en Neubauer-kammarhemocytometer, eller använd en likvärdig metod.
- Platta isolerade kardiomyocyter på plattor med 6 brunnar med en densitet av 3 x 10 ^ celler / cm2. Inkubera cellerna över natten vid 37 ° C och 5% CO2.
OBS! Alternativt kan celler också transfekteras vid denna punkt. Emellertid observerades ökad livskraft när cellerna odlades en dag innan de utsattes för elektroporation.
3. Transfektion med fluorescensmärkt märkt miRNA
- pre-Varm cellodlingsmedium (se steg 1.2) till 37 ° C i ett vattenbad eller en ekvivalent anordning.
- Bered en 20 μM stamlösning av fluorescerande miRNA i RNasfritt sterilt vatten.
- Förbered elektroporationsbuffert innehållande 90 mM Na2HP04, 90 mM NaH2P04, 5 mM KCl, 10 mM MgCl2 och 10 mM natriumsuccinat och justera pH till 7,2; Elektroporationsbufferten kan lagras vid -20 ° C i flera månader.
- Lossa cellerna från odlingsskålen med användning av 0,05% trypsin i 5 minuter. Inaktivera trypsinet genom att tillsätta cellodlingsmedium.
- Räkna cellerna med en Neubauer-kammarhemocytometer, eller använd en likvärdig metod. Centrifugera cellerna vid 300 xg under 10 minuter.
- Resuspendera cellerna i elektroporationsbufferten för att erhålla en koncentration av 4 x 10 ^ celler per 100 | il.
- Blanda 100 μl cell suspension med fluorescerande miRNA (slutkoncentration: 0,25 μM) i ett rör ochLadda blandningen till en elektroporationskuvett.
- Bestäm empiriskt den lämpliga mängden miRNA, beroende på celltyp.
- Utför elektroporation med hjälp av en elektroporationsanordning (se materialet ), med hjälp av programmet "G-009".
- Tillsätt 500 μl förvärmt cellodlingsmedium och överför hela cellsuspensionen (4 x 10 ^ celler) till en brunn i en 4-brunns glasbottnad kammare. Kultur cellerna i 1 dag vid 37 ° C i en 5% CO2-atmosfär.
OBS: För FRAP-analys är en celltäthet av ~ 80% optimal. Transfektionen av märkt miRNA bör uteslutande utföras med elektroporation. Eftersom den homogena fördelningen av märkta miRNA-molekyler är fördelaktig för FRAP-mätning, rekommenderas inte reagensbaserad transfektion.
4. Använda 3D-FRAP-mikroskopi (dag 3)
- Värm upp mikroskop inkubatorn till 37 °; C och slå på det konfokala mikroskopsystemet minst 2 timmar före FRAP-mätningen för att upprätta en termisk jämvikt och minska möjligheten till drift. Om möjligt behåll en 5% CO2-atmosfär.
- Sätt in kammarens glid i scenprovhållaren.
- Hitta ett kluster av transfekterade kardiomyocyter med hjälp av ett 1,4 NA-oljemål (400X förstoring) och 561 nm laser exciteringsljus vid låg laserffekt med ett detekteringsområde på 570-680 nm.
OBS! Definitionen av FRAP-inställningar, bildförvärv och analysen gjordes med hjälp av mikroskopsspecifik programvara (se Materialetabellen ). - Aktivera knapparna "z-stack", "Time Series", "Bleaching" och "Regions" i "Setup Manager".
- Definiera FRAP parametrarna.
- Definiera inställningarna för bildupptagning i menyn "Förvärvsläge" genom att ställa in "ramstorlek4; Till 512 x 512, "linjesteg" till 1 och "skanningstid" till <1 s.
- I menyn "Kanaler", justera laserkraften, förskjutningen och få inställningar för att få maximal fluorescens från minimal laser excitation ( t.ex. laserkraft: 1-5%); Justera för att undvika intensitetsmättnad. Ställ in "pinhålstorlek" till 2 μm.
- Därefter väljer du "ROI-teckningsverktyget" i menyn "Regioner" och använder markören för att markera målcellen, referenscellen och bakgrundsområdet. Om det behövs, välj flera målceller för photobleaching.
