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Neuroscience

Modélisation de la mort neuronale et la dégénérescence de neurones granules primaires de cervelet de souris

Published: November 6, 2017 doi: 10.3791/55871
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1,2,4
1Lady Davis Institute for Medical Research, Jewish General Hospital, 2Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 3Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa, 4Department of Oncology, Faculty of Medicine, McGill University

Summary

Ce protocole décrit une méthode simple pour isoler et cultiver les neurones de granule cérébral de souris primaire (SCT) de petits 6-7 jours vieux, transduction efficace du SCT pour la perte et gain d’études de fonction et modélisation excitotoxicité neuronale induite par le NMDA, la mort cellulaire induite par la basse-potassium, lésions de l’ADN et le stress oxydatif en utilisant le même modèle de culture.

Abstract

Neurones cérébelleux granule (SCT) sont un modèle neuronal fréquemment utilisé, formant une abondante population homogène dans le cervelet. Compte tenu de leur développement après l’accouchement, l’abondance et l’accessibilité, SCT est un modèle idéal pour étudier les processus neuronaux, y compris le développement neuronal, la migration neuronale et la stimulation de l’activité neuronale physiologique. En outre, cultures CGN fournissent un excellent modèle pour l’étude des différents modes de mort cellulaire, y compris l’excitotoxicité et l’apoptose. Moins d’une semaine dans la culture, SCT exprime des récepteurs N-méthyl-D-aspartate (NMDA), un récepteur de glutamate ionotropiques spécifiques avec de nombreuses fonctions essentielles de santé neuronale et la maladie. L’ajout de faibles concentrations de NMDA en conjonction avec la dépolarisation de la membrane pour rongeurs cultures primaires de CGN a été utilisée pour modéliser la stimulation de l’activité neuronale physiologique tandis que l’ajout de concentrations élevées de NMDA peut être employée pour modéliser lésions neuronales excitotoxiques. Ici, une méthode d’isolement et de culture du SCT de chiots âgés de 6 jours ainsi que la manipulation génétique du SCT par adénovirus et lentivirus sont décrits. Nous avons également présents protocoles optimisés sur la façon de stimuler l’excitotoxicité induite par le NMDA, l’apoptose induite par la basse-potassium, stress oxydatif et lésions de l’ADN après transduction de ces neurones.

Introduction

Neurones cérébelleux granule (SCT) sont bien caractérisés en culture et ont servi comme un modèle efficace pour étudier la mort neuronale et développement 1,2,3,4,5, 6. l’expression précoce des récepteurs N-méthyl-D-aspartate (NMDA) en CGN cultures in vitro rend un modèle attrayant pour étudier NMDA induite par la signalisation. L’activation de ces récepteurs NMDA en conjonction avec la dépolarisation de la membrane est utilisée pour modéliser la stimulation de l’activité neuronale physiologiques et a permis pour la recherche sur les mécanismes de la plasticité synaptique 7,8. Au contraire, une stimulation excessive de ces récepteurs par ligand NMDA peut être utilisée pour modéliser l’excitotoxicité, des principaux mécanismes de la perte neuronale dans l’aigu des lésions cérébrales et neurodégénératives maladies 9. Un mécanisme pour l’induction de l’excitotoxicité est par famine ATP en oxygène réduite, comme on le voit avec les lésions neuronales aiguës. Cela se traduit par une dépolarisation membranaire et des concentrations élevées de glutamate de sortie au niveau de la synapse. La surstimulation subséquente du récepteur NMDA par élevés de glutamate provoque Ca2 + afflux excessif par l’intermédiaire de ces récepteurs, qui à son tour active plusieurs voies y compris Ca2 +-activation de protéases, phospholipases, et endonucléases, entraînant la dégradation incontrôlée des composantes cellulaires essentielles et mort cellulaire. En outre, haute intracellulaire Ca2 + conduit à la génération de radicaux libres d’oxygène et mitochondriale dommages 10,11.

Bien que la majorité de la perte neuronale suite excitotoxicité neuronale induite par le NMDA est due à l’influx de calcium et Bax/Bak indépendant, les autres mécanismes de mort cellulaire ne peuvent être exclus de ce modèle. L’apparition des deux nécrotiques et apoptose comme la mort cellulaire en raison de l’excitotoxicité est partiellement due à la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et des lésions de l’ADN provoquée par le haut intracellulaire Ca2 + niveaux 12. Dommages à l’ADN se traduit par la mort neuronale par le biais de mécanismes apoptotiques, étant en corrélation avec les caractéristiques de la mort cellulaire par apoptose, comme l’apparition de masses de chromatine et corps apoptotiques. Induction de l’apoptose est médiée par la libération du cytochrome c par la mitochondrie et s’est avérée être tributaire de Bax/Bak oligomérisation 13. Bax/Bak oligomérisation favorise la formation de pores dans la membrane mitochondriale externe, aboutissant à la libération du cytochrome c et l’activation de pro-apoptotic régulateurs comme on le voit avec une lésion ischémique doux 14.

