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Neuroscience

Modellierung von neuronalen Tod und Degeneration in Maus primären zerebelläre Granulat Neuronen

Published: November 6, 2017 doi: 10.3791/55871
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1,2,4
1Lady Davis Institute for Medical Research, Jewish General Hospital, 2Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 3Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa, 4Department of Oncology, Faculty of Medicine, McGill University

Summary

Dieses Protokoll beschreibt eine einfache Methode zur Isolierung und Kultivierung primäre Maustaste zerebralen Granulat Neuronen (CGNs) von 6-7 Tage alten Welpen, effizienten Transduktion von CGNs für Verlust und Gewinn von Funktionsstudien, und Modellierung NMDA-induzierten neuronalen Excitotoxizität, niedrig-Kalium-induzierte Zelltod, DNA-Schäden und oxidativen Stress mit der gleichen Kultur-Modell.

Abstract

Zerebelläre Granulat Neuronen (CGNs) sind eine häufig verwendete neuronale Modell, bilden eine reiche homogene Bevölkerung im Kleinhirn. Im Hinblick auf ihre postnatale Entwicklung, Fülle und Zugänglichkeit sind CGNs ein ideales Modell, neuronale Prozesse, einschließlich der neuronalen Entwicklung, neuronale Migration und physiologische neuronale Aktivität Stimulation zu studieren. Darüber hinaus bieten CGN Kulturen ein hervorragendes Modell für das Studium der verschiedenen Modi des Zelltods einschließlich Excitotoxizität und Apoptose. CGNs express innerhalb von einer Woche in Kultur N-Methyl-D-Aspartat-(NMDA)-Rezeptoren, eine spezifische Ionotropic Glutamat-Rezeptor mit vielen wichtigen Funktionen in neuronalen Gesundheit und Krankheit. Die Zugabe von geringen Konzentrationen von NMDA in Verbindung mit Membran-Depolarisation, Nagetier CGN Primärkulturen wurde verwendet, um physiologische neuronale Aktivität Stimulation zu modellieren, während die Zugabe von hohen Konzentrationen von NMDA eingesetzt werden kann, um zu modellieren Excitotoxic neuronalen Verletzungen. Hier werden eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von CGNs aus 6 Tage alten Welpen sowie genetische Manipulation von CGNs durch Adenoviren und Lentiviren beschrieben. Wir auch anwesend optimierte Protokolle wie NMDA-induzierte Excitotoxizität, niedrig-Kalium-induzierte Apoptose, oxidativer Stress und DNA-Schäden nach Transduktion dieser Neuronen stimulieren.

Introduction

Zerebelläre Granulat Neuronen (CGNs) zeichnen sich auch in der Kultur und dienten als ein effektives Modell neuronalen Tod und Entwicklung 1,2,3,4,5, zu studieren 6. der frühen Ausdruck der N-Methyl-D-Aspartat-(NMDA)-Rezeptoren in CGN Kulturen in Vitro macht ihnen ein attraktives Modell, NMDA-induzierte Signalisierung zu studieren. Aktivierung dieser Rezeptoren mit NMDA in Verbindung mit Membran-Depolarisation wird verwendet, um physiologische neuronale Aktivität Stimulation zu modellieren und hat für die Forschung über die Mechanismen der synaptischen Plastizität 7,8erlaubt. Im Gegenteil, kann über-Stimulation dieser Rezeptoren durch NMDA-Liganden Excitotoxizität, einen wichtigen Mechanismus der neuronaler Verlust in akuten Hirnschäden und Neurodegenerative Krankheiten 9modellieren verwendet werden. Ein Mechanismus für die Induktion der Excitotoxizität ist durch ATP Hunger mit reduzierter Sauerstoff mit akuten neuronalen Verletzung gesehen. Dies führt zu Membran-Depolarisation und erhöhte Konzentrationen von Glutamat frei an der Synapse. Die nachfolgenden Reizüberflutung des NMDA-Rezeptors durch erhöhte Glutamat führt zu übermäßiger Ca2 + Zustrom über diese Rezeptoren, die wiederum mehrere Wege einschließlich Ca2 +aktiviert-aktiviert Proteasen, Phospholipases, und jedoch, was in den unkontrollierten Abbau von kritischen zellulären Komponenten und Zelltod. Darüber hinaus führt hohe intrazelluläre Ca2 + auf die Generation der freie Sauerstoff-Radikale und mitochondriale Schäden 10,11.

Während die Mehrheit der neuronalen Verlust nach NMDA-induzierten neuronalen Excitotoxizität aufgrund Kalzium Zustrom und Bax/Bak unabhängige, werden nicht andere Mechanismen des Zelltods von diesem Modell ausgeschlossen. Das Aussehen der beiden nekrotische und apoptotischen Zelltod durch Excitotoxizität teilweise durch die Generation von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und DNA-Schäden durchhohe intrazelluläre Ca 2 + Level 12ist. DNA-Schädigung führt zu neuronalen Tod durch Apoptose Mechanismen, mit Markenzeichen des apoptotischen Zelltod, wie das Auftreten von Chromatin Massen und Apoptotic Körper korreliert werden. Induktion der Apoptose ist vermittelt durch die Freisetzung von Cytochrom c aus Mitochondrien und hat gezeigt, dass Bax/Bak Oligomerisierung 13abhängig sein. Bax/Bak Oligomerisierung fördert Porenbildung in der äußeren mitochondrialen Membran, was zu Cytochrom C Version und die Aktivierung der Pro-apoptotische Regulierungsbehörden wie mit milden ischämische Schädigung 14gesehen.

