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Neuroscience

Modellazione di morte neuronale e degenerazione in neuroni cerebellari del granello primario del Mouse

Published: November 6, 2017 doi: 10.3791/55871
Automatic Translation
1,2, 1, 3, 1,2,4
1Lady Davis Institute for Medical Research, Jewish General Hospital, 2Integrated Program in Neuroscience, McGill University, 3Department of Cellular and Molecular Medicine, University of Ottawa, 4Department of Oncology, Faculty of Medicine, McGill University

Summary

Questo protocollo descrive un metodo semplice per isolare e neuroni di granulo cerebrale primario del mouse (CGNs) da cuccioli di 6-7 giorno vecchio, trasduzione efficiente di CGNs per la perdita e guadagno di funzione studia, la coltura e la modellazione eccitotossicità neuronale indotta da NMDA, basso-potassio-indotta delle cellule morte, danni al DNA e stress ossidativo utilizzando lo stesso modello di cultura.

Abstract

I neuroni cerebellari del granello (CGNs) sono un modello comunemente usato neuronale, formando una popolazione omogenea abbondante nel cervelletto. Alla luce del loro sviluppo post-natale, abbondanza e accessibilità, CGNs sono un modello ideale per studiare processi neuronali, compreso lo sviluppo neuronale, migrazione neuronale e stimolazione di attività neuronale fisiologica. Inoltre, culture CGN forniscono un eccellente modello per studiare le diverse modalità di morte cellulare tra cui excitotoxicity e apoptosi. All'interno di una settimana nella cultura, CGNs esprimere recettori N-metil-D-aspartato (NMDA), un recettore di glutammato di specifici recettori ionotropici con molte funzioni critiche in un neurone salute e nella malattia. L'aggiunta di basse concentrazioni di NMDA in combinazione con la depolarizzazione della membrana di roditore colture primarie di CGN è stato utilizzato per modellare la stimolazione fisiologica attività neuronale, mentre l'aggiunta di alte concentrazioni di NMDA può essere impiegato per modellare lesione di un neurone excitotoxic. Qui, un metodo di isolamento e coltura di CGNs da cuccioli 6 giorno precedente così come la manipolazione genetica di CGNs da adenovirus e lentivirus sono descritti. Siamo anche presenti protocolli ottimizzati su come stimolare eccitotossicità indotta da NMDA, apoptosi indotta da basso-potassio, stress ossidativo e danno al DNA dopo la trasduzione di questi neuroni.

Introduction

I neuroni cerebellari del granello (CGNs) sono ben caratterizzati in cultura e hanno servito come un modello efficace per studiare la morte neuronale e sviluppo 1,2,3,4,5, 6. l'espressione precoce dei recettori N-metil-D-aspartato (NMDA) CGN culture in vitro di li rende un modello interessante per studiare NMDA-indotta di segnalazione. L'attivazione di questi recettori con NMDA in combinazione con la depolarizzazione della membrana viene utilizzata per modellare la stimolazione fisiologica attività neuronale e ha permesso per la ricerca dei meccanismi di plasticità sinaptica 7,8. Al contrario, eccesso di stimolazione di questi recettori da ligando NMDA può essere utilizzato per modellare excitotoxicity, un meccanismo importante di perdita neuronale in malattie di neurodegenerative e danno cerebrale acuta 9. Un meccanismo per l'induzione di excitotoxicity è attraverso inedia ATP con ossigeno ridotto, come si è visto con la ferita di un neurone acuta. In questo modo la depolarizzazione della membrana e rilasciano di livelli elevati di glutammato in sinapsi. La sovrastimolazione successiva del recettore NMDA da elevati del glutammato provoca eccessiva Ca2 + afflusso attraverso questi recettori, che a sua volta attiva diverse vie tra cui Ca2 +-attivati proteasi, fosfolipasi, e endonucleasi, conseguente la degradazione incontrollata dei critici componenti cellulari e morte cellulare. Inoltre, alta intracellulare Ca2 + porta alla generazione di radicali liberi dell'ossigeno e danno mitocondriale 10,11.

Mentre la maggior parte della perdita di un neurone seguendo eccitotossicità neuronale indotta da NMDA è dovuto afflusso del calcio ed è indipendente di Bax e Bak, altri meccanismi di morte cellulare non possono essere escluso da questo modello. L'aspetto di entrambi necrotico e apoptotici come la morte delle cellule dovuto excitotoxicity è parzialmente dovuto alla generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e danni al DNA causati daalta intracellulare Ca 2 + livelli 12. Danno del DNA risultati nella morte neuronale attraverso meccanismi apoptotici, essendo correlati con tratti distintivi della morte apoptotica delle cellule, come la comparsa di masse di cromatina e corpi apoptotici. Induzione di apoptosi è mediata attraverso il rilascio di citocromo c dai mitocondri e ha dimostrato di essere dipendente da Bax/Bak oligomerizzazione 13. Oligomerizzazione di Bax/Bak promuove la formazione di pori nella membrana mitocondriale esterna, con conseguente rilascio del citocromo c e l'attivazione dei regolatori pro-apoptotiche come si è visto con una lieve lesione ischemica 14.