Génération de ROS est un problème important dans le cerveau en raison du faible niveau endogène d’antioxydants, couplés avec l’exigence d’oxygène importante pour fonctionnement neuronal 15. Lorsqu’il est exposé à un événement ischémique, l’oxyde nitrique synthase est augmentée, production d’oxyde nitrique et d’espèces réactives de l’oxygène 14. L’augmentation de la concentration des radicaux d’oxygène peut entraîner des dommages à l’ADN et indirectement provoquer famine énergétique. Des niveaux élevés de cassures double brin de l’ADN sont corrigées par l’activation de poly ADP-ribose polymérase 1 (PARP-1), une protéine de la chromatine lié aux eucaryote responsable de catalyser le transfert d’unités d’ADP-ribose de NAD+, un processus faisant partie intégrante de Réparation de l’ADN 16. Cependant, avec des dommages excessifs à cause du stress oxydatif, activation de PARP-1 peut provoquer famine énergétique en raison de la vidange accrue sur NAD+, de substrat nécessaire à la production d’ATP par phosphorylation oxydative. En fin de compte, le stress oxydatif va déclencher l’apoptose d’une manière dépendante de Bax/Bak conduisant à la libération du cytochrome mitochondrique c et a été montré pour induire le remodelage mitochondriale dans SCT 17.

Enfin, les variations de concentration de chlorure de potassium (KCl) dans les cultures de la CGN peuvent être utilisées pour modéliser les bas potassium/dépolarisation médiée par apoptose 18,19,20. Lorsqu’ils sont exposés à de faibles concentrations de K+, SCT subissent des changements physiologiques distincts, ce qui entraîne des réductions de la respiration mitochondriale et la glycolyse, attribuée à la réduction de la demande cellulaire 21, ainsi que réduction des niveaux de facteur nucléaire-κB (NFκB) qui réglemente les activités, notamment l’inflammation et la transmission synaptique, 22. Ce modèle est particulièrement intéressant pour l’étude de la mort cellulaire au cours du développement neuronal. L’environnement K+ faible plus étroitement ressemble à des conditions physiologiques et provoque des signes de mort cellulaire vu au cours du développement neuronal 23.

En résumé, le SCT fournit un modèle depuis longtemps afin d’étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents de la mort neuronale et la dégénérescence. Le protocole suivant permettra d’isolement et culture du SCT, expression ou la répression d’une voie génétique particulière à l’aide de virus et l’induction de la mort neuronale par des mécanismes différents représentant la dégénérescence et les lésions neuronales.

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Protocol

ce protocole est basé sur les modifications des procédures qui ont été décrits précédemment 18 , 24 , 25 , 26 , 27. le présent protocole est approuvé par le Comité de protection de l’Animal à l’Université McGill.

1. préparation expérimentale

Remarque : les solutions courantes suivantes peuvent être préparées et maintenues jusqu'à l’utilisation.

