Summary
Этот протокол описывает простой метод для изоляции и культивирования мыши мозгового гранул нейронов (КСГН) от 6-7 день старого щенков, эффективное трансдукции КСГН потери и получить функция исследований и моделирования NMDA-индуцированной Эксайтотоксичность нейронов, Низкий калий индуцированной клеточную гибель, повреждение ДНК и оксидативного стресса, с использованием той же модели культуры.
Abstract
Нейроны мозжечка гранул (КСГН) являются модель часто используемые нейронов, образуя обильные однородное население в мозжечке. В свете их послеродового развития, обилие и доступность КСГН являются идеальной моделью для изучения нейрональные процессы, включая развития нервной системы, нейронной миграции и стимуляция физиологической активности нейронов. Кроме того CGN культур обеспечивают отличную модель для изучения различных режимов гибели клеток, включая Эксайтотоксичность и апоптоз. В течение недели в культуре КСГН Экспресс N-метил D-аспартат (NMDA) рецепторы, конкретные ИОНОТРОПНЫХ рецептор глутамата с много важных функций в нейрональных здоровья и болезни. Помимо низких концентраций NMDA в сочетании с деполяризации мембраны для грызунов первичной CGN культур был использован для моделирования стимуляция физиологической активности нейронов, в то время как добавление высоких концентраций NMDA могут быть использованы для моделирования excitotoxic нейронных травмы. Здесь описаны метод изоляции и культивирование КСГН от 6-дневных детенышей, а также генетические манипуляции КСГН, аденовирусы и lentiviruses. Мы также настоящий оптимизированный протоколы о том, как стимулировать NMDA-индуцированной Эксайтотоксичность, Низкий калий индуцированного апоптоза, окислительный стресс и повреждение ДНК, после передачи этих нейронов.
Introduction
Нейроны мозжечка гранул (КСГН) характеризуются также в культуре и служил в качестве эффективной модели для изучения нейрональных смерти и развития 1,2,3,4,5, 6. Раннее выражение N-метил D-аспартат (NMDA) рецепторов в CGN культур в vitro делает их привлекательной модель для изучения NMDA-индуцированной сигнализации. Активация этих рецепторов с NMDA в сочетании с деполяризации мембраны используется для моделирования стимуляция физиологической активности нейронов и позволило для исследований в механизмы синаптической пластичности 7,8. Напротив, чрезмерная стимуляция этих рецепторов, NMDA лиганд может использоваться для моделирования Эксайтотоксичность, одним из основных механизмов нейронов потери острого повреждения головного мозга и нейродегенеративных заболеваний 9. Один механизм для индукции Эксайтотоксичность — через АТФ голода с сокращения кислородная, как видно с острой нейронных травмы. Это приводит к деполяризации мембраны и повышенные уровни глутамата отпустить в синапсе. Последующее перевозбуждения NMDA рецепторы повышенных глутамата результаты в чрезмерной Ca2 + приток через эти рецепторы, которые в свою очередь активирует несколько путей, включая Ca2 +-активированный протеаз, фосфолипаз, и эндонуклеазами, что приводит к неконтролируемым деградации важнейших клеточных компонентов и гибели клеток. Кроме того высокая внутриклеточных Ca2 + приводит к генерации свободных радикалов кислорода и митохондриальной повреждения 10,11.
Хотя большинство нейронов потери после NMDA-индуцированной нейрональных Эксайтотоксичность из-за притока кальция и Bax/бак независимой, другие механизмы клеточной смерти нельзя исключить из этой модели. Внешний вид как некротические и apoptotic как смерть клетки из-за Эксайтотоксичность частично объясняется поколения реактивнооксигенных видов (ров) и повреждения ДНК, вызванные высокой внутриклеточных Ca2 + уровнях 12. Повреждение ДНК приводит к гибели нейронов через механизмов апоптоза, коррелирует с отличительными чертами смерть клетки apoptotic, например появление хроматина масс и apoptotic тела. Индукции апоптоза опосредовано через выпуск c тситохрома из митохондрий и было показано, чтобы быть зависимым от Bax/бак олигомеризации 13. Bax/бак олигомеризации способствует порообразования в внешней митохондриальной мембраны, цитохром с выпуска и активация pro-apoptotic регуляторы как видно с мягким ишемического повреждения 14.
Поколение ROS является важным вопросом в головном мозге из-за низкого уровня эндогенных антиоксидантов, в сочетании с требованием большой кислорода для нейронов функционирования 15. При воздействии ишемических событий, синтаза оксида азота является upregulated, производство оксида азота и увеличивая реактивнооксигенных видов 14. Повышенная концентрация радикалов кислорода может привести к повреждению ДНК и косвенно вызвать нехватку энергии. Высокий уровень двуцепочечные разрывы ДНК были устранены путем активации поли АДФ рибоза полимеразы-1 (ПАРП-1), эукариотических хроматина прыгните белка, ответственных за стимулирование передачи АДФ рибоза единиц от NAD+, неотъемлемой частью процесса ДНК ремонт 16. Однако с чрезмерный ущерб вследствие оксидативного стресса, ППА-1 Активация может привести к энергии голода вследствие увеличения стока NAD+, необходимым субстратом для производства АТФ через окислительное фосфорилирование. В конечном счете Оксидативный стресс будет вызывать апоптоз в духе иждивенца Bax/бак, ведущих к митохондрий цитохрома с выпуска и было показано, чтобы побудить митохондриальной перепланировка в КСГН 17.
