Summary
نقدم طريقة لقياس النماذج الظاهرية للنمو من خلايا الخميرة الفردية لأنها تنمو إلى مستعمرات على وسائل الإعلام الصلبة باستخدام الوقت الفاصل بين المجهري وصفت، خلية واحدة مضاعفة تقييم صفائف المعيشة من الخميرة (أوديلاي). ويمكن ملاحظة عدم التجانس السكاني للخلايا المتطابقة وراثيا المتزايد في المستعمرات بشكل مباشر وكمي.
Abstract
النمو الظواهر من الكائنات الحية الدقيقة هي مؤشر قوي على اللياقة البدنية الجينية الكامنة ويمكن فصلها إلى 3 أنظمة النمو: مرحلة تأخر، مرحلة السجل، ومرحلة ثابتة. كل مرحلة نمو يمكن أن تكشف عن جوانب مختلفة من اللياقة البدنية التي ترتبط مختلف الظروف البيئية والجينية. ومن الصعب عموما الحصول على قياسات عالية الدقة وكمية لجميع مراحل النمو الثلاث. هنا نقدم طريقة مفصلة لتوصيف جميع مراحل النمو 3 على وسائل الاعلام الصلبة باستخدام مقايسة يسمى خلية واحدة مضاعفة تقييم صفائف المعيشة من الخميرة (أوديلاي). أوديلاي يحدد النماذج الظاهرية للنمو من الخلايا الفردية المتنامية إلى مستعمرات على وسائل الإعلام الصلبة باستخدام الفاصل الزمني الفاصل الزمني. هذه الطريقة يمكن أن يلاحظ مباشرة التغاير السكاني مع كل معلمة النمو في الخلايا المتطابقة وراثيا المتنامية في المستعمرات. هذا التباين السكاني يقدم منظورا فريدا لفهم التنظيم الجيني والتخلق الوراثي، والاستجابات لوالاضطرابات الجينية والبيئية. في حين أثبتت طريقة أوديلاي باستخدام الخميرة، ويمكن استخدامه على أي مستعمرة تشكيل الكائنات الحية الدقيقة التي مرئية من قبل المجهر الميدان مشرق.
Introduction
النمو الظاهري من الكائنات الدقيقة هي مؤشر قوي على اللياقة البدنية الكامنة وراءها إلى حالة بيئية معينة. يتم فصل النمو بشكل كلاسيكي إلى 3 أنظمة نمو مختلفة: مرحلة التأخر، مرحلة السجل، ونمو المرحلة الثابتة 1 . كل مرحلة نمو يمكن أن تكشف عن جوانب مختلفة من اللياقة البدنية التي تعتمد على مختلف الظروف البيئية والجينية. على سبيل المثال، وقت التأخر، أو طول الوقت الذي ينفقه الكائن الحي في مرحلة التأخر قبل بداية النمو الأسي، يمكن أن يكون مؤشرا على قدرة الكائن الحي على الاستجابة للظروف البيئية المتغيرة 2 . الوقت مضاعفة خلال النمو مرحلة سجل، المقياس الأكثر شيوعا من اللياقة الخلوية، ويكشف عن الكفاءة الكلية لقدرة الكائن الحي على تقسيم عن طريق التمثيل الغذائي واستخدام المواد البيئية للتكرار. المرحلة الثابتة، حيث النمو بعد تسجيل مرحلة خفض بسرعة، هو مؤشر آخر على اللياقة البدنية، والذي هو منتظملي تستخدم كنقطة نهاية النمو في المقايسات النمو الخميرة القائمة على بقعة.
