Summary
ويصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة لعزل واستزراع الماوس الأساسي الحبيبية الدماغي الخلايا العصبية (كنس) من يوم 6-7 القديمة الجراء، كفاءة توصيل لكنس للخسارة والحصول على دراسات مهمة، ونمذجة excitotoxicity الخلايا العصبية التي يسببها نمدا، موت الخلايا التي يسببها البوتاسيوم منخفضة وتلف الحمض النووي، والأكسدة باستخدام نفس نموذج الثقافة.
Abstract
الحبيبية للدماغ الخلايا العصبية (كنس) نموذج العصبية شيوعاً، تشكل نسبة سكان متجانسة وفيرة في المخيخ. وفي ضوء التنمية اللاحقة للولادة، ووفرة، وإمكانية الوصول، كجنس نموذجا مثاليا دراسة العمليات العصبية، بما في ذلك تنمية الخلايا العصبية والهجرة العصبية، وتحفيز نشاط الخلايا العصبية الفسيولوجية. وبالإضافة إلى ذلك، تقدم الثقافات CGN نموذجا ممتازا لدراسة أوضاع مختلفة لموت الخلية بما في ذلك اكسسيتوتوكسيسيتي والمبرمج. في غضون أسبوع في الثقافة، أعرب كنس مستقبلات ن-الميثيل-د-اسبارتاتي (نمدا)، مستقبل غلوتامات إيونوتروبيك محددة مع العديد من الوظائف الحيوية في الخلايا العصبية في الصحة والمرض. استخدمت إضافة تركيزات منخفضة من نمدا بالاقتران مع غشاء ديبولاريزيشن للقوارض الثقافات CGN الأولية لنموذج تحفيز نشاط الخلايا العصبية الفسيولوجية في حين يمكن أن تستخدم إضافة تركيزات عالية من نمدا لنموذج إصابة الخلايا العصبية اكسسيتوتوكسيك. هنا، يتم وصف طريقة العزل واستزراع لكنس من الجراء يوم 6 من العمر، فضلا عن التلاعب بالجينات لكنس غدية ولينتيفيروسيس. ونحن أيضا هذه البروتوكولات الأمثل في كيفية حفز المستحثة نمدا excitotoxicity والمبرمج التي يسببها البوتاسيوم منخفضة، والأكسدة وتلف الحمض النووي بعد توصيل هذه الخلايا العصبية.
Introduction
الحبيبية للدماغ الخلايا العصبية (كنس) تتسم أيضا بالثقافة، وكانت بمثابة نموذج فعال لدراسة موت الخلايا العصبية والتنمية 1،2،3،،من45، 6-التعبير المبكر عن مستقبلات ن-الميثيل-د-اسبارتاتي (نمدا) في CGN الثقافات في المختبر يجعلها نموذجا جذاباً للدراسة التي يسببها نمدا الإشارات. تفعيل هذه المستقبلات مع نمدا بالاقتران مع depolarization غشاء يستخدم نموذج تحفيز نشاط الخلايا العصبية الفسيولوجية ل، وسمح للبحث في آليات اللدونة متشابك 7،8. على العكس من ذلك، يمكن استخدام التحفيز المفرط لهذه المستقبلات التي يجند نمدا لنموذج اكسسيتوتوكسيسيتي، إليه رئيسية لفقدان الخلايا العصبية في الأمراض تلف المخ والأعصاب الحاد 9. إليه واحدة لاستحثاث excitotoxicity عن طريق التجويع ATP مع انخفاض الأكسجين، كما رأينا مع إصابة الخلايا العصبية الحادة. هذه النتائج في غشاء ديبولاريزيشن والإفراج عن مستويات مرتفعة من الغلوتامات في المشبك. أوفيرستيموليشن اللاحقة من مستقبلات NMDA بنتائج غلوتامات مرتفعة في المفرط Ca2 + التدفق عبر هذه المستقبلات، الذي بدوره يقوم بتنشيط مسارات عدة بما في ذلك Ca2 +-تفعيل البروتياز، فوسفوليباسيس، و اندونوكليسيس، أدى إلى التدهور غير المنضبط من المكونات الخلوية الحرجة وموت الخلايا. عالية داخل الخلية Ca2 + بالإضافة إلى ذلك، يؤدي إلى توليد الجذور الحرة الأكسجين وتلف الميتوكوندريا 10،11.
بينما غالبية فقدان الخلايا العصبية بعد اكسسيتوتوكسيسيتي الخلايا العصبية التي يسببها نمدا هو بسبب تدفق الكالسيوم وهو باكس/باك مستقلة، لا يمكن استبعاد آليات أخرى لموت الخلايا من هذا الطراز. مظهر كل نخرية وأبوبتوتيك مثل موت الخلايا بسبب اكسسيتوتوكسيسيتي جزئيا نتيجة لتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية (روس) والحمض النووي الضرر الناجم عن ارتفاع داخل الخلية Ca2 + مستويات 12. أضرار الحمض النووي يؤدي موت الخلايا العصبية من خلال آليات أبوبتوتيك، الذي يرتبط بالسمات المميزة لموت الخلية أبوبتوتيك، مثل مظهر الكروماتين الجماهير والهيئات أبوبتوتيك. التعريفي للمبرمج هو بوساطة من خلال إطلاق سراح ج الفسفرة من الميتوكوندريا، وقد ثبت أن يكون معتمداً على باكس/باك أوليجوميريزيشن 13. أوليجوميريزيشن باكس/باك يعزز تشكيل المسام في غشاء الميتوكوندريا الخارجي، مما أدى إلى الإفراج ج الفسفرة وتفعيل المنظمين برو-أبوبتوتيك كما رأينا مع الإصابات الدماغية معتدل 14.
