Summary
이 프로토콜 분리 하 고 기본 마우스 뇌과 립 신경 (CGNs) 6-7 주 오래 된 강아지, 손실에 대 한 CGNs의 효율적인 변환 및 기능 연구의 이득에서에서 경작 하 고 NMDA 유발 신경 excitotoxicity, 모델링에 대 한 간단한 방법을 설명 합니다. 낮은 칼륨-유도 된 세포 죽음, DNA 손상 및 산화 스트레스 같은 문화 모델을 사용 하 여
Abstract
소 뇌과 립 신경 (CGNs)는 소 뇌에 풍부한 균질 인구를 형성 일반적으로 사용 되 신경 모델입니다. 그들의 출생 개발, 풍부, 및 접근에 비추어 CGNs는 신경 프로세스, 신경 개발, 생리 적 신경 활동 자극, 신경 마이그레이션 등을 공부 하는 이상적인 모델입니다. 또한, CGN 문화 excitotoxicity 등 apoptosis는 세포 죽음의 다른 모드를 공부에 대 한 훌륭한 모델을 제공 합니다. 문화에 주, CGNs N-메 틸-D-aspartate (NMDA) 수용 체, 신경 건강 및 질병에 많은 중요 한 기능을 가진 특정 ionotropic 글루타민 산 염 수용 체를 표현 한다. 함께 설치류 기본 CGN 문화에 막 도발은 NMDA의 낮은 농도의 추가 동안 NMDA의 높은 농도의 추가 모델을 채택 될 수 있다 생리 적 신경 활동 자극을 모델링 하는 데 사용 되었습니다. excitotoxic 신경 부상입니다. 여기, 격리의 방법 및 6 주 오래 된 강아지 adenoviruses와 lentiviruses CGNs의 유전자 조작에서 CGNs의 배양 설명 되어 있습니다. 우리는 또한 NMDA 유도 excitotoxicity, 낮은 칼륨-유도 된 apoptosis, 산화 스트레스와 DNA 손상 이러한 뉴런의 변환에 따라 자극 하는 방법에 현재 최적화 된 프로토콜.
Introduction
소 뇌과 립 신경 (CGNs) 문화에서 잘 성격을 나타낸다 고 신경 죽음 및 개발 1,2,3,,45, 연구는 효과적인 모델 역임 6. CGN 문화에서 체 외에 있는 N-메 틸-D-aspartate (NMDA) 수용 체의 초기 식 게 NMDA 유도 신호를 공부 하는 매력적인 모델. 함께 막 도발은 NMDA와 함께 이러한 수용 체의 활성화 생리 적 신경 활동 자극, 모델링 하는 데 사용 되 고 시 냅 스가 소성 7,8의 메커니즘으로 연구에 대 한 허용 했다. 그와 반대로, NMDA ligand에 의해 이러한 수용 체의 과잉 자극 excitotoxicity, 급성 뇌 손상 및 신경 퇴행 성 질환 9신경 손실의 주요 메커니즘을 모델링 하는 데 사용할 수 있습니다. 급성 신경 상해 본 excitotoxicity의 유도 대 한 메커니즘 중 하나 감소 산소와 ATP 기아 통해 이다. 그러면 막 도발은 고 조미료의 높은 수준의 시 냅 스에서 출시. 과도 한 Ca2 + 유입이 수용이 체를 통해 여러 경로 포함 하 여 캘리포니아2 +차례 차례로 활성화에 높은 조미료 결과 NMDA 수용 체의 후속 overstimulation-phospholipases, 프로 테아 제 활성화 및 endonucleases, 중요 한 세포 구성 요소와 세포 죽음의 통제 저하 발생 또한, 높은 세포내 캘리포니아2 + 리드 생성 산소 자유 래 디 칼 및 미토 콘 드리 아 손상 10,11.