العديد من المقايسات نمو الخميرة المتاحة حاليا وتعتبر الطرق القياسية لتقييم الظواهر النمو في الخميرة 3 ، 4 ، 5 . وتستند هذه المقايسات في المقام الأول على أساليب لزراعة الخميرة سواء على وسائل الإعلام الصلبة أو في السائل. على وسائل الاعلام الصلبة، فحوصات تربط مستعمرة نقل عدد قليل من الخلايا على أجار الصلبة مع دبوس، وخلايا الخميرة يسمح للنمو لفترة محددة من الزمن. ثم يتم تصوير المستعمرات ويتم مقارنة أحجامها عند نقطة النهاية النهائية 6 . وقد أثبتت هذه المقايسات تعلق مستعمرة قوية وقابلة للتوليد لتوليد شاشات على نطاق الجينوم. في الآونة الأخيرة، تم دمج التصوير الدوري باستخدام الماسحات الضوئية المسطحة والكاميرات عدسة واحدة ريفلكس (سلر) في هذه المقايسات لتسجيل نمو مستعمرة مع مرور الوقت 7 ، 8، 9 . ومع ذلك، فإن حل هذه الأجهزة يمنعهم من الكشف عن خلايا واحدة، وبالتالي فإن هذه المقايسات تعلق مستعمرة لا تلاحظ مباشرة تأخر الوقت ولا يمكن أن نلاحظ الاختلاف بين الخلايا الفردية التي تنمو لتصبح مستعمرات.
كما تم استخدام مقايسات النمو المستندة إلى السائل لأداء الشاشات على نطاق الجينوم 3 . أظهر اقتران مقايسة النمو السائل مع الفحص المجهري الفاصل الزمني عدم التجانس السكاني في الوقت مضاعفة من الخلايا الفردية متطابقة وراثيا، والذي يوفر منظورا هاما لفهم التنظيم الجيني والتكيف البيئي. ومع ذلك، هذا المقياس لا يقيس جوانب أخرى من النمو مثل الوقت تأخر والقدرة على التحمل 10 . هنا نقدم طريقة لتوصيف كل مراحل النمو الثلاث من مستعمرة تشكيل الكائنات الحية الدقيقة على وسائل الإعلام الصلبة باستخدام مقايسة نحن مصطلح أوديلاي 11 . أوديلاي يتكون من أوتيليزينغ عالية الإنتاجية الوقت الفاصل بين المجهري لتسجيل الصور من خلايا واحدة تنمو إلى مستعمرات على وسائل الإعلام الصلبة. هذا السكان من الخلايا الفردية التي تنمو إلى مستعمرات تكشف عن عدم التجانس السكان الكامنة، والتي لم يتم الكشف عن غيرها من القياسات أقل حساسية مثل التهديف نهاية نقطة التهديف. علينا أن نظهر طريقة على الخميرة، ولكن أوديلاي يمكن تطبيقها على أي الكائن الذي يظهر التباين في مجال الفحص المجهري مشرق.
Protocol
1. إعداد أغاروس جل الأسهم
- تزن 2 غرام من أغاروس عالية النقاء.
- إضافة الاغاروز إلى زجاجة 500 مل وتسجيل كتلة مجتمعة بهم.
- حساب كتلة الهدف من زجاجة زائد 2 غرام أغاروس مع 150 غرام من الماء النقي جدا، ثم إضافة 150 غرام من الماء النقي جدا إلى داخل 0.1 غرام من هذه الكتلة الهدف.
- لاحظ كتلة من الزجاجة بالإضافة إلى الاغاروز والماء.
- وضع زجاجة في الميكروويف والتأكد من لتناسب زجاجة مع غطاء فضفاض على رأس للحد من تبخر المياه في حين تسخين الاغاروز.
- ميكروويف زجاجة في 15-20 ثانية رشقات نارية تليها لفترة وجيزة يحوم الزجاجة لخلط الاغاروز والماء. كرر هذا الإجراء حتى يغلي الحل والخليط متجانس.
تنبيه: يجب الحرص على تجنب تهيج البشرة بالبخار من الزجاجة. أيضا، فإن زجاجة تصبح ساخنة لمسة والحماية المناسبة، مثل قفازات الأوتوكلاف، مطلوب لتجنب الإصابة. - بعد الاغاروز المنصهر هو متجانسة، تزن زجاجة مرة أخرى وإضافة الماء عالى النقاء إلى داخل 0.1 غرام من الكتلة الأصلية. وهذا سيحل محل أي المياه المفقودة بسبب التبخر.
- قبل الاغاروز المنصهر يتصاعد، دوامة لخلط في الماء المضافة لضمان التجانس.
- قسامة 15.2 غرام من الاغاروز في أنابيب بلاستيكية 9 - 50 مل.
- تبريد الأنابيب حتى الحاجة.
2. إعداد أوديلاي الاغاروز وسائل الإعلام
- تسخين 400 مل من الماء منزوع الأيونات لتغلي في دورق مغطى، على موقد تحت التحريك لطيف مع شريط مغناطيسي.