جيل روس قضية هامة في الدماغ بسبب انخفاض مستويات المواد المضادة للأكسدة، مقترنة بشرط الأوكسجين كبيرة ل أداء الخلايا العصبية 15الذاتية. عندما تتعرض لحدث الدماغية، هو أكسيد النيتريك synthase upregulated، إنتاج أكسيد النيتريك وزيادة الأنواع الأكسجين التفاعلية 14. يمكن أن ينتج عنه تلف الحمض النووي زيادة تركيز الأكسجين الجذور ويسبب مجاعة الطاقة غير مباشر. مستويات عالية من الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل فواصل يتم علاجها بتفعيل بولي ADP-الريبوز بولمرس-1 (نشطت-1)، بروتين الكروماتين زمنياً حقيقية النواة مسؤولة عن تحفيز نقل وحدات شرطة أبوظبي-الريبوز من NAD+، جزءا لا يتجزأ من عملية إصلاح الحمض النووي 16. بيد مع مفرطة الضرر نتيجة للأكسدة، التنشيط نشطت-1 يمكن أن يسبب مجاعة الطاقة نتيجة لنزوح زيادة على ند+، ركيزة اللازمة لإنتاج ATP عن طريق الفسفرة. في نهاية المطاف، الأكسدة سوف يؤدي المبرمج بطريقة تعتمد باكس/باك مما يؤدي إلى الفسفرة المتقدرية ج الإفراج، ولقد ثبت للحث على تغيير طراز الميتوكوندريا في كنس 17.
أخيرا، يمكن استخدام تغييرات في تركيز كلوريد البوتاسيوم (بوكل) في الثقافات CGN طراز منخفضة البوتاسيوم/depolarization وساطة المبرمج 18،،من1920. عندما تتعرض لمستويات منخفضة من ك+، كنس الخضوع التغييرات الفسيولوجية متميزة، أسفر عن تخفيض التنفس المتقدرية وتحلل، يعزى إلى انخفاض الطلب الخلوية 21، فضلا عن انخفاض في مستويات النووية عاملاً-κB (NFκB) الذي ينظم الأنشطة بما في ذلك الالتهاب وانتقال متشابك 22. هذا النموذج أهمية خاصة لدراسة موت الخلية أثناء تطوير الخلايا العصبية. البيئة ك+ منخفضة أوثق تشبه الظروف الفسيولوجية، ويتسبب في السمات المميزة لموت الخلايا شهد خلال الخلايا العصبية التنمية 23.
وباختصار، كنس نموذجا منذ أمد بعيد للتحقيق في الآليات الجزيئية الكامنة وراء موت الخلايا العصبية والانحطاط. سيسمح البروتوكول التالي العزلة واستزراع كنس أو التعبير أو القمع طريقا الوراثية خاصة باستخدام الفيروسات واستحثاث موت الخلايا العصبية عن طريق آليات مختلفة تمثل الإصابة العصبية والانحطاط.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
هو هذا البروتوكول على أساس إدخال تعديلات على الإجراءات التي تم وصفها سابقا 18 ، ، من 24 25 ، 26 ، 27-هذا البروتوكول هو أقرته "لجنة رعاية الحيوان" في جامعة ماكغيل.
1-"إعداد تجريبية"
ملاحظة: يمكن إعدادها وصيانتها حتى استخدام الحلول الأسهم التالية.
- الحل تشريح
- ذوب 3.62 غ من كلوريد الصوديوم (NaCl)، 0.2 جم كلوريد البوتاسيوم (بوكل)، 0.069 غ فوسفات الصوديوم (نة 2 بو 4 ∙ ح 2 س)، و 1.306 ز د-(+)-الجلوكوز في 500 مل من المقطر H 2 o. ثم إضافة 12.5 مل من "المخزن المؤقت حبيس"، 450 ميليلتر من حل الفينول الحمراء، و 20 مل من جيش صرب البوسنة جزء الخامس إلى الحل. ضبط على درجة الحموضة 7.4 استخدام هيدروكسيد الصوديوم N 1 (هيدروكسيد الصوديوم).
- تعقيم 0.22 ميكرومتر تصفية ومخزن في 4 درجات مئوية. هذا الحل سيبقى مستقرا لفترة تصل إلى أسبوع واحد لمدة 10 أيام-
- التربسين
- تعد حلاً أسهم بتركيز 25 جرام/لتر التربسين في كلوريد الصوديوم 0.9%. تخزين الحل في-20 درجة مئوية.
- مثبط التربسين
- إعداد مخزون بتركيز من 10 ملغ/مل بإذابة 1 غ من الدجاج البيض الأبيض التربسين مثبط في 100 مل من 1 مم HCl. مخزن هذا الحل في-20 درجة مئوية.
- الدناز
- حل 100 مغ من الدناز 1 في 10 مل الماء المعقم لإنشاء مخزون 10 ملغ/مل. تخزين الحل في-20 درجة مئوية.
- مجسو 4
- إضافة ز 6.02 سلفات المغنيزيوم (مجسو 4) إلى 50 مل ماء المقطر (ح 2 س) لإنشاء مخزون 1 متر. تخزين الحل في 4 ° C.
- كاكل 2
- حل 0.735 ز كلوريد الكالسيوم (كاكل 2 ∙ 2 ح 2 س) في 50 مل من المقطر ح 2 س إلى تركز أسهم من 100 ملم. تخزين الحل في 4 ° C.
- بوكل
- ز 3.7275 حل بوكل في 50 مل من المقطر ح 2 س إلى تركز أسهم حل تخزين 1 م في 4 ° C.
- د-(+)-الجلوكوز
- حل ز 1.802 د-(+)-المقطر الجلوكوز في 50 مل من ح 2 س إلى تركز أسهم من 100 ملم. تخزين الحل في 4 ° C.