Generazione di ROS è un problema significativo nel cervello dovuto i bassi livelli endogeni di antiossidanti, accoppiati con il fabbisogno di ossigeno grande per funzionamento neuronale 15. Quando esposti ad un evento ischemico, ossido nitrico sintasi è aumentata, produzione di ossido nitrico e l'aumento di specie reattive dell'ossigeno 14. L'aumento della concentrazione dei radicali dell'ossigeno può provocare danni al DNA e causare indirettamente la fame di energia. Alti livelli di rotture del doppio filamento del DNA sono sanati mediante l'attivazione di poli ADP-ribosio polimerasi-1 (PARP-1), un'eucariota cromatina-proteina responsabile di che catalizza il trasferimento di unità di ADP-ribosio dal NAD+, un parte integrante del processo 16di riparazione del DNA. Tuttavia, con danni eccessivi a causa dello stress ossidativo, attivazione di PARP-1 può causare fame di energia dovuto lo scarico aumentato il NAD+, un substrato necessario per la produzione di ATP attraverso la fosforilazione ossidativa. In definitiva, lo sforzo ossidativo si innescherà apoptosi in un modo dipendente di Bax/Bak che conduce al rilascio mitocondriale del citocromo c ed è stato indicato per indurre il rimodellamento mitocondriale in CGNs 17.

Infine, cambiamenti nella concentrazione di cloruro di potassio (KCl) in colture CGN possono essere utilizzati per modellare basso potassio/depolarizzazione mediata apoptosi 18,19,20. Quando esposti a bassi livelli di K+, CGNs subiscono cambiamenti fisiologici distinti, con conseguente riduzioni di respirazione mitocondriale e di glicolisi, attribuito alla diminuzione della domanda cellulare 21, così come la riduzione dei livelli di Nuclear factor-f-κB (NFκB) che regola le attività tra cui l'infiammazione e la trasmissione sinaptica 22. Questo modello è di particolare interesse per lo studio della morte delle cellule durante lo sviluppo neuronale. L'ambiente di K+ basso più strettamente assomiglia a condizioni fisiologiche e provoca i tratti distintivi della morte delle cellule durante lo sviluppo neuronale 23.

In sintesi, CGNs forniscono un modello di vecchia data per studiare i meccanismi molecolari sottostanti di degenerazione e morte neuronale. Il seguente protocollo permetterà di isolamento e coltura di CGNs, espressione o repressione di una particolare via genetica utilizzando virus e l'induzione della morte neuronale attraverso diversi meccanismi che rappresenta la degenerazione e la lesione di un neurone.

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Protocol

questo protocollo si basa su modifiche delle procedure che sono state descritte precedentemente 18 , 24 , 25 , 26 , 27. il presente protocollo è approvato dal comitato di cura animale presso la McGill University.

1. preparazione sperimentale

Nota: le seguenti soluzioni di magazzino possono essere preparate e mantenute fino all'uso.