Наконец изменения концентрации хлорида калия (KCl) в CGN культур может использоваться для моделирования низкого калия/деполяризации опосредованной апоптоз 18,19,20. При низких уровней K+, КСГН подвергнуться различные физиологические изменения, в результате сокращения митохондриальное дыхание и гликолиз, приписываемых снижение спроса сотовых 21, а также снижение уровней ядерный фактор κB (NFκB) который регулирует деятельность, включая воспаление и синаптической передачи 22. Эта модель представляет особый интерес для изучения смерти клетки во время развития нервной системы. K+ окружающей среды низкой более тесно напоминает физиологических условиях и вызывает клейма смерти клетки во время развития нейронов 23.
В целом КСГН предоставляют модель давно расследовать глубинные механизмы нейрональных смерти и дегенерации. Следующий протокол позволит изоляции и культивирования КСГН, выражение или репрессии в отношении конкретного генетического пути, с использованием вирусов и индукции гибели нейронов через различные механизмы, представляющих нейронных травмы и дегенерации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
этот протокол основан на изменения процедур, которые были описаны ранее 18 , 24 , 25 , 26 , 27. Этот протокол утверждается Комитетом уход животных в университете Макгилла.
1. Экспериментальная подготовка
Примечание: следующие акции решения могут быть подготовлены и сохранены до использования.
- Растворяют 3.62 g Рассечение раствор хлорида натрия (NaCl), 0,2 г, хлорида калия (KCl), 0.069 г натрия фосфата (NaH 2 PO 4 ∙ H 2 O) и 1.306 g D-(+)-глюкозы в 500 мл дистиллированной H 2 O. Затем добавьте в решение 12,5 мл HEPES буфера, 450 мкл раствора фенола красного и 20 мл BSA фракции V. Отрегулируйте к пэ-ашу 7.4, используя 1 N гидроокиси натрия (NaOH).
- Стерилизируй-отпусти с 0,22 мкм фильтром и хранить при 4 ° C. Это решение будет оставаться стабильным на срок до одной недели до 10 дней.
- Трипсина
- подготовить раствор в концентрации 25 г/Л трипсина в 0,9% натрия хлорида. Хранят раствор при -20 ° с.
- Ингибитор трипсина
- подготовить запас при концентрации 10 мг/мл, растворяя 1 g ингибитора трипсина яичного курица в 100 мл 1 мм HCl. хранить это решение в -20 ° с.
- DNase
- растворить 100 мг в 10 мл стерильной воды для создания 10 мг/мл бульона DNase 1. Хранят раствор при -20 ° с.
- MgSO 4
- добавить 6,02 г сульфата магния (MgSO 4) до 50 мл дистиллированной воды (H 2 O) для создания запаса 1 M. Хранят раствор на 4 ° C.
- CaCl 2
- распустить 0,735 г, кальция хлорида (CaCl 2 ∙ 2 H 2 O) в 50 мл дистиллированной H 2 O к складе концентрации 100 мм. Хранят раствор на 4 ° C.
- KCl
- г KCl растворяют 3.7275 в 50 мл дистиллированной H 2 O запасов концентрации раствора 1 м. магазин на 4 ° C.
- D-(+)-глюкоза
- растворяют 1.802 g D-(+)-глюкозы в 50 мл дистиллированной H 2 O к складе концентрации 100 мм. Хранят раствор на 4 ° C.
- СМИ культуры клеток
- СМИ культуры клеток готовят следующим образом: 5 мл тепла инактивированных dialyzed плода Bovine сыворотки, 500 мкл 200 мм L-глютамином, 100 мкл 50 мг/мл 1 мл и гентамицина 1,0 м KCL следует добавить 45 мл фильтра стерилизации игл ' s минимальных основных СМИ (E-MEM), дополняется с 1.125 г/Л D-глюкозы для создания 50 мл мозжечковой гранул нейрон культуры средств массовой информации. Хранить средства массовой информации на 4 ° C.
- Цитозина бета-D-Arabino Furanoside
- распустить 48 мг цитозина бета D-arabino furanoside 10 мл средства роста запасов концентрации 20 мм. Хранят раствор при -20 ° с.
- Поли-D-лизин
- для создания 2 мг/мл поли D-лизин складе, добавить 10 мл стерильной H 2 O 20 мг поли D-лизин. Поли штока D-лизин должны храниться при температуре-80 ° C в 100 мкл аликвоты.