Generation von ROS ist ein wichtiges Thema im Gehirn aufgrund der niedrigen endogenen Antioxidantien, gepaart mit der großen Sauerstoffbedarf für neuronale funktionierenden 15. Wenn zu einem ischämischen Ereignis ausgesetzt, ist Stickoxid-Synthase hochreguliert, Produktion von Stickstoffmonoxid und Erhöhung der reaktiven Sauerstoff-Spezies- 14. Die erhöhte Konzentration von Sauerstoff-Radikalen kann DNA-Schäden führen und indirekt Energie Hunger verursachen. Hohes Maß an DNA-Doppelstrang-Brüche werden durch die Aktivierung von Poly ADP-Ribose-Polymerase-1 (PARP-1), eine eukaryotische Chromatin-gebundenen Protein verantwortlich für katalysieren die Übertragung der ADP-Ribose Einheiten von NAD+, ein integraler Bestandteil der Prozess behoben. DNA-Reparatur- 16. Jedoch mit unverhältnismäßig großer Schäden durch oxidativen Stress, kann Aktivierung von PARP-1 Energie Hungertod aufgrund der erhöhten Abfluss auf NAD+, notwendige Substrat für die ATP-Produktion durch Oxidative Phosphorylierung führen. Letztlich oxidativer Stress löst Apoptose in gewissem Bax/Bak abhängig zur mitochondrialen Cytochrom C Veröffentlichung, und hat gezeigt, dass mitochondriale Umbau in CGNs 17zu induzieren.

Zu guter Letzt können Konzentrationsänderungen von Kaliumchlorid (KCl) in CGN Kulturen zu niedrigen Kalium/Depolarisation vermittelte Apoptose 18,19,20Modell verwendet werden. Wenn auf ein niedriges Niveau von K+ausgesetzt, unterziehen CGNs unterschiedliche physiologische Veränderungen, was zu Kürzungen der mitochondrialen Atmung und Glykolyse, verminderte zelluläre Nachfrage 21, zugeschrieben sowie Abstriche an nuklearer Faktor-κB (NFκB) die Aktivitäten wie Entzündungen und synaptische Übertragung 22regelt. Dieses Modell ist von besonderem Interesse für das Studium der Zelltod während der neuronalen Entwicklung. Die niedrigen K+ Umwelt mehr ähnelt physiologische Bedingungen, und bewirkt, dass Kennzeichen des Zelltods gesehen während der neuronalen Entwicklung 23.

Zusammenfassend bieten CGNs eine langjährige Modell, um die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen der neuronalen Tod und Degeneration zu untersuchen. Das folgende Protokoll ermöglicht Isolierung und Kultivierung von CGNs, Ausdruck oder Unterdrückung von bestimmten genetischen Weg mit Viren und die Induktion der neuronalen Tod durch unterschiedliche Mechanismen aus neuronalen Verletzungen und Degeneration.

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Protocol

dieses Protokoll basiert auf Änderungen der Verfahren, die zuvor beschriebenen 18 , 24 , 25 , 26 , 27. dieses Protokoll ist genehmigt, die vom Tier Pflege an der McGill University.

1. experimentelle Vorbereitung

Hinweis: die folgenden Stammlösungen vorbereitet und bis zum Gebrauch gewartet werden können.