  1. Soluzione di dissezione
    1. sciogliere 3,62 g di cloruro di sodio (NaCl), 0,2 g di cloruro di potassio (KCl), 0,069 g di fosfato di sodio (NaH 2 PO 4 ∙ H 2 O) e 1,306 g di D-(+)-glucosio in 500 mL di distillata H 2 O. Quindi aggiungere 12,5 mL di tampone HEPES, 450 µ l di soluzione di rosso fenolo e 20 mL della frazione di BSA V alla soluzione. Regolare il pH 7.4 utilizzo 1 N idrossido di sodio (NaOH).
    2. Sterilizzare con un 0,22 µm filtro e conservare a 4 ° C. Questa soluzione rimarrà stabile fino ad una settimana a 10 giorni.
  2. Tripsina
    1. preparare una soluzione di riserva ad una concentrazione di 25 g/L di tripsina in cloruro di sodio 0,9%. Conservare la soluzione a -20 ° C.
  3. Trypsin Inhibitor
    1. preparare un brodo con una concentrazione di 10 mg/mL da sciogliere 1 g di inibitore della tripsina pollo uovo bianco in 100 mL di HCl. negozio di 1 mM questa soluzione a -20 ° C.
  4. Dnasi
    1. sciogliere 100 mg del DNase 1 in 10 mL di acqua sterile per generare uno stock di 10 mg/mL. Conservare la soluzione a -20 ° C.
  5. MgSO 4
    1. aggiungere 6,02 g di solfato di magnesio (MgSO 4) a 50 mL di acqua distillata (H 2 O) per generare uno stock di 1m. Conservare la soluzione a 4 ° C.
  6. CaCl 2
    1. sciogliere 0,735 g di cloruro di calcio (CaCl 2 ∙ 2 H 2 O) in 50 mL di acqua distillata di H 2 O a una concentrazione stock di 100 mM. Conservare la soluzione a 4 ° C.
  7. KCl
    1. sciogliere 3.7275 g di KCl in 50 mL di distillato di H 2 O a una concentrazione stock di soluzione negozio M. 1 a 4 ° C.
  8. D-(+)-glucosio
    1. sciogliere 1,802 g di D-(+)-glucosio in 50 mL di acqua distillata H 2 O a una concentrazione stock di 100 mM. Conservare la soluzione a 4 ° C.
  9. Terreni di coltura delle cellule
    1. preparare terreni di coltura delle cellule come segue: 5 mL di calore inattivato dializzati siero bovino fetale, 500 µ l di 200 mM L-Glutammina, 100 µ l di 50 mg/mL Gentamicina e 1 mL di KCL 1,0 M dovrebbe essere aggiunto a 45 mL del filtro sterilizzato Eagle ' s minimo essenziale di media (E-MEM) che è integrato con 1,125 g/L D-glucosio per generare 50 mL di terreni di coltura di neuroni cerebellari del granello. Conservare i supporti a 4 ° C.
  10. Furanoside Beta-D-Arabino citosina
    1. sciogliere 48 mg di citosina beta-D-arabino furanoside in 10 mL di coltura ad una concentrazione stock di 20 mM. Conservare la soluzione a -20 ° C.
  11. Poli-D-lisina
    1. per generare un poli Stock in D-lisina di 2 mg/mL, aggiungere 10 mL di sterile H 2 O a 20 mg di poli D-lisina. Stock poli D-lisina devono essere conservato a-80 ° C in aliquote di 100 µ l.
  12. Nota: le seguenti soluzioni devono essere preparate prima della dissezione e mantenute a 4 ° C fino all'utilizzo.
  13. MgSO 4 supplementato dissezione soluzione
    1. aggiungere 300 µ l di stock MgSO 4 a 250 mL di soluzione di dissezione.
  14. Soluzione di tripsina dissezione
    1. aggiungere 100 µ l di tripsina stock e 12 µ l di stock MgSO 4 a 10 mL di soluzione di dissezione.
  15. Tripsina inibitore soluzione 1
    1. µ l di aggiungere 164 dell'inibitore della tripsina stock, 250 µ l di brodo 1 DNasi e 12 µ l di stock MgSO 4 a 10 mL di soluzione di dissezione.
  16. 2 soluzione di tripsina inibitore
    1. µ l di aggiungere 1040 di inibitore della tripsina stock, 750 µ l di brodo 1 DNasi e 12 µ l di brodo MgSO4 a 10 mL di soluzione di dissezione.
  17. CaCl 2 completato soluzione dissezione
    1. aggiungere 10 µ l di stock CaCl 2 e 25 µ l di stock MgSO 4 a 10 mL di soluzione di dissezione.
  18. Poli D-lisina rivestito Petri
    1. per ricoprire le piastre di coltura, diluire 100 µ l di stock poli D-lisina in 40 mL di sterile H 2 O. Per piastre di coltura Nunc 35mm, aggiungere 2 mL di poli diluito soluzione D-lisina. Per 4 pozzetti, aggiungere 300 µ l di diluito poli D-lisina in ciascun pozzetto.
    2. Lasciare il sit di D-lisina poli per 1 h prima di aspirare e lavare ogni bene con 4 mL o 600 µ l (per 35 millimetri cultura piatti o 4 pozzetti, rispettivamente) di sterile H 2 O. Poi aspirare l' H 2 O e lasciare asciugare per 1 h. l'aria di piatti

2. Estrazione e isolamento del cervelletto cervello

  1. decapitare un 6-7 giorno di età pup del mouse utilizzando le forbici decapitazione. Eseguire la dissezione del cervello in un cappuccio sterili per coltura.
  2. Per rimuovere il cervello, afferrare la testa usando un paio di pinze e tagliare attraverso la pelle verso l'anteriore della testa usando le forbici microdissection come dimostrato nella Figura 1. Poi tagliare attraverso le ossa del cranio, utilizzando un nuovo paio di forbici per minimizzare il rischio di contaminazione. Rimuovere il teschio che coprono il cervello usando il forcipe e tirarne fuori il cervello con il forcipe o una spatola.
    1. Come necessario, tagliare attraverso il nervo ottico per facilitare l'ottenimento del cervello come un tutt'uno.
  3. Posto il cervello nella soluzione di dissezione che è integrata con MgSO 4. Tenere la soluzione e il cervello su Ice.
  4. Seguente rimozione, sotto un microscopio di dissezione del cervello, sezionare il cervelletto dal cervello mentre era ancora in soluzione di dissezione di MgSO 4 completato e rimuovere le meningi utilizzando una pinzetta. Girare il cervelletto al relativo lato ventrale e assicurare la rimozione del plesso coroidico.
  5. Piscina i cervelletti in un piatto di 35 mm contenente ~ 1 mL di soluzione di dissezione di MgSO 4 completato.
  6. Tagliare il tessuto in piccoli pezzi e trasferire in una provetta da 50 mL contenente 30 mL di soluzione di dissezione di MgSO 4 tamponata.