- Примечание: следующие решения должна быть подготовлена до вскрытия и поддерживается при температуре 4 ° C до использования.
- MgSO 4 интегрированном рассечение решения
- добавить 300 мкл запасов MgSO 4 до 250 мл раствора диссекции.
- Трипсина рассечение решения
- Добавить 100 мкл запасов трипсина и 12 мкл запасов MgSO 4-10 мл раствора диссекции.
- Ингибитор трипсина решения 1
- Добавить 164 мкл ингибитор трипсина запасов, 250 мкл запасов DNase 1 и 12 мкл запасов MgSO 4-10 мл раствора диссекции.
- 2 решения ингибитор трипсина
- Добавить 1040 мкл ингибитор трипсина запасов, 750 мкл складе DNase 1 и 12 мкл запасов MgSO4 до 10 мл раствора диссекции.
- CaCl 2 дополнено рассечение решения
- Добавить 10 мкл запасов CaCl 2 и 25 мкл запасов MgSO 4-10 мл раствора диссекции.
- Блюда с покрытием культуры поли D-лизин
- пальто культуры блюда, разбавляют 100 мкл запасов поли D-Лизин в 40 мл стерильного H 2 O. Для 35 мм Nunc культуры блюд добавьте 2 мл разбавленной поли D-лизин решение. Для 4 хорошо плиты, добавить 300 мкл разбавленного поли D-Лизин в каждой скважине.
- Пусть поли D-лизин сидеть за 1 ч до аспирационных и мыть каждый хорошо с 4 мл или 600 мкл (для 35 мм культура блюда или 4 хорошо плиты, соответственно) стерильные H 2 O. Затем удалить H 2 O и пусть блюда воздух сухой в течение 1 ч.
2. Мозг добычи и изоляции мозжечка
- обезглавить 6-7 день старые мыши щенка ножницами обезглавливание. Выполнения диссекции мозга в стерильных культуры ткани капюшоном.
- Чтобы удалить мозга, Возьмите голову, с помощью пары щипцов и прорваться через кожу к передней головы с помощью microdissection ножницы, как показано на рисунке 1. Затем вырежьте через кости черепа, используя новую пару ножниц для сведения к минимуму риска заражения. Удаление черепа, охватывающих мозга с помощью щипцов и дразнить из мозга с помощью щипцов или шпателем.
- По мере необходимости, прорваться через зрительный нерв для облегчения выхода мозга в целом.
- Место мозга в рассечение решение, которое дополняется MgSO 4. Сохранить решение и мозг на льду
- Следующие мозг удаления, под микроскопом рассечение, вскрыть из мозжечка от головного мозга, оставаясь в MgSO 4 дополнен рассечение решения и удалить мозговых оболочек, с помощью тонкой щипцами. Поверните мозжечка его вентральной стороне и застраховать удаления сосудистое сплетение.
- Бассейн cerebella в 35-мм блюдо, содержащие ~ 1 мл раствора MgSO 4 дополнен диссекции.
- Нарезать на мелкие кусочки ткани и передачи в Тюбик 50 мл, содержащие 30 мл раствора MgSO 4 буферизуются рассечение.
3. Мышь мозжечковой гранул нейрон изоляции и Culturing
- центрифуга Тюбик 50 мл, содержащие нарезанные мозговой ткани на 5 мин на 644 x g и 4 ° C.
- Удалить супернатант и добавить 10 мл раствора рассечение трипсина. Затем встряхнуть трубки на высокой скорости на 15 минут при 37 ° с.
- Добавить 10 мл раствора ингибитор трипсина 1 трубки и рок мягко в течение 2 мин.
- Центрифуга трубки для 5 мин на 644 x g и 4 ° C.
- Удалить супернатант и добавить 2 мл ингибитор трипсина решения 2 и затем передать 15 мл.
- , Нарезанных ткани в 15 мл трубку до тех пор, пока решение становится мутной. Затем пусть соглашаться на 5 минут
- Удалить супернатант ясно и передать новой трубки с 1 мл раствора рассечение 2 дополнено CaCl супернатант.
- Добавить еще один мл раствора ингибитор трипсина 2 в нижней части трубки, содержащие гранул из шага 3.6. Нарезанных снова и пусть урегулировать за 5 минут удалить супернатант и добавить его в пробирку, содержащую супернатант из шага 3.7 (это повторение шагов 3.6-3.7). Повторите этот процесс до тех пор, пока большая часть ткани механически отделить.
- Добавить 0,3 мл CaCl 2 дополнено рассечение решение супернатанта коллекции для каждого мл супернатант.
- Смешать содержимое трубки и затем центрифуги для 5 мин в 644 x g.
- Удалить супернатант и добавить 10 мл свежего СМИ в гранулах и смешайте.