- خلية ثقافة وسائل الإعلام
- إعداد خلية ثقافة وسائل الإعلام على النحو التالي: 5 مل حرارة إبطال دياليزيد "المصل البقري الجنين"، ينبغي إضافة 500 ميليلتر من 200 ملم ل الجلوتامين، 100 ميليلتر من 50 ملغم/مل مع الجنتامايسين ومل 1 متر واحد بوكل 45 مل لتصفية تعقيم النسر ' s الحد الأدنى الأساسي وسائل الإعلام (ه-م) أن تستكمل مع 1.125 غرام/لتر د-الجلوكوز لتوليد 50 مل من وسائل الإعلام ثقافة العصبية الحبيبية للدماغ. قم بتخزين الوسائط في 4 ° C.
- السيتوزين بيتا-د-أرابينو فورانوسيدي
- حل ملغ 48 من السيتوزين بيتا-د-أرابينو فورانوسيدي في 10 مل وسائط النمو لتركيز مخزون من عيار 20 ملم. تخزين الحل في-20 درجة مئوية.
- بولي-د-يسين
- لتوليد بولي 2 مغ/مل الأسهم د-يسين، أضف 10 مل من العقيم ح 2 س 20 ملغ من بولي د-يسين. يجب أن يتم تخزين المخزون بولي د-يسين في-80 درجة مئوية في 100 ميليلتر مختبرين.
- ملاحظة: ينبغي إعداد قبل تشريح والإبقاء على 4 درجة مئوية حتى استخدام الحلول التالية-
- مجسو 4 الحل تشريح سوبليمينتيد
- إضافة 300 ميليلتر من الأسهم مجسو 4 إلى 250 مل من محلول التشريح.
- التربسين تشريح الحل
- إضافة 100 ميليلتر من التربسين الأسهم و 12 ميليلتر من الأسهم مجسو 4 إلى 10 مل من محلول تشريح.
- 1 حل مثبط التربسين
- ميليلتر 164 إضافة مثبطات التربسين الأسهم، 250 ميليلتر للأوراق المالية الدناز 1 و 12 ميليلتر من الأسهم مجسو 4 إلى 10 مل من محلول تشريح.
- 2 حل مثبط التربسين
- ميليلتر 1040 إضافة مثبطات التربسين الأسهم، وميليلتر 750 من الأسهم 1 الدناز وميليلتر 12 من مخزون MgSO4 إلى 10 مل من محلول تشريح.
- كاكل 2 تكملة الحل تشريح
- إضافة 10 ميليلتر من الأسهم كاكل 2 و 25 ميليلتر من الأسهم مجسو 4 إلى 10 مل من محلول التشريح.
- بولي د-يسين مغلفة أطباق الثقافة
- معطف أطباق الثقافة، يؤدي إلى تمييع 100 ميليلتر من الأسهم بولي د-يسين في 40 مل من العقيم ح 2 o. للاطباق الثقافة أبجد 35 مم، إضافة 2 مل بولي المخفف د-يسين الحل. للوحات 4 جيدا، إضافة 300 ميليلتر من بولي المخفف د-يسين لكل بئر.
- اسمحوا الجلوس د-يسين بولي ح 1 قبل يسفط والغسيل كل جيدا مع 4 مل أو 600 ميليلتر (للثقافة 35 مم الأطباق أو لوحات 4 أيضا، على التوالي) العقيمة H 2 o. ثم نضح ح 2 س وتدع الأطباق الهواء الجاف حاء 1
2. الدماغ الاستخراج والعزل من المخيخ
- ديكابيتاتي يوم 6-7 ألجرو الماوس القديمة باستخدام مقص قطع الرأس. إجراء التشريح للمخ في غطاء زراعة الأنسجة معقمة.
- لإزالة الدماغ، فهم الرأس باستخدام زوج من الملقط وقطع طريق الجلد تجاه الأمامي من الرأس باستخدام مقص ميكروديسيكشن كما هو موضح في الشكل 1. ثم قطع طريق عظم الجمجمة باستخدام زوج من مقص جديدة للتقليل من خطر التلوث. إزالة الجمجمة تغطي الدماغ باستخدام الملقط وندف خارج الدماغ باستخدام الملقط أو ملعقة.
- حسب الحاجة، قطع طريق العصب البصري لتيسير الحصول على الدماغ ككل-
- مكان في الدماغ في حل التشريح التي تستكمل مع مجسو 4. يبقى الحل والدماغ على مدت
- التالية إزالة، تحت مجهر تشريح الدماغ وتشريح المخيخ من الدماغ بينما ما زال في مجسو 4 تكملة تشريح حل وإزالة السحايا استخدام الملقط غرامة. دورة المخيخ إلى الجانب البطني وضمان إزالة الضفيرة شرويد.
- تجمع في سيريبيلا إلى طبق 35 ملم تحتوي على ~ 1 مل مجسو 4 تكملة تشريح الحل.
- فرم الأنسجة إلى قطع صغيرة ونقل في أنبوب 50 مل تحتوي على 30 مل الحل تشريح 4 مخزنة مجسو.
3. عزل الخلايا العصبية الحبيبية للدماغ الماوس و Culturing
- الطرد المركزي أنبوب 50 مل تحتوي على أنسجة المخ المقطعة لمدة 5 دقائق في 644 × ز و 4 درجة مئوية.
- إزالة المادة طافية وإضافة 10 مل من محلول تشريح التربسين. ثم اهتز الأنبوب بسرعة عالية لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية.
- أضف 10 مل من حل مثبط التربسين 1 للأنبوب والصخور برفق للحد الأدنى 2
- الطرد المركزي في أنبوب لمدة 5 دقائق في 644 × ز و 4 درجة مئوية.
- إزالة المادة طافية وإضافة 2 مل من التربسين مثبط الحل 2، ونقل بعد ذلك إلى أنبوب 15 مل.