  1. Dissektion Lösung
    1. auflösen 3,62 g Natriumchlorid (NaCl), 0,2 g Kaliumchlorid (KCl), 0,069 g Natrium Phosphat (NaH 2 PO 4 ∙ H 2 O), und 1,306 g D-(+)-Glukose in 500 mL destilliertes H 2 O. Dann 12,5 mL HEPES-Puffer, 450 µL Phenol Red-Lösung und 20 mL BSA Teil V der Projektmappe hinzufügen. Passen Sie auf pH 7.4 mit 1 N Natriumhydroxid (NaOH).
    2. Sterilisation mit 0,22 µm Filter und Speicher bei 4 ° C. Diese Lösung stabil bleiben bis zu einer Woche bis 10 Tage.
  2. Trypsin
    1. bereiten eine Stammlösung in einer Konzentration von 25 g/L von Trypsin in 0,9 % Natriumchlorid. Speichern Sie die Lösung bei-20 ° c
  3. Trypsin-Inhibitor
    1. bereiten ein Lager mit einer Konzentration von 10 mg/mL durch Auflösen von 1 g Huhn Eiweiß Trypsin Inhibitor in 100 mL 1 mM HCl. Store diese Lösung bei-20 ° c
  4. DNase
    1. auflösen 100 mg DNase 1 in 10 mL sterilem Wasser, eine 10 mg/mL Brühe zu generieren. Speichern Sie die Lösung bei-20 ° c
  5. MgSO 4
    1. 50 mL destilliertem Wasser (H 2 O), ein 1 M-Lager zu generieren 6,02 g Magnesiumsulfat (MgSO 4) hinzufügen. Speichern Sie die Lösung bei 4 ° c
  6. CaCl 2
    1. auflösen 0,735 g Calciumchlorid (CaCl 2 ∙ 2 H 2 O) in 50 mL destilliertem H 2 O Lager Konzentration von 100 mM. Speichern Sie Lösung bei 4 ° c
  7. KCl
    1. auflösen 3.7275 g KCl in 50 mL destilliertem H 2 O Lager Konzentration von 1 M. Store Lösung bei 4 ° c
  8. D-(+)-Glucose
    1. auflösen 1,802 g D-(+)-Glukose in 50 mL destilliertem H 2 O Lager Konzentration von 100 mM. Speichern Sie Lösung bei 4 ° c
  9. Zellkulturmedien
    1. Zellkulturmedien wie folgt vorbereiten: 5 mL Hitze inaktiviert dialysierten fötalen Rinderserum, 45 mL 500 µL 200 mM L-Glutamin, 100 µL von 50 mg/mL Gentamycin und 1 mL von 1,0 M KCL hinzugefügt werden der Filter sterilisiert Eagle ' s minimale wesentlichen Medien (E-MEM), die mit 1,125 g/L D ergänzt wird-Glukose, 50 mL zerebelläre Granulat Neuron Nährmedien zu generieren. Speichern von Medien bei 4 ° c
  10. Cytosin Beta-D-Arabino Furanoside
    1. auflösen 48 mg Cytosin Beta-D-Arabino Furanoside in 10 mL Wachstumsmedien Lager Konzentration von 20 mM. Speichern-Lösung bei-20 ° c
  11. Poly-D-Lysin
    1. um eine 2 mg/mL-Poly-D-Lysin Lager zu erzeugen, fügen Sie 10 mL sterile H 2 O auf 20 mg von Poly-D-Lysin. Lager-Poly-D-Lysin bei-80 ° C in 100 µL-Aliquots gespeichert werden sollten.
  12. Hinweis: die folgenden Lösungen sollte vor Dissektion vorbereitet und bei 4 ° C bis zum Gebrauch erhalten.
  13. MgSO 4 Supplemented Dissektion Lösung
    1. fügen 300 µL Lager MgSO 4 bis 250 mL der Lösung Dissektion.
  14. Trypsin Dissektion Lösung
    1. Hinzufügen 100 µL Lager Trypsin und 12 µL Lager MgSO 4 bis 10 mL der Lösung Dissektion.
  15. Trypsin Inhibitor Lösung 1
    1. Hinzufügen 164 µL Lager Trypsin-Inhibitor, 250 µL Lager DNase-1 und 12 µL Lager MgSO 4 bis 10 mL der Lösung Dissektion.
  16. Trypsin Inhibitor Lösung 2
    1. Hinzufügen 1040 µL Lager Trypsin-Inhibitor, 750 µL Lager DNase-1 und 12 µL Lager MgSO4 Dissektion Lösung 10 mL.
  17. CaCl 2 ergänzt Dissektion Lösung
    1. fügen Sie 10 µL Lager CaCl 2 und 25 µL Lager MgSO 4 bis 10 mL der Lösung Dissektion.
  18. Poly-D-Lysin beschichtet Kultur Gerichte
    1. um Kultur Gerichte zu beschichten, verdünnen 100 µL der Lager-Poly-D-Lysin in 40 mL sterile H 2 O. Zugeben Sie für 35 mm-Nunc-Kultur-Gerichte 2 mL verdünnten Poly D-Lysin-Lösung. Für 4 gut Platten, fügen 300 µL verdünnter Poly D-Lysin in jede Vertiefung.
    2. Lassen Sie die Poly-D-Lysin sitzen für 1 h vor dem Absaugen und waschen jeweils gut mit 4 mL oder 600 µL (für 35 mm Gerichte Kultur oder auch 4, bzw. Platten) der sterilen H 2 O. Dann Aspirieren H 2 O und die Gerichte der Luft für 1 h trocknen lassen

2. Gehirn-Extraktion und Isolation des Kleinhirn

  1. enthaupten am 6. und 7. Tag alte Maus Welpe mit Enthauptung einer Schere. Führen die Dissektion des Gehirns in eine sterile Gewebekultur Kapuze.
  2. Um das Gehirn zu entfernen, halten Sie mit einer Zange und Schnitt durch die Haut in Richtung der vorderen des Kopfes mit Mikrodissektion Schere, wie in Abbildung 1 gezeigt. Dann Schnitt durch die Schädelknochen, die mit einem neuen Schere, um Risiko einer Kontamination zu minimieren. Entfernen Sie den Schädel, die das Gehirn mit Pinzette und herauszuarbeiten, das Gehirn mit Hilfe einer Pinzette oder einem Spatel.
    1. Bei Bedarf durch den Sehnerv zu erleichtern, das Gehirn als Ganzes raus geschnitten.
  3. Legen Sie das Gehirn in die Dissektion-Lösung, die mit MgSO 4 ergänzt wird. Halten Sie die Lösung und das Gehirn auf Ice
  4. Nach Entfernung, unter dem Mikroskop Dissektion des Gehirns, sezieren, das Kleinhirn aus dem Gehirn während noch in MgSO 4 ergänzt Dissektion Lösung und der Hirnhäute mit feinen Pinzette zu entfernen. Schalten Sie das Kleinhirn an der Bauchseite und Entfernung von choroid Plexus zu versichern.
  5. Bündeln die Cerebella in eine 35-mm-Schale mit ~ 1 mL MgSO 4 ergänzt Dissektion Lösung.
  6. Das Gewebe in kleine Stücke schneiden und in eine 50 mL-Tube mit 30 mL MgSO 4 gepuffert Dissektion Lösung übertragen.