- Клетки могут затем подсчет и разбавляют до концентрации 1,5 х 10 6 клеток/мл. Пожалуйста, обратите внимание, что в целом 10 миллионов клеток, как ожидается от каждой расчлененных мозга, зависит от trypsinization времени и эффективности диссекции. Пластина клетки на ранее сделанные поли D-лизин пластины. Для 4-ну пластины пластины 0,5 мл, давая 7,5 x 10 5 клеток на хорошо. Для 35-мм блюда, пластины 4 мл, давая 6 x 10 6 клеток на пластину.
- После 24 ч, добавьте цитозин β-arabino furanoside (AraC) пластины для уменьшения глиальных загрязнения. Для каждого мл СМИ 0.5 мкл 20 мм AraC не требуется. Добавление AraC не требует изменения средств массовой информации. Если клетки должны поддерживаться для 7-8 дней, повторить это лечение на день 3.
- Поддерживать культур в 5% CO 2 инкубатора при 37 ° C и кормить с 100 µL 100 мм глюкозы, добавлены к культуре для каждого 2 мл СМИ каждые 2 дня последних 5 дней. Не требуется изменение полной СМИ.
4. Лентивирусы упаковки, очистка и титрование
Примечание: протокол для упаковки, концентрации, очистки и титрование человека ранее была описана в деталях без использования комплекта 28, включая альтернативные методы для титрования, таких как поток цитометрии 29. Здесь мы кратко представить протокол, используемый в нашей лаборатории для производства Лентивирусы для изучения нейронных травмы с помощью быстрого вирус очистки раствора и комплект ПЦР лентивирусные титрования.
- Плиты Hek293T клеток в культуре блюда 10 см с Дульбекко ' s изменение орел ' минимальным необходимым среднего s (DMEM) с 10% FBS. Для получения высокий титр вирусных, расти по крайней мере 5 плит Hek293T клеток для каждого transfection. Убедитесь, что в день transfection клетки являются 70% притока. Изменить СМИ три часа до transfection.
- Для каждого трансфекции, подготовить две трубы. В пробирку 1 добавить 1,5 мл сыворотки MEM-снижение СМИ и 41 мкл Реагента трансфекции, хорошо перемешать. В трубе 2 добавьте 1,5 мл MEM-сокращение сыворотке СМИ и 6 мкг передачи плазмида, 6 мкг вектора (упаковка плазмида) pCMV-dR8.2, pCMV-VSV-G вектор 3 мкг (конверт плазмида) и 35 мкл Реагента p3000 усилитель (поставляется с lipofectamine). Смесь хорошо и комбинат трубы 1 и 2, вихрь и Инкубируйте 15 мин
- Удаление 50% средств массовой информации из Hek293T плит и добавить комплексов ДНК липидов клеток. Проинкубируйте 6 ч при 37 ° C, 5% CO 2. Удаление средства массовой информации и заменить с 5 мл свежего DMEM, инкубировать на ночь.
- На 24 ч после трансфекции, собрать первую партию вирусных супернатант от каждой плиты. Держите вирусных средств массовой информации на 4 ° C и добавить 5 мл свежего СМИ в каждой пластинке Hek293T клеток. Инкубируйте на ночь.
- 48 ч после трансфекции, собирать второй партии вирусных супернатанта, объединить его с первой партии и центрифуги комбинированных вирусный супернатант 10 мин на 600 x g.
- Через фильтр с размером пор 45 мкм фильтр супернатант.
- Очистить с помощью решения очистки скорейшего вирус вирус. Для каждого 45 мл вирусных супернатанта, добавить 5 мл раствора лентивирусные привязки, смеси и центрифуги для 10 мин на > 5000 x g и 4 ° C.
- Тщательно удалить супернатант чтобы не нарушить гранулы.
- 20-40 мкл среднего и вновь приостановить гранулы. Алиготе и хранить на -80 ° C. Используется
- для получения лентивирусные титр, лентивирусные титрования комплект ПЦР. Развести 2 мкл очищенный вирус в 500 мкл PBS. Добавить 2 мкл разбавленного вируса в 18 мкл буфера lysis вирус (поставляется в комплекте).
- Набор три различных q ПЦР-реакции в triplicates и пометьте их как, вирусный lysate, положительный контроль 1 (STD1) и положительный контроль 2 (STD2). Для каждой реакции мкл, 12,5 2 x ПЦР MasterMix, 2,5 мкл либо вирусный lysate или STD1 (поставляется в комплекте) или STD2 (поставляется в комплекте) и 10 мкл Реагента микс (поставляется в комплекте) в 0.2 мл ПЦР пробирок.
- Установите программу PCR следующим: 20 мин при 42 ° C для обратной транскрипции, 10 мин при 95 ° C для активации фермента, 40 циклов 15 s при 95 ° C для денатурации и 1 мин при 60 ° C для отжига/расширение.
- Вычисления вирусный титр, используя эту формулу:
Титр вирусных lysate = 5 x 10-7 / 2 3(Ctx-Ct1)/(Ct2-Ct1).
