Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Modelleren van neuronale dood en degeneratie in muis primaire cerebellaire submodule neuronen

Published: November 6, 2017 doi: 10.3791/55871
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1,2,4
1Lady Davis Institute for Medical Research, Jewish General Hospital, 2Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 3Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa, 4Department of Oncology, Faculty of Medicine, McGill University

Summary

Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode om te isoleren en primaire muisknop cerebrale submodule neuronen (CGNs) van 6-7 dag oud pups, efficiënte transductie van CGNs voor verlies en winst van functie studies, kweken en modellering NMDA-geïnduceerde neuronale excitotoxicity, lage-kalium-veroorzaakte celdood, DNA-schade en oxidatieve stress met behulp van de zelfde cultuur-model.

Abstract

Cerebellaire submodule neuronen (CGNs) zijn een veelgebruikte neuronale model, vormen een overvloedige homogene bevolking in het cerebellum. In het licht van hun postnatale ontwikkeling, overvloed en toegankelijkheid zijn CGNs een ideaal model om neuronale processen, met inbegrip van neuronale ontwikkeling, neuronale migratie en fysiologische Neuronale activiteit stimulatie te bestuderen. Daarnaast bieden de CGN culturen een uitstekend model voor het bestuderen van de verschillende vervoerswijzen met inbegrip van excitotoxicity en apoptosis van de dood van de cel. Binnen een week in cultuur express CGNs N-methyl-D-aspartaat (NMDA)-receptoren, een specifieke ionotropic glutamaat-receptor met vele kritische functies in neuronale gezondheid en ziekte. De toevoeging van lage concentraties van NMDA in combinatie met membraan depolarisatie knaagdier primaire CGN culturen is gebruikt voor het modelleren van fysiologische Neuronale activiteit stimulatie, terwijl de toevoeging van hoge concentraties van NMDA kan worden gebruikt om het model excitotoxic neuronale schade. Hier, worden een methode van isolement en kweken van CGNs van 6 dag oud pups, alsmede de genetische manipulatie van CGNs door adenovirussen en lentivirussen beschreven. Wij ook aanwezig geoptimaliseerde protocollen over hoe NMDA-geïnduceerde excitotoxicity, laag-kalium-veroorzaakte apoptosis, oxidatieve stress en DNA-schade na transductie van deze neuronen te stimuleren.

Introduction

Cerebellaire submodule neuronen (CGNs) worden ook gekenmerkt in cultuur en hebben gediend als een effectieve model om te studeren neuronale dood en ontwikkeling 1,2,3,4,5, 6. de vroege expressie van N-methyl-D-aspartaat (NMDA)-receptoren in de CGN culturen in vitro maakt hen een aantrekkelijk model te bestuderen NMDA-geïnduceerde signalering. Activering van deze receptoren met NMDA in combinatie met membraan depolarisatie wordt gebruikt voor het modelleren van fysiologische Neuronale activiteit stimulatie, en heeft toegestaan voor onderzoek naar de mechanismen van synaptische plasticiteit 7,8. Integendeel, kan overmatige stimulatie van deze receptoren door NMDA ligand worden gebruikt voor het model van excitotoxicity, een grote mechanisme van neuronale schade in acute schade aan de hersenen en neurodegeneratieve ziekten 9. Een mechanisme voor de inductie van excitotoxicity is door middel van ATP honger met verminderde zuurstof, zoals gezien bij acute neuronale schade. Dit leidt tot membraan depolarisatie en verhoogde niveaus van glutamaat vrij in de synaps. De daaropvolgende overstimulatie van de NMDA-receptor door verhoogde glutamaat resulteert in buitensporige Ca2 + toestroom via deze receptoren, die op zijn beurt activeert verschillende trajecten met inbegrip van Ca2 +-geactiveerd proteasen, phospholipases, en enzym, resulterend in de ongecontroleerde afbraak van kritische cellulaire componenten en celdood. Bovendien, leidt hoge intracellulaire Ca2 + tot de generatie van zuurstof vrije radicalen en mitochondriale schade 10,11.

Terwijl de meerderheid van de neuronale verlies na NMDA-geïnduceerde neuronale excitotoxicity te wijten aan de calcium toestroom is en Bax/Bak onafhankelijk is, kunnen niet andere mechanismen van celdood worden uitgesloten van dit model. Het uiterlijk van beide necrotische en apoptotic zoals celdood als gevolg van excitotoxicity gedeeltelijk te wijten aan de generatie van reactieve zuurstof soorten (ROS) en DNA-schade veroorzaakt doorhoge intracellulaire Ca 2 + niveaus 12 is. DNA-beschadiging resulteert in neuronale dood door middel van apoptotic mechanismen, worden gecorreleerd met kenmerken van apoptotic celdood, zoals het uiterlijk van de chromatine massa's en de apoptotic organen. Inductie van apoptosis is bemiddeld door de vrijlating van cytochroom c uit de mitochondriën, en heeft aangetoond dat Bax/Bak oligomerisatie 13afhankelijk te zijn. Bax/Bak oligomerisatie bevordert porie vorming in de buitenste mitochondriale membraan, wat resulteert in cytochroom c release en de activering van de regelgevers van de pro-apoptotic zoals gezien met milde ischemische schade 14.