3. Mouse cerebellari del granello del neurone isolamento e Culturing

  1. Centrifugare la provetta 50 mL contenente il tessuto cerebrale tritato per 5 min a 644 x g e 4 ° C.
  2. Rimuovere il supernatante e aggiungere 10 mL di soluzione di dissezione di tripsina. Poi agitare il tubo ad alta velocità per 15 min a 37 ° C.
  3. Aggiungere 10 mL di soluzione di tripsina inibitore 1 al tubo e rock delicatamente per 2 min.
  4. Centrifugare la provetta per 5 min a 644 x g e 4 ° C.
  5. Rimuovere il supernatante e aggiungere 2 mL di soluzione di tripsina inibitore 2 e poi trasferirlo in una provetta da 15 mL.
  6. Triturare il tessuto nel tubo da 15 mL, fino a quando la soluzione diventa torbida. Quindi lasciar decantare per un minimo di 5
  7. Rimuovere il supernatante chiaro e trasferire il surnatante in una provetta nuova contenente 1 mL di soluzione di CaCl 2 completato dissezione.
  8. Aggiungere un altro mL di soluzione di tripsina inibitore 2 verso il basso del tubo contenente il pellet dal punto 3.6. Triturare nuovamente e lasciar riposare per 5 minuti rimuovere il surnatante e aggiungerlo nella provetta contenente il supernatante dal passo 3,7 (che è una ripetizione di passaggi 3.6-3.7). Ripetere questo processo fino a quando la maggior parte del tessuto è meccanicamente dissociato.
  9. Aggiungi 0,3 mL di CaCl 2 completato soluzione di dissezione alla raccolta di surnatante per ogni mL di surnatante.
  10. Mescolare il contenuto del tubo e poi Centrifugare per 5 min a 644 x g.
  11. Rimuovere il supernatante e aggiungere 10 mL di mezzi freschi per il pellet e mescolare.
  12. Cellule possono quindi essere contati e diluite a una concentrazione di 1.5 x 10 6 cellule/mL. Siete pregati di notare che in generale le cellule 10 milioni sono attesi da ogni cervello dissecata, dipenda dal tempo di trypsinization e l'efficienza della dissezione. Piastra di cellule su piastre precedentemente fatte poli D-lisina. Per 4 pozzetti, piastra 0,5 mL, dando 7,5 x 10 5 cellule per pozzetto. Per i piatti di 35 mm, piastra 4 mL, dando 6 x 10 6 cellule per piastra.
  13. Dopo 24 h, aggiungere citosina-β-arabino furanoside (AraC) alle piastre per ridurre la contaminazione gliale. Per ogni mL di media 0,5 µ l di 20mm AraC è richiesto. Aggiunta di AraC non richiede un cambiamento di media. Se le cellule sono conservati per 7-8 giorni, ripetere questo trattamento il giorno 3.
  14. Mantenere culture in un 5% CO 2 incubatore a 37 ° C e mangimi con 100 µ l di 100 millimetri di glucosio aggiunto alla cultura per ogni 2 mL di media ogni 2 giorni, 5 giorni passati. Non è necessaria una modifica completa per i media.

4. Imballaggio dei lentivirus, purificazione e titolazione

Nota: il protocollo per l'imballaggio, la concentrazione, la purificazione e la titolazione di lentivirus precedentemente è stato descritto in dettaglio senza l'uso di un kit 28, compresi i metodi alternativi per la titolazione, come ad esempio flusso cytometry 29. Qui presentiamo brevemente il protocollo utilizzato nel nostro laboratorio per la produzione di lentivirus per studiare la lesione di un neurone utilizzando la soluzione di purificazione virus veloce e un kit di titolazione lentivirali qPCR.