CTX = среднее значение Ct неизвестный образец, Ct1 = среднее значение STD1, Ct2 = среднее значение STD2.
Примечание: КСГН можно лучше всего transduced с lentiviruses или инфицированы аденовирусов в зависимости от режима травмы изучается. Добавление lentiviruses на мои 2-3 для решения культуры клеток в то время обшивки используется для изучения NMDA индуцированной сигнализации на 7 день культуры. Это приводит к в более чем 80% трансдукция и целесообразным проводить биохимический анализ этих нейронов ( рис. 2). Добавление аденовирусов в день 5 культуры (на MOI 50) и изучения NMDA индуцированной сигнализации на 7-8 день используется для других методов, например изображений. Эта процедура приводит к менее чем 10% инфекции нейронов, что делает его идеальным для изображений и Сопредседатель Локализация белков. Аденовирусов может использоваться во время покрытия для изучения смерть клетки индуцированных повреждений ДНК путем добавления камптотецина на 2-3 день или оксидативного стресса путем добавления перекиси водорода. Наличие флуоресценции белков (GFP, ППП, СЛП или рекламы ЯФП) меткой ген интереса может использоваться для оценки процентного трансдукция и потенциальной токсичности. С Рекомендуемая МВД, мы видим, минимальная токсичность и максимальная трансдукции ( рис. 3).
5. Моделирования нейронных травмы
- чтобы побудить NMDA индуцированной нейрональных Эксайтотоксичность, после 7 дней в пробирке, лечить КСГН с 100 NMDA мкм и 10 мкм глицин, за 1 ч. заменить все средства с кондиционером среднего из параллельных культур с без лечение. Эта концентрация приводит к гибели клеток 50% на 24 ч после лечения ( рис. 3 c). Митохондриальной фрагментация проявляется на 6-8 ч после лечения (см. Джахани-Asl и др. 26 , 27).
- чтобы заставить ROS-индуцированной клеточную смерть (Оксидативный стресс), лечить нейроНС с 75-100 мкм перекиси водорода (H 2 O 2) и переключиться с кондиционером СМИ от параллельных культур, после 5 минут воздействия H 2 O 2. Обратите внимание, из-за нестабильности H 2 O 2, оптимизировать концентрацию до уровня, который индуцирует 50-70% гибели клеток в культуре, после 24 ч лечения.
- Чтобы побудить ДНК повреждения индуцированных клеточной смерти, лечить КСГН с 10 мкм камптотецина. Эта концентрация вызывает более, чем 50% клеточной гибели в 24 ч. митохондриальной фрагментации и начале apoptotic сигнализации происходит 2-3 ч после добавления камптотецина при этой концентрации (см. Джахани-Asl и др. 18)
- чтобы индуцировать апоптоз низкой K + индуцированной нейронов в КСГН, изменить СМИ, содержащих 25 мм K + Низкий калий СМИ с 5 мм K + после 7 дней в vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
С тщательного вскрытия нетронутыми мозга следует удалить с минимальным ущербом, как показано на рисунке 1A-B. Должны быть предприняты усилия для сведения к минимуму повреждение головного мозга во время удаления, особенно повреждения мозжечка. Повреждения мозжечка делает более трудным идентификации и полного удаления мозговых оболочек и увеличивает вероятность загрязнения нейрональных культуры. После того, как были удалены мозговых оболочек, мозжечка может расчлененный из оставшихся ткани, как показано на рисунке 1 c и подготовлен для диссоциации.
Перед обшивкой, КСГН может быть преобразованы с человека или инфицированных аденовирус, как описано на рисунке 2. Мы находим максимальную эффективность и минимальная токсичность для аденовирусной инфекции с MOI 50 и мои 2-3 на день обшивки для человека (рис. 3).
Transduced здоровые CGN культур на 7 DIV представлены на рисунке 3A. Если большое количество глии остаются в культуре, концентрация AraC может быть увеличена до обеспечения чисто нейрональные популяции. Также глиальные клетки принимают вверх вирус более легко, чем нейронов и который становится критической, если transductions выполняются в день 5. Присутствие нейронов, переживает смерть клетки можно оценить путем формирования pyknotic ядер, как показано на рисунке 3 c. Все концентрации из NMDA, H2O2и камптотецина оптимизированы для вызывать гибель клеток 50% после 24 ч. Это позволяет для изучения других ранних события, которые предшествуют нейрональных потери как митохондриальных фрагментации.