Generatie van ROS is een belangrijke kwestie in de hersenen als gevolg van de lage endogene niveaus van antioxidanten, gekoppeld aan de eis van de grote zuurstof voor neuronale functionerende 15. Wanneer blootgesteld aan een ischemische gebeurtenis, is stikstofoxide synthase upregulated, productie van stikstofmonoxide en het vergroten van reactieve zuurstof soorten 14. De verhoogde concentratie van zuurstof radicalen kan resulteren in DNA-beschadiging en niet indirect veroorzaken energie honger. Hoge niveaus van DNA double-stranded pauzes worden verholpen door de activering van poly ADP-ribose polymerase-1 (PARP-1), een eukaryote chromatine-gebonden eiwit dat verantwoordelijk is voor het katalyseren van de overdracht van ADP-ribose eenheden van NAD+, een proces dat integraal deel uitmaakt van 16van de reparatie van DNA. Met buitensporige schade als gevolg van oxidatieve stress, PARP-1 activering kan echter leiden tot energie honger als gevolg van de verhoogde afvoer op NAD+, een noodzakelijke substraat voor ATP productie door middel van oxidatieve fosforylering. Uiteindelijk, oxidatieve stress zal leiden tot apoptosis in een Bax/Bak afhankelijke wijze leidt tot mitochondriale cytochroom c release, en is gebleken voor het opwekken van mitochondriale reorganisatie in CGNs 17.

Ten slotte, veranderingen in de concentratie van kaliumchloride (KCl) in CGN culturen kunnen worden gebruikt om model te lage kalium/depolarisatie gemedieerde apoptosis 18,19,20. Wanneer blootgesteld aan lage niveaus van K+, ondergaan CGNs verschillende fysiologische veranderingen, wat resulteert in kortingen van mitochondriale ademhaling zowel glycolyse, toegeschreven aan verminderde cellulaire vraag 21, evenals vermindering van nucleaire factor-recombination (NFκB) die activiteiten, met inbegrip van ontsteking en synaptische transmissie 22regelt. Dit model is van bijzonder belang voor het bestuderen van celdood tijdens neuronale ontwikkeling. De lage K+ environment nauwer lijkt op fysiologische omstandigheden en kenmerken van celdood gezien tijdens neuronale ontwikkeling 23veroorzaakt.

Kortom bieden CGNs een langdurige model voor het onderzoek naar de moleculaire mechanismen van neuronale dood en degeneratie. Het volgende protocol kan isolatie en kweken van CGNs, expressie of onderdrukking van een bepaalde genetische traject met behulp van virussen en de inductie van neuronale dood via verschillende mechanismen die neuronale schade en degeneratie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

dit protocol is gebaseerd op wijzigingen van de procedures die zijn beschreven eerder 18 , 24 , 25 , 26 , 27. dit protocol is goedgekeurd door de Commissie van de zorg van het dier aan de McGill University.

1. experimental voorbereiding

Opmerking: de onderstaande voorraadoplossingen kunnen worden voorbereid en onderhouden tot gebruik.