3. Maus zerebelläre Granulat Neuron Isolation und Culturing

  1. Zentrifugieren der 50 mL-Tube mit der gehackten zerebralen Gewebe für 5 min bei 644 x g und 4 ° c
  2. Entfernen den Überstand und 10 mL Trypsin Dissektion Lösung. Dann schütteln Sie das Rohr mit hoher Geschwindigkeit für 15 min bei 37 ° c
  3. Fügen Sie 10 mL Trypsin-Inhibitor-Lösung 1 Tube und Rock sanft für 2 min.
  4. Zentrifugieren Sie das Rohr für 5 min bei 644 x g und 4 ° c
  5. Entfernen den Überstand und 2 mL Trypsin-Inhibitor Lösung 2 und übertragen Sie dann auf eine 15 mL-Tube.
  6. Genannte das Gewebe in der 15 mL Tube, bis die Lösung trüb wird. Dann lassen Sie für 5 min. vereinbaren
  7. Entfernen den klare überstand und übertragen den Überstand auf eine neue Röhrchen mit 1 mL der Lösung CaCl 2 ergänzt Dissektion.
  8. Hinzufügen einer anderen mL Trypsin-Inhibitor Lösung 2 an der Unterseite des Rohres, enthält das Pellet aus Schritt 3.6. Genannte wieder und lassen Sie für 5 min. Überstands zu entfernen und fügen sie Sie das Röhrchen mit der Überstand von Schritt 3,7 (das ist eine Wiederholung der Schritte 3.6-3.7) zu begleichen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die meisten des Gewebes ist mechanisch getrennt.
  9. Add 0,3 mL CaCl 2 ergänzt Dissektion Lösung der Überstand Auflistung für jedes mL des Überstandes.
  10. Mischen Sie den Inhalt des Röhrchens und dann für 5 min bei 644 X g. Zentrifugieren
  11. Entfernen den Überstand und das Pellet 10 mL frische Medien hinzufügen und mischen.
  12. Zellen können dann gezählt und zu einer Konzentration von 1, 5 x 10 6 Zellen/mL verdünnt. Bitte beachten Sie, dass in der Regel 10 Millionen Zellen von jeder seziert Gehirn, abhängig von der Trypsinization Zeit und Effizienz der Dissektion erwartet werden. Zellen auf zuvor erstellten Poly D-Lysin Platten Teller. Für 4-Well-Platten Teller 0,5 mL, 7,5 x 10 5 Zellen pro Bohrloch zu geben. Für 35-mm-Schalen, Teller 4 mL, 6 x 10 6 Zellen pro Platte geben.
  13. Nach 24 h, Cytosin-β-Arabino Furanoside (AraC) hinzufügen, die Platten, Glia Kontamination zu reduzieren. Für jedes mL Medien ist 0,5 µL 20 mm AraC erforderlich. Zugabe von AraC erfordert kein Medienwechsel. Wenn Zellen für 7-8 Tage aufrechterhalten werden, wiederholen Sie diese Behandlung am Tag 3.
  14. Kulturen in einem 5 % CO 2 Inkubator bei 37 ° C pflegen und füttern mit 100 µL 100 mM Glukose hinzugefügt, um die Kultur für jeden 2 mL Medien alle 2 Tage vergangenen 5 Tage. Eine komplette Medien-Änderung ist nicht erforderlich.

4. Lentivirus Verpackung, Reinigung und Titration

Hinweis: das Protokoll für die Verpackung, Konzentration, Reinigung und Titration von Lentivirus hat zuvor in Detail, ohne die Verwendung eines Bausatzes beschrieben worden 28, einschließlich alternative Methoden für die Titration, wie Flow Cytometry 29. Hier präsentieren wir kurz in unserem Labor für die Produktion von Lentivirus neuronalen Verletzungen mit schnellen Virenschutzlösung Reinigung und ein qPCR Lentivirale Titration Kit studieren verwendete Protokoll.