- Justera fotoladdningsinställningarna i "Bleaching" -menyn ( t.ex. iterationer: 9-14, laserstyrka för fotobildning: 100%, bildintervallintervall: 60 s, cykler: 15). Definiera start av blekning efter 3 första skanningar.
- I menyn "z-Stack" definierar du gränserna för z-stack-förvärv, beroende på cellens tjocklek. Justera "nummer oF z-skikt "till 12-15.
- Starta FRAP-experimentet och registrera fluorescensåtervinningen.
OBS! Eftersom inställningarna för ett FRAP-experiment beror på celltyp, fluorescerande färgämne och mikroskopssystemet är det bäst att utföra pilotförsök för att bestämma optimala parametrar för FRAP. Blekning bör vara tillräcklig för att minska den initiala fluorescensintensiteten med minst 50%. Typiskt bör fluorescensåtervinning registreras var 30-60 s tills platåfasen uppnås.
5. Dataanalys
- Skapa maximala prognoser för de förvärvade z-staplarna och uppnå fluorescensintensitetsvärden för de blekta målcellerna, referenscellen och bakgrunden. Använd mikroskopsspecifik programvara genom att klicka på "Bearbetning" → "Maximal intensitetsprojektion" → välj fil → "Apply."
- Alternativt använd ett motsvarande bildanalysverktyg (
- Alternativt använd ett motsvarande bildanalysverktyg (
- Kopiera fluorescensintensitetsdata vid alla tidpunkter från målcellen, bakgrunden och referenscellen till ett kalkylblad.
- Subtrahera bakgrundsintensiteten och intensiteten hos referenscellen från målcellens intensitetsvärden för att korrigera för fotobildning orsakad under förvärvsprocessen. Utför bakgrunds- och referenscellskorrigeringar för varje tidpunkt.
- Normalisera den korrigerade FRAP-data till den ursprungliga fluorescensintensiteten före blekning genom att dividera varje värde med den initiala fluorescensen.
- För att erhålla FRAP-kurvor, sätt baslinjen till fluorescensintensiteten omedelbart efter blekningen genom att subtrahera från intensitetsvärdena för varje tidpunkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Här presenterar vi 3D-FRAP-mikroskopi som en icke-invasiv teknik för att studera gapförbindelseshanteringen av fluorescerande miRNA inom neonatala kardiomyocyter. De isolerade kardiomyocyterna avslöjade det typiska strimmiga a-aktininmönstret och innehöll stora plack av Cx43 längs cellcellgränserna ( Figur 1A , vita pilhuvuden), vilket möjliggjorde det höga intercellulära flödet av molekyler. Renheten hos isolerade kardiomyocyter utvärderades genom mikroskopisk kvantifiering av a-aktinin-positiva celler. Även om vissa icke-kardiomyocyter (a-aktinin-negativa celler) var närvarande i kulturen, representerade neonatala kardiomyocyter huvudcellstypen efter isolering (79,62 ± 3,68%, Figur IB ).
För att undersöka gapövergångsutbytet av miRNA transfekterades celler med fluorescensmärkt miRNA. eleCtroporation är den metod som valts att leverera miRNA-molekyler till celler, eftersom det säkerställer en hög transfektionseffektivitet och den homogena fördelningen av transfekterade föreningar, som är obligatorisk för FRAP-analys. I vår experimentella inställning uppnådde vi en transfektionseffektivitet av ~ 45%, bestämd av flödescytometri ( Figur 2A ). Framställningen av kardiomyocyter för FRAP innefattar avskiljning från odlingsplattan, elektroporation och omfästning på kammarens glidbanor. En flödescytometrisk levande / död analys visade att majoriteten av cellerna visade hög lönsamhet, vilket är viktigt vid analys av klyftkopplingskommunikation ( Figur 2B ). Dessutom är celltäthet en avgörande parameter som påverkar FRAP-resultat. För optimala FRAP-mätningar bör celler utsädes med en densitet av ~ 80% för att möjliggöra bildandet av cellklyftor och upprättandet av funktionella gapförbindelser mellan celler ( Figur2C).
För FRAP-analys väljes målceller inom ett cellkluster och belyses med 100% laserkraft, vilket leder till minskad miRNA-fluorescens i de valda cellerna ( Figur 3A , blekning). Därefter registreras fluorescensåtervinning för att visualisera överföringen av miRNA från intilliggande celler in i det blekta området. Eftersom platåfasen av fluorescensåterhämtningen nåddes efter 13 minuter användes denna tidsperiod för bildupptagning i FRAP-experimenten. Kvantitativ analys och normalisering av de förvärvade uppgifterna visade en genomsnittlig återhämtning på 20%. Uppgifterna visade också att FRAP-mikroskopi möjliggör snabb registrering av miRNA shuttling med hög temporal upplösning. Beroende på färgämnets egenskaper kan förvärvsparametrar ändras för att ytterligare öka temporal upplösning.
Användningen av 3D-FRAP möjliggörJämförelsen av GJ-permeabilitet med miRNA under olika betingelser. För att demonstrera detta framkallade vi en siRNA-medierad knockdown av Cx43, vilket ledde till reducerat proteinuttryck ( Figur 3C ) och inhiberingen av gapförbindelsekommunikation. Som ett resultat reducerades fluorescensåtervinningen med mer än 50%, vilket indikerar att effektiviteten av miRNA-överföring starkt är beroende av omfattningen av gapförbindelsekopplingen mellan celler ( Figur 3B , Cx43-knockdown). För att bekräfta att fluorescensåtervinningen reflekterar passagen av det fluorescensmärkta miRNA, snarare än den avskilda Dy547-taggen, förvärvade vi också FRAP-data för kalceinfärg ( Figur 3D ). Calcein har en molekylvikt som är jämförbar med den hos Dy547 och har sålunda liknande överföringsdynamik. I motsats till fluorescensåtervinningen av Dy547-märkt miRNA demonstrerade calcein ökad gapförbindelseshastighet, vilket indikerar att Dy547-taggen iS är inte lossnat från miRNA-molekylen ( Figur 3D ).
Stabila fokusförhållanden är obligatoriska genom ett FRAP-experiment, särskilt när långsiktiga mätningar utförs. Jämfört med 2D-applikationer kan 3D-FRAP kompensera för potentiell fokusdrift. Såsom visas i figur 4 påverkar även små fokusförändringar den korrekta detekteringen av fluorescenssignalen för miRNA när bara ett enda 2D-skikt används för FRAP-experimentet ( Figur 4B ). Däremot registreras en hel z-stack av målcellen för 3D-FRAP, och maximala projektioner utsätts för dataanalys ( Figur 4A ). Effekten av fokusdrift på en normaliserad fluorescensintensitetskurva är avbildad i figur 4C . Medan fluorescensåterställning ständigt ökar över tid i 3D-FRAP, resulterar 2D-FRAP-förvärvet i en nedgång oF fluorescenssignalen.
Förutom kompensationen för fokusförändringar, tillhandahåller 3D-FRAP också rumsliga data för klyftkopplingsutbytet av miRNA. Figur 5 visar en 3D-ytaavgivning av ett FRAP-experiment. Jämfört med maximala projektioner kan förvärv av z-stackar användas för att skapa 3D-rekonstruktioner för att undersöka lokalisering och rörlighet för miRNA i celler ( Figur 5 ). Co-märkning med organeller kommer att möjliggöra undersökning av involvering av andra cellulära komponenter i miRNA-överföring.
Figur 1: Representativa mikroskopiska bilder av isolerade neonatala kardiomyocyter. ( A ) Strukturerad belysningsmikroskopi visar det höga uttrycket av Cx43, som ackumuleras i stor pLaques vid cellcellsgränser (arrowheads). Den uttalade bildningen av GJ med angränsande celler möjliggör en omfattande utbyte av små molekyler, inklusive miRNA. Skala bar = 20 μm ( B ) Renhet av isolerade kardiomyocyter. Märkning av a-aktinin visar att kardiomyocyter representerar huvudcellstypen efter isolering. Skala bar = 50 μm. Celler färgades med anti-Cx43 (grön) och anti-a-aktinin antikroppar (röd). Nukleär visualiserades med användning av DAPI (blå). En beskrivning av strukturerad belysningsmikroskopi och immunologisk märkning ges i en tidigare publikation 20 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Transfektionseffektivitet, livskraft , Och celldensitet av neonatal kardiomyocytkultur. ( A ) Flödescytometri avslöjade att miR547 elektroporation resulterade i en transfektionseffektivitet av ~ 45%. ( B ) Celllabilitet hos kardiomyocyter som används för FRAP. Efter isolering, elektroporation och återmontering utsattes kardiomyocyter för levande och dödcellsfärgning och demonstrerade högcellsevarabilitet. ( C ) Mikroskopisk bild av mir547-transfekterade kardiomyocyter framställda för FRAP-mikroskopi. En celltäthet av 80-90% säkerställer den uttalade bildningen av gapförbindelser med cellcellkontakter. Skala bar = 50 μm. Ett förfarande för flödescytometrisk analys av transfektionseffektivitet och livskraftbar färgning nämns i tidigare publikationer 20 , 21 . Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: GJ-beroende utbyte av miRNA i neonatala kardiomyocyter. ( A ) Representativa bilder av ett FRAP-experiment. Efter transfektion med märkt miRNA fotograferas målceller i ett cellkluster med en stark laserpuls (förblekning mot blekmedel). Beroende på omfattningen av gapförbindelsekopplingen resulterar gapförloppet i miRNA från intilliggande celler i ökad fluorescensintensitet i de blekta målcellerna (efterblekning t = 3, 6, 9 och 13 min). Skalbalk = 20 μm ( B ) Kvantitativ analys av förvärvad FRAP-data visar en fluorescensåtervinning av 20% efter 13 min. För att bekräfta involverings-GJ i den intercellulära överföringen av miRNA utfördes en cx43-knockdown vilket ledde till en stark minskning av fluorescensåtervinning (50%). ( C ) Immunostaining med anti-Cx43Antikropp och efterföljande konfokalmikroskopi visar effektiviteten hos Cx43-knockdownen på proteinnivån. Skala bar = 50 μm. ( D ) Jämförelse av FRAP-data för miR547 och calceinfärg visar de olika överföringsdynamikerna. Den mindre molekylvikten av kalcein resulterade i en ökad fluorescensåtervinning jämfört med dy547-märkta miRNA-molekyler. FRAP-kurvor sammanfattar data för n ≥56 celler, som visas som medelvärdet ± SEM. Statistisk analys utfördes med användning av tvåvägs ANOVA följt av Bonferronis post-hoc-test (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Kompensation av fokusdrift med 3D-FRAP-mikroskopi. (
Figur 5: 3D-ytframställning av ett 3D-FRAP-experiment. (Vänster) Maximal utskjutning av en FRAP-mätning. Den photobleached cellen (röd ram) demonstrerar en ökning i fluorescensintensitet på grund av miRNA-överföring från intilliggande celler. (Höger) Förvärvade z-stackar av samma fotobaserade cell (röd) utsattes för 3D-ytframställning för att visualisera den rumsliga fördelningen av miRNA. Skala bar = 20 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
MiRNAs är nyckelaktörer inom cellfysiologi och visade sig fungera som signalerande molekyler genom att använda-bland annat -GJs som en väg för intercellulär utbyte 11 , 12 , 22 . Det aktuella protokollet presenterar en in vitro- levande cellbildnings teknik för att karakterisera denna GJ-beroende shuttling med användning av fluorescerande miRNA i cellklyftor.
Protokollet utvecklades på kardiomyocyter som ett cellmodelsystem. Emellertid kan detta tillvägagångssätt tillämpas på flera celltyper om elektroporation är en lämplig metod för miRNA-transfektion. Förutom cell-till-cellutbyte är den presenterade tekniken också lämplig för att undersöka den intracellulära rörligheten av miRNA-molekyler ( t.ex. för identifiering av möjliga transportmekanismer i cellen) 23 , 24 .