  1. Dissectie oplossing
    1. Los 3.62 g natriumchloride (NaCl), 0.2 g van kaliumchloride (KCl), 0.069 g natriumfosfaat (NaH 2 PO 4 ∙ H 2 O), en 1.306 g D-(+)-Glucose in 500 mL gedestilleerd H 2 O. Voeg dan 12,5 mL HEPES-Buffer, 450 µL van fenol red oplossing, en 20 mL van BSA breuk V aan de oplossing. Aanpassen op een pH van 7,4 met behulp 1 N van natriumhydroxide (NaOH).
    2. Sterilize met een 0,22 µm filter en bewaren bij 4 ° C. Deze oplossing zal stabiel blijven voor maximaal een week tot 10 dagen.
  2. Trypsine
    1. bereiden een stockoplossing met een concentratie van 25 g/L trypsine in natriumchloride 0,9%. Opslaan van de oplossing bij -20 ° C.
  3. Trypsine remmer
    1. bereiden een materieel met een concentratie van 10 mg/mL door ontbinding van 1 g van kip-ei wit trypsine remmer in 100 mL 1 mM HCl. winkel deze oplossing bij -20 ° C.
  4. DNase
    1. los 100 mg DNase 1 in 10 mL steriel water voor het genereren van een voorraad van 10 mg/mL. Opslaan van de oplossing bij -20 ° C.
  5. MgSO 4
    1. 6.02 g magnesiumsulfaat (MgSO 4) toevoegen aan 50 mL gedestilleerd water (H 2 O) voor het genereren van een voorraad van 1 M. De oplossing bewaren bij 4 ° C.
  6. CaCl 2
    1. Los 0.735 g van calciumchloride (CaCl 2 ∙ 2 H 2 O) in 50 mL gedestilleerd H 2 O een voorraad concentratie van 100 mM. Oplossing bewaren bij 4 ° C.
  7. KCl
    1. Los 3.7275 g van KCl in 50 mL gedistilleerd H 2 O een voorraad concentratie van 1 M. winkel oplossing bij 4 ° C.
  8. D-(+)-Glucose
    1. los 1.802 g D-(+)-glucose in 50 mL gedistilleerd H 2 O een voorraad concentratie van 100 mM. Oplossing bewaren bij 4 ° C.
  9. Cel voedingsbodems
    1. bereiden van voedingsbodems van de cel als volgt: 5 mL warmte geïnactiveerd dialyzed foetale runderserum, 500 µL van 200 mM L-Glutamine, 100 µL van 50 mg/mL gentamycine en 1 mL van 1,0 M KCL moet worden toegevoegd aan 45 mL voor filter gesteriliseerde Eagle ' s minimale essentiële media (E-MEM) dat wordt aangevuld met 1.125 g/L D-Glucose voor het genereren van 50 mL cerebellaire submodule neuron voedingsbodems. Media bewaren bij 4 ° C.
  10. Cytosine Beta-D-Arabino Furanoside
    1. los 48 mg cytosine beta-D-arabino furanoside in 10 mL groei media een voorraad concentratie van 20 mM. Opslaan van de oplossing bij -20 ° C.
  11. Poly-D-Lysine
    1. voor het genereren van een 2 mg/mL poly D-lysine voorraad, voeg toe 10 mL steriele H 2 O met 20 mg poly D-lysine. Voorraad poly D-lysine moet worden opgeslagen bij-80 ° C in 100 µL aliquots.
  12. Opmerking: de volgende oplossingen moeten worden voorbereid voordat dissectie en onderhouden bij 4 ° C tot gebruik.
  13. MgSO 4 Supplemented dissectie oplossing
    1. toevoegen 300 µL van voorraad MgSO 4 tot 250 mL van de oplossing van de dissectie.
  14. Trypsine dissectie oplossing
    1. Voeg 100 µL van voorraad trypsine en 12 µL van voorraad MgSO 4 tot 10 mL van de oplossing van de dissectie.
  15. Trypsine remmer oplossing 1
    1. toevoegen 164 µL van voorraad trypsine-remmer, 250 µL van voorraad DNase 1 en 12 µL van voorraad MgSO 4 tot 10 mL van de oplossing van de dissectie.
  16. Trypsine remmer oplossing 2
    1. toevoegen 1040 µL van voorraad trypsine-remmer, 750 µL van voorraad DNase 1 en 12 µL van voorraad MgSO4 tot 10 mL van de oplossing van de dissectie.
  17. CaCl 2 aangevuld dissectie oplossing
    1. toevoegen 10 µL van voorraad CaCl 2 en 25 µL van voorraad MgSO 4 tot 10 mL van de oplossing van de dissectie.
  18. Poly D-Lysine gecoat cultuur gerechten
    1. om de jas cultuur gerechten, Verdun 100 µL van voorraad poly D-lysine in 40 mL steriele H 2 O. Voor 35 mm Nunc cultuur gerechten, voeg 2 mL verdunde poly D-Lysine oplossing. Voor 4 goed platen, voeg 300 µL van verdunde poly D-Lysine aan elk putje.
    2. Laat de zitten van de poly-D-lysine voor 1 h voor zuigen en wassen elk goed met 4 mL of 600 µL (voor 35 mm cultuur gerechten of 4 goed, respectievelijk platen) van steriele H 2 O. Vervolgens gecombineerd de H 2 O en laat de gerechten lucht drogen voor 1 h.

2. Brain extractie en isolatie van Cerebellum

  1. Decapitate per 6-7 dagen oude muis pup met onthoofding schaar. Uitvoeren van de dissectie van de hersenen in de kap van een steriele weefselkweek.
  2. Als u wilt verwijderen de hersenen, het hoofd met behulp van een paar pincet te begrijpen en snijden door de huid naar de voorste van het hoofd met behulp van microdissection-schaar, zoals aangetoond in Figuur 1. Vervolgens snijden door het bot van de schedel met behulp van een nieuw paar van schaar om risico van besmetting te minimaliseren. Verwijderen van de schedel die betrekking hebben op de hersenen met behulp van Tang en plagen uit de hersenen met behulp van pincet of een spatel.
    1. Zo nodig het doorsnijden van de oogzenuw te vergemakkelijken om de hersenen uit als een geheel.
  3. Plaats van de hersenen in de dissectie-oplossing die is aangevuld met MgSO 4. Houd de oplossing en de hersenen op ice.
  4. Volgende brain verwijdering, onder een Microscoop dissectie, ontleden uit het cerebellum van de hersenen terwijl nog in MgSO 4 aangevuld dissectie oplossing en verwijderen van de hersenvliezen die met behulp van fijne pincet. Draai het cerebellum aan de ventrale zijde en verzekeren van de verwijdering van de plexus choroideus.
  5. De cerebella bundelen in een 35-mm-schotel met ~ 1 mL MgSO 4 aangevuld dissectie oplossing.
  6. Hak van het weefsel in kleine stukjes en breng kwantitatief over in een tube van 50 mL met MgSO 4 gebufferde dissectie oplossing 30 mL.