- إضافة 2 مل من وسائل الإعلام 10X (على سبيل المثال ، الخميرة استخراج بيبتون (يب)، أو كامل خليط الملحق (كسم)) إلى قسامة الاغاروز 15.2 غرام في أنبوب مخروطي 50 مل من الخطوة 1.10.
ملاحظة: متوسط كسم يميل إلى التمسك الشرائح الزجاجية. إذا كان استخدام تركيبات وسائل الإعلام كسم، إضافة 5 ميكرولتر من 50٪ بالوزن البولي إيثيلين جلايكول (بيج) في الماء المعقم إلى صياغة المتوسطة. و بيج يمنع أغار من التمسك الشرائح الزجاجية خلال الافراج عن العفن ولا تمنع نمو الخميرة. - إضافة 100X إضافية المكملات الغذائية، إذا لزم الأمر، واستخدام المياه لتحقيق إجمالي حجم المضافة من هذه الخطوة إلى 1 مل.
- تزن قسامة الاغاروز مع وسائل الإعلام المضافة والمكملات الغذائية قبل وضع أنبوب مخروطي 50 مل في الماء المغلي من الخطوة 2.1.
- بعد 16 دقيقة، واخراج أنبوب 50 مل وتجانس الخليط باستخدام دوامة. إبقاء الغطاء تثبيتها ضيقة على أنبوب مخروطي 50 مل.
ملاحظة: غطاء على الكأس يساعد على حرارة أنبوب كامل بالتساوي فيلم من الاغاروز الصلبة ستشكل وربما لا تذوب. أيضا خلال هذا الوقت، أنها مريحة لتجميع العفن الاغاروز ( الشكل 1 ). - تجانس الخليط باستخدام دوامة.
- يغلي لمدة 2 دقيقة إضافية لضمان خلط جميع آغار وذاب.
- تزن أنبوب واستبدال أي كتلة فقدت مع الماء النقي جدا نقية.
- إضافة 2 مل من 10X الكربون الحامضسي (على سبيل المثال ، 20٪ ث / الخامس الجلوكوز) والدوامة للحصول على الحل المتوسط الاغاروز.
ملاحظة: فصل الشرائح الزجاجية: عند تجميع القالب، يجب توخي الحذر للتأكد من وضع الفواصل طويلة في القالب مع التوجه الصحيح. وذلك لأن الليزر قطع الاكريليك، فإنه يميل إلى قطع كما مخروط ترك الجزء مع الجانبين زاوية قليلا بدلا من بالضبط 90 درجة الجانبين. ثم عندما يتم وضع القالب على مقاعد البدلاء للافراج عن الزجاج من أجار، ينبغي أن تكون حافة فاصل في زاوية حادة مع أجار. الزاوية الحادة تساعد على ضغط حافة أجار بعيدا عن الجزء العلوي من الزجاج كما الحافة الخارجية للفتحة العفن يتمحور حول الحافة السفلى (انظر الشكل 1 ). والنتيجة هي فصل أكثر اتساقا من أجار من الجزء العلوي من الزجاج.
ملاحظة: لا ينبغي استخدام عوامل الافراج عن العفن المطبقة على الزجاج مثل الزيوت أو بخاخ السيليكون أو حتى معالجة النوافذ التجارية لأنها سوف تلوث s أورفيس من أجار وربما تمنع النمو. هذه الأساليب تأخذ بعض الممارسات لتكون متسقة. - تنظيف أربعة 2 في × 3 في × 1 ملم شرائح الزجاج السميك مع الايثانول 70٪ وجافة باستخدام الهواء القسري.
- قوالب الاكريليك نظيفة مع الايثانول 70٪، جافة، وتجميع كما هو مبين في الشكل 1 . خذ قطع أسفل ثلاثة، كما هو مبين، وتجميعها بحيث قطعتين متطابقة شطيرة القطعة الثالثة ( الشكل 1B ). المشبك قطعة قاعدة على كل جانب باستخدام اثنين من مقاطع الموثق صغير ( الشكل 1C ). وضع أوبريتس في القالب التأكد من أن كيرف الليزر يتم وضعه بشكل صحيح ( الشكل 1E ).