  1. Piastra Hek293T cellule in piastre di coltura di 10cm con Dulbecco ' s modificato Eagle ' medium essenziale minimo s (DMEM) completati con 10% FBS. Per ottenere un alto titolo virale, crescere almeno 5 piatti di Hek293T cellule per ogni trasfezione. Assicurarsi che il giorno delle cellule di transfezione sono 70% confluenti. Cambiare supporto tre ore prima della trasfezione.
  2. Per ogni trasfezione, preparare due provette. In tubo 1 aggiungere 1,5 mL Siero MEM-riduzione media e 41 µ l di reagente di transfezione, mescolare bene. Nel tubo 2, aggiungere 1,5 mL di media di siero MEM-ridotto e 6 µ g del plasmide di trasferimento, 6 µ g di pCMV-dR8.2 vettoriale (plasmide imballaggio), vettore di 3 µ g pCMV-VSV-G (plasmide busta) e 35 µ l di reagente di enhancer p3000 (fornito con lipofectamine). Mescolare bene e combinare tubi 1 e 2, vortex e incubare per 15 min.
  3. Rimuovere il 50% dei mezzi di comunicazione da piastre di Hek293T e aggiungere complessi DNA-lipidi alle cellule. Incubare per 6 h a 37 ° C, 5% CO 2. Rimuovere i supporti e sostituire con 5 mL di DMEM fresco, incubare per una notte.
  4. Alle 24 ore post-transfezione, raccogliere il primo lotto di surnatante virale da ogni piatto. Mantenere i mezzi di comunicazione virale a 4 ° C e aggiungere 5 mL di terreno fresco in ogni piatto di Hek293T cellule. Incubare per una notte.
  5. 48 ore post-transfezione, raccogliere il secondo lotto di surnatante virale, combinarlo con il primo lotto e centrifugare combinato surnatante virale per 10 min a 600 x g.
  6. Filtrare il surnatante attraverso un filtro con pori di 45 µm.
  7. Purificare il virus utilizzando una soluzione di purificazione speedy virus. Per ogni 45 mL di surnatante virale, aggiungere 5 mL di soluzione di rilegatura lentivirali, mescolare e centrifugare per 10 min > 5.000 x g e a 4 ° C.
  8. Rimuovere il surnatante con attenzione per non disturbare il pellet.
  9. Aggiungere 20-40 µ l di terreno e risospendere il pellet. Aliquotare e conservare a -80 ° C.
  10. Per ottenere il titolo di vettori lentivirale, un kit di titolazione lentivirali qPCR viene utilizzato. Diluire 2 µ l di virus purificato in 500 µ l di PBS. Aggiungere 2 µ l di virus diluito a 18 µ l di tampone di lisi di virus (fornito nel kit).
  11. Set a tre diverse reazioni di RT-q-PCR in triplicates ed etichettare come controllo positivo, lisato virale 1 (STD1) e controllo positivo 2 (STD2). Per ogni reazione aggiungere, 12,5 µ l di 2 x qPCR MasterMix, 2,5 µ l di sia virale lisato o STD1 (fornito nel kit) o STD2 (fornito nel kit) e 10 µ l di reagente-mix (fornito nel kit) in provette per PCR 0,2 mL.
  12. Impostare il programma PCR come segue: 20 min a 42 ° C per trascrizione inversa, 10 min a 95 ° C per l'attivazione degli enzimi, 40 cicli di 15 s a 95 ° C per denaturazione e 1 min a 60 ° C per ricottura/estensione.
  13. Calcolare il titolo virale utilizzando questa formula:
    Titolo di virale lisato = 5 x 10 7 / 2 3(Ctx-Ct1)/(Ct2-Ct1).
    CTX = valore medio di Ct del campione sconosciuto, Ct1 = valore medio di STD1, Ct2 = valore medio di STD2.
    Nota: CGNs può essere meglio trasdotte con lentivirus o infetti con adenovirus a seconda della modalità di lesioni in fase di studio. Aggiunta di lentivirus presso un MOI di 2-3 alla soluzione di cultura cellulare al momento della placcatura è usato per studiare NMDA indotta segnalazione al 7 ° giorno della cultura. Ciò si traduce in più di 80% trasduzione ed è opportuno procedere con analisi biochimiche di questi neuroni ( Figura 2). Aggiunta di adenovirus giorno 5 di cultura (a 50 MOI) e lo studio di NMDA indotta segnalazione a giorno 7-8 viene utilizzato per altre tecniche come l'imaging. Questo trattamento si traduce in meno del 10% l'infezione dei neuroni, che lo rende ideale per l'imaging e co-localizzazione delle proteine. Adenovirus possono essere utilizzati al momento della placcatura a studiare la morte delle cellule del DNA danno indotto tramite l'aggiunta di camptothecin al giorno 2-3 o stress ossidativo mediante aggiunta di acqua ossigenata. La presenza di proteine di fluorescenza (GFP, RFP, PCP o YFP) etichettata al gene di interesse può essere utilizzata per stimare la percentuale trasduzione e potenziale tossicità. Con il MOI consigliato, vediamo tossicità minima e massima trasduzione ( Figura 3).