3. Muis cerebellaire submodule Neuron isolatie en Culturing

  1. centrifugeren van de tube van 50 mL, met de gehakte cerebrale weefsel voor 5 min op 644 x g en 4 ° C.
  2. Verwijder het supernatant en voeg toe 10 mL trypsine dissectie oplossing. Schud vervolgens de buis op hoge snelheid gedurende 15 minuten bij 37 ° C.
  3. Voeg 10 mL trypsine remmer oplossing 1 om de buis en rock gedurende 2 min. zachtjes
  4. Centrifugeren van de buis gedurende 5 minuten op 644 x g- en 4 ° C.
  5. Verwijder het supernatant en voeg toe 2 mL trypsine remmer oplossing 2, en dan overdracht aan een tube van 15 mL.
  6. Triturate het weefsel in de tube van 15 mL tot de oplossing troebel wordt. Vervolgens laat regelen voor 5 min.
  7. Verwijderen van het supernatans dat duidelijk en het supernatant overbrengen in een nieuwe buis met 1 mL CaCl 2 aangevuld dissectie oplossing.
  8. Toevoegen een ander mL trypsine remmer oplossing 2 aan de onderkant van de buis met de pellet uit stap 3.6. Triturate weer en laat regelen voor 5 min. de bovendrijvende vloeistof verwijderen en toevoegen aan de buis met het supernatant uit stap 3.7 (dat is een herhaling van stappen 3.6-3.7). Herhaal dit proces totdat het grootste deel van het weefsel is mechanisch losgekoppeld.
  9. Toevoegen 0.3 mL CaCl 2 aangevuld dissectie oplossing aan de supernatant collectie voor elke mL van het supernatans.
  10. Meng de inhoud van de tube en vervolgens gedurende 5 min op 644 x g. centrifugeren
  11. De bovendrijvende vloeistof verwijderen en toevoegen van 10 mL verse media aan de pellet en meng.
  12. Cellen kunnen vervolgens worden geteld en verdund tot een concentratie van 1,5 x 10 6 cellen/mL. Houd er rekening mee dat het 10 miljoen cellen in het algemeen worden verwacht van elke ontleed hersenen, afhankelijk van de tijd van de trypsinebehandeling en de efficiëntie van de dissectie. Plaat cellen op eerder gemaakte poly D-lysine platen. Plaat voor 4-Wells-platen, 0,5 mL, geven van 7,5 x 10 5 cellen per putje. Plaat voor 35-mm gerechten, 4 mL, 6 x 10 6 cellen per plaat geven.
  13. Na 24 h, cytosine-β-arabino furanoside (AraC) aan de platen ter beperking van verontreiniging gliale toevoegen. Voor elke media mL is 0,5 µL van 20 mM AraC vereist. Toevoeging van AraC is niet vereist voor een wijziging van de media. Als cellen worden gehandhaafd voor 7-8 dagen, herhaal deze behandeling op dag 3.
  14. Onderhouden culturen in een 5% CO 2 incubator bij 37 ° C en diervoeders met 100 µL van 100 mM glucose toegevoegd aan de cultuur voor elke 2 mL van media om de 2 dagen afgelopen 5 dagen. Een volledige media-verandering is niet vereist.

4. Lentivirus verpakking, zuivering en titratie

Opmerking: het protocol voor de verpakking, de concentratie, de zuivering en de titratie van lentivirus is eerder beschreven in detail zonder het gebruik van een kit 28, met inbegrip van alternatieve methoden voor titratie, zoals stroom cytometry 29. Hier presenteren we kort het protocol dat wordt gebruikt in ons lab voor de productie van lentivirus te bestuderen van neuronale schade met behulp van snelle virus zuivering oplossing en een qPCR lentivirale titratie kit.

  1. Plaat Hek293T cellen in 10 cm cultuur gerechten met Dulbecco ' s bewerkt Eagle ' s minimaal essentiële medium (DMEM) aangevuld met 10% FBS. Voor het verkrijgen van een hoge virale titer, groeien ten minste 5 platen van Hek293T cellen voor elk transfectie. Zorg ervoor dat op de dag van de transfectie cellen zijn 70% heuvels. Wijzigen van media drie uur voor Transfectie.
  2. Voor elke transfectie, bereiden twee buizen. In buis Voeg 1 1,5 mL serum MEM verminderde media en 41 µL van transfectiereagens, meng goed. Toevoegen in buis 2, 1,5 mL serum MEM verminderde media en 6 µg overdracht plasmide, 6 µg van pCMV-dR8.2 vector (verpakking plasmide) 3 µg pCMV-VSV-G-vector (envelop plasmide) en 35 µL van p3000 enhancer reagens (meegeleverd met lipofectamine). Meng goed, en combineren buizen 1 en 2, vortex en incubeer gedurende 15 min.
  3. 50% van de media verwijderen uit Hek293T platen en lipide-DNA complexen aan cellen toevoegen. Incubeer gedurende 6 uur bij 37 ° C, 5% CO 2. Media verwijderen en vervangen door verse DMEM 5 mL, na een nacht bebroeden.
  4. Op 24 h na transfectie, verzamelen de eerste partij van virale supernatant van elke plaat. Het virale medium bewaren bij 4 ° C en 5 mL van de verse media toe te voegen in elke plaat van Hek293T cellen. Na een nacht bebroeden.
  5. 48 h na transfectie, verzamelen de tweede partij van virale supernatans, Combineer het met de eerste partij en centrifugeer gecombineerde virale bovendrijvende vloeistof gedurende 10 minuten op 600 x g.
  6. De bovendrijvende vloeistof filteren door een filter met 45 µm poriegrootte.
  7. Zuiveren het virus met behulp van een snelle virus zuivering oplossing. Voor elke 45 mL van het supernatans dat virale, voeg 5 mL lentivirale bindoplossing, mix en Centrifugeer gedurende 10 min op > 5000 x g- en 4 ° C.
  8. Zorgvuldig bovendrijvende vloeistof verwijderen dus niet te verstoren de pellet.
  9. Toevoegen van 20-40 µL van medium en resuspendeer de pellet. Aliquot en winkel op -80 ° C.
  10. Om de lentivirale titer, een qPCR lentivirale titratie kit wordt gebruikt. Verdun 2 µL van gezuiverde virus in 500 µL van PBS. Voeg 2 µL van het verdunde virus aan 18 µL van virus lysis buffer (meegeleverd in de kit).
  11. Set van drie verschillende RT-q-PCR reacties in triplicates en labelen hen als virale lysate, positieve controle 1 (STD1) en 2 (STD2) als positieve controle. Voor elke reactie toevoegt, 12,5 µL van 2 x qPCR MasterMix, 2.5 µL van een virale lysate of STD1 (meegeleverd in de kit) of STD2 (meegeleverd in de kit) en 10 µL van reagens-mix (meegeleverd in de kit) in 0,2 mL PCR buizen.
  12. De PCR-programma als volgt instellen: 20 min op 42 ° C voor omgekeerde transcriptie, 10 min bij 95 ° C gedurende enzymactivering, 40 cycli van 15 s bij 95 ° C voor denaturatie en 1 minuut bij 60 ° C gedurende gloeien/extensie.
  13. Berekenen de virale titer met behulp van deze formule:
    Titer van virale lysate = 5 x 10, 7 / 2 3(Ctx-Ct1)/(Ct2-Ct1).
    CTX = gemiddelde Ct waarde van onbekende monster, Ct1 = gemiddelde waarde van STD1, Ct2 = gemiddelde waarde van STD2.
    Opmerking: CGNs kan worden best getransduceerde met lentivirussen of geïnfecteerd met adenovirussen afhankelijk van de modus van letsel bestudeerd. Toevoeging van lentivirussen bij een MOI voor 2-3 tot oplossing van de cultuur van de cel op het moment van beplating wordt gebruikt om te studeren NMDA geïnduceerde signalering op dag 7 van de cultuur. Dit resulteert in meer dan 80% transductie en is geschikt om na te streven met biochemische analysen van deze neuronen ( Figuur 2). Toevoeging van adenovirussen op dag 5 van cultuur (op MOI 50) en het bestuderen van de NMDA geïnduceerde signalering op dag 7-8 wordt gebruikt voor andere technieken, zoals beeldvorming. Deze behandeling leidt tot minder dan 10% infectie van neuronen, waardoor het ideaal is voor beeldvorming en co lokalisatie van eiwitten. Adenovirussen kunnen worden gebruikt op het moment van de beplating te bestuderen van celdood van DNA schade veroorzaakte door toevoeging van camptothecine op dag 2-3 of oxidatieve stress door toevoeging van waterstofperoxide. De aanwezigheid van eiwitten van de fluorescentie (GFP, RFP, GVB of YFP) gelabeld naar het gen van belang kan worden gebruikt om te schatten percentage transductie en potentiële toxiciteit. Met de aanbevolen MOI, zien we de toxiciteit van de minimale en maximale transductie ( Figuur 3).