NMDA 유발 신경 excitotoxicity 다음 신경 손실의 대부분은 칼슘 유입 때문 이며 Bax/박 독립,이 모델에서 세포 죽음의 다른 메커니즘을 제외할 수 없습니다. 회 저 성 둘 다의 외관 그리고 apoptotic 세포 죽음 excitotoxicity 때문 반응성 산소 종 (선생님)와 높은 세포내 캘리포니아2 + 레벨 12로 인 한 DNA 손상의 발생으로 인해 부분적으로 같은. DNA 손상 신경 죽음 apoptotic 세포 죽음, chromatin 대중과 apoptotic 시체의 모습 등의 연관 되는 apoptotic 메커니즘을 통해 결과. Apoptosis의 감 응 작용은 미토 콘 드리 아에서 시 토 크롬 c의 출시를 통해 중재 그리고 Bax/박 oligomerization 13에 종속 되도록 표시 되었습니다. Bax/박 oligomerization 시 토 크롬 c 출시 및 프로 apoptotic 레 귤 레이 터로 가벼운 허 혈 성 부상 14본의 활성화의 결과로 외부 미토 콘 드리 아 막의 기 공 형성을 촉진 합니다.
선생님의 세대 신경 기능 15큰 산소 요구와 결합 하는 항 산화 물질의 낮은 생 수준 때문에 뇌에서 중요 한 문제입니다. 허 혈 성 이벤트에 노출 되 면 산화 질소 synthase upregulated, 질소 산화물을 생성 하 고 반응성 산소 종 14증가입니다. 산소 래 디 칼의 농도 증가 DNA 손상 하 고 간접적으로 에너지 부족을 일으킬 수 있습니다. 높은 수준의 DNA 이중 가닥 나누기의 폴 리 ADP ribose 중 합 효소-1 (PARP-1), 진 핵 chromatin-바인딩 단백질 catalyzing 나드+, 통합 하는 과정에서에서 ADP ribose 단위 전송에 대 한 책임의 활성화에 의해 조치를 취했고합니다 DNA 수리 16. 그러나, 산화 스트레스로 인해 과도 한 손상, PARP 1 활성화 하면 증가 드레인으로 인해 에너지 기아 나드+, 산화 인 산화를 통해 ATP 생산을 위한 필요한 기판에. 궁극적으로, 산화 스트레스는 미토 콘 드리 아 시 토 크롬 c 출시로 이어지는 Bax/박 종속 방식으로 apoptosis를 일으킬 것 이다 그리고 유도 미토 콘 드 리아 CGNs 17개장을 보여줘 왔다.
마지막으로, 염화 칼륨 (KCl) CGN 문화에서의 농도에 변화 낮은 칼륨/도발은 중재 apoptosis 18,,1920를 사용할 수 있습니다. K+의 낮은 수준에 드러낼 때, CGNs 받아야 뚜렷한 생리 적 변화, 미토 콘 드리 아 호흡의 분해, 세포질 수요 감소 21에 감소 레벨의 감소에 있는 결과 핵 요인-κB (NFκB) 염증, 시 냅 스 전송 22등의 활동을 조절. 이 모형은 신경 발달 동안에 세포 죽음의 연구에 대 한 특정 관심의 이다. 낮은 K+ 환경 더 밀접 하 게 유사한 생리 적 조건, 고 신경 개발 23중 세포 죽음의.
요약 하자면, CGNs 신경 죽음 및 변성의 기본 분자 메커니즘을 조사 하는 오랜 모델을 제공 합니다. 다음 프로토콜 고립과 CGNs, 식 또는 바이러스 및 신경 상해 및 변성을 대표 하는 다른 메커니즘을 통해 신경 죽음의 유도 사용 하 여 특정 유전 통로의 억압의 경작을 허용할 것 이다.
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Protocol
이 프로토콜에 따라 수정 된 절차의 설명 이전 18 , , 24 25 , 26 , 27.이 프로토콜 맥 길 대학에서 동물 관리 위원회에 의해 승인 됩니다.
1. 실험 준비
참고: 다음 재고 솔루션을 준비 하 고 사용할 때까지 유지 수.
- 디졸브 3.62 g 염화 나트륨 (NaCl), 염화 칼륨 (KCl), 0.069 g의 나트륨 인산 염의 0.2 g의
- (NaH 2 포 4 ∙ H 2 O), 1.306 g D-(+)-500 mL의 포도 당 증 류 된 H 2 o. 그런 다음 솔루션에 HEPES 버퍼, 페 놀 레드 솔루션의 450 µ L 및 BSA 분수 V의 20 mL의 12.5 mL를 추가 합니다. PH 7.4 1 N 수산화 나트륨 (NaOH)를 사용 하 여 조정.