  1. Platte Hek293T Zellen in 10 cm-Kultur-Gerichte mit Dulbecco ' s geändert Eagle ' s minimale wesentliche Medium (DMEM) ergänzt mit 10 % FBS. Wachsen Sie für den Erhalt eines hohen virale Titers mindestens 5 Platten von Hek293T Zellen für jede Transfektion. Achten Sie darauf, am Tag der Transfektion Zellen sind 70 % Zusammenfluss. Drei Stunden vor Transfektion Medium wechseln.
  2. Für jede Transfektion bereiten zwei Röhren. Im Rohr hinzufügen 1 1,5 mL MEM-reduzierte Serum Medien und 41 µL Transfection Reagens, gut mischen. Fügen Sie im Rohr 2 1,5 mL der MEM-reduzierte Serum Medien und 6 µg Plasmid Transfer, 6 µg pCMV-dR8.2 Vektor (Verpackung Plasmid), 3 µg pCMV-VSV-G Vektor (Umschlag Plasmid) und 35 µL p3000 Enhancer Reagenz (mit Lipofectamine geliefert hinzu). Mischen Sie gut und kombinieren Röhren 1 und 2, Wirbel und inkubieren Sie für 15 min.
  3. 50 % der Medien aus Hek293T Platten entfernen und Hinzufügen von DNA-Lipid komplexe Zellen. 6 h bei 37 ° C, 5 % CO 2 inkubieren. Medien zu entfernen und ersetzen mit 5 mL frischem DMEM, über Nacht inkubieren.
  4. Bei 24 h nach Transfektion, sammle die erste Partie der viralen Überstand von jeder Platte. Halten Sie die viralen Medien bei 4 ° C und 5 mL frische Medien in jeder Platte von Hek293T Zellen. Über Nacht inkubieren.
  5. 48 h nach Transfektion, sammeln die zweite Charge virale überstand, kombinieren Sie es mit der ersten Charge und Zentrifugieren kombinierte virale überstand für 10 min bei 600 X g.
  6. Filtern den Überstand durch einen Filter mit 45 µm Porengröße.
  7. Reinigen das Virus mit einer schnellen Reinigung Virenschutzlösung. Für jede 45 mL virale überstand, fügen Sie 5 mL Lentivirale verbindliche Lösung, Mix und Zentrifuge für 10 min bei > 5.000 x g und 4 ° c
  8. Überstand vorsichtig um nicht zu stören, das Pellet.
  9. 20-40 µL Medium hinzufügen und erneut aussetzen das Pellet. Aliquoten und bei-80 ° c
  10. , Lentivirale Titer, Bausatz qPCR Lentivirale Titration zu erhalten wird verwendet. Verdünnen Sie 2 µL des gereinigten Virus in 500 µL PBS. 18 µL Virus Lyse Puffer (mitgelieferten) 2 µL des verdünnten Virus hinzugefügt.
  11. Set, drei verschiedene RT-Q-PCR-Reaktionen in triplicates und beschriften Sie sie als virale lysate, positive Kontrolle 1 (STD1) und Positivkontrolle 2 (STD2). Für jede Reaktion hinzufügen, 12,5 µL 2 X qPCR MasterMix, 2,5 µL entweder virale lysate oder STD1 (mitgelieferten) oder STD2 (mitgelieferten) und 10 µL des Reagenz-Mix (mitgelieferten) in 0,2 mL PCR-Röhrchen.
  12. Legen Sie die PCR-Programm wie folgt: 20 min bei 42 ° C für reverse Transkription, 10 min bei 95 ° C für die Enzym-Aktivierung, 40 Zyklen von 15 s bei 95 ° C für die Denaturierung und 1 min bei 60 ° C für Glühen/Erweiterung.
  13. Der viralen Titer mit dieser Formel berechnen:
    Titer von virale lysate = 5 x 10 7 / 2 3(Ctx-Ct1)/(Ct2-Ct1).
    CTX = durchschnittliche Ct-Wert der unbekannten Probe, Ct1 = Mittelwert der STD1, Ct2 = Mittelwert der STD2.
    Hinweis: CGNs können werden am besten mit Lentiviren ausgestrahlt oder infizierte mit Adenoviren abhängig von der Art der Verletzungen untersucht. Zugabe von Lentiviren bei einer MOI von 2-3, Zelle Kulturlösung zum Zeitpunkt der Beschichtung wird verwendet, um NMDA induzierte Signalisierung am 7. Tag der Kultur zu studieren. Dies führt zu mehr als 80 % Transduktion und eignet sich mit biochemischen Analysen dieser Neuronen ( Abbildung 2) verfolgen. Zugabe von Adenoviren an Tag 5 der Kultur (bei MOI 50) und Studium NMDA induzierte Signalisierung bei Tag 7-8 wird für andere Techniken wie Bildgebung verwendet. Diese Behandlung führt zu weniger als 10 % Infektion von Neuronen, wodurch es ideal für Bildgebung und Co Lokalisierung von Proteinen. Adenoviren können zum Zeitpunkt der Beschichtung verwendet werden, um DNA-Schäden induzierte Zelltod zu studieren durch Zugabe von Camptothecin am Tag 2-3 oder oxidativen Stress durch Zugabe von Wasserstoffperoxid. Das Vorhandensein von Fluoreszenz-Proteine (GFP, RFP, CFP und YFP) markiert, das gen des Interesses kann verwendet werden, um Prozent Transduktion und potentielle Toxizität zu schätzen. Mit der empfohlenen MOI sehen wir minimale Toxizität und maximale Transduktion ( Abbildung 3).