Рисунок 1: удаление мозга мыши и рассечение мозжечка. (A) для извлечения мозга 6-7 день старые мыши, используя пару щипцов, Возьмите голову и вырезать кожу кпереди по пунктирным линиям с использованием microdissection ножницами. Будьте осторожны, чтобы вырезать только кожи и соединительной ткани, слишком глубокий разрез может проколоть черепа и повреждения мозга. Эти три разрезы, прямо вдоль средней линии и два, изгибая боков, позволяют для кожи, чтобы быть толкнул обратно, раскрывая черепа. После разоблачены, черепа можно проникли с кончиком ножниц и сократить кпереди. Необходимо большую осторожность, чтобы не повредить мозжечок для облегчения идентификации и удаления мозговых оболочек. Один отрежь, щипцы могут использоваться для отогните черепа, подвергая мозг, который затем может быть дразнили в прохладном рассечение решение с помощью пары щипцами или шпателем. Чтобы удалить мозга, зрительного нерва может потребоваться быть разорваны. (B) после удаления из черепа, мозговых оболочек должны быть удалены из мозжечка, используя пару тонкой наконечником щипцы. (C) использование пара тонкой наконечником щипцы, мозжечок расчлененный из оставшихся ткани и проверен, чтобы обеспечить полное удаление мозговых оболочек. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: моделирования нейронных травмы в нейронов мозжечка гранул. Изолированные cerebella с 6-7 мышей отделить в одной клетки в порядке дня представлена в части 3. После диссоциации клетки, учитываются и высокомобильна в объеме культуры средств массовой информации для создания 1,5 х 106 cells/mL.For 35 мм блюда, 4 мл покрытием, давая 6 x 106 клеток на пластину. Для визуализации слайды, это покрытие 0,5 мл, давая 7,5 x 105 клеток/хорошо. Можно затем преобразованы с человека или инфицированных аденовирус КСГН. С помощью аденовирус в день покрытие (0 дней в пробирке (DIV)) дает более чем 90% эффективность трансфекции и позволяет для изучения нейронных травмы через окислительный стресс и повреждение ДНК. Добавление 10 мкм камптотецина (КПП) вызовет повреждение ДНК, в то время как 75-100 мкм перекиси водорода (H2O2) будет вызывать окислительный стресс. Концентрацию H2O2 должны быть оптимизированы для вызывать гибель клеток 50% после 24 ч. Заражение аденовирусов на 5 DIV дает более низкой эффективности трансдукции менее чем на 10%. На 7 DIV когда NMDA рецепторы обогащаются в культуре, нейроны можно лечить с 100 NMDA мкм и 10 мкм глицин побудить Эксайтотоксичность. Это идеально подходит для последующего анализа изображений или трассировки одного нейрона. Наконец, преобразователя с человека на 0 DIV, следуют с 100 мкм NMDA и 10 мкм глицин на 7 DIV, дает достаточно высокой электромеханической эффективности (> 80%) для биохимического анализа культуры, в том числе чип виртуализации, изучение выражение протеина и выполнение жить/мертвые анализов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: нейронов мозжечка грануле. (A) нейронов были преобразованы с lentiviruses ППП в MOI 3 в то время обшивки и фиксированной и окрашенных в 7 дней в пробирке. Colocalization сигнал ППП, MAP2 и Hoechst показано продемонстрировать здоровое нейронов, которые полностью преобразованы в lentiviruses. (B) изображения представляют собой живые мертвые пробирного анализа нейронов, инфицированных различными MOI, для измерения токсичности. КСГН, инфицированных аденовирус, выражая LacZ в MOI между 25 и 50 позволяет для максимального повышения эффективности при сохранении минимальной токсичностью. Менее, чем 1% разницы в ячейку выживания, по сравнению с контролем рассматривается при заражении в этом MOI. (C) Хёхст окрашивание управления КСГН и КСГН относились с NMDA побудить смерти клетки. Обратите внимание на формирование pyknotic ядер с NMDA лечения. Это свидетельствует о гибели клеток и может рассматриваться примерно 50% культуры 24 ч после лечения с 100 мкм NMDA и 10 мкм глицин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Здесь мы предоставляем простой метод для культивирования мыши нейронов мозжечка гранул (КСГН), потери и выгоды функции исследований и моделирования различных механизмов клеточной смерти. Воспроизводимости результатов, с помощью этой процедуры, которые требуют тщательного мониторинга влиять несколько факторов. К ним относятся чистоту культуры, включая ликвидацию глиальных клеток в культуре, слияния культуры и поддерживать здоровые клетки. Представляя изменчивости в этих факторов может исказить результаты и вызов воспроизводимость. Ниже мы опишем, как свести к минимуму факторы, которые отрицательно влияют на результаты.
Чтобы устранить глиальные клетки от культуры КСГН и создать чисто нейрональные населения, мы используем 10 мкм цитозин β-arabino furanoside (AraC), пиримидинов антиметаболит, которая убивает пролиферирующих клеток путем ингибирования синтеза ДНК. Если есть еще население глиальных клеток, концентрации AraC может быть увеличена до 15 мкм. Это также много зависит. Кроме того для языков, которые поддерживаются до 7-8 дней, второй AraC лечение может выполняться на 3 день. Чтобы получить чисто нейрональные населения и избежать смерти клетки, важно чистить все мозговых оболочек от мозжечка до резки ткани на куски, а затем trypsinization. Это должно быть сделано в достаточно короткий период времени (не более 7-10 мин в мозжечке). Присутствие мозговых оболочек в нейрональных культуры приводит к нездоровой культуры и в конечном итоге гибели клеток. Еще одним фактором, который может привести к гибели нейронов до лечения это время trypsinization. Важно, что клетки не являются чрезмерно trypsinized. С другой стороны под trypsinization требует дальнейшей механической диссоциации клеток, которые могут повредить их или приведет к низкой урожайности. Таким образом trypsinization время требует оптимизации и это много зависит.