- Sterilize 0.22 μ m 필터와 4 ° c.에 게 이 솔루션 10 일 최대 1 주일 동안 안정적으로 유지 됩니다.
- 0.9% 염화 나트륨에에서 trypsin의 25 g/L의 농도에서 재고 솔루션을 준비. 저장 솔루션-20에 ° c.
- 닭고기 달걀 흰 트립 신 억제 물 100 ml의 1 m m HCl. 저장소의 1 g을 용 해 하 여-20에이 솔루션 10 mg/mL의 농도와 재고를 준비 ° c.
- 100mg DNase 1의 10 mg/mL 재고를 생성 하기 위해 살 균 물 10 mL에 녹. 저장 솔루션-20에 ° c.
- 50 mL의 증류수 (H 2 O) 1 M 재고 생성 하에 6.02 g 황산 마그네슘 (MgSO 4)의 추가. 저장 솔루션 4 ° c.
- 0.735 g 염화 칼슘의 분해 (CaCl 2 ∙ 2 H 2 O) 50 ml 증류수 H 2 O 100 m m의 재고 농도에. 저장 솔루션 4 ° c.
- 50 mL에 KCl의 분해 3.7275 g H 2 O 4에 1 M. 저장소 솔루션의 재고 농도에 증류수 ° c.
- 녹 1.802 g D-(+)-50 mL에 포도 증 류 H 2 O 100 m m의 재고 농도에. 저장 솔루션 4 ° c.
- 세포 배양 기를 다음과 같이 준비: 열의 5 mL 비활성화 소 태아 혈 청을 dialyzed, 200 m m 1.0 M KCL의 L-글루타민, 50 mg/mL Gentamycin 및 1 mL의 100 µ L의 500 µ L 45 mL에 추가 되어야 한다 필터의 소독이 글 ' s 최소한의 필수 미디어 (전자-MEM) 1.125 g/l D 보충-소 뇌과 립 신경 문화 미디어의 50 mL를 생성 하는 포도 당. 저장 미디어 4 ° c.
- 48 mg 10 ml 20 m m의 재고 농도에 성장 매체의 시 토 신 베타-D-arabino furanoside의 분해. 저장 솔루션-20 ° c.
- 2 mg/mL 폴 리 D-리 신 주식을 생성, 폴 D-리 리의 20 밀리 그램 살 균 H 2 O의 10 mL을 추가. 소재 폴 리 D-라이 신-80 ° c 100 µ L aliquots에서 저장 해야 합니다.
- 재고 MgSO 4 절 개 솔루션의 250 mL의 추가 300 µ L.
- 재고 trypsin 및 재고 MgSO 4 절 개 솔루션의 10 mL의 12 µ L의 추가 100 µ L.
- 재고 트립 신 억제 물, 재고 DNase 1 250 µ L 해 부 솔루션의 10 mL를 재고 MgSO 4의 12 µ L의 추가 164 µ L.
- 재고 트립 신 억제 물, 재고 DNase 1 750 µ L 해 부 솔루션의 10 mL을 MgSO4 주식의 12 µ L의 추가 1040 µ L.
- 재고 CaCl 2 및 재고 MgSO 4 절 개 솔루션의 10 mL의 25 µ L의 추가 10 µ L.
- 코트 문화 요리, 살 균 H 2 o.의 40 mL에 재고 폴 리 D-리의 100 µ L를 희석 35 mm Nunc 문화 요리에 대 한 희석된 폴 리 D-리 솔루션의 2 개 mL를 추가 합니다. 4 잘 플레이트, 300 µ L 희석된 폴 리 D-리의 각 음을 추가할.
- 게 발음 하 고 각각을 세척 하기 전에 폴 리 D-리 앉아 1 h 4 mL 또는 600 µ L (대 35 mm 요리 문화 또는 4 잘 플레이트, 각각) 잘 살 균 H 2 o. H 2 O 발음 그리고 요리 공기 1 헤 건조
2. 추출 및 격리의 소 뇌 뇌
- Decapitate 6-7 일 오래 된 마우스 강아지 잘린이 위를 사용 하 여. 메 마른 조직 문화 후드에는 뇌의 해 부를 수행.
- 집게의 쌍을 사용 하 여 머리를 잡고 두뇌를 제거 하 고 그림 1에서 같이 서가 위를 사용 하 여 머리의 앞쪽으로 피부를 통해 잘라. 그럼 오염 위험을 최소화 하기 위해가 위의 새로운 쌍을 사용 하 여 두개골 뼈를 통해 서 잘라. 집게를 사용 하 여 두뇌를 포함 하는 두개골을 제거 하 고 집게 또는 주걱을 사용 하 여 두뇌 애타게.
- 전체적으로 뇌를 빼내 촉진을 시 신경을 통해 필요에 따라 잘라.
- 뇌 해 부 솔루션 MgSO 4 보충 되는 장소. 솔루션 및 얼음에 두뇌
- 다음 제거, 해 부 현미경 뇌, MgSO 4 보충 해 부 솔루션에서 뇌에서 뇌를 해 부하 고 meninges 미세 집게를 사용 하 여 제거. 그것의 복 부 측에 소 뇌 및 맥락 막 신경 총의 제거 확실히.
- MgSO 4 보충 해 부 솔루션의 ~ 1 mL를 포함 하는 35 mm 접시에는 cerebella 풀.
- 조직의 작은 조각으로 잘라 고 MgSO 4 버퍼링 해 부 솔루션의 30 mL를 포함 하는 50 mL 튜브로 전송.
3. 마우스의 소 뇌과 립 신경은 고립과 Culturing
- g x 644 및 4에 5 분에 대 한 다진된 대뇌 조직을 포함 하는 50 mL 튜브 원심 ° c.
- 제거는 상쾌한 고 트립 신 해 부 솔루션의 10 mL를 추가 합니다. 다음 37에서 15 분 동안 고속에 튜브를 흔들어 ° c.
- 트립 신 억제제 솔루션 튜브를 2 분에 대 한 부드럽게 바위 1의 추가 10 mL
- G x 644 및 4에 5 분 동안 튜브 원심 ° c.
- 는 상쾌한을 제거 하 고의 2 개 mL를 추가 트립 신 억제제 솔루션 2, 및 다음 이전 15 mL 튜브.
- Triturate 15 mL에 조직 관 솔루션 어두운 될 때까지. 다음 5 분에 대 한 정착 하자
- 분명 상쾌한을 제거 하 고 새 튜브 CaCl 2 보충 해 부 솔루션의 1 mL를 포함 하는 상쾌한 전송.
- 단계 3.6에서에서 펠 릿을 포함 하는 튜브의 하단에 트립 신 억제제 솔루션 2의 또 다른 mL를 추가 합니다. 다시 triturate 그리고 5 분은 상쾌한을 제거 하 고 상쾌한 단계 3.7 (즉, 반복 단계 3.6-3.7)에서 포함 된 튜브에 추가 대 한 합의. 조직의 대부분 기계적으로 해리 될 때까지이 과정을 반복.
- 추가 CaCl 2의 0.3 mL 보충 상쾌한의 모든 mL에 대 한 표면에 뜨는 컬렉션에 해 부 솔루션.
- 튜브의 내용을 믹스 하 고 644 x g.에서 5 분 동안 원심
- 제거는 상쾌한 10 mL 신선한 매체의 펠 릿을 추가 하 고 혼합.
- 셀 다음 계산 하 고 1.5 x 10 6 셀/mL의 농도를 희석 수 있습니다. 일반적으로 10 백만 셀 trypsinization 시간 및 해 부의 효율성에 따라 각 해 부 두뇌에서 예상 된다 note 하시기 바랍니다. 이전 만든된 폴 리 D-리 신 판에 셀 플레이트. 4-잘 접시, 접시 0.5 mL, 잘 당 10 5 셀 x 7.5를 주는. 35 mm 요리 접시 4 mL 접시 당 6 x 10 6 세포 주는.
- 후 24 h, glial 오염 줄이기 위해 접시를 시 토 신-β-arabino furanoside (아크)를 추가 합니다. 미디어의 각 mL 20 m m 아크의 0.5 µ L가 필요 합니다. 아크의 추가 미디어의 변화를 필요 하지 않습니다. 셀 하는 경우 7-8 일에 대 한 유지, 3 일에이 치료를 반복.
- 37 ° C에서 5% CO 2 배양 기에서 문화를 유지 하 고 100 m m 포도 당 매 2 일 지난 5 일 미디어의 모든 2 mL에 대 한 문화에 추가의 100 µ L를 피드. 완전 한 미디어 변경 필요 하지 않습니다.
4. Lentivirus 포장, 정화와 적정
참고: 포장, 농도, 정화 및 lentivirus의 적정에 대 한 프로토콜 이전 키트의 사용 없이 자세히 기술 되었다 28, 교류 cytometry 29 등 적정에 대 한 대체 메서드를 포함 하 여. 여기에 우리가 짧게 제시 신경 부상 빠른 바이러스 정화 솔루션 및 정량 lentiviral 적정 키트를 사용 하 여 공부 하기 lentivirus의 생산에 대 한 우리의 실험실에서 사용 하는 프로토콜.
- ' s 수정이 글 ' s 최소 필수 매체 (DMEM) 10% 보충 FBS. 높은 바이러스 titer를 얻기 위해 각 transfection에 대 한 Hek293T 셀의 적어도 5 접시를 성장. Transfection 셀 당일 확인은 70% 합칠. 변경 미디어 transfection 전에 3 시간.
Lysate의 바이러스 titer = 5 × 10 7 / 2 3(Ctx-Ct1)/(Ct2-Ct1).
Ctx = 알 수 없는 샘플, Ct1의 평균 Ct 값 = STD1, Ct2의 평균 값 = STD2의 평균 값.
참고: CGNs는 lentiviruses로 불리고 또는 공부 되 고 상해의 모드 adenoviruses 감염 최고의 될 수 있습니다. 도금 시에 2-3 셀 문화 솔루션의 나는 lentiviruses의 추가 NMDA 유도 신호 문화 제 7 일에 공부 하는 데 사용 됩니다. 80% 이상에서이 결과 변환 ( 그림 2) 이러한 뉴런의 생 화 확 적인 분석을 추구 하 고. (나 50)에서 문화와 NMDA 유도 하루 7-8에서 신호를 공부 하 고 5 일에 adenoviruses의 추가 영상 같은 다른 기술을 사용 됩니다. 10%가 하에이 치료 결과 신경 세포 이미징 및 단백질의 공동 지역화에 이상적의 감염. Adenoviruses 도금 시 DNA 손상 유도 된 세포 죽음을 공부를 과산화 수소의 추가 의해 하루 2-3 또는 산화 긴장에서 camptothecin의 추가 의해 사용할 수 있습니다. 관심사의 유전자에 형광 단백질 (GFP, RFP, CFP 또는 YFP)의 존재는 백분율 변환 및 잠재적인 독성 예측에 사용할 수 있습니다. 권장된 나 우리 볼 최소한의 독성과 최대 변환 ( 그림 3).
5. 신경 상해 모델링
- NMDA 유도
- 유도 신경 excitotoxicity, 체 외에 7 일, 1 헤 없이 병렬 문화에서 바른된 매체 바꿉니다 모든 매체에 대 한 100 μ M NMDA와 10 µ M 글리신 CGNs 치료 치료입니다. 이 농도 24 h 게시물 치료 ( 그림 3C)에서 50% 세포 죽음에서 발생합니다. 미토 콘 드 리아 조각화는 분명 6-8 h 게시물 치료 (참조 Jahani Asl 외. 26 , 27).
- 신경 치료 선생님-유도 된 세포 죽음 (산화 스트레스)을 유도 하는 것75-100 µ M 과산화 수소 (H 2 O 2)와 스위치를 ns H 2 O 2에 5 분 노출 다음 병렬 문화에서 미디어 조절. 참고, H 2 O 2의 불안정으로 인해 문화 치료의 24 h 다음에 50-70% 세포 죽음을 유도 하는 수준으로 농도 최적화.
- 유도 DNA를 손상 유도 된 세포 죽음, 10 µ M camptothecin와 CGNs를 치료. 이 농도 24 h. 미토 콘 드 리아 조각화의 50% 세포 죽음 보다 더 유도 및이 농도 (참조 Jahani Asl 외에 camptothecin의 추가 후 2-3 h 발생 초기 apoptotic 신호 18)
- 낮은 K + 유도 신경 apoptosis CGNs에서 유도, 25 m m K + + 5 m K m 낮은 칼륨 미디어 7 일에서 체 외에 다음을 포함 하는 미디어 변경.
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Representative Results
그림 1A-B에서 보듯이 조심 해 부와 그대로 뇌 최소한의 손상으로 제거 한다. 노력 제거 하는 동안 두뇌에 손상을 최소화, 특히 소 뇌 손상에 취해야 한다. 더 어려운 식별 하 고 meninges의 완전 한 제거에 대 한 소 뇌 손상 그리고 신경 문화의 오염의 가능성을 증가. Meninges 제거 되었습니다 일단 소 뇌 그림 1C 에서 보듯이 나머지 조직에서 해 부 고 분리에 대 한 준비.
도금, 이전 CGNs lentivirus로 불리고 하거나 그림 2에 설명 된 대로 아 데 노 바이러스에 감염 될 수 있습니다. 우리 lentivirus (그림 3)에 대 한 도금의 하루에 최대의 효율성과 나 50 아 데 노 바이러스, 감염에 대 한 최소한의 독성과 2-3의 나를 찾아.
건강 한 CGN 문화 7 DIV에 불리고 그림 3A에서 제공 됩니다. 명과의 다 수 문화에 남아 있으면 아크의 농도 순수한 신경 인구를 위해 늘릴 수 있습니다. 또한 glial 세포는 바이러스에 신경 보다는 더 쉽게 차지 하 고 5 일에는 transductions을 수행 하는 중요 한 되는. 신경 세포의 죽음을 겪고의 존재 그림 3C에서 보듯이 pyknotic 핵의 형성에 의해 평가 될 수 있다. 모든 농도 NMDA의 H2O2, Camptothecin 최적화 됩니다 24 h 후 50% 세포 죽음을 유도 하. 미토 콘 드 리아 조각화 같은 신경 손실 앞 다른 초기 이벤트를 공부에 대 한 수 있습니다.
그림 1: 쥐의 뇌와 소 뇌의 해 부의 제거. (A) 집게의 쌍을 사용 하 여 6-7 일 오래 된 마우스의 두뇌를 추출 하 고 머리를 잡고 서가 위를 사용 하 여 점선 따라 anteriorly 피부를 잘라. 피부 및 결합 조직만 잘라 조심, 너무 깊은 절 개는 두개골 펑크 두뇌를 손상 수 있습니다. 이 세 절, 중간 선, 두 측면, 커브를 따라 똑바로 푸시된 피부에 대 한 허용 두개골을 드러내는 다시. 일단 노출, 두개골은가 위, 끝으로 관통 고 anteriorly 잘라 수 있습니다. 큰 해야 합니다 주의 하지를 식별 및 제거 meninges의 소 뇌 손상. 컷 한 번, 집게 한 쌍의 집게 또는 주걱을 사용 하 여 멋진 해 부 솔루션으로 다음 밖으로 조롱 수 있습니다 뇌를 노출 두개골을 다시 껍질을 사용할 수 있습니다. 뇌를 제거 하기 위해 시 신경 절단 될 필요가 있습니다. (B) 두개골에서 분리, meninges 잘 밀고 집게의 쌍을 사용 하 여 소 뇌에서 제거 되어야 합니다. 잘 밀고 집게, 소 뇌의 쌍 나머지 조직에서 해 부하 고 meninges의 완전 한 제거를 보장 하기 위해 검사에 사용을 (C) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 소 뇌과 립 신경에 있는 신경 상해 모델링. 하루 6-7 마우스 절차에 따라 단일 셀에 해리는에서 분리 된 cerebella 파트 3에에서 제시. 분리, 다음 셀 계산 됩니다 및 35 m m 요리 문화 미디어 1.5 x 106 cells/mL.For 생성 하는 볼륨에 resuspended, 4 mL는 도금 접시 당 6 x 106 세포 주는. 슬라이드 이미징에 대 한 0.5 mL 도금, 7.5 105 셀/잘 x 주는. CGNs 다음 lentivirus로 불리고 또는 아 데 노 바이러스에 감염 수 있습니다. 아 데 노 바이러스를 사용 하 여 90% 이상의 transfection 효율 제공 (0 일에서 생체 외에서 (DIV)) 도금의 날 및 산화 스트레스와 DNA 손상을 통해 신경 상해의 연구에 대 한 수 있습니다. 10 µ M camptothecin (CPT)의 추가 75-100 µ M (H2O2) 과산화 수소 산화 스트레스를 유발 한다 하는 동안 DNA 손상을 유발 한다. H2O2 의 농도 24 시간 후 50% 세포 죽음을 유도 하기 위해 낙관 되어야 한다. 5 DIV에서 adenoviruses 감염 10% 미만의 낮은 변환 효율을 제공 합니다. 7 DIV에 NMDA 수용 체, 문화에 풍성 하 게 하는 경우 100 μ M NMDA와 10 µ M 글리신 excitotoxicity 유도 신경 치료 수 있습니다. 이것은 후속 이미징 분석 또는 추적 하나의 신경에 대 하 이상적 이다. 마지막으로, 충분히 높은 변환 효율을 제공 0 DIV, 100 μ M NMDA와 7 DIV에 10 µ M 글리신 치료 뒤에 lentivirus와 시험 (> 80%) 문화, 시퀀싱, 칩 등의 생 화 확 적인 분석에 대 한 허용 단백질 표정, 그리고 라이브/죽은 분석 실험을 수행. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 소 뇌과 립 신경. (A) 뉴런 도금의 때에 3의 나에서 RFP에 대 한 lentiviruses로 불리고 고정 그리고 7 일에 생체 외에서 얼룩이. RFP 신호를 MAP2, Hoechst의 colocalization는 lentiviruses로 불리고 완전히 건강 한 뉴런을 보여 주기 위해 표시 됩니다. (B)는 이미지 신경 독성을 측정 하기 위해 다른 나 감염의 라이브 죽은 분석 결과 분석을 나타냅니다. CGNs 25와 50 사이 나에서 LacZ 표현 하는 아 데 노 바이러스 감염 최소한의 독성을 유지 하면서 최대한의 효율성에 대 한 수 있습니다. 제어에 비해 세포 생존에 1% 차이 볼 때이 나가에 감염 보다는 더 적은. (C) Hoechst NMDA 세포 죽음을 유도 하 치료 제어 CGNs와 CGNs의 얼룩. NMDA 치료 pyknotic 핵의 형성 note 이 세포의 죽음, 그리고 문화 24 100 μ M NMDA와 함께 치료 후 h 및 10 µ M의 약 50%에서 볼 수 있습니다 글리신. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기 우리는 기본 마우스 소 뇌과 립 신경 (CGNs), 손실 및 기능 연구의 이득의 경작 그리고 세포 죽음의 다른 메커니즘을 모델링에 대 한 간단한 방법을 제공 합니다. 여러 가지 요인을 가까운 모니터링을 요구 하는이 절차를 사용 하 여 결과의 재현성을 영향을 줍니다. 문화 문화, 문화의 합류에에서 glial 세포의 제거를 포함 하 고 건강 한 세포를 유지의 순도 포함 됩니다. 이러한 요인에 변화를 도입 결과 바이어스 하 고 재현성을 도전 수 있습니다. 아래는 부정적인 결과 영향을 주는 요소를 최소화 하는 방법에 설명 합니다.
CGNs 문화에서 glial 세포를 제거 하 고 순수한 신경 모집단 확립, 시 토 신-β-arabino furanoside (아크), DNA 합성을 억제 함으로써 증식 세포를 죽이고 pyrimidine antimetabolite의 10 µ M을 사용 합니다. 여전히 인구 glial 세포 존재의 경우에, 아크의 농도 15 µ M를 늘릴 수 있습니다. 이것은 또한 많은 종속입니다. 또한, 최대 7-8 일 동안 유지 되는 문화에 대 한 두 번째 아크 치료 3 일에 수행할 수 있습니다. 하는 순수한 신경 인구 세포 죽음을 방지, 조직 trypsinization 다음 조각으로 절단 전에 소 뇌에서 모든 meninges 껍질 중요 하다. 이 시간 (안 이상 소 뇌 당 7-10 분)의 비교적 짧은 기간에 행해져야 한다. 건강에 해로운 문화 및 최후 세포 죽음에 신경 문화 결과에서 meninges의 존재. 치료 전에 뉴런의 죽음에 발생할 수 있는 또 다른 요인은 trypsinization 시간 이다. 셀-trypsinized는 중요 하다.입니다. 다른 한편으로, 아래 trypsinization 그들을 손상 하거나 낮은 수율 결과 세포의 기계적 분리를 더 필요 합니다. 따라서, trypsinization 시간 최적화를 필요로 하 고 많은 종속.
고려해 야 할 다음 요소 사용 시 셀의 합류입니다. 다른 confluency는 결과에 변화를 생성할 수 있습니다. 이 실험에서 판독에 따라 특히 중요 하다. 낮은 합류 상태와 신경 2-3 일 후 덩어리를 시작 합니다. 너무 낮거나 너무 높은 합류 상태는 뉴런의 신호를 손상 한다. 그것은 정확한 도금에 대 한 라이브 셀의 수를 계산 하는 것이 중요입니다.
CGN 문화의 다른 방법 설명, 특히 기본적인 자란 절차 보고 Papain 분리 시스템을 사용 하 여 키트 30 도 후 자란으로 절차와 CGN의 조작으로 신경 마이그레이션을 공부 하기 위하여 고 형태 31 이 외 에 의해 제시 하는 프로토콜 Papain 분리 시스템 키트의 사용을 설명합니다. 그들은 고립 된 CGNs의 순도 높이기 위해 두 가지 방법을 추천: Percoll 그라데이션 분리를 통해 셀을 실행으로 미리 20 분 폴 리-D-리 접시에 도금. 두 방법 모두 glial 오염 물질에서 CGNs의 분리에서 원조 하는. 이 아크 혼자 치료 되지 않을 경우 순수한 신경 문화에 대 한 풍부 하 것이 좋습니다. 또한,이 사용 하 여 4-6 일 오래 된 마우스 새끼,이 신경 감 별 법;을 조사 하기 위한 효과적인 모델을 제공 하는 동안 우리는 신경 상해의 연구에 더 적합은 6-7 일 오래 된 마우스 새끼에서 CGNs를 사용 하 여 찾을. Holubowska 외는 게 칼슘 인산 염 방법을 생체 외에서 그리고 electroporation 비보를 사용 하 여 포스트 mitotic 소 뇌 신경 세포의 transfection에 대 한 프로토콜을 제공 합니다. 이들은 하나의 신경 추적 될 수 있다 신경의 유전 조작 위한 우수한 방법 이다입니다. 칼슘 인산 염 방법을 사용 하 여 transfection 효율 0.1-5에서 다를 수 있습니다 %. 따라서, 우리 생 화 확 적인 분석 등 칩 Seq 분석, 공동-immunoprecipitation, immunoblotting, lentiviruses의 사용입니다 찾을 80% 이상에 더 적절 한 변환 때 도금 시간에 불리고.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 자연 과학 및 공학 연구 위원회 캐나다 지원 및 건강 연구의 캐나다 학회가 A로 부여
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| qPCR lentivitral titration kit | ABM | #LV900 | |
| speedy virus purification solution | ABM | #LV999 | |
| pCMV-dR8.2 | Addgene | #8455 | |
| pCMV-VS.VG | Addgene | #8454 | |
| Distilled water | Gibco | #15230162 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | #25030081 | |
| 35 mm Nunc culture dishes | Gibco | #174913 | |
| PowerUP SYBR green master mix | life technologies | #A25742 | |
| BSA V Solution | Sigma Aldrich | #A-8412 | |
| CaCl2 • 2H2O | Sigma Aldrich | #C-7902 | |
| Camptothecin | Sigma Aldrich | #C-9911 | |
| Chicken Egg White Trypsin Inhibitor | Sigma Aldrich | #10109878001 | |
| Cytosine beta-D-Arabino Furanoside | Sigma Aldrich | #C-1768 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | #G-7528 | |
| DNase1 | Sigma Aldrich | #11284932001 | |
| Eagle-minimal essential medium | Sigma Aldrich | #M-2279 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | #G-5417 | |
| Heat inactivated dialyzed Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | #F-0392 | |
| Hepes Buffer | Sigma Aldrich | #H-0887 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | #216763 | |
| 50 mg/mL Gentamycin | Sigma Aldrich | #G-1397 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | #M-2643 | |
| N-Methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | #M-3262 | |
| Phenol Red Solution | Sigma Aldrich | #P-0290 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich | #T-4549 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| p3000 enhancer reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| KCl | VWR | #CABDH9258 | |
| NaCl | VWR | #CABDH9286 | |
| NaH2PO4H2O | VWR | #CABDH9298 | |
| Poly D-lysine | VWR | #89134-858 | |
| DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
| FBS | Wisent | #080-450 |
References
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