5. Modelleren van neuronale schade

  1. voor het opwekken van NMDA geïnduceerde neuronale excitotoxicity, na 7 dagen in vitro, behandelen van CGNs met 100 µM NMDA en 10 µM glycine voor 1 h. vervangt alle het medium met geconditioneerde medium uit parallelle culturen met neen behandeling. Deze concentratie resulteert in de dood van de cel van 50% op 24 h na de behandeling ( Figuur 3 c). Mitochondriale fragmentatie blijkt op 6-8 uur na de behandeling (Zie Jahani-Asl et al. 26 , 27).
  2. om te induceren ROS-veroorzaakte celdood (oxidatieve stress), behandeling van neuroNS met 75-100 µM waterstofperoxide (H 2 O 2) en overschakelt naar geconditioneerd media van parallelle culturen na 5 minuten blootstelling aan H 2 O 2. Opmerking, als gevolg van de instabiliteit van de H 2 O 2, optimaliseren de concentratie tot een niveau dat 50-70% celdood in cultuur na 24 h behandeling induceert.
  3. Voor het opwekken van DNA schade veroorzaakte celdood, CGNs met 10 µM camptothecine behandelen. Deze concentratie induceert meer dan 50% van de celdood in 24 h. mitochondriale fragmentatie en vroege signalering van apoptotic vindt plaats van 2-3 h na toevoeging van camptothecine op deze concentratie (Zie Jahani-Asl et al. 18)
  4. wijzigen om te induceren lage K + geïnduceerde neuronale apoptosis in CGNs, medium met 25 mM K + te lage kalium media met 5 mM K + na 7 dagen in vitro.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Met zorgvuldige dissectie, moet de hersenen intact worden verwijderd met minimale schade, zoals te zien in figuur 1A-B. Inspanning moet worden genomen om het minimaliseren van schade aan de hersenen tijdens verwijderen, met name schade aan het cerebellum. Het cerebellum schadelijk maakt voor moeilijker identificatie en volledige verwijdering van de hersenvliezen, en verhoogt de kans op besmetting van de neuronale cultuur. Zodra de hersenvliezen zijn verwijderd, kan het cerebellum worden ontleed van het resterende weefsel, zoals te zien in Figuur 1 c en dissociatie voorbereid.

Voorafgaand aan de beplating, kan CGNs worden getransduceerde met lentivirus of geïnfecteerd met adenovirus zoals beschreven in Figuur 2. Maximale efficiëntie en minimaal toxiciteit met 50 van de MOI voor besmetting met adenovirus, en een MOI voor 2-3 vinden we op de dag van de beplating voor lentivirus (Figuur 3).