5. Lesione di un neurone di modellazione

  1. per indurre NMDA indotta eccitotossicità neuronale, dopo 7 giorni in vitro, trattare CGNs con 100 µM NMDA e glicina 10 µM per 1 h. sostituire tutto il mezzo con il medium condizionato dalle culture parallele con n trattamento. Questa concentrazione risultati nella morte delle cellule di 50% al trattamento dopo 24 h ( Figura 3). Frammentazione mitocondriale è evidente al trattamento dopo 6-8 h (vedere Jahani-Asl et al. 26 , 27).
  2. per indurre la morte cellulare indotta da ROS (stress ossidativo), trattare neuroNS con 75-100 µM perossido di idrogeno (H 2 O 2) e passare alla condizionata media da culture parallele che seguono l'esposizione di 5 min a H 2 O 2. Nota, a causa dell'instabilità di H 2 O 2, ottimizzare la concentrazione ad un livello che induce la morte di 50-70% delle cellule in coltura dopo 24 h di trattamento.
  3. Per indurre il DNA danneggiano la morte cellulare indotta, trattare CGNs con 10 µM camptotecine. Questa concentrazione induce più di morte delle cellule di 50% in 24 h. frammentazione mitocondriale e segnale apoptotico precoce si verifica 2-3 h dopo l'aggiunta della camptotecina a questa concentrazione (vedere Jahani-Asl et al. 18)
  4. per indurre apoptosi neuronale indotta da K + basso in CGNs, cambiare supporto contenente 25 mM K + ai media di potassio basso con 5 mM K + dopo 7 giorni in vitro.

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Representative Results

Con la dissezione attenta, cervello intatto deve essere rimosso con il minimo danno come visto in Figura 1A-B. Sforzo dovrebbe essere presa per minimizzare i danni al cervello durante la rimozione, specialmente danni al cervelletto. Danneggiare il cervelletto rende più difficile identificazione e rimozione completa delle meningi e aumenta la probabilità di contaminazione della coltura neuronale. Una volta che sono state rimosse le meningi, cervelletto può essere dissecato dal tessuto rimanente come visto in Figura 1 e preparato per dissociazione.

Prima della placcatura, CGNs può essere trasdotte con lentivirus o infettati con l'adenovirus come descritto nella Figura 2. Troviamo la massima efficienza e tossicità minima con 50 MOI per infezione da adenovirus e un MOI di 2-3 al giorno di placcatura per lentivirus (Figura 3).

Trasdotte culture CGN sane alle 7 DIV sono presentate in Figura 3A. Se un numero elevato di cellule gliali rimanga presente nella cultura, si può aumentare la concentrazione di AraC per garantire una popolazione neuronale pura. Anche le cellule gliali prendono il virus più facilmente rispetto ai neuroni e che diventa critica se la trasduzioni vengono eseguite al giorno 5. La presenza di neuroni in fase di morte delle cellule può essere valutata dalla formazione di nuclei pyknotic, come si vede in Figura 3. Tutte le concentrazioni di NMDA, H2O2e camptotecine sono ottimizzati per indurre la morte delle cellule di 50% dopo 24 h. In questo modo per studiare altri eventi iniziali che precedono la perdita di un neurone come frammentazione mitocondriale.