  1. Solution de dissection
    1. dissoudre 3,62 g de chlorure de sodium (NaCl), 0,2 g de chlorure de potassium (KCl), 0,069 g de phosphate de sodium (NaH 2 PO 4 ∙ H 2 O) et 1,306 g de D-(+)-Glucose dans 500 mL de distillée H 2 O. Puis ajoutez 12,5 mL de tampon HEPES, 450 µL de solution de rouge de phénol et 20 mL de sab fraction V à la solution. Ajuster le pH 7,4 en utilisant 1 N d’hydroxyde de sodium (NaOH).
    2. Stériliser avec 0,22 µm filtre et conserver à 4 ° C. Cette solution reste stable pendant une semaine à 10 jours.
  2. La trypsine
    1. préparer une solution à une concentration de 25 g/L de la trypsine dans le chlorure de sodium 0,9 %. Conserver la solution à -20 ° C.
  3. Inhibiteur de la trypsine
    1. préparer un stock avec une concentration de 10 mg/mL dissoudre 1 g de l’inhibiteur de la trypsine de blanc d’oeuf de poulet dans 100 mL d’HCl. magasin de 1 mM, cette solution à -20 ° C.
  4. DNase
    1. dissoudre 100 mg de DNase 1 dans 10 mL d’eau stérile pour générer un stock de 10 mg/mL. Conserver la solution à -20 ° C.
  5. MgSO 4
    1. Ajouter 6,02 g de sulfate de magnésium (MgSO 4) dans 50 mL d’eau distillée (H 2 O) pour générer un stock de 1 M. Conserver la solution à 4 ° C.
  6. CaCl 2
    1. dissoudre 0,735 g de chlorure de calcium (CaCl 2 ∙ 2 H 2 O) dans 50 mL de distillée H 2 O à une concentration de stock de 100 mM. Conserver la solution à 4 ° C.
  7. KCl
    1. dissoudre 3.7275 g de KCl dans 50 mL d’eau distillée H 2 O à une concentration de stock de la solution de boutique de 1 M. à 4 ° C.
  8. D-(+)-Glucose
    1. dissoudre 1,802 g de D-(+)-glucose dans 50 mL d’eau distillée H 2 O à une concentration de stock de 100 mM. Conserver la solution à 4 ° C.
  9. Milieux de Culture cellulaire
    1. préparer des milieux de culture cellulaire comme suit : 5 mL de chaleur inactivé dialysée sérum de veau fœtal, ajouter 500 µL de 200 mM de L-Glutamine, 100 µL de 50 mg/mL de gentamycine et 1 mL de KCL à 1,0 M à 45 mL du filtre stérilisé Eagle ' minimal médias essentiel s (E-MEM) qui est additionné de 1,125 g/L de D-Glucose pour produire 50 mL de milieux de culture pour le neurone granule cérébelleux. Entreposer le milieu à 4 ° C.
  10. Furanoside bêta-D-Arabino cytosine
    1. dissoudre 48 mg de furanoside bêta-D-arabino cytosine dans 10 mL de milieu de culture à une concentration de stock de 20 mM. Stocker la solution à -20 ° C.
  11. Poly-D-Lysine
    1. pour générer un poly de 2 mg/mL stock D-lysine, ajouter 10 mL de stérile H 2 O à 20 mg de poly D-lysine. Poly stock D-lysine doit être conservé à-80 ° C dans 100 µL d’extraits.
  12. Remarque : les solutions suivantes doivent être préparées avant la dissection et maintenues à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.
  13. MgSO 4 complété Dissection Solution
    1. Ajouter 300 µL de stock MgSO 4 à 250 mL de solution de dissection.
  14. Solution de trypsine Dissection
    1. Ajouter 100 µL de trypsine stock et 12 µL de stock MgSO 4 à 10 mL de solution de dissection.
  15. Inhibiteur de trypsine Solution 1
    1. 164 ajouter µL d’inhibiteur de la trypsine stock, 250 µL de stock DNase 1 et 12 µL de stock MgSO 4 à 10 mL de solution de dissection.
  16. Inhibiteur de trypsine Solution 2
    1. Ajouter 1040 µL d’inhibiteur de la trypsine stock, 750 µL de stock DNase 1 et 12 µL de stock MgSO4 à 10 mL de solution de dissection.
  17. CaCl 2 complété solution dissection
    1. Ajouter 10 µL de stock CaCl 2 et 25 µL de stock MgSO 4 à 10 mL de solution de dissection.
  18. Poly D-Lysine enduite Pétri
    1. pour enrober Pétri, diluer 100 µL de poly stock D-lysine dans 40 mL de stérile H 2 O. Pour les récipients de culture Nunc 35 mm, ajouter 2 mL de poly dilué solution D-Lysine. Pour 4 assiettes bien, ajouter 300 µL de poly dilué D-Lysine dans chaque cupule.
    2. Laissez la poly D-lysine se reposer pendant 1 h avant d’aspirer et laver chacun bien avec 4 mL ou 600 µL (pour 35 mm culture plats ou 4 assiettes bien, respectivement) de stérile H 2 O. Puis aspirer l’H 2 O et laissez la vaisselle l’air sec pendant 1 h.

2. Extraction et Isolation de cervelet de cerveau

  1. Decapitate par jour 6-7 vieux chiot de souris à l’aide de ciseaux de décapitation. Effectuer la dissection du cerveau dans une hotte stérile vitroplants.
  2. Pour retirer le cerveau, saisissez la tête à l’aide d’une paire de pinces et couper à travers la peau vers la partie antérieure de la tête à l’aide de ciseaux de microdissection comme illustré à la Figure 1. Ensuite, couper à travers l’os du crâne à l’aide d’une nouvelle paire de ciseaux pour minimiser les risques de contamination. Supprimer le crâne couvrant le cerveau à l’aide de pinces et de cerner le cerveau à l’aide de pinces ou une spatule.
    1. Au besoin, couper à travers le nerf optique pour faciliter le sortir du cerveau dans son ensemble.
  3. Placer le cerveau dans la solution de dissection qui est additionnée de MgSO 4. Garder la solution et le cerveau sur glace
  4. Qui suit enlèvement, sous un microscope à dissection du cerveau, disséquer sur le cervelet du cerveau tout en restant dans la solution de dissection MgSO 4 complété et supprimer les méninges à l’aide de pinces fines. Tourner le cervelet à sa face ventrale et assurer le retrait du plexus choroïde.
  5. Centraliser le sembable dans un plat de 35 mm ~ 1 ml de solution de dissection MgSO 4 complété.
  6. Couper le tissu en petits morceaux et transvaser dans un tube de 50 mL contenant 30 mL de solution de dissection MgSO 4 tamponnée.