Следующим фактором считается является слияния клеток во время использования. Различные confluency может генерировать изменчивости в результатах. Это особенно важно в зависимости от индикации в экспериментах. С низким слияния государством нейронов начинают собираться после 2-3 дня. Слишком низкое или слишком высокое слияния состояние нейронов повреждает сигнализации. Важно подсчитать количество живых клеток для точных обшивкой.
Были описаны другие методы CGN культур, особенно глядя на основные культивирования процедуры с использованием системы папаин диссоциации комплект 30 как хорошо, как после культивирования процедуры и манипуляции CGN с целью изучения миграции нейронов и Морфология 31. Протокол, представленный Lee et al. Описывает использование системы комплект папаин диссоциации. Они рекомендуют два метода для повышения чистоты изолированных КСГН: Запуск через Percoll градиент разделения клетки, а также предварительное покрытие на плите поли D-лизин 20 мин. Оба метода являются для помощи в отделение КСГН от глиальных загрязнений. Это рекомендуется в случае, если лечение с AraC одиночку недостаточно для обогащения для чисто нейрональные культуры. Кроме того ли использует 4-6 день старые мыши щенков, хотя это служит эффективной модели для изучения нейрональных дифференциации; Мы находим, что использование КСГН от 6-7 день старые мыши щенков является более подходящим для изучения нейронных травмы. Holubowska et al. представляет собой протокол для transfection должность митотическая мозжечковой нейронов, используя фосфата кальция метода in vitro и электропорации в естественных условиях. Это отличные методы для генетических манипуляций нейронов, в которых можно проследить один нейрон. Эффективность трансфекции методом фосфата кальция может варьироваться от 0.1-5%. Таким образом, мы находим, что для биохимических анализов, включая анализы, Co Иммунопреципитация и immunoblotting чип-Seq, использование lentiviruses является более уместным, как это приводит к более чем 80% трансдукции когда преобразованы в то время обшивки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа поддерживается естественных наук и инженерных исследований Совет Канады и канадской институтов здравоохранения исследовательских грантов с A.J.-A.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| qPCR lentivitral titration kit | ABM | #LV900 | |
| speedy virus purification solution | ABM | #LV999 | |
| pCMV-dR8.2 | Addgene | #8455 | |
| pCMV-VS.VG | Addgene | #8454 | |
| Distilled water | Gibco | #15230162 | |
| 200 mM L-Glutamine | Gibco | #25030081 | |
| 35 mm Nunc culture dishes | Gibco | #174913 | |
| PowerUP SYBR green master mix | life technologies | #A25742 | |
| BSA V Solution | Sigma Aldrich | #A-8412 | |
| CaCl2 • 2H2O | Sigma Aldrich | #C-7902 | |
| Camptothecin | Sigma Aldrich | #C-9911 | |
| Chicken Egg White Trypsin Inhibitor | Sigma Aldrich | #10109878001 | |
| Cytosine beta-D-Arabino Furanoside | Sigma Aldrich | #C-1768 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | #G-7528 | |
| DNase1 | Sigma Aldrich | #11284932001 | |
| Eagle-minimal essential medium | Sigma Aldrich | #M-2279 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | #G-5417 | |
| Heat inactivated dialyzed Fetal Bovine Serum | Sigma Aldrich | #F-0392 | |
| Hepes Buffer | Sigma Aldrich | #H-0887 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | #216763 | |
| 50 mg/mL Gentamycin | Sigma Aldrich | #G-1397 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | #M-2643 | |
| N-Methyl-D-aspartic acid | Sigma Aldrich | #M-3262 | |
| Phenol Red Solution | Sigma Aldrich | #P-0290 | |
| Trypsin | Sigma Aldrich | #T-4549 | |
| Lipofectamine 3000 | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| p3000 enhancer reagent | Thermo Fisher Scientific | L3000-008 | |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Thermo Fisher Scientific | 31985070 | |
| KCl | VWR | #CABDH9258 | |
| NaCl | VWR | #CABDH9286 | |
| NaH2PO4H2O | VWR | #CABDH9298 | |
| Poly D-lysine | VWR | #89134-858 | |
| DMEM | Wisent | #319-005-CL | |
| FBS | Wisent | #080-450 |
References
- Goldowitz, D., Hamre, K. The cells and molecules that make a cerebellum. Trends in Neurosciences. 21 (9), 375-382 (1998).