- تريتوراتي الأنسجة في أنبوب 15 مل حتى يصبح الحل غامضة. ثم ترك تسوية للحد الأدنى 5
- إزالة المادة طافية واضحة ونقل المادة طافية إلى أنبوب جديد يحتوي على 1 مل كاكل 2 تكملة تشريح الحل. إضافة
- مل أخرى من محلول مثبط التربسين 2 إلى الجزء السفلي من الأنبوب الذي يحتوي على بيليه من الخطوة 3، 6. تريتوراتي مرة أخرى وترك تسوية الحد الأدنى 5 إزالة المادة طافية وإضافته إلى الأنبوب الذي يحتوي على المادة طافية من الخطوة 3، 7 (الذي تكرار الخطوات 3.6-3.7). كرر هذه العملية حتى ميكانيكيا هو فصل معظم الأنسجة.
- إضافة 0.3 مل كاكل 2 تكملة الحل تشريح لجمع طافية لكل مل من المادة طافية.
- خلط محتويات الأنبوبة وثم الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 644 x زاي
- إزالة المادة طافية وإضافة 10 مل وسائط جديدة لبيليه ومزيج. قد يكون ثم عد الخلايا
- والمخفف بتركيز 1.5 × 10 6 خلايا/مل. يرجى ملاحظة أن الخلايا 10 مليون المتوقع بشكل عام من كل تشريح الدماغ، وتعتمد على الوقت تريبسينيزيشن والكفاءة للتشريح. لوحة الخلايا على ألواح بولي تم إجراؤه من قبل د-يسين. 4-جيدا لوحات، لوحة 0.5 مل، إعطاء 7.5 × 10 5 خلايا كل بئر. للاطباق 35 ملم، لوحة 4 مل، إعطاء 6 × 10 6 خلايا للوحة الواحدة. إضافة
- بعد 24 ساعة، السيتوزين-β-أرابينو فورانوسيدي (أراك) إلى لوحات للحد من تلوث الدبقية. لكل مل من وسائل الإعلام 0.5 ميليلتر من عيار 20 ملم أراك المطلوبة. بالإضافة لأراك لا يتطلب تغيير وسائط. إذا كانت الخلايا الإبقاء على 7-8 أيام، كرر هذا العلاج في يوم 3-
- الحفاظ على الثقافات في 5% CO 2 حاضنة في 37 درجة مئوية وار مع 100 ميليلتر الجلوكوز 100 ملم إضافة إلى الثقافة لكل 2 مل من وسائل الإعلام كل يومين خلال 5 أيام. غير مطلوب تغيير وسائط كاملة-
4. تغليف lentivirus وتنقيتها ومعايرة
ملاحظة: البروتوكول للتعبئة والتغليف وتركيز، وتنقية ومعايرة lentivirus قد وصفت سابقا بالتفصيل دون استخدام مجموعة 28، بما في ذلك أساليب بديلة للمعايرة، مثل التدفق الخلوي 29. نقدم هنا بإيجاز البروتوكول المستخدم في لدينا مختبر لإنتاج لينتيفيروس لدراسة الإصابة العصبية باستخدام الحل تنقية الفيروسات السريع ومجموعة أدوات معايرة لينتيفيرال قبكر.
- Hek293T لوحة الخلايا في أطباق الثقافة 10 سم مع دولبيكو ' s تعديل النسر ' المتوسطة s الأساسية الحد الأدنى (دميم) وتستكمل مع 10% FBS. للحصول عيار فيروسية عالية، تنمو على الأقل 5 ألواح من الخلايا Hek293T لكل تعداء. تأكد اليوم من تعداء الخلايا روافد 70%. تغيير الوسائط ثلاث ساعات قبل تعداء-
- لكل تعداء، إعداد أنابيب اثنين. في الأنبوب 1 إضافة 1.5 مل مصل خفضت MEM وسائط الإعلام وميليلتر 41 من كاشف تعداء، مزيج جيد. في الأنبوب 2، إضافة 1.5 مل من المصل خفض MEM وسائل الإعلام و 6 ميكروغرام من بلازميد نقل 6 ميكروغرام لناقل بكمف-dR8.2 (تغليف بلازميد)، 3 ميكروغرام بكمف-منظمة-ز ناقلات (المغلف بلازميد) و 35 ميليلتر من p3000 محسن الكاشف (المتوفرة مع ليبوفيكتاميني). مزيج دوامة جيدا، وأنابيب الجمع بين 1 و 2، واحتضان ل 15 دقيقة إزالة 50% من وسائل الإعلام من لوحات Hek293T
- وإضافة مجمعات الدهنية الحمض النووي للخلايا. احتضانها ح 6 في 37 درجة مئوية، وأول أكسيد الكربون 5% 2. قم بإزالة الوسائط واستبدال مع 5 مل دميم الطازجة، واحتضان بين عشية وضحاها.
- ح تعداء بعد الساعة 24، جمع الدفعة الأولى من المادة طافية الفيروسية من كل لوحة. تبقى وسائل الإعلام الفيروسية عند 4 درجة مئوية وإضافة 5 مل وسائط جديدة في كل لوح من الخلايا Hek293T. تبني بين عشية وضحاها.
- تعداء بعد 48 ساعة، جمع الدفعة الثانية من المادة طافية الفيروسية، والجمع بين ذلك مع الدفعة الأولى والطرد المركزي المادة طافية الفيروسية المجمعة لمدة 10 دقيقة في 600 x غ.
- تصفية المادة طافية من خلال عامل تصفية مع حجم المسام ميكرومتر 45-
- تنقية الفيروس استخدام حل تنقية فيروس سريعاً. لكل 45 مل من المادة طافية الفيروسية، إضافة 5 مل حل ملزم لينتيفيرال والمزيج، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في > 5,000 x ز و 4 درجة مئوية.
- إزالة المادة طافية بعناية حتى لا تتعرض للإزعاج بيليه. إضافة 20-40 ميليلتر من متوسطة
- وتعليق إعادة بيليه. قاسمة ومخزن في-80 درجة مئوية. يتم استخدام
- للحصول على عيار لينتيفيرال، مجموعة أدوات معايرة لينتيفيرال قبكر. تمييع 2 ميليلتر من الفيروسات المنقاة في 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني. إضافة 2 ميليلتر للفيروس المخفف إلى 18 ميليلتر من الفيروس تحلل المخزن المؤقت (المقدمة في الطقم). ردود RT-q-بكر
- مجموعة حتى ثلاثة مختلفة في تريبليكاتيس وتسمية لهم كالتحكم ليساتي، الإيجابي الفيروسية 1 (STD1) وإيجابية والتحكم 2 (STD2). لكل رد فعل إضافة، 12.5 ميليلتر من 2 x qPCR MasterMix، ميليلتر 2.5 أما الفيروسية ليساتي أو STD1 (المقدمة في الطقم) أو STD2 (المقدمة في المجموعة)، و 10 ميليلتر من كاشف-ميكس (المقدمة في الطقم) في أنابيب PCR 0.2 مل.
- تعيين البرنامج بكر كما يلي: 20 دقيقة في 42 درجة مئوية لعكس النسخ، 10 دقيقة عند 95 درجة مئوية لتنشيط إنزيم، دورات 40 15 s عند 95 درجة مئوية تمسخ و 1 دقيقة عند 60 درجة مئوية للصلب/extension.
- حساب عيار الفيروسية باستخدام هذه الصيغة:
عيار الفيروسية ليستي = 5 × 10 7/2 3(Ctx-Ct1)/(Ct2-Ct1)-
Ctx = متوسط قيمة قيراط غير معروف عينة، Ct1 = متوسط قيمة STD1، Ct2 = متوسط قيمة STD2-
ملاحظة: يمكن أفضل كنس ترانسدوسيد مع لينتيفيروسيس أو المصابين غدية اعتماداً على طريقة الإصابة التي تجري دراستها. إضافة لينتيفيروسيس وزارة الداخلية من 2-3 إلى خلية ثقافة حل وقت الطلاء يستخدم لدراسة نمدا الناجمين عن الإشارات في اليوم السابع للثقافة. وهذا يؤدي في أكثر من 80% توصيل وهو مناسبة لمتابعة مع التحليلات الكيميائية الحيوية لهذه الخلايا العصبية ( الشكل 2). إضافة غدية في اليوم الخامس للثقافة (في وزارة الداخلية 50) ودراسة نمدا الناجمين عن الإشارات في يوم 7-8 يستخدم تقنيات أخرى مثل التصوير. يؤدي هذا العلاج إلى أقل من 10% العدوى من الخلايا العصبية، مما يجعله مثاليا للتصوير والتعريب المشارك من البروتينات. يمكن استخدام غدية وقت الطلاء لدراسة الحمض النووي الأضرار التي يسببها موت الخلايا بإضافة كامبتوثيسين في يوم 2-3 أو الأكسدة بإضافة بيروكسيد الهيدروجين. وجود بروتينات فلورية (التجارة والنقل، وطلب تقديم العروض، الحراجية المعتمدة أو يفب) معلم للجينات للفائدة يمكن استخدامها لتقدير نسبة توصيل والسمية المحتملة. مع وزارة الداخلية الموصى بها، ونحن نرى سمية الحد الأدنى والحد الأقصى تنبيغ ( الشكل 3).
5. النمذجة "إصابة الخلايا العصبية"
- لحمل نمدا الناجمين عن اكسسيتوتوكسيسيتي الخلايا العصبية، بعد 7 أيام في المختبر، وعلاج كنس مع 100 ميكرومتر نمدا وجليكاين 10 ميكرون حاء – 1 استبدال جميع المتوسطة بمتوسطة مكيفة من الثقافات الموازية مع أي العلاج. ويؤدي هذا التركيز موت الخلايا 50% في 24 ساعة بعد العلاج ( الشكل 3). تجزئة المتقدرية الواضح في ح 6-8 بعد العلاج (انظر جيهاني-أصل et al. 26 ، 27)-
- للحث على موت الخلايا المستحثة بروس (الأكسدة)، علاج العصبيةتكييف ns مع 75-100 ميكرومتر بيروكسيد الهيدروجين (حاء 2 يا 2) والتحول إلى وسائل الإعلام من الثقافات الموازية عقب التعرض دقيقة 5 إلى ح 2 س 2. ملاحظة، نظراً لعدم استقرار ح 2 س 2، تحسين تركيز إلى مستوى الذي يؤدي إلى موت الخلية 50-70% في الثقافة بعد 24 ساعة علاج.
- للحث على الحمض النووي الضرر موت الخلايا المستحثة، علاج كنس مع 10 ميكرون camptothecin. يدفع هذا التركيز أكثر من موت الخلايا 50% في 24 h. تجزئة Mitochondrial وإشارات apoptotic المبكر يحدث ح 2-3 بعد إضافة كامبتوثيسين في هذا التركيز (انظر جيهاني-أصل et al. 18)
- للحث استموات الخلايا العصبية منخفضة K + التي يسببها في كنس، تغيير الوسائط التي تحتوي على 25 مم ك + لوسائل الإعلام البوتاسيوم منخفضة مع 5 مم ك + بعد 7 أيام في المختبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
مع تشريح دقيق، يجب إزالة الدماغ سليمة مع الحد الأدنى من الضرر كما هو مبين في الشكل 1 ألف-باء. ينبغي بذل جهد للحد من الأضرار في الدماغ أثناء الإزالة، ولا سيما الضرر الذي يلحق المخيخ. الأضرار المخيخ يجعل أكثر صعوبة تحديد وإزالة كاملة للسحايا، ويزيد من احتمال تلوث ثقافة العصبية. وبمجرد السحايا قد أزيلت، يمكن تشريح من الأنسجة المتبقية كما هو مبين في الشكل 1 المخيخ ومستعدة للانفصال.
قبل الطلاء، ويمكن ترانسدوسيد مع لينتيفيروس كجنس أو المصابين إتش كما هو موضح في الشكل 2. أننا نجد أقصى قدر من الكفاءة وسمية الحد الأدنى مع 50 موي لعدوى إتش، ووزارة الداخلية من 2-3 في يوم طلاء ل lentivirus (الشكل 3).
وترد ترانسدوسيد الثقافات CGN صحية في الدرجة 7 في الشكل 3 ألف. إذا كان عدد كبير من إطلاق تظل موجودة في الثقافة، يمكن زيادة تركيز أراك التأكد من عدد الخلايا العصبية البحتة. أيضا الخلايا الدبقية يستغرق الفيروس بسهولة أكثر من الخلايا العصبية والتي تصبح حرجة إذا كانت تتم في ترانسدوكتيونس في يوم 5. ويمكن تقييم وجود تشهد موت الخلية من الخلايا العصبية من تشكيل نواة متنكرزه كما هو مبين في الشكل 3. جميع التركيزات من نمدا، ح2س2، وكامبتوثيسين هي الأمثل للحث على موت الخلايا 50% بعد 24 ساعة. وهذا يسمح لدراسة الأحداث الأخرى المبكرة التي تسبق فقدان الخلايا العصبية مثل تجزئة المتقدرية.
رقم 1: إزالة الماوس الدماغ وتشريح من المخيخ- (أ) استخراج الدماغ بالماوس يوم 6-7 القديمة، باستخدام زوج من الملقط وأمسك الرأس وقطع الجلد الأسفل على طول الخطوط المنقطة باستخدام مقص ميكروديسيكشن. احرص على قطع الجلد والنسيج الضام، عميق جداً قد شق من ثقب في الجمجمة وتلف الدماغ فقط. هذه الشقوق الثلاثة، مباشرة على طول خط الوسط واثنين من التقويس أفقياً، تسمح للجلد لدفع مرة أخرى يكشف عن الجمجمة. بمجرد الكشف عن الجمجمة يمكن اخترقت بطرف المقص، وقطع في الأسفل. ويجب إيلاء عناية كبيرة ليس للأضرار المخيخ لتيسير تحديد وإزالة السحايا. قص مرة واحدة، يمكن استخدام الملقط قشر مرة الجمجمة، وتعريض الدماغ والتي قد تكون مثار ثم إلى الحل تشريح باردة باستخدام زوج من الملقط أو ملعقة. من أجل إزالة الدماغ، قد تحتاج العصب البصري تكون مقطوعة. (ب) بمجرد إزالة من الجمجمة، يجب إزالة السحايا من المخيخ باستخدام زوج من الملقط مقلوب غرامة. (ج) استخدام زوج من غرامة الملقط مقلوب، المخيخ هو تشريح من الأنسجة المتبقية والتفتيش لضمان الإزالة الكاملة للسحايا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: نمذجة إصابة الخلايا العصبية في الخلايا الحبيبية للدماغ العصبية. سيريبيلا المعزولة من اليوم يتم فصلها الفئران 6-7 في الخلايا المفردة بعد الإجراء المعروضة في الجزء 3. وعقب الانفصال، يتم عد الخلايا وحراكه في مجلد من وسائط الثقافة لتوليد 1.5 × 106 cells/mL.For 35 مم الأطباق، مطلي 4 مل، إعطاء 6 × 106 خلايا للوحة الواحدة. لتصوير الشرائح، هو مطلي 0.5 مل، إعطاء 7.5 × 105 خلايا/جيدا. ثم يمكن كنس ترانسدوسيد مع لينتيفيروس أو المصابة مع إتش. استخدام إتش اليوم من الطلاء (0 أيام في المختبر (DIV)) يعطي أكبر من كفاءة تعداء 90% ويسمح بدراسة الخلايا العصبية من الضرر عن طريق الأكسدة وتلف الحمض النووي. إضافة 10 ميكرون camptothecin (CPT) ستؤدي ضرر الحمض النووي، بينما ستؤدي 75-100 ميكرومتر بيروكسيد الهيدروجين (حاء2يا2) الأكسدة. أن تركيز ح2س2 يجب أن يكون الأمثل للحث على موت الخلايا 50% بعد 24 ساعة. إصابة مع غدية في الدرجة 5 يعطي من كفاءة توصيل أقل من أقل من 10%. في شعبة 7 عندما يتم إثراء مستقبلات NMDA في الثقافة، ويمكن علاج الخلايا العصبية مع 100 ميكرومتر نمدا وجليكاين 10 ميكرون للحث على اكسسيتوتوكسيسيتي. هذا المثل الأعلى للتصوير التحليل اللاحق أو اقتفاء أثرها من خلية واحدة. وأخيراً، ترانسدوسينج مع لينتيفيروس في DIV 0, يتبعها علاج مع 100 ميكرومتر نمدا و 10 ميكرون جليكاين في شعبة 7، يعطي من كفاءة توصيل عالية بما فيه الكفاية (> 80%) للسماح لتحليل الكيمياء الحيوية للثقافة، بما في ذلك شرائح التسلسل، ودراسة تعبير البروتين، وإجراء فحوصات لايف/قتيلا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الحبيبية للدماغ الخلايا العصبية. (أ) الخلايا العصبية كانت ترانسدوسيد مع لينتيفيروسيس لطلب تقديم العروض في وزارة الداخلية 3 في الوقت من الطلاء، وثابتة والملون في 7 أيام في المختبر. ويرد كولوكاليزيشن لإشارة طلب تقديم العروض، MAP2، وهويشت لإثبات صحة الخلايا العصبية التي هي ترانسدوسيد تماما من لينتيفيروسيس. (ب) تمثل الصور تحليلات المقايسة الميت يعيش من الخلايا العصبية المصابة مع وزارة الداخلية المختلفة، لقياس سمية. كنس المصابين إتش معربا عن لاكز وزارة الداخلية بين 25 و 50 يسمح للكفاءة القصوى مع الحفاظ على الحد الأدنى من السمية. أقل مما يعتبر فرق 1% في بقاء الخلية مقارنة بعنصر التحكم عند إصابة في وزارة الداخلية هذا. (ج) هويشت تلطيخ التحكم كنس وكنس تعامل مع نمدا للحث على موت الخلايا. ملاحظة تكوين نويات متنكرزه مع العلاج نمدا. وهذا يدل على موت الخلية، ويمكن أن ينظر إليه في حوالي 50% ميكرومتر الثقافة 24 ساعة بعد العلاج مع 100 ميكرومتر نمدا و 10 جليكاين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا نقدم طريقة بسيطة لاستزراع الماوس الأساسي الحبيبية للدماغ الخلايا العصبية (كجنس)، وفقدان والحصول على دراسات مهمة، ونمذجة آليات مختلفة لموت الخلايا. هناك عدة عوامل تؤثر على إمكانية تكرار نتائج النتائج باستخدام هذا الإجراء الذي يتطلب رصداً دقيقا. وتشمل هذه نقاء الثقافة بما في ذلك القضاء على الخلايا الدبقية في الثقافة، والتقاء الثقافة، والحفاظ على الخلايا السليمة. الأخذ بالتغير في هذه العوامل يمكن أن التحيز في النتائج والطعن في إمكانية تكرار نتائج. أدناه ونحن تصف كيفية التقليل من العوامل التي تؤثر سلبا على النتائج.