- ضع الشريحة الزجاجية المجففة والمجففة على القالب واحتفظ بها في مكانها أثناء وضع شريحة زجاجية ثانية على الجانب الآخر. المشبك التجمع مع مقطع الموثق أكبر ( الشكل 1D ). المشبك أسفل الشرائح مع مقاطع الموثق أكبر (لاس = "زفيغ"> الشكل 1D). تأكد من أن مقطع الموثق العلوي هو في اتصال مع شريحة زجاجية تتداخل مع الاكريليك.
- إضافة مقاطع الموثق المتبقية. مرة أخرى، تأكد من المشابك الاتصال الشريحة حيث يتداخل الاكريليك ( الشكل 1D ).
ملاحظة: قبل ملء العفن تجميعها مع آغار المنصهر، وضمان حواف مختومة من قبل بيبتينغ حوالي 70 ميكرولتر من وسائل الإعلام أجار المنصهر على طول الجانب الداخلي من القالب. هذا أجار سوف تصلب بسرعة ومنع أي تسرب. - ملء القالب مع آغار المنصهر، والتأكد من تجنب محاصرة فقاعات الهواء في القالب.
ملاحظة: هذا يمكن أن يتحقق عن طريق بيبتينغ ببطء أجار المنصهر على طول حافة القالب. بعد شغله، والسماح للعفن لتبرد لمدة 40 دقيقة إلى 1 ساعة عند حوالي 23 درجة مئوية درجة الحرارة المحيطة. إذا سمح لتبرد وقتا طويلا قد أجار كسر في القالب.
ملاحظة: فصل العفن: إزالة السليم من القالب أجار ضروري لضمان موحدة الصلبةأجار وسادة لنمو الخميرة. الفشل في ضمان الفصل الفعال للقالب في هذه الخطوة سوف يسبب اختلافات النمو التي تعزى إلى عيوب في وسادة أجار الصلبة. ويوصى بممارسة هذه الخطوة عدة مرات. - ابدأ بإزالة مقطع الموثق السفلي. إزالة الجزء السفلي من القالب الذي يتكون من قطع ثلاثة محاطة. عقد الشرائح عن طريق ضغط لهم ثم إزالة مقاطع الموثق. تأكد من عدم عثرة الجانبين العفن أثناء إزالة مقاطع الموثق. وهذا سوف تشوه وسائل الإعلام.
- وضع القالب على حافة أعلى مقاعد البدلاء بحيث الجانب من القالب مع النقطة الزرقاء تواجه أعلى وفي الزاوية اليسرى السفلى ( الشكل 1E ). وضع الابهام تحت الاكريليك والاصبع الأول على القمة نحو الحافة الداخلية للقالب.
- ببطء وبدقة دفع مع الإبهام ضد القالب، كما لو محوري فاصل العفن حول الحافة السفلى ( الشكل 1F ). تطبيق ثابتولكن زيادة الضغط ببطء. وسيكون للمستخدمين رؤية كسر وتظهر فقاعة الهواء على طول الخط حيث يغطي الزجاج العلوي فاصل العفن.
- بعد رؤية خط الانقطاع الأولي، استمر في الضغط مع الإبهام وتطبيق الضغط المستمر. أجار يجب أن تبدأ كسر بعيدا عن الزجاج عند هذه النقطة ( الشكل 1F ). الاستمرار في محور القالب صعودا. وهذا رفع الزجاج دون انزلاق ذلك. يجب أن يستمر الخط الذي يقشر فيه الأجار بعيدا عن الزجاج في الابتعاد عن خط الفاصل الأولي.
ملاحظة: عند هذه النقطة، أجار هو التمسك كل من الجزء السفلي وأعلى من الزجاج. وهذا يحدث أحيانا مع اليسار معظم الحافة. طالما أن المنطقة المشوهة ليست في المنطقة حيث يتم رصد الخميرة، وهذا ينبغي أن يكون على ما يرام. - كما يأتي الزجاج مجانا تماما، والاستيلاء عليه وإزالته تماما من القالب. ثم إزالة قطعة العفن الأخرى باستخدام حركة مماثلة لرفع قطعة مجانا دون تحريك أجار. ضع الشرائح فيمربع معقم مع بعض الماء العقيمة عالية النقاء في الجزء السفلي. إغلاق مربع وتخزينها في 4 ° كو / N لاستخدامها في اليوم التالي. إذا تم تخزينها لفترة أطول، فإن معدلات النمو تصبح غير متناسقة.