5. Modellierung von neuronalen Verletzung

  1. induzieren NMDA induzierten neuronalen Excitotoxizität, nach 7 Tagen in Vitro, CGNs mit 100 µM NMDA und 10 µM Glycin zu behandeln, denn 1H. ersetzen Sie das Medium mit konditionierten Medium parallele Kulturen ohne Behandlung. Diese Konzentration führt zu 50 % Zelltod bei 24 h nach der Behandlung ( Abbildung 3). Mitochondriale Fragmentierung ist offensichtlich auf 6-8 h nach der Behandlung (siehe Jahani-Asl Et al. 26 , ( 27).
  2. , ROS-induzierte Zelltod (oxidativer Stress) induzieren, behandeln NeuroNS mit 75-100 µM Wasserstoffperoxid (H 2 O 2) und Umstellung auf konditioniert Medien aus parallele Kulturen nach 5 min Exposition gegenüber H 2 O 2. Hinweis aufgrund der Instabilität der H 2 O 2, optimieren Sie die Konzentration auf ein Niveau, das 50-70 % Zelltod in der Kultur nach 24 Stunden nach der Behandlung induziert.
  3. Induzieren DNA Schäden induzierte Zelltod, CGNs mit 10 µM Camptothecin zu behandeln. Diese Konzentration führt zu mehr als 50 % Zelltod in 24 h. mitochondriale Fragmentierung und frühen Apoptotic Signalisierung erfolgt ca. 2-3 h nach Zugabe von Camptothecin bei dieser Konzentration (siehe Jahani-Asl Et al. 18)
  4. um niedrige K + induzierte neuronale Apoptose in CGNs induzieren, Medium mit 25 mM K + zu niedrigen Kalium Medien mit 5 mM K + nach 7 Tagen in Vitro wechseln.

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Representative Results

Mit sorgfältiger Präparation sollte die intakte Gehirn mit minimalen Schäden entfernt werden, wie in Abbildung 1A-B. Anstrengung sollte geachtet werden, Schädigung des Gehirns bei der Entnahme zu minimieren, insbesondere Schäden an das Kleinhirn. Beschädigen das Kleinhirn sorgt für schwieriger Identifizierung und vollständige Entfernung der Hirnhäute und erhöht die Wahrscheinlichkeit einer Verunreinigung der neuronalen Kultur. Nach dem Entfernen der Hirnhäute kann das Kleinhirn seziert vom restlichen Gewebe, wie in Abbildung 1 zu sehen und Dissoziation vorbereitet.

Vor der Beschichtung, kann CGNs mit Lentivirus ausgestrahlt oder mit Adenovirus infiziert, wie in Abbildung 2beschrieben. Maximale Effizienz und minimale Toxizität mit MOI 50 für eine Infektion mit Adenoviren und einer MOI von 2 bis 3 finden wir am Tag der Beschichtung für Lentivirus (Abbildung 3).

Ausgestrahlt gesunde CGN Kulturen auf 7 DIV sind in Abbildung 3Avorgestellt. Wenn große Anzahl von Gliazellen in der Kultur bleiben, kann die Konzentration von AraC erhöht werden, um eine reine neuronalen Bevölkerung sicherzustellen. Auch Gliazellen nehmen das Virus leichter als Neuronen und das wird kritisch, wenn die Transductions am 5. Tag durchgeführt werden. Das Vorhandensein von Neuronen Zelltod unterziehen kann durch die Bildung von pyknotischen Kernen beurteilt werden, wie in Abbildung 3zu sehen. Alle Konzentrationen von NMDA, H2O2und Camptothecin werden optimiert, um 50 % Zelltod nach 24 h zu induzieren. Dies ermöglicht eine andere frühe Ereignisse, die vorausgehen, neuronaler Verlust z. B. mitochondrialen Fragmentierung zu studieren.