Getransduceerde gezonde CGN culturen op 7 DIV worden gepresenteerd in figuur 3A. Als grote aantallen glia aanwezig in de cultuur blijven, kan de concentratie van AraC worden verhoogd om ervoor te zorgen een zuivere neuronale bevolking. Ook gliale cellen nemen het virus gemakkelijker dan neuronen en die kritiek als de transductions worden uitgevoerd op dag 5 wordt. De aanwezigheid van neuronen ondergaan celdood kan worden beoordeeld door de vorming van pyknotische kernen, zoals te zien in Figuur 3 c. Alle concentraties van de NMDA, H2O2en camptothecine zijn geoptimaliseerd voor het veroorzaken van de dood van de cel van 50% na 24 h. Dit zorgt voor het bestuderen van andere vroege gebeurtenissen die voorafgaan aan de neuronale verlies zoals mitochondriale fragmentatie.

Figure 1
Figuur 1: verwijdering van muis hersenen en dissectie van cerebellum. (A) te halen van de hersenen van een 6-7 dagen oude muis, met behulp van een paar pincet, begrijpen van het hoofd en de huid anteriorly langs de gestippelde lijnen met behulp van een paar microdissection schaar te knippen. Wees voorzichtig met het knippen van alleen de huid en bindweefsel, te diep een ingesneden kan doorprikken van de schedel en de hersenen beschadigen. Deze drie incisies, direct langs de middellijn, en twee gebogen lateraal, toestaan voor de huid te worden geduwd terug onthullen de schedel. Zodra blootgesteld, kan de schedel worden gepenetreerd met het topje van de schaar, en knip anteriorly. Grote zorg moet worden genomen om niet te beschadigen het cerebellum ter vergemakkelijking van de identificatie en verwijdering van de hersenvliezen. Één keer knippen, kan pincet worden gebruikt om schil terug de schedel en de hersenen die vervolgens kan worden geplaagd uit bloot in cool dissectie oplossing met behulp van een paar pincet of spatel. Om het verwijderen van de hersenen, kan de oogzenuw moet worden verbroken. (B) zodra verwijderd van de schedel, de hersenvliezen moeten worden verwijderd uit het cerebellum met behulp van een paar fijne omver te werpen pincet. (C) met een paar fijne omver te werpen pincet, het cerebellum is ontleed van het resterende weefsel en gecontroleerd om ervoor te zorgen volledige verwijdering van de hersenvliezen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: modellering van neuronale schade in cerebellaire submodule neuronen. Geïsoleerde cerebella vanaf dag die 6-7 muizen zijn losgekoppeld in afzonderlijke cellen na de procedure in deel 3 gepresenteerd. Na dissociatie, cellen worden geteld en geresuspendeerde in een volume van voedingsbodems voor het genereren van 1.5 x 106 cells/mL.For 35 mm gerechten, 4 mL zijn verguld, geven van 6 x 106 cellen per plaat. Voor imaging-dia's, is 0,5 mL verguld, waardoor 7,5 x 105 cellen/well. CGNs kunnen dan worden getransduceerde met lentivirus of besmet met adenovirus. Met behulp van adenovirus op de dag van plating (0 dagen in vitro (DIV)) geeft meer dan 90% transfectie efficiëntie en zorgt voor de studie van neuronale schade door middel van oxidatieve stress en DNA-schade. De toevoeging van camptothecine van 10 µM (CPT) zal het induceren van DNA-beschadiging, terwijl 75-100 µM waterstofperoxide (H2O2) zal het induceren van oxidatieve stress. De concentratie van H2O2 moet worden geoptimaliseerd om de dood van de cel van 50% na 24 h. Infecteren met adenovirussen op 5 DIV geeft een lagere efficiëntie van de transductie van minder dan 10%. Bij 7 DIV kunnen NMDA-receptoren zijn verrijkt met de cultuur, neuronen behandeld worden met 100 µM NMDA en 10 µM glycine ertoe excitotoxicity. Dit is ideaal voor latere analyse imaging of het traceren van een enkel neuron. Tenslotte transducing met lentivirus op 0 DIV, gevolgd door behandeling met 100 µM NMDA en 10 µM glycine op 7 DIV, geeft de efficiëntie van een voldoende hoge signaaltransductie (> 80%) aan de biochemische analyse van de cultuur, inclusief ChIP sequencing, behandeling eiwit expressie, en het uitvoeren van leven/dood testen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: cerebellaire submodule neuronen. (A) neuronen waren getransduceerde met lentivirussen voor RFP op een MOI van 3 ten tijde van de beplating, vaste en gekleurd op 7 dagen in vitro. Colocalization van RFP signaal, MAP2, en Hoechst wordt weergegeven om aan te tonen van gezonde neuronen die zijn volledig getransduceerde door lentivirussen. (B) de afbeeldingen vertegenwoordigen levende dode assay analyses van neuronen geïnfecteerd met verschillende MOI, voor het meten van de toxiciteit. CGNs besmet met adenovirus uiting van LacZ bij een MOI tussen 25 en 50 zorgt voor maximale efficiëntie met behoud van minimaal toxiciteit. Minder dan een 1% verschil in overleving van de cel t.o.v. controle wordt gezien als infecteren op deze MOI. (C) Hoechst NMDA ertoe celdood kleuring van controle CGNs en CGNs behandeld. Opmerking de vorming van pyknotische kernen met NMDA behandeling. Dit is een indicatie van de dood van de cel, en kan worden gezien in ongeveer 50% van de cultuur 24 uur na behandeling met 100 µM NMDA en 10 µM Glycine. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Wij bieden hier een eenvoudige methode voor het kweken van primaire muisknop cerebellaire submodule neuronen (CGNs), verlies en aanwinst van functie studies, en modelleren van verschillende vormen van dood van de cel. Verschillende factoren beïnvloeden de reproduceerbaarheid van de resultaten met behulp van deze procedure waarvoor nauwlettend te worden gevolgd. Het gaat hierbij om de zuiverheid van de cultuur, waaronder de verwijdering van gliale cellen in de cultuur, de samenvloeiing van de cultuur, en het behoud van gezonde cellen. Invoering van variabiliteit in deze factoren kan vertekening van de resultaten en de reproduceerbaarheid uitdaging. Hieronder beschrijven we hoe om te minimaliseren van de factoren die negatief van invloed zijn op de resultaten.