للقضاء على الخلايا الدبقية من ثقافة كنس وإنشاء عدد الخلايا العصبية البحتة، نستخدم 10 ميكرون من السيتوزين-β-أرابينو فورانوسيدي (أراك)، أنتيميتابوليتي بيريميدين الذي يقتل تكاثر الخلايا عن طريق تثبيط توليف الحمض النووي. إذا كان لا يزال هناك عدد خلايا الدبقية الحالية، يمكن زيادة تركيز أراك إلى 15 ميكرون. وهذا هو أيضا الكثير يتوقف. وبالإضافة إلى ذلك، للثقافات التي يتم الاحتفاظ بها لمدة تصل إلى 7-8 أيام، يمكن إجراء علاج أراك ثانية في اليوم 3. للحصول على عدد الخلايا العصبية نقي وتجنب موت الخلية، من المهم أن قشر جميع السحايا إيقاف المخيخ قبل قطع الأنسجة أربا، تليها تريبسينيزيشن. وهذا ينبغي أن يتم في فترة قصيرة معقولة من الزمن (لا تتجاوز 7-10 دقيقة الواحدة المخيخ). وجود السحايا في نتائج ثقافة العصبية في الثقافة غير الصحية وموت الخلايا في نهاية المطاف. وثمة عامل آخر يمكن أن تؤدي إلى موت الخلايا العصبية قبل المعالجة الوقت تريبسينيزيشن. من المهم أن تكون الخلايا غير الإفراط تريبسينيزيد. من ناحية أخرى، يتطلب تحت تريبسينيزيشن كذلك الميكانيكية تفكك الخلايا التي قد تلحق الضرر بها أو يؤدي إلى انخفاض عائد. ولذلك، يتطلب الوقت تريبسينيزيشن الأمثل والكثير يتوقف.
العامل القادم اعتبار هو التقاء الخلايا في وقت الاستخدام. كونفلوينسي مختلفة يمكن أن تولد تقلب في النتائج. هذا مهم خاصة اعتماداً على قراءات في التجارب. مع حالة التقاء منخفض، تبدأ الخلايا العصبية تثاقل بعد 2-3 أيام. ويضعف دولة التقاء منخفضة جداً أو مرتفعة جداً من الخلايا العصبية الإشارات. من المهم لحساب عدد الخلايا الحية للطلاء دقيقة.
وقد وصف أساليب أخرى للثقافات CGN، خاصة تبحث في إجراءات تثقيف الأساسية باستخدام نظام "الانفصال غراء" كيت 30 أيضا تثقيف بعد انتهاء الإجراءات والتلاعب CGN بغية دراسة الهجرة العصبية و مورفولوجيا 31. البروتوكول قدمه لي et al. توضح هذه المقالة استخدام "مجموعة نظام الانفصال غراء". وأوصوا بطريقتين لزيادة نقاء كنس معزولة: تشغيل الخلايا عن طريق فصل تدرج بركل، فضلا عن ما قبل الطلاء على لوحة بولي-د-يسين لمدة 20 دقيقة. كلا الأسلوبين للمساعدة في فصل كنس عن الملوثات الدبقية. ويوصي هذا في حالة العلاج مع أراك وحدها ليست كافية لإثراء للثقافة العصبية البحتة. بالإضافة إلى ذلك، يستخدم لي يوم 4-6 القديمة الماوس الجراء، بينما هذا يقدم نموذجا فعالاً للنظر في تمايز الخلايا العصبية؛ ونجد استخدام كنس من يوم 6-7 القديمة الماوس الجراء أكثر ملاءمة لدراسة الإصابة العصبية. ويعرض هولوبووسكا et al. بروتوكول تعداء الخلايا العصبية الدماغ وظيفة الانقسامية فوسفات الكالسيوم الأسلوب في المختبر وانهانسر فيفو فياستخدام. هذه هي طرق ممتازة للتحوير الوراثي للخلايا العصبية التي يمكن تتبع خلية مفردة. يمكن أن تختلف كفاءة تعداء استخدام الأسلوب فوسفات الكالسيوم من 0.1-5%. ولذلك، نجد أن استخدام لينتيفيروسيس الأنسب كما أنه يؤدي إلى أكثر من 80% للتحاليل الكيميائية الحيوية بما في ذلك التحليلات وشركة إيمونوبريسيبيتيشن immunoblotting Seq رقاقة، توصيل عند ترانسدوسيد في الوقت من الطلاء.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ويدعم هذا العمل العلوم الطبيعية ومجلس البحوث الهندسية في كندا و "المعاهد الكندية للبحوث الصحية" المنح لجعفر-ألف.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| qPCR lentivitral titration kit | ABM | #LV900 | |
| speedy virus purification solution | ABM | #LV999 | |
| pCMV-dR8.2 | Addgene | #8455 | |
| pCMV-VS.VG | Addgene | #8454 | |
| Distilled water | Gibco | #15230162 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | #25030081 | |
| 35 mm Nunc culture dishes | Gibco | #174913 | |
| PowerUP SYBR green master mix | life technologies | #A25742 | |
| BSA V Solution | Sigma Aldrich | #A-8412 | |
| CaCl2 • 2H2O | Sigma Aldrich | #C-7902 | |
| Camptothecin | Sigma Aldrich | #C-9911 | |
| Chicken Egg White Trypsin Inhibitor | Sigma Aldrich | #10109878001 | |
| Cytosine beta-D-Arabino Furanoside | Sigma Aldrich | #C-1768 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | #G-7528 | |
| DNase1 | Sigma Aldrich | #11284932001 | |
| Eagle-minimal essential medium | Sigma Aldrich | #M-2279 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | #G-5417 | |
| Heat inactivated dialyzed Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | #F-0392 | |
| Hepes Buffer | Sigma Aldrich | #H-0887 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | #216763 | |
| 50 mg/mL Gentamycin | Sigma Aldrich | #G-1397 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | #M-2643 | |
| N-Methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | #M-3262 | |