Figure 1
Abb. 1: Entfernung von Gehirn der Maus und Dissektion des Kleinhirns. (A), um das Gehirn der Maus 6-7 Tage alt, mit einer Zange zu extrahieren, halten Sie und schneiden Sie die Haut anterior entlang der gestrichelten Linien mit einem Mikrodissektion Schere. Achten Sie darauf, nur die Haut und Bindegewebe zu schneiden, zu tiefer ein Einschnitt kann Punktion den Schädel und das Gehirn schädigen. Diese drei Einschnitte, geradeaus entlang der Mittellinie und zwei seitlich, geschwungene ermöglichen die Haut geschoben werden enthüllt den Schädel zurück. Einmal ausgesetzt, kann der Schädel Drang mit der Spitze der Schere und Körpertiefe geschnitten werden. Große Vorsicht ist geboten, um nicht zu beschädigen das Kleinhirn zur Ermittlung und Beseitigung der Hirnhaut zu erleichtern. Einmal schneiden, kann Zange verwendet werden, um wieder schälen des Schädels, das Gehirn, die dann hervorgelockt werden kann in kühlen Dissektion Lösung mit einer Pinzette oder einer Spachtel auszusetzen. Um das Gehirn zu entfernen, müssen den Sehnerv durchtrennt werden. (B) Sobald vom Schädel entfernt, sollte der Hirnhäute aus das Kleinhirn, mit einer feinen Spitzen Pinzette entfernt werden. (C) mit ein paar feine Spitzen Pinzette, das Kleinhirn ist vom restlichen Gewebe seziert und kontrolliert, um vollständige Entfernung von der Hirnhaut zu gewährleisten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Modellierung neuronaler Schädigung im Kleinhirn Granulat Neuronen. Isolierte Cerebella ab Tag 6 und 7 Mäuse in Einzelzellen, die nach dem Verfahren getrennt sind in Teil 3 vorgestellt. Nach Dissoziation Zellen werden gezählt und Nukleinsäuretablette in einem Volumen von Nährmedien, 1,5 x 106 cells/mL.For generieren 35 mm Schalen, 4 mL sind beschichtet, 6 x 106 Zellen pro Platte geben. Für imaging-Folien, ist 0,5 mL plattiert, 7,5 x 105 Zellen/Brunnen geben. CGNs können dann mit Lentivirus ausgestrahlt oder mit Adenovirus infiziert werden. Mit Adenoviren am Tag der Beschichtung (0 Tage in Vitro (DIV)) bietet mehr als 90 % Transfektion Effizienz und erlaubt für die Erforschung der neuronalen Verletzungen durch oxidativen Stress und DNA-Schäden. Die Zugabe von 10 µM Camptothecin (CPT) werden DNA-Schäden, induzieren, während 75-100 µM Wasserstoffperoxid (H2O2) oxidativen Stress induziert wird. Die Konzentration von H2O2 muss optimiert werden, um 50 % Zelltod nach 24 h zu induzieren. Infektion mit Adenoviren an 5 DIV gibt einen niedrigeren Wirkungsgrad der Transduktion von weniger als 10 %. Bei 7 DIV als NMDA-Rezeptoren in der Kultur bereichert werden können Neuronen mit 100 µM NMDA und 10 µM Glycin induzieren Excitotoxizität behandelt werden. Dies ist ideal für nachfolgende bildgebende Analyse oder ein einzelnes Neuron nachzeichnen. Schließlich mit Lentivirus bei 0 DIV, gefolgt durch die Behandlung mit 100 µM NMDA und 10 µM Glycin bei 7 DIV transducing gibt einen ausreichend hohen Transduktion Wirkungsgrad (> 80 %) für biochemische Analyse der Kultur, einschließlich ChIP Sequenzierung, Prüfung ermöglichen Proteinexpression und lebenden/Toten Tests durchführen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Kleinhirn Granulat Neuronen. (A) Neuronen wurden ausgestrahlt mit Lentiviren für RFP bei einer MOI von 3 zum Zeitpunkt der Beschichtung, und fixiert und an 7 Tagen in-vitro-gebeizt. NS1 RFP Signal, MAP2 und Hoechst erweist sich gesunde Neuronen zu demonstrieren, die voll von Lentiviren ausgestrahlt werden. (B) repräsentieren die Bilder live dead Assay Analysen von Neuronen infiziert mit verschiedenen MOI, Toxizität zu messen. CGNs infiziert mit Adenoviren auszudrücken LacZ bei einer MOI zwischen 25 und 50 ermöglicht maximale Effizienz und gleichzeitig minimale Toxizität. Weniger als eine Differenz von 1 % in Zelle Überleben im Vergleich zur Kontrolle gesehen wird, wenn bei diesem MOI zu infizieren. (C) Hoechst Färbung des Steuerelements CGNs und CGNs mit NMDA Zelltod induzieren behandelt. Beachten Sie die Bildung von pyknotischen Kernen mit NMDA-Behandlung. Dies ist bezeichnend für Zelltod und kann man in etwa 50 % der Kultur 24 Stunden nach der Behandlung mit 100 µM NMDA und 10 µM Glycin. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Hier bieten wir eine einfache Methode für die Kultivierung der primäre Maustaste zerebelläre Granulat Neuronen (CGNs), Verlust und Gewinn von Funktionsstudien und Modellierung verschiedene Mechanismen des Zelltods. Mehrere Faktoren beeinflussen die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse mit diesem Verfahren die engmaschige Überwachung erfordern. Dazu gehören die Reinheit der Kultur einschließlich der Beseitigung von Gliazellen in der Kultur, dem Zusammenfluss von der Kultur und Erhaltung gesunde Zellen. Einführung Variabilität dieser Faktoren kann die Ergebnisse beeinflussen und fordern die Reproduzierbarkeit. Im folgenden beschreiben wir, wie die Faktoren zu minimieren, die sich negativ auf die Ergebnisse.

Zur Beseitigung von Gliazellen aus der CGNs Kultur und eine reine neuronale Bevölkerung zu etablieren, setzen wir 10 µM von Cytosin-β-Arabino Furanoside (AraC), ein Pyrimidine Antimetabolite, die wuchernde Zellen tötet durch Hemmung der DNA-Synthese. Wenn es noch eine Bevölkerung von Gliazellen vorhanden immer, kann die Konzentration von AraC bis 15 µM erhöht werden. Dies ist auch viel abhängig. Darüber hinaus kann eine zweite Behandlung AraC für Kulturen, die bis zu 7-8 Tage gewartet werden, am 3. Tag erfolgen. Um eine reine neuronalen Population zu erhalten und Zelltod zu vermeiden, ist es wichtig, der Hirnhäute aus dem Kleinhirn vor dem Schneiden des Gewebes in Stücke, gefolgt von Trypsinization zu schälen. Dies sollte in relativ kurzer Zeit (nicht länger als ca. 7-10 min pro Kleinhirn). Das Vorhandensein der Hirnhaut in der neuronalen Kultur führt zu ungesunden Kultur und schließlich Zelltod. Ein weiterer Faktor, der Tod von Neuronen vor der Behandlung führen kann, ist die Trypsinization Zeit. Es ist wichtig, dass Zellen nicht übermäßig trypsiniert. Auf der anderen Seite erfordert unter Trypsinization weitere mechanische Dissoziation der Zellen, die eventuell zu beschädigen, führen zu einem niedrigen Ertrag. Daher die Trypsinization Zeit erfordert Optimierung und es ist viel abhängig.