3. أوديلاي إعداد الثقافة
- وضع سلالات في لوحة 96-جيدا لنمو O / N.
- في اليوم التالي، تمييع 20 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها في 200 ميكرولتر وسائل الإعلام ل 220 ميكرولتر الحجم الكلي في لوحة جديدة.
- قياس كثافة بصرية في 600 نانومتر (OD600) من كل ثقافة في قارئ لوحة. باستخدام قارئ لوحة والروبوت التعامل مع السائل، اتبع بروتوكول التخفيف الآلي من الخطوات 3.3.1 - 3.3.6. يخفف يدويا الثقافات في لوحة إلى حوالي 0.1 OD600 (اختياري).
- على القارئ لوحة، ضرب "تجربة" تحت "إنشاء جديد". اختر ODELAYDilution.exp وقم بتشغيل التجربة. أدخل اسم التجربة ك أوديلاي "ديت" "تايم" "اسم التجربة" التكرار.
- انقر على sتاتيستيكش ثم انقر فوق أيقونة إكسيل. حفظ البيانات إلى محرك الأقراص الإبهام ونقله إلى الكمبيوتر الروبوت التعامل مع السائل.
- افتح محرر تخطيط وطريقة روبوت. افتح ملف ميثود "ODELAYDilution_v1.med". تشغيل إكسكوتابل "Convert_SynergyFiles.exe". أدخل 0.09 ل OD600 المستهدفة.
- انقر على "تصحيح غلو" و "تصحيح غال" إلى 0.05. قياس وسائل الإعلام فارغة في لوحة متطابقة. انقر على "إنشاء ملف". حدد الملف في محرر الطريقة. انقر على أيقونة التوقف لبدء طريقة لفتح برنامج تخفيف وقت التشغيل.
- تأكد من عدم وجود أنابيب مؤكدة وإزالة الأغطية، كما تتم إزالة أغطية الغبار من النصائح. تحميل لوحات، أنابيب ونصائح على سطح السفينة التعامل مع الروبوت، كما هو مبين من قبل تخطيط سطح السفينة.
- انقر على زر "تشغيل" لتشغيل برنامج التخفيف. حدد العدد الصحيح من 50 ميكرولتر نصائح. حدد العدد الصحيح من 300 ميكرولتر نصائح. انتظر12 دقيقة لتشغيل العملية.
- خذ لوحة التخفيف من الروبوت، وتغطي النصائح، وخلاصة أنابيب الوسائط 15 مل. ثقافة لوحة لمدة 5 - 6 ساعات في 30 درجة مئوية.
- حوالي 1 - 2 ساعة قبل بدء التخفيف الثاني تأكد من تشغيل غرف الحضانة للمجهر. السماح لهم بالتوازن عند درجة مئوية أو درجة الحرارة المطلوبة للتجربة.
- كرر خطوات التخفيف 3.3 - 3.4، ولكن تمييع الثقافات إلى OD600 من 0.01 - 0.02 لاكتشاف الثقافات على الشرائح الاغاروز.
- غطاء لوحة التخفيف مع ختم الفريزر المعدنية.
- يصوتن لوحة التخفيف في حمام الجليد لمدة 30 ثانية مع لوحة العائمة في الماء المثلج باستخدام دلو الطرد المركزي المعدني المناسب لعقد لوحة ( الشكل 2A ). نقل الثقافات سونيكاتد من لوحة التخفيف إلى لوحة أسفل مسطحة. تسمية 4 × 96 جيدا لوحات مسطحة القاع 1 و 2 و 3 و 4 ( الشكل 2B ).
- نقل 150 &# 181؛ L من لوحة التخفيف من الآبار A01 - D06 في الآبار C04 - F09 من لوحة المسمى 1. ثم نقل 150 ميكرولتر من لوحة التخفيف من الآبار A07 - D12 في الآبار C04 - F09 من لوحة المسمى 2. ثم نقل 150 ميكرولتر من لوحة التخفيف من الآبار E01 - H06 في الآبار C04 - F09 من لوحة المسمى 3. وأخيرا نقل 150 ميكرولتر من لوحة التخفيف من الآبار E07 - H12 في الآبار C04 - F09 من لوحة المسمى 4.