We gebruiken om te elimineren gliale cellen uit de CGNs-cultuur en een zuivere neuronale bevolking, 10 µM van cytosine-β-arabino furanoside (AraC), een pyrimidine-antimetabolite dat delende cellen doodt door remming van de DNA synthese. Als er nog steeds een bevolking van gliale cellen aanwezig is, kan de concentratie van AraC worden verhoogd tot 15 µM. Dit is ook veel afhankelijk. Bovendien, voor de culturen die voor maximaal 7-8 dagen worden bijgehouden, kan een tweede AraC behandeling worden uitgevoerd op dag 3. Voor het verkrijgen van een zuivere neuronale bevolking en celdood te vermijden, is het belangrijk te schillen van alle de hersenvliezen uit het cerebellum vóór het snijden van het weefsel in stukjes, gevolgd door trypsinebehandeling. Dit moet gebeuren in een redelijk korte termijn (niet langer dan 7-10 min per cerebellum). De aanwezigheid van hersenvliezen in de neuronale cultuur leidt tot ongezonde cultuur en uiteindelijk celdood. Een andere factor die in de dood van neuronen voorafgaand aan de behandeling resulteren kan is de trypsinebehandeling tijd. Het is belangrijk dat de cellen niet overdreven trypsinized zijn. Aan de andere kant, vereist onder-trypsinebehandeling verdere mechanische dissociatie van de cellen die kunnen beschadigen of het resultaat in een lage opbrengst. Dus de trypsinebehandeling tijd vereist optimalisatie en het is heel erg afhankelijk.

De volgende factor beschouwd is de samenvloeiing van de cellen op het moment van gebruik. Verschillende confluentie kunt genereren variabiliteit in de resultaten. Dit is met name belangrijk is afhankelijk van de uitlezing in de experimenten. Met een lage samenvloeiing staat beginnen neuronen te klomp na 2-3 dagen. Een te laag of te hoog samenvloeiing staat van de neuronen schaadt signalering. Het is belangrijk om te tellen van het aantal levende cellen voor nauwkeurige plating.

Andere methoden van CGN culturen zijn beschreven, met name kijken naar basisprocedures kweken met behulp van een systeem van papaïne dissociatie kit 30 als goed als post kweken procedures en manipulatie van CGN te bestuderen van neuronale migratie en morfologie 31. Het protocol gepresenteerd door Lee et al. Beschrijving van het gebruik van de Kit papaïne dissociatie systeem. Zij adviseren twee methoden om de zuiverheid van de geïsoleerde CGNs: loopt de cellen door een verlopende scheiding van Percoll, evenals het vooraf plating op een plaat poly-D-Lysine voor 20 min. Beide methoden zijn om te helpen bij de scheiding van CGNs van gliale contaminanten. Dit wordt aanbevolen in het geval dat behandeling met AraC alleen is niet voldoende om te verrijken voor neuronale reincultuur. Bovendien, Lee maakt gebruik van 4-6 daagse oude muis pups, terwijl dit een effectief model dient voor de behandeling van neuronale differentiatie; Wij vinden het gebruik van CGNs van 6-7 dagen oude muis pups is meer geschikt voor de studie van neuronale schade. Holubowska et al. presenteert een protocol voor transfectie van post mitotische cerebellaire neuronen met behulp van het calciumfosfaat methode in vitro en electroporation in vivo. Dit zijn uitstekende methoden voor genetische manipulatie van neuronen waarin een enkel neuron kan worden getraceerd. De efficiëntie van de transfectie calciumfosfaat methode kan variëren van 0.1-5%. Daarom vinden we dat voor biochemische analyses, met inbegrip van ChIP-Seq analyses, Co-immunoprecipitation, en immunoblotting, gebruik van lentivirussen geschikter als het resulteert in meer dan 80% signaaltransductie bij getransduceerde op het moment van plating.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk wordt ondersteund door Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada en de Canadese instituten van gezondheidsonderzoek verleent aan A.J.-A.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
qPCR lentivitral titration kit  ABM #LV900
speedy virus purification solution  ABM #LV999
pCMV-dR8.2 Addgene #8455
pCMV-VS.VG Addgene #8454
Distilled water  Gibco #15230162
200 mM L-Glutamine  Gibco #25030081
35 mm Nunc culture dishes Gibco #174913
PowerUP SYBR green master mix life technologies #A25742
BSA V Solution Sigma Aldrich #A-8412
CaCl2 • 2H2O Sigma Aldrich #C-7902 
Camptothecin Sigma Aldrich #C-9911
Chicken Egg White Trypsin Inhibitor  Sigma Aldrich #10109878001
Cytosine beta-D-Arabino Furanoside Sigma Aldrich #C-1768
D-(+)-Glucose  Sigma Aldrich #G-7528
DNase1  Sigma Aldrich #11284932001
Eagle-minimal essential medium Sigma Aldrich #M-2279
Glycine Sigma Aldrich #G-5417
Heat inactivated dialyzed Fetal Bovine Serum  Sigma Aldrich #F-0392
Hepes Buffer  Sigma Aldrich #H-0887
Hydrogen peroxide Sigma Aldrich #216763
50 mg/mL Gentamycin  Sigma Aldrich #G-1397
MgSO4  Sigma Aldrich #M-2643
N-Methyl-D-aspartic acid Sigma Aldrich #M-3262
Phenol Red Solution  Sigma Aldrich #P-0290
Trypsin  Sigma Aldrich #T-4549
Lipofectamine 3000 Thermo Fisher Scientific L3000-008
p3000 enhancer reagent Thermo Fisher Scientific L3000-008
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
KCl  VWR #CABDH9258
NaCl  VWR #CABDH9286
NaH2PO4H2O  VWR #CABDH9298
Poly D-lysine  VWR #89134-858
DMEM Wisent #319-005-CL
FBS Wisent #080-450