Der nächste Faktor zu berücksichtigen ist der Zusammenfluss der Zellen zum Zeitpunkt der Nutzung. Verschiedenen Konfluenz erzeugen Variabilität in den Ergebnissen. Dies ist besonders wichtig, je nach dem Auslesen in den Experimenten. Mit einem niedrigen Zusammenfluss Zustand beginnen Neuronen, nach 2-3 Tagen verklumpen. Ein zu niedrig oder zu hoch Zusammenfluss Zustand der Neuronen beeinträchtigt signalisieren. Es ist wichtig, die Anzahl der lebenden Zellen für genaue Beschichtung.

Andere Methoden der CGN Kulturen beschrieben worden, vor allem einen Blick auf Kultivierung Grundverfahren mit einem Papain Dissoziation System kit 30 als auch als Post-Kultivierung Verfahren und Manipulation der CGN um neuronale Migration zu studieren und Morphologie- 31. Das Protokoll von Lee Et Al. vorgestellt beschreibt die Verwendung des Papain Dissoziation System Kit. Sie empfehlen zwei Methoden, um die Reinheit der isolierten CGNs zu erhöhen: die Zellen durch eine Percoll gradient Trennung läuft, sowie Pre-Beschichtung auf einer Poly-D-Lysin-Platte für 20 min. Beide Methoden sind, um die Trennung der CGNs von Gliazellen Verunreinigungen zu unterstützen. Dies empfiehlt sich für den Fall, dass Behandlung mit AraC allein reicht nicht für neuronale Reinkultur zu bereichern. Darüber hinaus nutzt Lee 4-6 Tage alte Maus Welpen, während dies ein effektives Modell für die Untersuchung neuronaler Differenzierung dient; Wir finden mit CGNs aus 6-7 Tage alte Maus Welpen besser geeignet für die Erforschung der neuronalen Verletzung ist. Holubowska Et Al. stellt ein Protokoll für die Transfektion von post mitotischen zerebelläre Neuronen mit der Calcium-Phosphat-Methode in Vitro und Elektroporation in Vivo. Dies sind ausgezeichnete Methoden zur Genmanipulation von Neuronen, in denen ein einzelnes Neuron zurückverfolgt werden kann. Die Transfektion Effizienz mit Calcium-Phosphat-Methode kann variieren von 0,1-5 %. Daher finden wir, dass für biochemische Analysen einschließlich ChIP-Seq-Analysen, Co-Immunopräzipitation und Immunoblotting, Verwendung von Lentiviren besser geeignet ist, da es mehr als 80 % führt Transduktion, wenn zum Zeitpunkt der Beschichtung ausgestrahlt.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit stützt sich auf Naturwissenschaften und Engineering Research Council of Canada und der Canadian Institutes of Health Research räumt a.j.-A.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
qPCR lentivitral titration kit  ABM #LV900
speedy virus purification solution  ABM #LV999
pCMV-dR8.2 Addgene #8455
pCMV-VS.VG Addgene #8454
Distilled water  Gibco #15230162
200 mM L-Glutamine  Gibco #25030081
35 mm Nunc culture dishes Gibco #174913
PowerUP SYBR green master mix life technologies #A25742
BSA V Solution Sigma Aldrich #A-8412
CaCl2 • 2H2O Sigma Aldrich #C-7902 
Camptothecin Sigma Aldrich #C-9911
Chicken Egg White Trypsin Inhibitor  Sigma Aldrich #10109878001
Cytosine beta-D-Arabino Furanoside Sigma Aldrich #C-1768
D-(+)-Glucose  Sigma Aldrich #G-7528
DNase1  Sigma Aldrich #11284932001
Eagle-minimal essential medium Sigma Aldrich #M-2279
Glycine Sigma Aldrich #G-5417
Heat inactivated dialyzed Fetal Bovine Serum  Sigma Aldrich #F-0392
Hepes Buffer  Sigma Aldrich #H-0887
Hydrogen peroxide Sigma Aldrich #216763
50 mg/mL Gentamycin  Sigma Aldrich #G-1397
MgSO4  Sigma Aldrich #M-2643
N-Methyl-D-aspartic acid Sigma Aldrich #M-3262
Phenol Red Solution  Sigma Aldrich #P-0290
Trypsin  Sigma Aldrich #T-4549
Lipofectamine 3000 Thermo Fisher Scientific L3000-008
p3000 enhancer reagent Thermo Fisher Scientific L3000-008
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
KCl  VWR #CABDH9258
NaCl  VWR #CABDH9286
NaH2PO4H2O  VWR #CABDH9298
Poly D-lysine  VWR #89134-858
DMEM Wisent #319-005-CL
FBS Wisent #080-450

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Modellierung von neuronalen Tod und Degeneration in Maus primären zerebelläre Granulat Neuronen
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Laaper, M., Haque, T., Slack, R. S., Jahani-Asl, A. Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons. J. Vis. Exp. (129), e55871, doi:10.3791/55871 (2017).

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