Innehållet "> Undersökningen av miRNA-överföring med FRAP-mikroskopi kräver fluorescensmärkta miRNA-molekyler ( Figur 2 ). Eftersom märkning av specifika cellulära miRNA inte är möjlig kan endast exogent introducerat märkt miRNA användas för 3D-FRAP för att analysera dess intercellulära rörlighet . I våra experiment transfekterades celler med 250 nM miRNA. Denna koncentration var mycket högre jämfört med fysiologiska betingelser, där miRNA-nivån varierar från 10 till 50 000 molekyler per cell 27 , 28. Sådana låga koncentrationer kan inte användas i FRAP-experiment, Som en viss nivå av fluorescerande miRNA-molekyler erfordras för att erhålla en tillräcklig fluorescenssignal och för att säkerställa en korrekt diskriminering mellan bakgrundsfluorescens och fluorescensmärkt miRNA. Men beroende på det konfokala avbildningssystemet och färgämnesegenskaperna är användningen av miRNA-koncentrationer vid låg -nM-intervallet bör vara genomförbart för FRAP-analyser. </ P>Olika tekniker tillämpas vanligtvis för att studera intercellulär miRNA-överföring, innefattande flödescytometri, PCR och luciferasreporterassays 12 , 13 . Dessa metoder upptäcker miRNA shuttling med låg temporal upplösning ( dvs timmar till dagar). Däremot möjliggör 3D-FRAP-mikroskopi visualisering och kvantifiering av miRNA-överföring och mobilitet i realtid. Förutom klyftkopplingscell-cellkontakter medieras också intercellulär shuttling av miRNA av andra mekanismer, såsom exosomer 18 , 29 , 30 . Endast 3D-FRAP ger tillräckligt hög tidsmässig upplösning för att diskriminera mellan exosomal och gapövergångsöverföring. Således tillåter den specifik undersökning av den direkta effekten av GJ-permeabilitet på miRNA-signaler under olika patologiska eller fysiologiska förhållanden ( FiguRe 2).
Vi rekommenderar användningen av 3D-FRAP, vilket överstiger konventionell 2D-FRAP, eftersom det ger mer exakta data om GJ-beroende miRNA-överföring. 3D-FRAP-mätningar inkluderar hela cellvolymen, vilket är viktigt vid användning av storskaliga celltyper. Dessutom kan det kompensera fokusförändringar eller cellrörelser, vilket visade sig signifikant försämra fluorescensåterhämtning i 2D-FRAP ( Figur 3 ). Slutligen ger inspelningen av z-stackar i 3D-FRAP-experiment möjlighet att erhålla rumlig information, vilket inte är möjligt när bara ett enda 2D-lager används för analys av fluorescensintensiteter ( Figur 3B ).
Eftersom fluorescensåterhämtning är beroende av tillströmningen av miRNA från intilliggande celler är antalet celler som är anslutna till den blekta cellen kritisk och måste likna över olika mätningar för att erhålla tillförlitliga data. Därför krävs en högcellstäthetD för att säkerställa bildandet av cellulära kluster som är mest lämpade för FRAP-analys. Vidare måste preliminära experiment utföras för att välja milda blekningsförhållanden ( dvs. laserkraft, blekningstid och skanningsinställningar) för att undvika fototoxiska effekter som orsakas av en hög laserintensitet 25 , 26 . Detta kommer även att bidra till att minska den fotobildning som uppstår under förvärvsprocessen.
Trots begränsningarna visar våra data att 3D-FRAP är ett kraftfullt verktyg för att utvärdera rollen som miRNAs som signalmolekyler inom ett mobilnät. Effekten av konnexinkomposition på miRNA shuttling eller selektiv permeabilitet av GJ för specifika miRNA kan adresseras med direkt kvantifiering av transporteffektivitet. 3D-FRAP kan ge viktig information för att förbättra utvecklingen av nya terapier med miRNA och siRNA, såsom genom att definiera lämpliga förhållanden som underlättar distributionenN av små RNA via GJ-nätverket 31 , 32 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar ingen intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Förbundsministeriet för utbildning och forskning Tyskland (FKZ 0312138A och FKZ 316159), staten Mecklenburg-Vorpommern med EU: s strukturfonder (ESF / IVWM-B34-0030 / 10 och ESF / IVBM-B35-0010 / 12), DFG (DA1296-1), och German Heart Foundation (F / 01/12). Dessutom stöds RD av FORUN-programmet för Rostock University Medical Center (889001), DAMP Foundation och BMBF (VIP + 00240).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| neonatal NMRI mice | Charles River | ||
| Gelatin | Sigma Aldrich | G7041 | 0.1% solution in PBS, sterilized |
| PBS | Pan Biotech | P04-53500 | |
| Dulbecco´s modified medium | Pan Biotech | P04-03550 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | 100 U/mL, 100µg/mL |
| Fetal bovine serum | Pan Biotech | P30-3306 | |
| Cell culture plastic | TPP | ||
| Primary Cardiomyocyte Isolation Kit | Thermo Fisher Scientific | 88281 | |
| HBSS | Thermo Fisher Scientific | 88281 | included in primary cardiomyocyte isolation kit |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
| miRIDIAN Dy547 labeled microRNA Mimic | Dharmacon | CP-004500-01-05 | dissolve in RNAse free water, stock solution 20µM |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S3139 | |
| Sodium phosphate dibasic | Carl Roth | T877.2 | |
| Potassium chloride | Sigma | P9333 | |
| Magnesium chloride | Serva | 28305.01 | |
| Sodium succinate | Carl Roth | 3195.1 | |
| 0.05% Trypsin/EDTA solution | Merck | L2153 | |
| 4-well- Glass bottom chamber slides | IBIDI | 80827 | coat with 0.1% gelatin solution |
| Amaxa Nucleofector II | Lonza | program G-009 was used for Electroporation | |
| LSM 780 ELYRA PS.1 system | Zeiss | ||
| Excel software | Microsoft | ||
| α-actinin antibody | Abcam | ab9465 | dilution 1:200 |
| Connexin43 antibody | Santa Cruz | sc-9059 | dilution 1:200 |
| goat anti-mouse Alexa 594 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11005 | dilution 1:300 |
| goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Thermo Fisher Scientific | A-11034 | dilution 1:300 |
| Connexin43 siRNA | Thermo Fisher Scientific | AM16708 ID158724 | final concentration 250 nM |
| Near-IR Live/Dead Cell Stain Kit | Thermo Fisher Scientific | L10119 | |
| CellTrace Calcein Red-Orange | Thermo Scientific | C34851 | |
| DAPI nuclear stain | Thermo Scientific | D1306 |
References
- Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell. 136 (4), 642-655 (2009).
- Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
- Grimm, D. Small silencing RNAs: state-of-the-art. Adv Drug Deliv Rev. 61 (9), 672-703 (2009).
- Raghunathan, S., Patel, B. M. Therapeutic implications of small interfering RNA in cardiovascular diseases. Fundam Clin Pharmacol. 27 (1), 1-20 (2013).
- Sluijter, J. P. G. MicroRNAs in Cardiovascular Regenerative Medicine: Directing Tissue Repair and Cellular Differentiation. ISRN Vasc Med. , 1-16 (2013).
- Li, M., Zhang, J. Circulating MicroRNAs: Potential and Emerging Biomarkers for Diagnosis of Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases. Biomed Res Int. , 1-9 (2015).
- Romaine, S. P. R., Tomaszewski, M., Condorelli, G., Samani, N. J. MicroRNAs in cardiovascular disease: an introduction for clinicians. Heart. 101 (12), 921-928 (2015).
- Maes, M., Crespo Yanguas,, Willebrords, S., Cogliati, J., Vinken, B., M, Connexin and pannexin signaling in gastrointestinal and liver disease. Transl Res. 166 (4), 332-343 (2015).
- Michela, P., Velia, V., Aldo, P., Ada, P. Role of connexin 43 in cardiovascular diseases. Eur. J. Pharmacol. 768, 71-76 (2015).
- Naus, C. C., Laird, D. W. Implications and challenges of connexin connections to cancer. Nat Rev Cancer. 10 (6), 435-441 (2010).
- Hong, X., Sin, W. C., Harris, A. L., Naus, C. C. Gap junctions modulate glioma invasion by direct transfer of microRNA. Oncotarget. 6 (17), Available from: http://www.impactjournals.com/oncotarget 15566-15577 (2015).
- Lee, H. K. H., et al. Mesenchymal stem cells deliver synthetic microRNA mimics to glioma cells and glioma stem cells and inhibit their cell migration and self-renewal. Oncotarget. 4 (2), 346-361 (2013).
- Katakowski, M., Buller, B., Wang, X., Rogers, T., Chopp, M. Functional microRNA is transferred between glioma cells. Cancer Res. 70 (21), 8259-8263 (2010).
- Zong, L., Zhu, Y., Liang, R., Zhao, H. -B. Gap junction mediated miRNA intercellular transfer and gene regulation: A novel mechanism for intercellular genetic communication. Sci Rep. 6, 19884 (2016).
- Yum, S. W., Zhang, J., Scherer, S. S. Dominant connexin26 mutants associated with human hearing loss have trans-dominant effects on connexin30. Neurobiol Dis. 38 (2), 226-236 (2010).
- Kuzma-Kuzniarska, M., Yapp, C., Pearson-Jones, T. W., Jones, A. K., Hulley, P. A. Functional assessment of gap junctions in monolayer and three-dimensional cultures of human tendon cells using fluorescence recovery after photobleaching. J Biomed Opt. 19 (1), 15001 (2013).
- Lemcke, H., Nittel, M. -L., Weiss, D. G., Kuznetsov, S. A. Neuronal differentiation requires a biphasic modulation of gap junctional intercellular communication caused by dynamic changes of connexin43 expression. Eur J Neurosci. 38 (2), 2218-2228 (2013).
- Lemcke, H., Steinhoff, G., David, R. Gap junctional shuttling of miRNA - A novel pathway of intercellular gene regulation and its prospects in clinical application. Cell Signal. 27 (12), 2506-2514 (2015).
- Lemcke, H., Kuznetsov, S. A. Involvement of connexin43 in the EGF/EGFR signalling during self-renewal and differentiation of neural progenitor cells. Cell Signal. 25 (12), 2676-2684 (2013).
- Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 98, 117-127 (2016).
- Laupheimer, M., et al. Selective Migration of Subpopulations of Bone Marrow Cells along an SDF-1 α and ATP Gradient. Bone Marrow Res. , 1-10 (2014).
- Zhang, S., Wang, Q., Liu, L., Hong, X., Zhang, Y., Tao, L. Gap junctions enhance the antiproliferative effect of microRNA-124-3p in glioblastoma cells. J Cell Physiol Physiol. 230 (10), 2476-2488 (2015).
- Vasilescu, C., Tanase, M., Dragomir, M., Calin, G. A. From mobility to crosstalk. A model of intracellular miRNAs motion may explain the RNAs interaction mechanism on the basis of target subcellular localization. Math Biosci. 280, 50-61 (2016).
- Pitchiaya, S., Androsavich, J. R., Walter, N. G. Intracellular single molecule microscopy reveals two kinetically distinct pathways for microRNA assembly. EMBO Rep. 13 (8), 709-715 (2012).
- Heinze, K. G., Costantino, S., De Koninck, P., Wiseman, P. W. Beyond photobleaching, laser illumination unbinds fluorescent proteins. J Phys Chem B. 113 (15), 5225-5233 (2009).
- Jou, M. J., Jou, S. B., Guo, M. J., Wu, H. Y., Peng, T. I. Mitochondrial reactive oxygen species generation and calcium increase induced by visible light in astrocytes. Ann N Y Acad Sci. 1011, 45-56 (2004).
- Dong, H., Lei, J., Ding, L., Wen, Y., Ju, H., Zhang, X. MicroRNA: Function, detection, and bioanalysis. Chem Rev. 113 (8), 6207-6233 (2013).
- Liang, Y., Ridzon, D., Wong, L., Chen, C. Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues. BMC Genomics. 8 (1), 166 (2007).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat Commun. 2, 282 (2011).
- Squadrito, M. L., et al. Endogenous RNAs Modulate MicroRNA Sorting to Exosomes and Transfer to Acceptor Cells. Cell Rep. 8, 1432-1446 (2014).
- Zhang, B., Farwell, M. A. microRNAs: a new emerging class of players for disease diagnostics and gene therapy. J Cell Mol Med. 12 (1), 3-21 (2008).
- Chen, Y., Gao, D. -Y., Huang, L. In vivo delivery of miRNAs for cancer therapy: Challenges and strategies. Adv Drug Deliv Rev. 81C, 128-141 (2015).