| Phenol Red Solution | Sigma Aldrich | #P-0290 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich | #T-4549 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| p3000 enhancer reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| KCl | VWR | #CABDH9258 | |
| NaCl | VWR | #CABDH9286 | |
| NaH2PO4H2O | VWR | #CABDH9298 | |
| Poly D-lysine | VWR | #89134-858 | |
| DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
| FBS | Wisent | #080-450 |
References
- Goldowitz, D., Hamre, K. The cells and molecules that make a cerebellum. Trends in Neurosciences. 21 (9), 375-382 (1998).
- Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).
- Bilimoria, P. M., Bonni, A. Cultures of cerebellar granule neurons. CSH Protoc. , (2008).
- Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
- Burgoyne, R. D., Cambray-Deakin, M. A. The cellular neurobiology of neuronal development: the cerebellar granule cell. Brain Res. 472 (1), 77-101 (1988).
- Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annu Rev Neurosci. 18, 385-408 (1995).
- Evans, G. J. Synaptic signalling in cerebellar plasticity. Biol Cell. 99 (7), 363-378 (2007).
- Hunt, D. L., Castillo, P. E. Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 496-508 (2012).
- Arundine, M., Tymianski, M. Molecular mechanisms of calcium-dependent neurodegeneration in excitotoxicity. Cell Calcium. 34 (4-5), 325-337 (2003).
- Szydlowska, K., Tymianski, M. Calcium, ischemia and excitotoxicity. Cell Calcium. 47 (2), 122-129 (2010).
- Jahani-Asl, A., Germain, M., Slack, R. S. Mitochondria: joining forces to thwart cell death. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 162-166 (2010).
- Rego, A. C., Oliveira, C. R. Mitochondrial dysfunction and reactive oxygen species in excitotoxicity and apoptosis: implications for the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Neurochem Res. 28 (10), 1563-1574 (2003).
- Wei, M. C., et al. Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death. Science. 292 (5517), 727-730 (2001).
- Doyle, K. P., Simon, R. P., Stenzel-Poore, M. P. Mechanisms of ischemic brain damage. Neuropharmacology. 55 (3), 310-318 (2008).
- Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262 (5134), 689-695 (1993).
- Cole, K., Perez-Polo, J. R. Neuronal trauma model: in search of Thanatos. Int J Dev Neurosci. 22 (7), 485-496 (2004).
- Cheung, E. C., McBride, H. M., Slack, R. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of neuronal cell death. Apoptosis. 12 (5), 979-992 (2007).
- Jahani-Asl, A., et al. Mitofusin 2 protects cerebellar granule neurons against injury-induced cell death. J Biol Chem. 282 (33), 23788-23798 (2007).
- Gallo, V., Kingsbury, A., Balazs, R., Jorgensen, O. S. The role of depolarization in the survival and differentiation of cerebellar granule cells in culture. J Neurosci. 7 (7), 2203-2213 (1987).
- Miller, T. M., et al. Bax deletion further orders the cell death pathway in cerebellar granule cells and suggests a caspase-independent pathway to cell death. J Cell Biol. 139 (1), 205-217 (1997).
- Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation. Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).
- Piccioli, P., et al. Inhibition of nuclear factor-kappaB activation induces apoptosis in cerebellar granule cells. J Neurosci Res. 66 (6), 1064-1073 (2001).
- D'Mello, S. R., Galli, C., Ciotti, T., Calissano, P. Induction of apoptosis in cerebellar granule neurons by low potassium: inhibition of death by insulin-like growth factor I and cAMP. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (23), 10989-10993 (1993).
- Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (24), 7919-7923 (1982).
- Messer, A. The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture. Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).
- Jahani-Asl, A., et al. CDK5 phosphorylates DRP1 and drives mitochondrial defects in NMDA-induced neuronal death. Hum Mol Genet. 24 (16), 4573-4583 (2015).
- Jahani-Asl, A., et al. The mitochondrial inner membrane GTPase, optic atrophy 1 (Opa1), restores mitochondrial morphology and promotes neuronal survival following excitotoxicity. J Biol Chem. 286 (6), 4772-4782 (2011).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. (32), (2009).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), (2009).
- Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. (85), (2014).