Figure 1
Figura 1: rimozione del cervello del topo e la dissezione del cervelletto. (A) per estrarre il cervello di un topo di 6-7 giorno vecchio, usando un paio di pinze, afferrare la testa e tagliare la pelle anteriormente lungo le linee tratteggiate utilizzando un paio di forbici di microdissection. Fare attenzione a tagliare solo la pelle e il tessuto connettivo, un'incisione troppo profonda potrebbe perforare il cranio e danneggiare il cervello. Questi tre incisioni, dritto lungo la linea mediana e due curvando lateralmente, consentono alla pelle di essere spinto indietro rivelando il cranio. Una volta esposto, il cranio può essere penetrato con la punta delle forbici e tagliare anteriormente. Dovrà prestare molta attenzione per non danneggiare il cervelletto per facilitare l'identificazione e rimozione dei meninges. Una volta tagliato, forcipe può essere usato per tirare indietro il cranio, esponendo il cervello che poi può essere in giro nella soluzione di dissezione cool usando un paio di pinze o spatola. Al fine di rimuovere il cervello, il nervo ottico potrebbe essere necessario essere reciso. (B) una volta rimosso dal cranio, meningi dovrebbero essere rimosso dal cervelletto utilizzando una coppia di una pinzetta punta. (C) utilizzando una coppia di una pinzetta punta, il cervelletto è dissecata dal tessuto rimanente e controllata per garantire la rimozione completa delle meningi. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2: lesione di un neurone in neuroni cerebellari del granello di modellazione. Cervelletti isolati dal giorno che 6-7 topi sono dissociati in singole celle seguendo la procedura presentata nella parte 3. A seguito di dissociazione, cellule sono contati e risospesi in un volume di terreno di coltura per generare 1.5 x 106 cells/mL.For piatti di 35 mm, 4 mL sono placcati, dando 6 x 106 cellule per piastra. Per l'imaging di diapositive, 0,5 mL è placcato, dando 7,5 x 105 cellule per pozzetto. CGNs può essere trasdotte con lentivirus o infettati con l'adenovirus. Utilizzando l'adenovirus il giorno della placcatura (0 giorni in vitro (DIV)) dà maggiore di 90% di efficienza di trasfezione e permette per lo studio della lesione di un neurone attraverso lo sforzo ossidativo e danno al DNA. L'aggiunta di 10 µM camptotecina (CPT) può indurre danni al DNA, mentre 75-100 µM perossido di idrogeno (H2O2) induce lo sforzo ossidativo. La concentrazione di H2O2 deve essere ottimizzata per indurre la morte delle cellule di 50% dopo 24 h. Infettare con adenovirus alle 5 DIV dà una bassa efficienza di trasduzione di meno del 10%. Alle 7 DIV quando i recettori NMDA sono arricchiti nella cultura, neuroni possono essere trattati con 100 µM NMDA e glicina 10 µM per indurre excitotoxicity. Questo è l'ideale per successive analisi di imaging o l'analisi di un singolo neurone. Infine, trasducendo con lentivirus a DIV 0, seguita da trattamento con 100 µM NMDA e 10 µM glicina a 7 DIV, dà un efficienza di trasduzione sufficientemente elevato (> 80%) per consentire l'analisi biochimica della cultura, tra cui ChIP sequenziamento, esaminando espressione della proteina ed eseguire dosaggi live/dead. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: i neuroni cerebellari del granello. (A) neuroni erano trasdotte con lentivirus per RFP presso un MOI di 3 al momento della placcatura e fissi e macchiati a 7 giorni in vitro. Colocalizzazione di segnale RFP, MAP2 e Hoechst viene visualizzato per illustrare i neuroni sani che sono completamente microlavorati lentivirus. (B) le immagini rappresentano dal vivo morto analisi analisi dei neuroni infettati con diversi MOI, per misurare la tossicità. CGNs infettati con l'adenovirus esprimendo LacZ presso un MOI tra 25 e 50 permette per la massima efficienza, pur mantenendo la tossicità minima. Meno di una differenza di 1% nella sopravvivenza delle cellule rispetto al controllo è visto quando infettare a questo MOI. (C) Hoechst macchiatura di controllo CGNs e CGNs trattati con NMDA per indurre la morte delle cellule. Si noti la formazione di nuclei pyknotic con trattamento di NMDA. Questo è indicativo della morte delle cellule e può essere visto in circa il 50% della cultura 24 h dopo il trattamento con 100 µM NMDA e 10 µM glicina. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Qui forniamo un metodo semplice per la coltura di neuroni cerebellari del granello di mouse primario (CGNs), perdita e guadagno di funzione studia e modellazione di diversi meccanismi di morte cellulare. Diversi fattori influenzano la riproducibilità dei risultati utilizzando questa procedura che richiedono un attento monitoraggio. Questi includono la purezza della cultura tra cui l'eliminazione delle cellule gliali nella cultura, alla confluenza della cultura e mantenere le cellule sane. L'introduzione di variabilità in questi fattori può influenzare i risultati e sfida la riproducibilità. Qui di seguito descriviamo come ridurre al minimo i fattori che influenzano negativamente i risultati.

Per eliminare le cellule gliale dalla cultura CGNs e stabilire una popolazione neuronale pura, usiamo 10 µM di citosina-β-arabino furanoside (AraC), un antimetabolita pirimidinico che uccide le cellule proliferanti inibendo la sintesi del DNA. Se c'è ancora una popolazione di cellule gliali presenti, la concentrazione di AraC può essere aumentata a 15 µM. Questo è anche molto dipendente. Inoltre, per le lingue che vengono mantenute fino a 7-8 giorni, un secondo trattamento di AraC può essere eseguito il giorno 3. Per ottenere una popolazione neuronale pura ed evitare la morte cellulare, è importante a buccia tutte le meningi fuori il cervelletto prima di tagliare il tessuto in pezzi, seguite da trypsinization. Questo dovrebbe essere fatto in un periodo ragionevolmente breve di tempo (non più di 7-10 min al cervelletto). La presenza di meningi nei risultati della coltura neuronale in cultura malsana e, infine, morte delle cellule. Un altro fattore che potrebbe provocare la morte dei neuroni prima del trattamento è la volta di trypsinization. È importante che le cellule non sono eccessivamente trypsinized. D'altra parte, sotto-trypsinization richiede ulteriore dissociazione di meccanica delle cellule che possono danneggiarli o provocare un rendimento basso. Di conseguenza, il tempo di trypsinization richiede l'ottimizzazione ed è molto dipendente.

Il successivo fattore da considerare è la confluenza delle cellule al momento dell'uso. Confluency di diversi possono generare variabilità nei risultati. Ciò è particolarmente importante a seconda la lettura negli esperimenti. Con uno stato di basso confluenza, neuroni iniziano a ciuffo dopo 2-3 giorni. Uno stato troppo bassa o troppo alta confluenza dei neuroni altera la segnalazione. È importante contare il numero di cellule vive per placcatura accurata.

Sono stati descritti altri metodi di culture CGN, specialmente guardando le procedure di coltura di base utilizzando un sistema di papaina dissociazione kit 30 come bene come post-coltura le procedure e la manipolazione di CGN per studiare la migrazione neuronale e morfologia 31. Il protocollo presentato da Lee et al. viene descritto l'utilizzo del Kit sistema papaina dissociazione. Ci hanno consigliato due metodi per aumentare la purezza della CGNs isolato: in esecuzione le cellule attraverso una separazione di gradienti di Percoll, così come pre-placcatura su una zolla di poli-D-lisina per 20 min. Entrambi i metodi sono per facilitare la separazione di CGNs da contaminanti glial. Questo è consigliato nel caso in cui il trattamento con AraC da sola non è sufficiente per arricchire per coltura pura di un neurone. Inoltre, Lee utilizza cuccioli: 4-6 gg vecchio mouse, mentre questo serve un modello efficace per l'esame di differenziamento neuronale; troviamo che usando CGNs da cuccioli di 6-7 giorno vecchio mouse è più appropriato per lo studio della lesione di un neurone. Holubowska et al. presenta un protocollo per la transfezione di neuroni cerebellari post mitotic utilizzando il fosfato di calcio metodo in vitro ed elettroporazione in vivo. Questi sono ottimi metodi per la manipolazione genetica dei neuroni in cui un singolo neurone possa essere rintracciato. L'efficienza di trasfezione mediante metodo di fosfato di calcio può variare da 0,1-5%. Di conseguenza, troviamo che per le analisi biochimiche tra cui analisi ChIP-Seq, Co-immunoprecipitazione e immunoblotting, uso di lentivirus è più appropriato come si traduce in più di 80% trasduzione quando transduced al momento della placcatura.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Acknowledgments

Questo lavoro è supportato da scienze naturali e ingegneria Research Council of Canada e la canadese istituti di ricerca sanitaria concede a A.J.-A.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
qPCR lentivitral titration kit  ABM #LV900
speedy virus purification solution  ABM #LV999
pCMV-dR8.2 Addgene #8455
pCMV-VS.VG Addgene #8454
Distilled water  Gibco #15230162
200 mM L-Glutamine  Gibco #25030081
35 mm Nunc culture dishes Gibco #174913
PowerUP SYBR green master mix life technologies #A25742
BSA V Solution Sigma Aldrich #A-8412
CaCl2 • 2H2O Sigma Aldrich #C-7902 
Camptothecin Sigma Aldrich #C-9911
Chicken Egg White Trypsin Inhibitor  Sigma Aldrich #10109878001
Cytosine beta-D-Arabino Furanoside Sigma Aldrich #C-1768
D-(+)-Glucose  Sigma Aldrich #G-7528
DNase1  Sigma Aldrich #11284932001
Eagle-minimal essential medium Sigma Aldrich #M-2279
Glycine Sigma Aldrich #G-5417
Heat inactivated dialyzed Fetal Bovine Serum  Sigma Aldrich #F-0392
Hepes Buffer  Sigma Aldrich #H-0887
Hydrogen peroxide Sigma Aldrich #216763
50 mg/mL Gentamycin  Sigma Aldrich #G-1397
MgSO4  Sigma Aldrich #M-2643
N-Methyl-D-aspartic acid Sigma Aldrich #M-3262
Phenol Red Solution  Sigma Aldrich #P-0290
Trypsin  Sigma Aldrich #T-4549
Lipofectamine 3000 Thermo Fisher Scientific L3000-008
p3000 enhancer reagent Thermo Fisher Scientific L3000-008
Opti-MEM I Reduced Serum Medium Thermo Fisher Scientific 31985070
KCl  VWR #CABDH9258
NaCl  VWR #CABDH9286
NaH2PO4H2O  VWR #CABDH9298
Poly D-lysine  VWR #89134-858
DMEM Wisent #319-005-CL
FBS Wisent #080-450

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Modellazione di morte neuronale e degenerazione in neuroni cerebellari del granello primario del Mouse
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Laaper, M., Haque, T., Slack, R. S., Jahani-Asl, A. Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons. J. Vis. Exp. (129), e55871, doi:10.3791/55871 (2017).

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