3. Souris cérébelleux Granule neurone isolement et Culturing

  1. Centrifuger le tube de 50 mL contenant le tissu cérébral haché pendant 5 min, 644 x g, 4 ° C.
  2. Enlever le surnageant et ajouter 10 mL de solution de dissection de la trypsine. Puis secouer le tube à haute vitesse pendant 15 min à 37 ° C.
  3. Ajouter 10 mL de solution d’inhibiteur de trypsine 1 pour le tube et balancez doucement pendant 2 min.
  4. Centrifuger le tube pendant 5 min, 644 x g, 4 ° C.
  5. Enlever le surnageant et ajouter 2 mL de solution d’inhibiteur de trypsine 2 et puis transférez dans un tube de 15 mL.
  6. Triturer le tissu dans le tube de 15 mL jusqu'à ce que la solution devient trouble. Alors, que se contenter de 5 min.
  7. Enlever le surnageant clair et transférer le surnageant dans un nouveau tube contenant 1 mL de solution de dissection CaCl 2 complétée.
  8. Ajouter un autre mL de solution d’inhibiteur de trypsine 2 au fond du tube contenant le culot à l’étape 3.6. Broyer à nouveau et laisser s’installer pour 5 min. Retirez le surnageant et ajoutez-le dans le tube contenant le liquide surnageant de l’étape 3,7 (qui est une répétition des étapes 3,6 à 3,7). Répétez ce processus jusqu'à ce que la plupart des tissus est dissocié mécaniquement.
  9. Ajouter 0,3 mL de CaCl 2 complété solution de dissection à la collection surnageante pour chaque mL du surnageant.
  10. Mélanger le contenu du tube et centrifuger pendant 5 min à 644 x g.
  11. Enlever le surnageant et ajouter 10 mL de supports neufs au culot et mélanger.
  12. Cellules peuvent ensuite être comptés et diluées à une concentration de 1,5 x 10 6 cellules/mL. Veuillez noter que, en général, 10 millions de cellules sont attendus de chaque cerveau disséqué, tributaire de la trypsinisation et réduit son efficacité de dissection. Plaque de cellules sur des plaques de poly déjà faites D-lysine. Pour les plaques de 4 puits, plaque de 0,5 mL, donnant 7,5 x 10 5 cellules par puits. Pour les plats de 35 mm, plaque 4 mL, ce qui donne 6 x 10 6 cellules / plaque.
  13. Après 24 h, ajouter furanoside arabino-β-cytosine (AraC) aux plaques pour réduire la contamination gliale. Pour chaque mL de médias 0,5 µL de 20 mM AraC est requise. Ajout de l’AraC ne nécessite pas un changement de support. Si les cellules doivent être conservés pendant 7-8 jours, répétez ce traitement au jour 3.
  14. Maintenir les cultures dans un 5 % CO 2 incubateur à 37 ° C et se nourrissent avec 100 µL de 100 mM de glucose ajoutée à la culture pour tous 2 mL de médias depuis 5 jours tous les 2 jours. Un changement de support complet n’est pas nécessaire.

4. Emballage de lentivirus, de Purification et de titrage

Remarque : le protocole pour l’emballage, la concentration, la purification et la titration des lentivirus a déjà été décrite en détail sans l’utilisation d’un kit 28, y compris des méthodes alternatives pour le titrage, tels que l’écoulement cytometry 29. Nous présentons ici brièvement le protocole utilisé dans notre laboratoire pour la production de lentivirus pour étudier les lésions neuronales à l’aide de la solution de purification de virus rapide et un kit de titrage des gènes de qPCR.

  1. Cellules Hek293T de plaque dans les récipients de culture de 10 cm avec Dulbecco ' s modified Eagle ' s milieu essentiel minimal (DMEM) additionné de 10 % FBS. Pour l’obtention d’un titre viral élevé, croître au moins 5 plaques de cellules Hek293T pour chaque transfection. S’assurer que le jour des cellules de transfection sont 70 % anastomosé. Changer de média trois heures avant la transfection.
  2. Pour chaque transfection, préparer deux tubes. Dans le tube 1 ajouter 1,5 mL de milieu de sérum MEM-réduit et 41 µL de réactif de transfection, bien mélanger. Dans le tube 2, ajouter 1,5 mL de médias de sérum MEM-réduit et 6 µg de plasmide de transfert, 6 µg du CMVp-dR8.2 vecteur (plasmide d’emballage), 3 µg CMVp-VSV-G vecteur (plasmide enveloppe) et 35 µL de réactif de renforceur p3000 (livré avec lipofectamine). Mélangez bien et combiner tubes 1 et 2, vortex et incuber pendant 15 min.
  3. Supprimer 50 % des médias de Hek293T plaques et ajouter des complexes ADN-lipidiques aux cellules. Incuber pendant 6 heures à 37 ° C, 5 % de CO 2. Retirez les supports et remplacer par 5 mL de DMEM fraîche, incuber pendant la nuit.
  4. À 24 h après transfection, recueillir le premier lot de surnageant viral de chaque plaque. Gardez les médias virales à 4 ° C et ajouter 5 mL de supports neufs dans chaque boîte de cellules Hek293T. Incuber pendant la nuit.
  5. 48 h après transfection, recueillir le deuxième lot de surnageant viral, combinez-le avec le premier lot et centrifuger combiné surnageant viral pendant 10 min à 600 x g.
  6. Filtrer le liquide surnageant à travers un filtre avec 45 µm taille de pore.
  7. Purifier le virus à l’aide d’une solution de purification rapide de virus. Pour chaque 45 mL du surnageant viral, ajouter 5 mL de solution de liaison des gènes, mix et centrifugation pendant 10 min à > 5 000 x g et 4 ° C.
  8. Enlever le surnageant avec précaution pour ne pas déranger le culot.
  9. Ajouter 20-40 µL de milieu et remettre en suspension l’extrait concentré. Aliquote et les conserver à -80 ° C.
  10. Pour obtenir le titre des gènes, un kit de titrage des gènes de qPCR est utilisé. Diluer 2 µL de virus purifié dans 500 µL de PBS. Ajouter 2 µL du virus dilué à 18 µL de tampon de lyse de virus (fourni dans le kit).
  11. Ensemble à trois différentes réactions de q-RT-PCR dans triplicates et l’étiquette comme contrôle viral de lysat, positif 1 (STD1) et contrôle positif 2 (STD2). Pour chaque réaction ajouter, 12,5 µL de 2 x qPCR MasterMix, 2,5 µL de soit virale lysat ou STD1 (fourni dans le kit) ou STD2 (fourni dans le kit) et 10 µL de réactif-mix (fourni dans le kit) en tubes PCR de 0,2 mL.
  12. Définir le programme de la PCR comme suit : 20 min à 42 ° C pour la transcription inverse, 10 min à 95 ° C pour l’activation de l’enzyme, 40 cycles de 15 s à 95 ° C pour la dénaturation et à 1 min à 60 ° C pour le recuit et l’extension.
  13. Calculer le titre viral en utilisant cette formule :
    Titre du viral lysat = 5 x 10, 7 / 2 3(Ctx-Ct1)/(Ct2-Ct1).
    CTX = valeur Ct moyenne d’échantillon inconnu, Ct1 = valeur moyenne de STD1, Ct2 = valeur moyenne de STD2.
    NOTE : SCT peuvent être mieux transduite avec lentivirus ou infectés avec les adénovirus selon le mode de l’étude des blessures. Ajout de lentivirus à un MOI de 2-3 à la solution de culture cellulaire au moment de l’électrodéposition est utilisé pour étudier le NMDA induit signalisation au 7e jour de la culture. Cela se traduit par plus de 80 % la transduction et convient de poursuivre avec des analyses biochimiques de ces neurones ( Figure 2). Ajout des adénovirus au jour 5 de culture (chez MOI 50) et d’étudier la NMDA induit signalisation à jour 7-8 est utilisé pour d’autres techniques comme l’imagerie. Ce traitement entraîne moins de 10 % infection des neurones, ce qui est idéal pour l’imagerie et la co-localisation des protéines. Adénovirus peuvent servir au moment de l’électrodéposition d’étudier l’ADN des dommages induits par la mort cellulaire par addition de camptothécine au jour 2-3 ou un stress oxydatif par addition d’eau oxygénée. La présence de protéines de fluorescence (GFP, DP, PCP ou YFP) taggée pour le gène d’intérêt peut servir à estimer le pourcentage transduction et la toxicité potentielle. Avec le ministère de l’intérieur recommandée, nous voyons la toxicité minimale et maximale transduction ( Figure 3).