- Contestabile, A. Cerebellar granule cells as a model to study mechanisms of neuronal apoptosis or survival in vivo and in vitro. Cerebellum. 1 (1), 41-55 (2002).
- Bilimoria, P. M., Bonni, A. Cultures of cerebellar granule neurons. CSH Protoc. , (2008).
- Kramer, D., Minichiello, L. Cell culture of primary cerebellar granule cells. Methods Mol Biol. 633, 233-239 (2010).
- Burgoyne, R. D., Cambray-Deakin, M. A. The cellular neurobiology of neuronal development: the cerebellar granule cell. Brain Res. 472 (1), 77-101 (1988).
- Hatten, M. E., Heintz, N. Mechanisms of neural patterning and specification in the developing cerebellum. Annu Rev Neurosci. 18, 385-408 (1995).
- Evans, G. J. Synaptic signalling in cerebellar plasticity. Biol Cell. 99 (7), 363-378 (2007).
- Hunt, D. L., Castillo, P. E. Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 496-508 (2012).
- Arundine, M., Tymianski, M. Molecular mechanisms of calcium-dependent neurodegeneration in excitotoxicity. Cell Calcium. 34 (4-5), 325-337 (2003).
- Szydlowska, K., Tymianski, M. Calcium, ischemia and excitotoxicity. Cell Calcium. 47 (2), 122-129 (2010).
- Jahani-Asl, A., Germain, M., Slack, R. S. Mitochondria: joining forces to thwart cell death. Biochim Biophys Acta. 1802 (1), 162-166 (2010).
- Rego, A. C., Oliveira, C. R. Mitochondrial dysfunction and reactive oxygen species in excitotoxicity and apoptosis: implications for the pathogenesis of neurodegenerative diseases. Neurochem Res. 28 (10), 1563-1574 (2003).
- Wei, M. C., et al. Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death. Science. 292 (5517), 727-730 (2001).
- Doyle, K. P., Simon, R. P., Stenzel-Poore, M. P. Mechanisms of ischemic brain damage. Neuropharmacology. 55 (3), 310-318 (2008).
- Coyle, J. T., Puttfarcken, P. Oxidative stress, glutamate, and neurodegenerative disorders. Science. 262 (5134), 689-695 (1993).
- Cole, K., Perez-Polo, J. R. Neuronal trauma model: in search of Thanatos. Int J Dev Neurosci. 22 (7), 485-496 (2004).
- Cheung, E. C., McBride, H. M., Slack, R. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of neuronal cell death. Apoptosis. 12 (5), 979-992 (2007).
- Jahani-Asl, A., et al. Mitofusin 2 protects cerebellar granule neurons against injury-induced cell death. J Biol Chem. 282 (33), 23788-23798 (2007).
- Gallo, V., Kingsbury, A., Balazs, R., Jorgensen, O. S. The role of depolarization in the survival and differentiation of cerebellar granule cells in culture. J Neurosci. 7 (7), 2203-2213 (1987).
- Miller, T. M., et al. Bax deletion further orders the cell death pathway in cerebellar granule cells and suggests a caspase-independent pathway to cell death. J Cell Biol. 139 (1), 205-217 (1997).
- Jekabsons, M. B., Nicholls, D. G. Bioenergetic analysis of cerebellar granule neurons undergoing apoptosis by potassium/serum deprivation. Cell Death Differ. 13 (9), 1595-1610 (2006).
- Piccioli, P., et al. Inhibition of nuclear factor-kappaB activation induces apoptosis in cerebellar granule cells. J Neurosci Res. 66 (6), 1064-1073 (2001).
- D'Mello, S. R., Galli, C., Ciotti, T., Calissano, P. Induction of apoptosis in cerebellar granule neurons by low potassium: inhibition of death by insulin-like growth factor I and cAMP. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (23), 10989-10993 (1993).
- Gallo, V., Ciotti, M. T., Coletti, A., Aloisi, F., Levi, G. Selective release of glutamate from cerebellar granule cells differentiating in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (24), 7919-7923 (1982).
- Messer, A. The maintenance and identification of mouse cerebellar granule cells in monolayer culture. Brain Res. 130 (1), 1-12 (1977).
- Jahani-Asl, A., et al. CDK5 phosphorylates DRP1 and drives mitochondrial defects in NMDA-induced neuronal death. Hum Mol Genet. 24 (16), 4573-4583 (2015).
- Jahani-Asl, A., et al. The mitochondrial inner membrane GTPase, optic atrophy 1 (Opa1), restores mitochondrial morphology and promotes neuronal survival following excitotoxicity. J Biol Chem. 286 (6), 4772-4782 (2011).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031 (2012).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. (32), (2009).
- Lee, H. Y., Greene, L. A., Mason, C. A., Manzini, M. C. Isolation and culture of post-natal mouse cerebellar granule neuron progenitor cells and neurons. J Vis Exp. (23), (2009).
- Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. (85), (2014).