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldowitz, D., Hamre, K. The cells and molecules that make a cerebellum. Trends in Neurosciences. 21 (9), 375-382 (1998).
  2. Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).
  3. Bilimoria, P. M., Bonni, A. Cultures of cerebellar granule neurons. CSH Protoc. , (2008).
  4. Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
  5. Burgoyne, R. D., Cambray-Deakin, M. A. The cellular neurobiology of neuronal development: the cerebellar granule cell. Brain Res. 472 (1), 77-101 (1988).
  6. Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annu Rev Neurosci. 18, 385-408 (1995).
  7. Evans, G. J. Synaptic signalling in cerebellar plasticity. Biol Cell. 99 (7), 363-378 (2007).
  8. Hunt, D. L., Castillo, P. E. Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 496-508 (2012).
  9. Arundine, M., Tymianski, M. Molecular mechanisms of calcium-dependent neurodegeneration in excitotoxicity. Cell Calcium. 34 (4-5), 325-337 (2003).
  10. Szydlowska, K., Tymianski, M. Calcium, ischemia and excitotoxicity. Cell Calcium. 47 (2), 122-129 (2010).
  11. Jahani-Asl, A., Germain, M., Slack, R. S. Mitochondria: joining forces to thwart cell death. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 162-166 (2010).
  12. Rego, A. C., Oliveira, C. R. Mitochondrial dysfunction and reactive oxygen species in excitotoxicity and apoptosis: implications for the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Neurochem Res. 28 (10), 1563-1574 (2003).
  13. Wei, M. C., et al. Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death. Science. 292 (5517), 727-730 (2001).
  14. Doyle, K. P., Simon, R. P., Stenzel-Poore, M. P. Mechanisms of ischemic brain damage. Neuropharmacology. 55 (3), 310-318 (2008).
  15. Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262 (5134), 689-695 (1993).
  16. Cole, K., Perez-Polo, J. R. Neuronal trauma model: in search of Thanatos. Int J Dev Neurosci. 22 (7), 485-496 (2004).
  17. Cheung, E. C., McBride, H. M., Slack, R. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of neuronal cell death. Apoptosis. 12 (5), 979-992 (2007).
  18. Jahani-Asl, A., et al. Mitofusin 2 protects cerebellar granule neurons against injury-induced cell death. J Biol Chem. 282 (33), 23788-23798 (2007).
  19. Gallo, V., Kingsbury, A., Balazs, R., Jorgensen, O. S. The role of depolarization in the survival and differentiation of cerebellar granule cells in culture. J Neurosci. 7 (7), 2203-2213 (1987).
  20. Miller, T. M., et al. Bax deletion further orders the cell death pathway in cerebellar granule cells and suggests a caspase-independent pathway to cell death. J Cell Biol. 139 (1), 205-217 (1997).
  21. Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation. Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).
  22. Piccioli, P., et al. Inhibition of nuclear factor-kappaB activation induces apoptosis in cerebellar granule cells. J Neurosci Res. 66 (6), 1064-1073 (2001).
  23. D'Mello, S. R., Galli, C., Ciotti, T., Calissano, P. Induction of apoptosis in cerebellar granule neurons by low potassium: inhibition of death by insulin-like growth factor I and cAMP. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (23), 10989-10993 (1993).
  24. Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (24), 7919-7923 (1982).
  25. Messer, A. The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture. Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).
  26. Jahani-Asl, A., et al. CDK5 phosphorylates DRP1 and drives mitochondrial defects in NMDA-induced neuronal death. Hum Mol Genet. 24 (16), 4573-4583 (2015).
  27. Jahani-Asl, A., et al. The mitochondrial inner membrane GTPase, optic atrophy 1 (Opa1), restores mitochondrial morphology and promotes neuronal survival following excitotoxicity. J Biol Chem. 286 (6), 4772-4782 (2011).
  28. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
  29. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. (32), (2009).
  30. Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), (2009).
  31. Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. (85), (2014).

Tags

Neurowetenschappen kwestie 129 Cerebellum cerebellaire submodule neuronen (CGN) Adenovirus lentivirale signaaltransductie Excitotoxicity N-methyl-D-aspartaat (NMDA) Apoptosis kaliumchloride (KCl) camptothecine waterstof peroxide (H2O2)
Modelleren van neuronale dood en degeneratie in muis primaire cerebellaire submodule neuronen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Laaper, M., Haque, T., Slack, R. S., … More

Laaper, M., Haque, T., Slack, R. S., Jahani-Asl, A. Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons. J. Vis. Exp. (129), e55871, doi:10.3791/55871 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter