Summary
Skive oppdateringen klemme teknikken er en effektiv metode for å analysere læring-induserte endringer i iboende egenskaper og plastisitet av eksitatoriske eller hemmende synapser.
Abstract
Skive oppdateringen klemme teknikken er et kraftig verktøy for å undersøke læring-indusert nevrale plastisitet i bestemte hjernen regioner. Analysere motor-læring indusert plastisitet, trent vi rotter ved hjelp av en akselerert rotoren rod oppgave. Rotter utført oppgaven 10 ganger i 30-s intervaller for 1 eller 2 dager. Resultatene var betydelig forbedret på opplæring dager i forhold til den første rettssaken. Vi så forberedt akutt hjernen skiver av primære motorisk cortex (M1) i utrente og trent rotter. Gjeldende-klemme analyse viste dynamiske endringer i hvile membran potensial, spike terskel, afterhyperpolarization og membran motstand i layer II/III pyramidale nevroner. Aktuell sprøytebruk indusert mange flere toppene i 2-dagers trent rotter enn i utrente kontroller.
Analysere innholdsrettet-læring indusert plastisitet, trent vi rotter ved hjelp av en hemmende unngåelse (IA) oppgave. Etter foten-sjokk i den mørke siden av en boks, lært rotter å unngå det, bor i den opplyste siden. Vi forberedt akutt hippocampus skiver fra utrente, IA-trent, hender og gjennomgang rotter. Spenning-klemme analyse ble brukt til å registrere sekvensielt miniatyr eksitatoriske og inhibitory postsynaptic strøm (mEPSCs og mIPSCs) fra samme CA1 Nevron. Vi fant ulike betyr mEPSC og mIPSC amplituder i hver CA1 Nevron, antyder at hver Nevron hadde forskjellige postsynaptic styrker på sin eksitatoriske og inhibitory synapser. Videre hadde sammenlignet med utrente kontroller, IA-trent rotter høyere mEPSC og mIPSC amplituder, med brede mangfoldet. Disse resultatene antydet at innholdsrettet læring skaper postsynaptic mangfoldet i både eksitatoriske og inhibitory synapser på hver CA1 Nevron.
AMPA eller GABAA reseptorer syntes å megle postsynaptic strøm siden bad behandling med CNQX eller bicuculline blokkert mEPSC eller mIPSC hendelser, henholdsvis. Denne teknikken kan brukes å studere ulike typer læring i andre regioner som sensoriske cortex og amygdala.
Introduction
Oppdateringen klemme teknikken, utviklet av Neher og Sakmann, har vært mye brukt for elektrofysiologiske eksperimenter1. Hele celle oppdateringen klemme teknikk2 kan brukes til å registrere intracellulær strøm- eller spenningskilde hjelp gigaohm segl cellemembranen. Gjeldende-klemme teknikken tillater oss å analysere forskjeller i membranen egenskaper som hviler potensial, motstand og kapasitans3. Spenning-klemme teknikken tillater oss å analysere læring-indusert synaptiske plastisitet på både eksitatoriske og inhibitory synapser.
Primære motorisk cortex (M1) er et sentralt område som er avgjørende for å gjøre dyktige frivillig bevegelser. Forrige elektrofysiologiske studier vist utviklingen av langsiktige potensiering (LTP)-som plastisitet i layer II/III eksitatoriske synapser etter dyktige motor trening4. Videre demonstrerte i vivo imaging studier videre remodeling av M1 dendrittiske spines etter en dyktig nå oppgave5,6. Men har læring-indusert synaptic og iboende plastisitet ikke vist i M1 neurons.
Vi har nylig rapportert at en rotor rod oppgave forfremmet dynamiske endringer i glutamatergic og GABAergic synapser og endret iboende plastisitet i M1 layer II/III neurons7. Her brukte vi skive oppdateringen klemme teknikken for å undersøke læring-indusert plastisitet. Denne teknikken kan også brukes til å undersøke andre typer erfaring-avhengige plastisitet i andre områder av hjernen. For eksempel sanseinntrykk i fat cortex kan styrke AMPA reseptor-mediert eksitatoriske innspill til layer II/III neurons8og cued frykt condition styrker eksitatoriske innganger på de laterale amygdala neurons, som er nødvendig for frykt minne9. Dessuten skaper kontekstuelle læring mangfold i form av eksitatoriske og inhibitory synaptic innspill til hippocampus CA1 neurons10,11.
Protocol
alle dyr bolig og kirurgiske prosedyrer var i samsvar med retningslinjene for dyr eksperimentering av Yamaguchi University School of Medicine og ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteen av Yamaguchi Universitetet.
1. dyr
- bruker 4 - 5 uke-gamle Sprague-Dawley hannrotter (postnatal 28 til 31 dager gammel).
- Huset rottene i individuelle plastmerder (40 cm x 25 cm × 25 cm) opprettholdt på en konstant temperatur (23 ° C ± 1 ° C) under en 12-h lys/mørke syklus. Gi rotter annonse libitum tilgang til vann og mat.
2. Rotoren rod test
- å undersøke motorisk ferdighet læring, underlagt hver rotte rotoren rod testen (stang diameter 7 cm; lane bredde 8,9 cm; fall høyde 26.7 cm) for 1 eller 2 dager ( figur 1A i Kida et al., 2016 < sup class = "xref" > 7). Utføre oppgaven i et rolig og temperaturkontrollerte rom (23 ± 1 ° C). Ikke forstyrr eller håndtere rotter før test
- Angi rotoren stangen til akselerasjon-modus, noe som øker lineært fra 4 rotasjoner/min til 40 rotasjoner/min (8 π/min til 80 π/min) i 5 min.
- Putte rotta på hvile roterende stangen. Bekrefte at alle lemmer på stangen.
- Måle ventetiden å falle fra roterende stangen evaluere motor, er ytelsen.
- Tillater hver rotte 10 forsøk (forsøk) med 30-s mellomrom.
- Hvis rotta faller fra roterende stangen, sette den på stangen igjen etter et 10-20 s intervall.
- Ofre rotte med en overdose av pentobarbital (400 mg/kg) 30 min etter siste rettssaken. Injisere utrente kontroll rotter med den samme dosen av anestesi inne deres hjem burene.
3. Hemmende unngåelse test
- å undersøke innholdsrettet læring, emnet rotter til en hemmende unngåelse (IA) test ( figur 1 d i Mitsushima et al., 2011 2013 10 , 11) unngå alle episodisk erfaringer ved eksperimentet som kontakt med andre, bur endringer eller rengjøring. Utføre oppgaven i et rolig og temperaturkontrollerte rom (23 ± 1 ° C).
Merk: IA trening apparatet er en to-chambered akryl boks (lengde 33 cm; bredde 58 cm, høyde 33 cm). Den har en tent sikre siden og en mørk sjokk side som er atskilt med en felle døren ( figur 1 d). - Sett rotta trygt (lyse) side av boksen opplyst. Hånd rotta forsiktig uten stress.
- Vente en kort tid (10 til 20 s) å acclimate rotte til miljøet.
- Åpne skyvedøren å tillate rotta å skrive inn den mørke på vilje.
- Måle ventetiden (s) før rotta inn romanen mørke side boksen. Ventetiden på den første rettssaken representerer rotta ' s resultater før trening.
- Etter inn i den mørke siden, lukke døren og bruke en kryptert elektrisk foten støt (2 s, 1.6 mA) via elektrisk stål stenger til gulvet i boksen. Tillate gjennomgang rotter å utforske trening apparatet for 1 min uten å være sjokkert. Huset kortet rotter i en opplyst sjokk bur i flere gi dager og plutselig sjokket uten episodisk erfaringer. Håndtere forsiktig uten stress i noen grupper.
- Behold hver rotte i mørke boksen for 10 før tilbake til hjem buret.
- På 30 min sjokket foten plasser igjen rotta i den opplyste siden av boksen. Måle ventetiden for å angi den mørke siden.
- Tilbake rotta til hjem buret.
- På 60 min sjokket ofre rotte med en overdose av pentobarbital (400 mg/kg). Hånd rotta mildt og injisere av bedøvelsen intraperitoneally. I utrente kontroll rotter, injisere anestesi inne deres hjem burene uten erfaring som beskrevet ovenfor.
4. Disseksjon buffer
- oppløse krystaller av 0,195 g NaH 2 PO 4-2 H 2 O, 0.188 g KCl, 0.074 g CaCl 2, 1.423 g MgCl 2-6 H 2 O og 12.579 g kolin klorid i ultrapure vann (900 mL til 950 mL) . Se tabell 1.
- Oppløse krystaller av 2.340 g askorbinsyre, 0.342 g pyruvic syre natrium salt, 2.100 g NaHCO 3 og 4.500 g glukose.
- Legg til vann opp til 1000 mL. Utvalget av osmolality vil være mellom 290 mOsm/L og 300 mOsm/L. justere osmolality ved å legge ultrapure vann, hvis det er over området.
- Boble løsningen med 5% CO 2 / 95% O 2 gass blanding ved iskalde temperaturer for 5 min. før bruk.
5. Kunstig cerebrospinalvæske (aCSF)
- oppløsning krystaller av 0.186 g KCl, 6.700 g NaCl, og 0.156 g NaH 2 PO 4-2 H 2 O i ultrapure vann (900 mL til 950 mL). Se tabell 2.
- Boble med gass blandingen for 5 min.
- Løses krystaller av 1.800 g glukose og 2.184 g NaHCO 3 og deretter legge 4 mL MgCl 2 og 4 mL CaCl 2 fra 1 M lager løsninger.
- Legg til vann opp til 1000 mL. Utvalget av osmolality vil være mellom 290 mOsm/L og 295 mOsm/L. justere osmolality ved å legge ultrapure vann, hvis det er over området.
- Bubble med gass blanding før bruke.
6. Intracellulær løsninger
- For gjeldende-klemme opptak (tabell 3), løses 0.0746 g KCl, 6.089 g K-gluconate, 0.476 g HEPES, 0.0456 g EGTA og 500 µL MgCl 2 fra 1 M lager løsning i 180 mL ultrapure vann (justere pH til 7.2 med KOH).
- Legge til 0.4408 g Na 2 - ATP, 0.0418 g Na 3 - GTP og 0.510 g Na-phosphocreatine. Legge vann til 200 mL og justere pH til 7.35 med KOH.
- Justerer osmolality til rundt 290 mOsm/L ved å legge ultrapure vann.
- Lagre som 1-mL dele i fryseren (-30 ° C).
- For spenningen-klemme opptak (tabell 4), løses 5.244 g CsMeSO 3, 0.672 g CsCl, 0.476 g HEPES 0.0456 g EGTA og 500 µL MgCl 2 fra 1 M lager løsninger i 180 mL ultrapure vann. Justere pH til 7.2 med CsOH. MEPSP og mIPSP opptak, bruk endrede konsentrasjonen av 5.814 g CsMeSO 3 og 0.252 g CsCl for å justere reversering potensialet av GABA A reseptor svar 11.
- Legge til 0.4408 g Na 2 - ATP, 0.0418 g Na 3 - GTP og 0.510 g Na-phosphocreatine. Legge vann til 200 mL og justere pH til 7.35 med CsOH.
- Justerer osmolality til rundt 290 mOsm/L ved å legge ultrapure vann.
- Lagre som 1-mL dele i fryseren (-30 ° C).
7. Skjær forberedelse
- før ofre, ned alle disseksjon verktøy med knust is ( figur 2A). Legger til ca 500 mL kaldt vann i beholderen knust is å øke kontakt areal. Denne fremgangsmåten ble beskrevet tidligere 10 , 11 , 12.
Merk: Verktøyene her er: store saks, iris saks, en slikkepott, en mikro slikkepott, tang, pinsett, en rustfritt stål 200 mL kanne, et blad for hjernen trimmer, 120-mL cardiac perfusjon sprøyte fylt med disseksjon buffer behandlet med gass-blanding, en silikon tube (20 cm) koblet til en flat 18-gauge nål, en rustfritt hjernen disseksjon scene (tykkelse = 3 mm, ϕ = 12 cm), og en montering scene for vibratome (ϕ = 5 cm). - Ofre rotta 30 min etter fullført atferdsmessige paradigmet av anesthetizing det med en overdose av pentobarbital (400 mg/kg kroppsvekt). Utføre skive utarbeidelse raskt for å sikre at sektorene er så frisk som mulig 10 , 11 , 12. Hjernen-ehandling protokollen oppfyller alle veterinary standarder for våre universitet.
- Fylle en 120 mL sprøyte med iskald disseksjon buffer (tabell 1) frikirkelige 5% CO 2 / 95% O 2 gass blanding. Fjern eventuelle luftbobler før perfusjonsmåling.
- Etter utsette hjertet, setter du inn nålen i bakre del av venstre ventrikkel.
- Utføre transcardial perfusjon av hjernen manuelt ved hjelp av sprøyten. Større rotter forlange flere disseksjon buffer for perfusjon. Senk hjernen med iskald disseksjon bufferen for 5 min. boble bufferen kontinuerlig under neddykking.
- Trim bakre siden av hjernen på en vinkel parallell dendrittiske retningen på målet kortikale området med et blad. Siden hjernen er stå på disseksjon scenen med cut slutten bunnen, bestemmer den første vinkelen vinkelen på alle etterfølgende hjernen skiver. Dette trinnet er kritisk viktig. ( figur 2B). Feil vinkel kan skjære gjennom mål pyramidale nevroner.
Merk: Verktøyene her er: et blad for hjernen trimmer, et filter papir (ϕ = 10 cm), en rustfritt hjernen disseksjon scene (tykkelse = 3 mm, ϕ = 12 cm), en slikkepott, en superglue, en dropper og en montering scenen for vibratome (ϕ = 5 cm). - Skiver 350-µm tykk koronale hjernen ved hjelp av en vibratome. Fyll disseksjon kammeret med iskald buffer frikirkelige 5% CO 2 / 95% O 2 gass blanding ( figur 2C). Boble bufferen kontinuerlig under hjernen sektoren.
- Trim utkanten av målområdet bruker iris saks.
- Vask trimmet sektorene forsiktig i romtemperatur aCSF boblet med 5% CO 2 / 95% O 2 (tabell 2).
- Behold trimmet skiver i en grensesnittet kammer til innspillingen er utført ( figur 2D og E). Inkubasjon 1t i kammeret forbedrer tilstanden til cellene, men av fenotyper endre hvis skivene er ruges i mer enn 10 timer. Lukk lokket på kammeret til å omslutte gassene og små væsken dråper aCSF.
8. Hele celle oppdateringen klemme
Merk: hele celle opptak krever en forsterker og et low pass-filteret som er satt til en cutoff frekvens 5 kHz. Signalene er digitalisert og lagres i en PC. De lagrede dataene analyseres frakoblet ( figur 3A).
- Opprette glass elektroder bruke en horisontal avtrekker. Fylle elektrodene med en egnet løsning (tabeller 3 og 4) bruker en vanlig polyetylen 1-mL sprøyte knyttet til fine røret og filtere 0.22-µm.
- Før kontakt med cellen, vedlikeholde positivt trykk og justere pipette gjeldende null.
- Etter danner et gigaohm segl, bruke negative trykket til ruptur cellemembranen (hele celle konfigurasjon i figur 3F).
9. Gjeldende-klemme analyse
- Egenskaper av cellemembranen
- fylle oppdateringen opptak Pipetter med intracellulære løsning for gjeldende-klemme opptak (tabell 3). Motstanden av pipette er mellom 4 MΩ og 7 MΩ i aCSF.
- Etter membranen brudd, holde membran spenningen på-60 mV i V-KLEMME modus. Deretter bytter fra " bad " å " celle " modus i membranen test bruke programvare for å måle de iboende celleegenskaper som membran kapasitans, motstand og tidskonstant.
- Denne injeksjon studien
- etter innspillingen de iboende egenskapene, bytte modus fra V-KLEMME til spor (jeg = 0) /I-CLAMP NORMAL for gjeldende injeksjon. Merk at flytende krysset potensial bør ikke korrigert 10.
- Sett inn gjeldende i cellen for 300 ms. endre intensitet gjeldende gradvis fra − 100 pA til +550 pA med 50-pA øker. Antall toppene (handling potensialer) brakt frem av gjeldende injeksjoner.
- Måle minimum spenning for å indusere en handling potensial (dette er terskel spenning).
- Beregner afterhyperpolarization amplituden som forskjellen mellom spenningsnivået spike initiering og laveste spenningen oppnådd under afterhyperpolarization 7.
10. Spenning-klemme analyse
- The AMPA/NMDA forholdet
Merk: The AMPA/NMDA er en vanlig måte å evaluere postsynaptic plastisitet glutamatergic eksitatoriske synapser 7 , 8 , 9 , 10 , 11. Merk imidlertid at samtidig øker i både komponenter ikke kan endre forholdet 13.- Perfuse til opptak kammeret fysiologiske løsning frikirkelige gass blandingen og opprettholde temperaturen på 22 ° C til 25 ° C. Legg til 0,1 mM picrotoxin løsningen å blokkere GABA A - mediert respons og legge 4 µM 2- chloroadenosine å stabilisere evoked nevrale respons 14.
- Fylle oppdateringen opptak Pipetter med intracellulære løsningen for spenningen-klemme opptak (tabell 4). Når motstanden av opptak Pipetter i aCSF. Motstanden er mellom 4 MΩ og 7 MΩ.
- For innspilling i layer II/III pyramidale nevroner i M1, plasserer en bipolar wolfram stimulere elektrode 200 µm til 300 µm lateral til cellene skal registreres, under pial overflaten i regionen forlemen representasjon (2 mm lateral til den midtlinjen) 15 , 16 , 17.
- For innspilling i en CA1 pyramideformet Nevron, plasser den stimulerende elektrode 200 µm til 300 µm lateral (Schaffer oppstå fiber) eller mediale (temporoammonic sti) til cellene som blir spilt inn ( figur 3B).
- Øke stimulans intensiteten til synaptic svaret > 10 pa
- Beregner AMPA/NMDA forholdet forholdet mellom toppen gjeldende målt på − 60 mV til gjeldende avmålt for +40 mV på 150 MS etter stimulans utbruddet. Merk at 50 til 100 spor skal være gjennomsnitt for å beregne forholdet.
- Miniatyr postsynaptic gjeldende opptak
Merk: miniatyr eksitatoriske postsynaptic strøm (mEPSCs) er antatt å korrespondere med svarene elicited av presynaptic utgivelsen av en enkelt vesicle av glutamat 18 . Derimot er miniatyr hemmende postsynaptic strøm (mIPSCs) antatt å korrespondere med svarene elicited av presynaptic utgivelsen av en enkelt vesicle GABA 18. Økninger i amplitudes mEPSCs og mIPSCs gjenspeiler postsynaptic overføring styrke, mens øker i tilfelle frekvens gjenspeiler økning i antall funksjonelle synapser eller presynaptic utgivelse sannsynligheten 11 .- Fylle oppdateringen opptak pipette med endrede intracellulær løsning (tabell 4) å justere reversering potensialet av GABA A reseptor-mediert gjeldende-60 mV.
- Legg til 0,5 µM tetrodotoxin til bath blokkere spontan handling potensialer.
- Hold spenningsnivået-60 mV til rRegistrer mEPSC hendelsene for 5 min.
- Endre holde potensielle 0 mV posten mIPSC hendelser i 5 min. Fordi M1 neurons viser litt høyere reversering potensial for AMPA reseptor-mediert strøm, mIPSCs M1 neurons registreres på 15 mV med 0,1 mM APV.
- Vente i noen minutter for gjeldende å stabilisere.
- Registrere mIPSC hendelser i 5 min.
- Oppdage miniatyr hendelsene ved hjelp av programvare, og bruke hendelser over 10 pA for analyse. Telle antall mEPSCs eller mIPSCs hendelser for 5 min å bestemme frekvensen. Gjennomsnittlig amplituder hendelsesforløpet å få mener amplituden.
- Bekrefte om bad behandling med 10 µM CNQX eller 10 µM bicuculline methiodide blokkerer de mEPSCs og mIPSCs hendelsene, henholdsvis.
- Parvise-puls analyse
Merk: Presynaptic plastisitet kan analyseres sammen-puls analyse. En økning i sammen-puls antyder en nedgang i den presynaptic glutamat eller GABA løslate sannsynlighet 7 , 10 , 11.- Analysere eksitatoriske synapser, legge til 0,1 mM picrotoxin og registrert svaret på-60 mV. Selv om vi lagt 4 µM 2-chloroadenosine til badet, vi trenger å huske på at stoffet påvirker den presynaptic utgivelse sannsynlighet 14.
- å analysere hemmende synapser, legge til 0,1 mM APV og 4 µM 2-chloroadenosine på badet og registrert svaret på 0 mV. I M1 neurons, registrert svaret på 15 mV.
- Bruke sammenkoblede pulser med et Inter stimulans intervall på 100 ms eller 200 ms.
- Ta 50-100 sammenhengende spor på hver holde potensielle og beregne gjennomsnittet for verdiene.
- Beregne sammenkoblede puls forholdet som forholdet mellom andre toppen til første toppen av postsynaptic gjeldende.
Representative Results
Som vi beskrev nylig7, indusert rotoren stang trening (figur 1A) dynamiske endringer i indre plastisitet av M1 layer II/III pyramidale nevroner. Måler ventetiden til rotter falle fra roterende stangen tillater oss å beregne dyktige læring ytelsen av rotte. Lengre ventetid angir bedre motor ytelse. På dag 1 av trening økt rotter rotoren stangen før rettssaken endte. På dag 2, rotter oppnådd nesten asymptotisk nivåer i gjennomsnitt økt scorer (figur 1B). Sammenlignet med ventetiden på første rettssaken, post-hoc analyse viste betydelige forbedringer i siste forsøk på Treningsdager (figur 1 c).
Figur 4A viser et eksempel på gjeldende-klemme analyse der egenskapene neuronal endres etter motorisk ferdighet læring. Injeksjoner av 400 pA og 500 pA strøm var nødvendig å indusere handling potensialer i gruppen utrente og 1-dags trent rotter, henholdsvis. I kontrast, var injeksjon av bare en 150 pA gjeldende tilstrekkelig til å lokke fram handling potensialene i 2-dagers trent rotter. Forholdet mellom gjeldende intensiteten og antall handling potensialer vises i figur 4B. 50 pA gjeldende var tilstrekkelig til å lokke fram toppene i 2-dagers trent rotter; derimot svarte 1-dags trent rotter med færre handling potensialer enn untrained rotter 350 pA og høyere strøm. Videre figur 4C viser at 1-dags trent rotter viste lavere hviler potensielle, høyere pigge terskelverdi og dypere afterhyperpolarization, mens 2-dagers trent rotter viste høyere hvile potensial (figur 4C) og membran motstand ( Figur 4 d).
Som vi beskrev tidligere11, indusert IA trening (figur 1 d) postsynaptic plastisitet på eksitatoriske og inhibitory synapser hippocampus CA1 neurons. Ved å måle ventetiden i lyset boksen, kunne vi anslår innholdsrettet læring ytelsen av rotte. Figur 1E viser resultatet av aktiviteten IA. Etter sammenkoblede elektrisk sjokk lære rotter å unngå den mørke siden av boksen og bo i den opplyste siden, som vanligvis de ikke foretrekker. Tendens til å unngå den mørke siden angir derfor oppkjøpet av innholdsrettet minner.
Figur 5 viser et eksempel på spenning-klemme analyse i som miniatyr postsynaptic strømmer ble dramatisk endret etter innholdsrettet læring. Undersøke læring-indusert plastisitet, spontan AMPA-mediert mEPSCs og GABAA-mediert mIPSCs sekvensielt innspilt i nærvær av 0,5 µM tetrodotoxin (figur 5A og B). Som vist på todimensjonale tomter (figur 5C), hadde hver CA1 Nevron forskjellige mener amplituder for mEPSCs og mIPSCs. Selv om amplituder var lav og viste en smal utbredelsesområde i utrente, unpaired, og gjennomgang rotter, de var forskjellige i IA-trent rotter (tabell 5). ANOVA etterfulgt av innlegg-hoc analyse viste en betydelig økning i de mener amplituder av mEPSC og mIPSC i IA-trent rotter (figur 5E), foreslå læring-indusert postsynaptic plastisitet i CA1 nervecellene.
Videre utstilt hver CA1 Nevron forskjellige mEPSC og mIPSC frekvenser (figur 5 d). Selv om frekvensene var lav og viste en smal utbredelsesområde i utrente, unpaired, og gjennomgang rotter, de var forskjellige i IA-trent rotter (tabell 6). ANOVA etterfulgt av innlegg-hoc analyse viste en betydelig økning i frekvenser av mEPSC og mIPSC hendelser i IA-trent rotter (figur 5F). Det er to mulige tolkninger av disse resultatene. Først er at innholdsrettet læring økt antall funksjonelle synapser av neurons. Den andre er at innholdsrettet læring økt presynaptic utgivelse sannsynligheten av glutamat og GABA.
For å ytterligere undersøke presynaptic plastisitet, vi også gjennomført sammen-puls stimulations, som rapportert tidligere10,11.
Figur 1 : Lære prestasjonene.
A: eksperimentell design viser rotoren stang trening og koronale hjernen stykke. B: Gjennomsnittlig ventetid faller fra akselererende rotoren rod fat. C: Gjennomsnittlig ventetid å falle av stangen på først og de siste forsøkene på trening dager 1 og 2-7. P< 0,01 vs første rettssaken. D: skjema på hemmende unngåelse (IA) aktivitet og Koronal hjernen sektoren. E: Gjennomsnittlig ventetid å skrive inn den mørke før og etter IA trening11. P< 0,01 vs før IA trening. Tallene ved framskaffet angir avstanden anterior bregma i mm. Antall dyr vises nederst på barene. Feilfelt viser SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Skjær prosedyrer.
A: fotografiene viser utarbeidelse av akutt hjernen skiver. Disseksjon verktøyene avkjølt i knust is før bruk. B: hjernen disseksjon og trimming. Merk at vinkelen trimming på bakre side må være orientert parallelt med dendrittiske retningen. C: Slicing hjernen i en vibratome kammer. Hjernen er badet i disseksjon buffer og boblet kontinuerlig med en 5% CO2/95% O2 gassblanding. D: en grensesnitt-kammer laget av to plastic mat containere og en silikon rør. Kammeret ble fylt med kunstig CSF og boblet kontinuerlig med gassblanding. E: hjernen stykker ble plassert på våt filter papir i kammeret.Bar = 5 mm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Patch klemme prosedyrer.
A: patch-klemme systemet brukes til å registrere elektriske signaler fra en Nevron. Plasseringen av den stimulerende og innspillingen elektrodene i layer II/III neurons er vist i rotte motorisk cortex. B: for å analysere Schaffer synapser av en CA1 pyramideformet Nevron, en stimulerende elektrode ble plassert på stratum radiatum. Analysere temporoammonic synapser, ble en stimulerende elektrode plassert på stratum moleculare. Representant spor av evoked AMPA og NMDA reseptor-mediert eksitatoriske postsynaptic strømmer i samme CA1 Nevron vises. C: en skive anker ble brukt til å stabilisere sektoren i innspillingen kammeret. D: kart representasjon i motorisk cortex, basert på de publiserte artikler15,16,17. ML = midtlinjen. E: IR-DIC micrographs av M1 layer II/III neurons før (øvre) og under innspillingen (lavere). Bar = 10 µm. F: endringer i pipette gjeldende før trykk (øverst) og på membran ruptur (nederst). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Representant resultatet av gjeldende-klemme analyse7 .
A: representant spor av handlingen potensialer registreres etter induksjon med gjeldende injeksjoner. B: relasjoner mellom gjennomsnittlig gjeldende inndata (pA) vs handling potensial produksjon (Antall spisser) i hjernen skiver fra utrente (åpne barer), 1-dag utdannet (grå barer) og 2-dagers trent rotter (fylte stolper). C: hvile potensial, terskel og afterhyperpolarization lag II/III neurons. D: membranen motstand og serien motstand av neurons. Vi brukte 9-10 rotter i hver gruppe. Antall celler vises i hver stolpe. Feilfelt viser SEM. *P< 0,05, **P< 0,01 vs utrente. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Representant resultatene av spenning-klemme analyse11 .
Representant spor av miniatyr eksitatoriske og inhibitory postsynaptic strøm (mEPSCs og mIPSCs) i utrente (A) og hemmende unngåelse (IA)-trent rotter (B). mEPSCs-60 mV og mIPSCs på 0 mV ble målt etter hverandre i samme CA1 pyramideformet Nevron i nærvær av tetrodotoxin (0,5 µM). Loddrett = 20 pA, Svingstang = 200 MS. C: todimensjonal tomter for gjennomsnittet meg (I) PSC amplituder i utrente, IA-utdannet, unpaired, og gjennomgang rotter. D: todimensjonal tomter meg (I) PSC frekvenser i 4 grupper. Merk at hver CA1 Nevron utstilt forskjellige mener meg (I) PSC amplitudes og frekvenser. IA trening styrkes ikke bare betyr amplitudes (E) men også økt frekvenser av meg (I) PSC hendelser (F). Vi brukte 4-6 rotter i hver gruppe. Antall celler vises nederst på barene. Rødt plusstegn (C, D) og barer med loddrette linjer (E, F) angir gjennomsnittlig ± SEM. **P< 0,01 vs utrente rotter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Disseksjon buffer (totalt 1L) | ||
| NaH2PO4 • 2t2O | 0,195 g | 1,25 mmol/L |
| KCl | 0.188 g | 2.5 mmol/L |
| CaCl2 | 0.074 g | 0,5 mmol/L |
| MgCl2 • 6t2O | 1.423 g | 7,0 mmol/L |
| Kolin klorid | 12.579 g | 90 mmol/L |
| Askorbinsyre | 2.340 g | 11.6 mmol/L |
| Pyruvic syre | 0.342 g | 3.1 mmol/L |
| NaHCO3 | 2.100 g | 25 mmol/L |
| Glukose | 4.500 g | 25 mmol/L |
Tabell 1: En oppskrift på disseksjon buffer
| Kunstig CSF (totalt 1L) | ||
| KCl | 0.186 g | 2.5 mmol/L |
| NaCl | 6.700 g | 114.6 mmol/L |
| NaH2PO4 •2H2O | 0.156 g | 1 mmol/L |
| Glukose | 1.800 g | 10 mmol/L |
| NaHCO3 | 2.184 g | 26 mmol/L |
| 1M MgCl2 | 4 mL | 4 mmol/L |
| 1M CaCl2 | 4 mL | 4 mmol/L |
Tabell 2: En oppskrift på kunstig cerebrospinalvæske (CSF)
| Intracellulær løsning for gjeldende klemme (totalt 200 mL) | ||
| KCl | 0.0746 g | 5 mmol/L |
| K-Gluconate | 6.089 g | 130 mmol/L |
| HEPES | 0.476 g | 10 mmol/L |
| EGTA | 0.0456 g | 0,6 mmol/L |
| 1M MgCl2 | 500 ΜL | 2.5 mmol/L |
| Na2 ATP | 0.4408 g | 4 mmol/L |
| Na3 GTP | 0.0418 g | 0,4 mmol/L |
| Na phosphocreatine | 0.510 g | 10 mmol/L |
Tabell 3: En oppskrift på en intracellulær løsning for gjeldende klemme opptak
| Intracellulær løsning for spenning klemme (totalt 200 mL) | ||||
| CsMeSO3 | 5 | |||
Tabell 4: En oppskrift på en intracellulær løsning for spenning klemme opptak
| Parametere | utrente | IA trent | hender | gå gjennom | |
| mEPSC amplitude | Avvik | 5.8 | 32,1 | 4.7 | 5.9 |
| Standardavvik | 2.4 | 5.7 | 2.2 | 2.4 | |
| Variasjonskoeffisienten | 0.189 | 0.326 | 0.177 | 0.190 | |
| mIPSC amplitude | Avvik | 17.1 | 56,7 | 31,8 | 20.7 |
| Standardavvik | 4.1 | 7.5 | 5.6 | 4.5 | |
| Variasjonskoeffisienten | 0.279 | 0.387 | 0.367 | 0.286 |
Tabell 5: Mangfoldet av miniatyr eksitatoriske og inhibitory postsynaptic gjeldende (mEPSC og mIPSC) amplituder i hemmende unngåelse (IA)-trent rotter
| Parametere | utrente | IA trent | hender | gå gjennom | |
| mEPSC frekvens | Avvik | 278 | 2195 | 188 | 195 |
| Standardavvik | 17 | 47 | 14 | 14 | |
| Variasjonskoeffisienten | 0.902 | 1.198 | 0.893 | 0.874 | |
| mIPSC frekvens | Avvik | 3282 | 27212 | 1385 | 5135 |
| Standardavvik | 57 | 165 | 37 | 72 | |
| Variasjonskoeffisienten | 1.195 | 1.006 | 0.955 | 0.836 |
Tabell 6: Mangfoldet av miniatyr eksitatoriske og inhibitory postsynaptic gjeldende (mEPSC og mIPSC) frekvenser i hemmende unngåelse (IA)-trent rotter
Discussion
Stor begrensning av skive oppdateringen klemme teknikken er innspillingen skive forberedelse, som ikke kanskje reflektere hva skjer i vivo. Selv om i vivo gjeldende-klemme analyse er mer pålitelig, er det teknisk utfordrende for å få nok data fra bevisst dyr. Siden hver pyramideformet Nevron har ulike mobilnettet egenskaper, er et tilstrekkelig antall celler nødvendig å riktig analysere forskjeller i neurons etter trening. Videre krever spenning-klemme analyse sammenhengende behandling med CNQX, APV, eller bicuculline for å angi postsynaptic svarene. Analysere miniatyr svarene indusert av en enkelt vesicle glutamat eller GABA, er sammenhengende behandling med tetrodotoxin nødvendig å blokkere spontan handling potensialer. Selv om det nylig utviklet flere Foton tenkelig teknikken er kraftig for å analysere morfologiske endringer eksitatoriske synapser19, er en kombinert oppdateringen klemme teknikk nødvendig for å analysere funksjonen til synapser i vivo. Det er ganske vanskelig å analysere morfologiske endringer på hemmende synapser, siden de fleste hemmende synapser ikke form spines. Foreløpig ville skive oppdateringen klemmen være de mest egnede teknikken til å analysere egenskaper eller funksjonene til eksitatoriske/hemmende synapser i trent dyr.
Bruker gjeldende-klemme analyse (Figur 4), rapportert vi nylig motor læring-indusert iboende plastisitet i layer II/III neurons. Spesielt, 1-dag trent rotter viste en signifikant nedgang i hvile membran potensial og en økning i spike terskelen. 2-dagers trent rotter viste en betydelig økning i hvile membran potensialet som førte til økt excitability. Disse resultatene antydet at det var dynamiske endringer i indre plastisitet av M1 layer II/III nerveceller i trent rotter. Ekstra spenning-klemme analyse viste en økning i sammen-puls forholdet i 1-dags trent rotter, antyder at det var en forbigående nedgang i presynaptic GABA release sannsynlighet7. Det er derfor mulig at disinhibition fra GABA på laget II/III synapser kan utløse den resulterende læring-indusert plastisitet i M1. Dette krever skive utarbeidelse av M1 bad behandling med en GABAA reseptor blokkering å indusere LTP20.
Analyse av miniatyr postsynaptic potensialer er en effektiv måte å oppdage synaptiske plastisitet i IA-trente dyr. Sekvensiell opptak av mEPSCs og mIPSCs i en enkelt CA1 Nevron tillater analyse av synaptic eksitatoriske/hemmende styrken til hver enkelt Nevron. Siden en enkelt meg (I) PSC svar er knyttet til en enkelt vesicle glutamat eller GABA, en økning i meg (jeg) PSC amplituden antyder postsynaptic styrke. Bruke meg (I) PSC analyse, fant vi individuelle forskjeller i styrken av eksitatoriske/hemmende innspill til hver CA1 Nevron (figur 5C). IA trening tydelig fremmet mangfold i synaptiske styrke, men dette ble ikke observert i andre grupper (tabell 5).
Læring-indusert synaptic mangfold kan analyseres matematisk. Ved å beregne utseendet sannsynligheten for hvert punkt, kan data fra hver Nevron konverteres til selv-entropi (bit) ved hjelp av informasjon teorien Claude E. Shannon21. Et punkt med høy utseende sannsynlighet (rundt mener nivået) angir lav selvtillit-entropi, mens et punkt med svært sjeldne sannsynlighet (en avveket punkt) indikerer høy self-entropi. Sammenlignet med utrente rotter, selv-entropien per Nevron var tydelig økte i IA-trent rotter men ikke unpaired eller gjennomgang rotter22. Denne analysen antyder at det var en økning i intra-CA1 informasjon etter innholdsrettet læring.
Skive oppdateringen klemme teknikken kan også brukes for cued frykt condition studier i laterale amygdala9 og sanseopplevelse studier i fat cortex8. Dessuten, denne teknikken kan brukes med ulike andre teknikker for videre undersøkelser. For eksempel, virus-mediert grønne fluorescerende protein (GFP)-merket gen levering teknikk kan kombineres med oppdateringen klemme teknikken å analysere funksjonen til bestemte molekyler. I tillegg kan fokal microinjection av en retrograd tracer brukes å visualisere bestemt neurons prosjektet til et bestemt område. Deretter kan bruker gjeldende-klemme teknikken, celle-spesifikke egenskaper analyseres i visualisert neurons23. Videre har kombinerer to-fotonet-laserskanning mikroskopi med to-fotonet laser uncaging av glutamat blitt brukt til å demonstrere ryggraden-spesifikke vekst og EPSC svar i mus kortikale layer II/III pyramidale nevroner19. Dermed blir skive oppdateringen klemme teknikken forbedret ved å kombinere det med romanen kjemikalier, gen levering og Foto manipulasjon teknikker.
Disclosures
Forfatterne erklærer ikke interessekonflikter. Vi bekrefte at vi har lest journalens posisjon på problemer involvert i etiske publikasjon, og vi bekrefter at denne rapporten er i overensstemmelse med disse retningslinjene. Fond ikke hadde noen rolle i studien design, datainnsamling analyse, beslutningen om å publisere eller utarbeidelse av manuskriptet.
Acknowledgments
Vi vil gjerne takke Dr. Paw-Min-Thein-Oo, Dr. Han-Thiri-Zin og fru H. Tsurutani for deres kundestøtte. Dette prosjektet ble støttet av Grants-in-Aid for unge forskere (H.K. og utleid), vitenskapelig forskning B (DM), vitenskapelig forskning C (DM) og forskning i nyskapende områder (DM), fra Kunnskapsdepartementet, kultur, sport, vitenskap, og Teknologi i Japan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rota-Rod Treadmills | Med Associates Inc. | ENV577 | |
| inhibitory avoidance box | Shinano Seisakusho | ||
| Pentobarbital | Kyoritsu Seiyaku | ||
| Blade | Nisshin EM Co., Ltd | LC05Z | |
| Cardiac perfusion syringe | JMS Co., Ltd | JS-S00S | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT-1200 | |
| Horizontal puller | Sutter Instrument | Model P97 | |
| Microfilm 34 gauge | World Precision Instruments, Inc | MF34G-5 | |
| 0.22 µm filter | Millipore | SLGVR04NL | |
| Axopatch–1D amplifier | Axon Instruments | ||
| Digidata 1440 AD board | Axon Instruments | ||
| pCLAMP 10 software | Axon Instruments | ||
| Upright Microscope | Olympus | BX51WI | |
| CCD camera | Olympus | U-CMAD3 | |
| Camera controller | Hamamatsu Photonics K.K. | C2741 | |
| Stimulator | Nihon Kohden | SEN-3301 | |
| Isolator | Nihon Kohden | SS-104J | |
| Motorized manipulator | Sutter Instrument | MP-285 | |
| Micromanipulator | Narishige | NMN-21 | |
| Peristaltic Pump | Gilson, Inc | MINIPULS® 3 | |
| Glass capillary | Narishige | GD-1.5 | |
| Ag/AgCl electrode | World Precision Instruments, Inc | EP4 | |
| Slice Anchor | Warner instruments | 64-0252 | |
| Stimulus electrode | Unique Medical Co., Ltd | KU201-025B | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection buffer/ artificial CSF |
|||
| NaH2PO4 • 2H2O | Sigma-Aldrich Co. | C1426 | |
| KCl | Wako Pure Chemical Industries | 163-03545 | |
| CaCl2 | Wako Pure Chemical Industries | 039-00475 | |
| MgCl2 • 6H2O | Wako Pure Chemical Industries | 135-00165 | |
| Choline chloride | Sigma-Aldrich Co. | C7527 | |
| Ascorbic acid | Wako Pure Chemical Industries | 190-01255 | |
| Pyruvic acid Na | Wako Pure Chemical Industries | 199-03062 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich Co. | 28-1850-5 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich Co. | 07-0680-5 | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Intracellular solution | |||
| K-Gluconate | Sigma-Aldrich Co. | G4500 | |
| HEPES | Wako Pure Chemical Industries | 346-01373 | |
| EGTA | Wako Pure Chemical Industries | 348-01311 | |
| Na2 ATP | Nacalai Tesque | 01072-24 | |
| Na3 GTP | Sigma-Aldrich Co. | G-8877 | |
| Na phosphocreatine | Sigma-Aldrich Co. | P-7936 | |
| CsMeSO3 | Sigma-Aldrich Co. | C1426 | |
| CsCl | Wako Pure Chemical Industries | 033-01953 | |
| Materials | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs in aCSF | |||
| 2-Chloroadenosine | Sigma-Aldrich Co. | C5134 | |
| Picrotoxin | Sigma-Aldrich Co. | P-1675 | |
| Tetrodotoxin | Wako Pure Chemical Industries | 207-15901 | |
| CNQX | Sigma-Aldrich Co. | C239 | |
| APV | Sigma-Aldrich Co. | A5282 |
References
- Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260 (5554), 799-802 (1976).
- Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches. Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).
- Edwards, F. A., Konnerth, A., Sakmann, B., Takahashi, T. A thin slice preparation for patch clamp recordings from neurones of the mammalian central nervous system. Pflugers Arch. 414 (5), 600-612 (1989).
- Rioult-Pedotti, M. S., Friedman, D., Donoghue, J. P. Learning-induced LTP in neocortex. Science. 290 (5491), 533-536 (2000).
- Yang, G., Pan, F., Gan, W. B. Stably maintained dendritic spines are associated with lifelong memories. Nature. 462 (7275), 920-924 (2009).
- Xu, T., et al. Rapid formation and selective stabilization of synapses for enduring motor memories. Nature. 462 (7275), 915-919 (2009).
- Kida, H., et al. Motor Training Promotes Both Synaptic and Intrinsic Plasticity of Layer II/III. Pyramidal Neurons in the Primary Motor Cortex. Cereb Cortex. 26 (8), 3494-3507 (2016).
- Takahashi, T., Svoboda, K., Malinow, R. Experience strengthening transmission by driving AMPA receptors into synapses. Science. 299 (5612), 1585-1588 (2003).
- Rumpel, S., LeDoux, J., Zador, A., Malinow, R. Postsynaptic receptor trafficking underlying a form of associative learning. Science. 308 (5718), 83-88 (2005).
- Mitsushima, D., Ishihara, K., Sano, A., Kessels, H. W., Takahashi, T. Contextual learning requires synaptic AMPA receptor delivery in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12503-12508 (2011).
- Mitsushima, D., Sano, A., Takahashi, T. A cholinergic trigger drives learning-induced plasticity at hippocampal synapses. Nat Commun. 4, 2760 (2013).
- Kida, H., Mitsushima, D. Patch Clamp Technique in Brain Slices: Recording of Neuronal Activity in the Rat Primary Motor Cortex. Yamaguchi Medical Journal. 63, (2014).
- Watt, A. J., van Rossum, M. C., MacLeod, K. M., Nelson, S. B., Turrigiano, G. G. Activity coregulates quantal AMPA and NMDA currents at neocortical synapses. Neuron. 26 (3), 659-670 (2000).
- Baidan, L. V., Zholos, A. V., Wood, J. D. Modulation of calcium currents by G-proteins and adenosine receptors in myenteric neurones cultured from adult guinea-pig small intestine. Br J Pharmacol. 116 (2), 1882-1886 (1995).
- Tandon, S., Kambi, N., Jain, N. Overlapping representations of the neck and whiskers in the rat motor cortex revealed by mapping at different anaesthetic depths. Eur J Neurosci. 27 (1), 228-237 (2008).
- Adachi, K., Murray, G. M., Lee, J. C., Sessle, B. J. Noxious lingual stimulation influences the excitability of the face primary motor cerebral cortex (face MI) in the rat. J Neurophysiol. 100 (3), 1234-1244 (2008).
- Tennant, K. A., et al. The organization of the forelimb representation of the C57BL/6 mouse motor cortex as defined by intracortical microstimulation and cytoarchitecture. Cereb Cortex. 21 (4), 865-876 (2011).
- Pinheiro, P. S., Mulle, C. Presynaptic glutamate receptors: physiological functions and mechanisms of action. Nat Rev Neurosci. 9 (6), 423-436 (2008).
- Kwon, H. B., Sabatini, B. L. Glutamate induces de novo growth of functional spines in developing cortex. Nature. 474 (7349), 100-104 (2011).
- Hess, G., Donoghue, J. P. Long-term potentiation of horizontal connections provides a mechanism to reorganize cortical motor maps. J Neurophysiol. 71 (6), 2543-2547 (1994).
- Shannon, C. E. A mathematical theory of communication. Bell Sys Tech J. 27, (1948).
- Ono, K. M., D, Learning creates diversity of excitatory and inhibitory synapses in the hippocampal CA1: a possible amount of information at a single synapse. J Physiol Sci. 67, (2017).
- Wang, L., Conner, J. M., Rickert, J., Tuszynski, M. H. Structural plasticity within highly specific neuronal populations identifies a unique parcellation of motor learning in the adult brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (6), 2545-2550 (2011).