5. Modélisation des lésions neuronales

  1. pour induire la NMDA induit l’excitotoxicité neuronale, après 7 jours in vitro, traiter SCT avec 100 µM NMDA et glycine 10 µM pour 1 h. remplacer tous le milieu par milieu conditionné de cultures parallèles avec no traitement. Cette concentration entraîne la mort cellulaire de 50 % à 24h post traitement ( Figure 3). Fragmentation mitochondriale est évidente au post-traitement de 6 à 8 heures (voir Jean-Asl et al. 26 , 27).
  2. pour induire la mort cellulaire induite par le ROS (stress oxydatif), traiter les neuroNS avec 75-100 µM peroxyde d’hydrogène (H 2 O 2) et les interrupteurs à conditionné médias de cultures parallèles après une exposition de 5 min à 2 H 2 O. Remarque, en raison de l’instabilité de l’H 2 O 2, optimiser la concentration à un niveau qui induit la mort des cellules en culture après 24 h de traitement 50-70 %.
  3. Pour induire l’ADN endommager la mort cellulaire induite, traiter le SCT avec 10 µM camptothécine. Cette concentration induit plus que la mort cellulaire de 50 % en 24 h. fragmentation mitochondriale et signalisation d’apoptose précoce produit 2-3 h après l’addition de camptothécine à cette concentration (voir Jean-Asl et al. 18)
  4. pour induire la faible K + induit l’apoptose neuronale au SCT, changer les milieux contenant 25 mM K + de médias de potassium faible avec 5 mM K + après 7 jours in vitro.

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Representative Results

Avec dissection minutieuse, le cerveau intact doit être retiré avec un minimum de dommages, comme le montre la Figure 1 a-B. Effort devrait être prise pour minimiser les dommages au cerveau pendant l’enlèvement, en particulier dommages au cervelet. Endommager le cervelet fait pour compliquer l’identification et l’élimination complète des méninges et augmente la probabilité de contamination de la culture neuronale. Après ont enlevé les méninges, le cervelet peut être disséqué par le tissu restant, comme on le voit dans la Figure 1 et préparé pour la dissociation.

Avant la culture, le SCT peut être transduites avec lentivirus ou infectées par l’adénovirus comme décrit à la Figure 2. Nous trouvons une efficacité maximale et une toxicité minimale avec MOI 50 pour l’infection par l’adénovirus et un MOI de 2-3 jour de placage pour lentivirus (Figure 3).

Transduite cultures saines de CGN au DIV 7 sont présentées dans la Figure 3 a. Si un grand nombre de cellules gliales reste présent dans la culture, la concentration de l’AraC peut être augmentée afin d’assurer une population neuronale pure. Également des cellules gliales occupent le virus plus facilement que les neurones et qui devient critique si les transductions sont effectuées au jour 5. La présence de neurones subissant la mort cellulaire peut être évaluée par la formation des noyaux pycnotiques comme on le voit dans la Figure 3. Toutes les concentrations de la NMDA, H2O2et camptothécine sont optimisés pour induire la mort cellulaire de 50 % après 24 h. Cela permet d’étudier les autres premiers événements qui précèdent la perte neuronale telles que la fragmentation mitochondriale.

Figure 1
Figure 1 : retrait du cerveau de souris et la dissection du cervelet. (A) pour extraire le cerveau de souris vieux de 6-7 jours, à l’aide d’une paire de pinces, saisissez la tête et couper la peau vers l’avant le long des pointillés à l’aide d’une paire de ciseaux de microdissection. Veillez à couper uniquement la peau et du tissu conjonctif, trop profond, une incision peut perforer le crâne et endommagent le cerveau. Ces trois incisions, tout droit le long de la ligne médiane et deux courbant latéralement, permettant à la peau d’être poussé en arrière révélant le crâne. Une fois exposé, le crâne peut être pénétré avec la pointe des ciseaux et couper vers l’avant. Il faut en grand ne pas à endommager le cervelet pour faciliter l’identification et l’élimination des méninges. Une fois coupé, pinces peuvent servir à peler le crâne, exposant le cerveau qui peut ensuite être taquiné dans la solution de dissection cool à l’aide d’une paire de pinces ou d’une spatule. Afin d’éliminer le cerveau, le nerf optique devrez peut-être être retranché. (B) une fois séparées du crâne, les méninges devraient être supprimées dans le cervelet à l’aide d’une paire de pinces à pointe fine. (C) l’aide d’une paire de pinces à pointe fine, le cervelet est disséquée des tissus restants et inspectée pour s’assurer de l’élimination complète des méninges. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : modélisation d’une lésion neuronale dans les neurones granulaires cérébelleux. Sembable isolé du jour que 6-7 souris sont dissociées en cellules individuelles suivant la procédure présentée dans la partie 3. Après dissociation, les cellules sont comptées et remis en suspension dans un volume de milieux de culture pour générer 1,5 x 106 cells/mL.For des 35 plats mm, 4 mL sont plaqués, donnant 6 x 106 cellules / plaque. Des images de diapositives, 0,5 mL est plaqué, donnant 7,5 x 105 cellules/puits. SCT peut ensuite être transduites avec lentivirus ou infectées par l’adénovirus. À l’aide d’adénovirus le jour du placage (0 jours in vitro (DIV)) donne plus de 90 % efficacité de transfection et permet l’étude des lésions neuronales par le stress oxydatif et les dommages à l’ADN. L’addition de 10 µM camptothécine (CPT) va entraîner des lésions de l’ADN, tandis que 75 à 100 µM peroxyde d’hydrogène (H2O2) va entraîner un stress oxydatif. La concentration de H2O2 doit être optimisée pour induire la mort cellulaire de 50 % après 24 h. Infecter avec les adénovirus à DIV 5 donne une efficacité plus faible de la transduction de moins de 10 %. À 7 DIV lorsque les récepteurs NMDA sont enrichis dans la culture, les neurones peuvent être traitées avec 100 µM NMDA et glycine 10 µM pour induire l’excitotoxicité. C’est idéal pour l’imagerie analyse subséquente ou en traçant un seul neurone. Enfin, transduction avec lentivirus à DIV 0, suivi en traitant avec 100 µM NMDA et 10 glycine µM à 7 DIV, donne une efficacité de transduction suffisamment élevée (> 80 %) pour permettre une analyse biochimique de la culture, y compris la puce séquençage, examinant expression de la protéine et effectuer des essais de vivre/morts. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : neurones granulaires cérébelleux. (A) les neurones étaient transduites avec lentivirus pour appel d’offres à un MOI de 3 au moment de l’ensemencement et fixés et colorés à 7 jours in vitro. Colocalisation de signal DP, MAP2 et Hoechst est montrée pour démontrer les neurones sains qui sont entièrement transduites par lentivirus. (B) les images représentent des analyses de dosage morts vivants des neurones infectés par différente MOI, pour mesurer la toxicité. SCT infectées par l’adénovirus exprimant LacZ à un MOI entre 25 et 50 permet pour une efficacité maximale tout en conservant la toxicité minimale. Moins qu’une différence de 1 % de la survie des cellules par rapport au contrôle est visible lorsque infectant à ce MOI. (C) Hoechst coloration de contrôle SCT et SCT traités par NMDA pour induire la mort cellulaire. Notez la formation des noyaux pycnotiques avec traitement NMDA. C’est révélateur de la mort cellulaire et peut être vu dans environ 50 % de la culture 24 h après le traitement avec 100 µM NMDA et 10 µM Glycine. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

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Discussion

Nous fournissons ici une méthode simple pour la mise en culture de neurones granule cervelet de souris primaire (SCT), de perte et de gain d’études de fonction et la modélisation des différents mécanismes de mort cellulaire. Plusieurs facteurs affectent la reproductibilité des résultats à l’aide de cette procédure qui nécessitent une surveillance étroite. Il s’agit de la pureté de la culture, y compris l’élimination des cellules gliales dans la culture, à la confluence de la culture et de maintenir les cellules en bonne santé. Introduction de la variabilité de ces facteurs peut biaiser les résultats et contester la reproductibilité. Ci-dessous, nous décrivons comment réduire au minimum les facteurs qui affectent négativement les résultats.

Pour éliminer les cellules gliales de la culture de la SCT et établir une population neuronale pure, nous utilisons 10 µM de cytosine-β-arabino furanoside (AraC), un antimétabolite pyrimidine qui tue les cellules en prolifération en inhibant la synthèse de l’ADN. S’il y a toujours une population de cellules gliales présentes, la concentration de l’AraC peut être augmentée à 15 µM. C’est aussi beaucoup dépendant. En outre, pour les cultures qui sont maintenues jusqu'à 7-8 jours, un second traitement AraC peut être effectué au jour 3. Pour obtenir une population neuronale pure et éviter la mort des cellules, il est important d’éplucher tous les méninges hors du cervelet avant de couper le tissu en morceaux, suivie par trypsinisation. Cela devrait se faire dans un délai relativement court de temps (pas plu de 7-10 min par cervelet). La présence des méninges dans la culture neuronale entraîne la culture malsaine et finalement la mort cellulaire. Un autre facteur qui pourrait entraîner la mort des neurones avant le traitement est le temps de la trypsinisation. Il est important que les cellules ne sont pas trop trypsinisés. En revanche, en vertu de la trypsinisation nécessite plue mécanique dissociation des cellules qui peuvent les endommager ou résulte en un faible rendement. Par conséquent, le temps de la trypsinisation nécessite optimisation et c’est beaucoup de dépendant.

Le prochain facteur à considérer est la confluence des cellules au moment de l’utilisation. Confluence de différente peut générer la variabilité dans les résultats. Ceci est particulièrement important selon la lecture dans les expériences. Avec un État faible confluence, les neurones commencent à s’agglutiner après 2-3 jours. Un état de confluence trop basse ou trop élevée des neurones altère la signalisation. Il est important de compter le nombre de cellules vivantes pour l’électrodéposition précise.

Autres méthodes de cultures de la CGN ont été décrits, surtout en regardant les procédures élémentaires de culture à l’aide d’un système de Dissociation de la papaïne kit 30 comme bien aussi après culture de procédures et de manipulation de la CGN afin d’étudier la migration neuronale et morphologie, 31. Le protocole présenté par Lee et al. décrit l’utilisation de la trousse de système de Dissociation de papaïne. Ils recommandent deux méthodes pour augmenter la pureté de la SCT isolé : les cellules en cours d’exécution grâce à une séparation de gradient de Percoll, mais aussi de pré-revêtement sur une plaque de poly-D-Lysine pendant 20 min. Les deux méthodes sont pour aider à la séparation du SCT de contaminants gliales. Ceci est recommandé en cas de traitement par AraC seul ne suffit pas à enrichir pour pure culture neuronale. En outre, Lee utilise des souriceaux de 4 à 6 jours vieux, tandis que cela sert un modèle efficace pour l’examen de la différenciation neuronale ; nous trouvons à l’aide de SCT de souriceaux 6-7 jours vieux est plus approprié pour l’étude des lésions neuronales. Holubowska et coll. présente un protocole de transfection de post mitotiques neurones cérébraux utilisant le phosphate de calcium méthode in vitro et électroporation in vivo. Ce sont d’excellentes méthodes pour la manipulation génétique des neurones dans lequel un seul neurone peut être tracé. L’efficacité de transfection à l’aide de la méthode de phosphate de calcium peut varier de 0,1 à 5 %. Par conséquent, nous constatons que, pour des analyses biochimiques, y compris les analyses, Co-Immunoprécipitation et immunoblotting ChIP-Seq, utilisation de lentivirus est plus appropriée puisqu’il se traduit par plus de 80 % la transduction lorsque transduites au moment de l’ensemencement.

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Disclosures

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgments

Ce travail est soutenu par les Sciences naturelles et en génie conseil de recherches du Canada et les instituts de recherche en santé du Canada accorde à A.J..-a.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
qPCR lentivitral titration kit  ABM #LV900
speedy virus purification solution  ABM #LV999
pCMV-dR8.2 Addgene #8455
pCMV-VS.VG Addgene #8454
Distilled water  Gibco #15230162
200 mM L-Glutamine  Gibco #25030081
35 mm Nunc culture dishes Gibco #174913
PowerUP SYBR green master mix life technologies #A25742
BSA V Solution Sigma Aldrich #A-8412
CaCl2 • 2H2O Sigma Aldrich #C-7902 
Camptothecin Sigma Aldrich #C-9911
Chicken Egg White Trypsin Inhibitor  Sigma Aldrich #10109878001
Cytosine beta-D-Arabino Furanoside Sigma Aldrich #C-1768
D-(+)-Glucose  Sigma Aldrich #G-7528
DNase1  Sigma Aldrich #11284932001
Eagle-minimal essential medium Sigma Aldrich #M-2279
Glycine Sigma Aldrich #G-5417
Heat inactivated dialyzed Fetal Bovine Serum  Sigma Aldrich #F-0392
Hepes Buffer  Sigma Aldrich #H-0887
Hydrogen peroxide Sigma Aldrich #216763
50 mg/mL Gentamycin  Sigma Aldrich #G-1397
MgSO4  Sigma Aldrich #M-2643
N-Methyl-D-aspartic acid Sigma Aldrich #M-3262
Phenol Red Solution  Sigma Aldrich #P-0290
Trypsin  Sigma Aldrich #T-4549
Lipofectamine 3000 Thermo Fisher Scientific L3000-008
p3000 enhancer reagent Thermo Fisher Scientific L3000-008
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
KCl  VWR #CABDH9258
NaCl  VWR #CABDH9286
NaH2PO4H2O  VWR #CABDH9298
Poly D-lysine  VWR #89134-858
DMEM Wisent #319-005-CL
FBS Wisent #080-450

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References

  1. Goldowitz, D., Hamre, K. The cells and molecules that make a cerebellum. Trends in Neurosciences. 21 (9), 375-382 (1998).
  2. Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).
  3. Bilimoria, P. M., Bonni, A. Cultures of cerebellar granule neurons. CSH Protoc. , (2008).
  4. Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
  5. Burgoyne, R. D., Cambray-Deakin, M. A. The cellular neurobiology of neuronal development: the cerebellar granule cell. Brain Res. 472 (1), 77-101 (1988).
  6. Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annu Rev Neurosci. 18, 385-408 (1995).
  7. Evans, G. J. Synaptic signalling in cerebellar plasticity. Biol Cell. 99 (7), 363-378 (2007).
  8. Hunt, D. L., Castillo, P. E. Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 496-508 (2012).
  9. Arundine, M., Tymianski, M. Molecular mechanisms of calcium-dependent neurodegeneration in excitotoxicity. Cell Calcium. 34 (4-5), 325-337 (2003).
  10. Szydlowska, K., Tymianski, M. Calcium, ischemia and excitotoxicity. Cell Calcium. 47 (2), 122-129 (2010).
  11. Jahani-Asl, A., Germain, M., Slack, R. S. Mitochondria: joining forces to thwart cell death. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 162-166 (2010).
  12. Rego, A. C., Oliveira, C. R. Mitochondrial dysfunction and reactive oxygen species in excitotoxicity and apoptosis: implications for the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Neurochem Res. 28 (10), 1563-1574 (2003).
  13. Wei, M. C., et al. Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death. Science. 292 (5517), 727-730 (2001).
  14. Doyle, K. P., Simon, R. P., Stenzel-Poore, M. P. Mechanisms of ischemic brain damage. Neuropharmacology. 55 (3), 310-318 (2008).
  15. Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262 (5134), 689-695 (1993).
  16. Cole, K., Perez-Polo, J. R. Neuronal trauma model: in search of Thanatos. Int J Dev Neurosci. 22 (7), 485-496 (2004).
  17. Cheung, E. C., McBride, H. M., Slack, R. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of neuronal cell death. Apoptosis. 12 (5), 979-992 (2007).
  18. Jahani-Asl, A., et al. Mitofusin 2 protects cerebellar granule neurons against injury-induced cell death. J Biol Chem. 282 (33), 23788-23798 (2007).
  19. Gallo, V., Kingsbury, A., Balazs, R., Jorgensen, O. S. The role of depolarization in the survival and differentiation of cerebellar granule cells in culture. J Neurosci. 7 (7), 2203-2213 (1987).
  20. Miller, T. M., et al. Bax deletion further orders the cell death pathway in cerebellar granule cells and suggests a caspase-independent pathway to cell death. J Cell Biol. 139 (1), 205-217 (1997).
  21. Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation. Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).
  22. Piccioli, P., et al. Inhibition of nuclear factor-kappaB activation induces apoptosis in cerebellar granule cells. J Neurosci Res. 66 (6), 1064-1073 (2001).
  23. D'Mello, S. R., Galli, C., Ciotti, T., Calissano, P. Induction of apoptosis in cerebellar granule neurons by low potassium: inhibition of death by insulin-like growth factor I and cAMP. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (23), 10989-10993 (1993).
  24. Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (24), 7919-7923 (1982).
  25. Messer, A. The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture. Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).
  26. Jahani-Asl, A., et al. CDK5 phosphorylates DRP1 and drives mitochondrial defects in NMDA-induced neuronal death. Hum Mol Genet. 24 (16), 4573-4583 (2015).
  27. Jahani-Asl, A., et al. The mitochondrial inner membrane GTPase, optic atrophy 1 (Opa1), restores mitochondrial morphology and promotes neuronal survival following excitotoxicity. J Biol Chem. 286 (6), 4772-4782 (2011).
  28. Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
  29. Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. (32), (2009).
  30. Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), (2009).
  31. Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. (85), (2014).

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Neurosciences numéro 129 cervelet cérébelleuse Granule neurones (CGN) adénovirus Transduction des gènes l’excitotoxicité N-méthyl-D-aspartate (NMDA) apoptose chlorure de Potassium (KCl) camptothécine peroxyde d’hydrogène (H2O2)
Modélisation de la mort neuronale et la dégénérescence de neurones granules primaires de cervelet de souris
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Laaper, M., Haque, T., Slack, R. S., Jahani-Asl, A. Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons. J. Vis. Exp. (129), e55871, doi:10.3791/55871 (2017).

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