- انتقل إلى الخطوة 4، الإكتشاف على أغار.
4. الإكتشاف على أغار باستخدام الآلي الكشف عن السائل الروبوت
- إزالة الشرائح أغاروس المخزنة في 4 ° كو / N (من الخطوة 2.19) من صناديق ماصة مرطب ترطيبها.
- إذا لزم الأمر، وتقليم زوايا المتوسطة الاغاروز مع شفرة حلاقة نظيفة لضمان أنها سوف تناسب على غرفة الشريحة.
- إزالة المشبك الشريحة قبالة جبل. وضع بعناية لوحة أجار في منطقة راحة من المرحلة غرفة جبل.
ملاحظة: تأكد من أوإينتاتيون من الشريحة يتسق من التجربة إلى التجربة. - تحقق للتأكد من المشبك هو دافق مع الجزء السفلي من الغرفة. إذا كان ملتوية، ثم الشريحة قد لا يجلس تماما في منطقة راحة. وضع فاصل تسوية في مركز لوحة موقف الروبوت اكتشاف. هذا فاصل يوفر الاتصال لمسامير التسوية بحيث غرفة الشرائح يمكن مسوي مع النصائح.
- وضع لوحات على الطاولة في ترتيب ربعهم. لوحات 1، 2، 3 و 4 أمر من اليسار إلى اليمين ( الشكل 2B ).
- وضع النصائح بحيث 24 البئر الداخلية C04 - F09 مشغولة مع نصائح في 4 صناديق تلميح فارغة. وهناك مربع خامس تحتاج إلى أن يكون طرف واحد في موقف C10، فضلا عن 4 نصائح مع أهدافها قطعت في A01، A12، H01، و H12 المواقف. هذه 4 قطع نصائح توفر الاستقرار لوحة تلميح المشبك ( الشكل 2C و 2D ).
- إزالة الغطاء العلوي من سيإيد غرفة جبل.
- وضع أول لكمة طرف في موقع البداية من برنامج مراقبة الروبوت الكشف عن. هذا ينبغي لكمة ثقب في الاغاروز التي سيتم استخدامها في وقت لاحق لمواءمة تنسيق الأصل. وضع لوحة 1 على الروبوت التعامل مع السائل على الفور في الربع الأول. تأكد من إزالة الغطاء ومواصلة برنامج اكتشاف.
- تحقق للتأكد من جميع البقع موجودة. أيضا، انتظر ~ 30 ثانية بالنسبة لهم لتجف. عندما تكون البقع حوالي 1 ملم في القطر، قد يستمر البرنامج. إفراغ النصائح المستخدمة في حاوية البيولوجية، ووضع نصائح جديدة على الروبوت. مبادلة خارج لوحة 1 ل 2 رباعي لوحة.
- كرر الربع الثالث. وكرر مرة أخرى للربع الرابع .
- عندما تكون البقع جافة، استبدل غطاء غرفة الشرائح وقم بتركيب الجهاز.
- قم بترکیب توصیلات الأنابیب باستخدام فلتر الھواء.
- وضع شريحة زجاجية على الجانب العلوي من الغرفة.
ملاحظة: هذه الشريحة أمر بالغ الأهمية ل ريدوسينغ تدفق الحرارة إلى أجار ويقلل من تشكيل التكثيف على الهدف غطاء زلة الجانب من الغرفة. لا ننسى هذا الغطاء زلة. اعتمادا على تكوين المجهر، وهذا الغطاء زلة يمنع التدفئة من الجانب الإضاءة من التسبب في التكثيف على الجانب الهدف. - وضع مروحة لتفجير الهواء الساخن على الجانب الهدف من الغرفة. هذا المروحة يمنع التكثيف من تشكيل على زلة الغطاء. تعيين معدل تدفق الهواء من خلال فقاعة إلى 10 مل / دقيقة.
5. تشغيل أوديلاي على المجهر
- تشغيل البرنامج النصي "ODELAY_Microscope_Control.m".
- انقر على "مصراع" لفتح مصراع الضوء المرسلة وثم زر "التركيز" لبدء ارتفاع معدل الكاميرا ( الشكل 3A ، الأسهم الحمراء).
- انقر على "أصل المنشأ" وتحريك المرحلة للعثور على علامة المنشأ التي كانت لكمات في أجار.
- ثم تحرك قليلا إلى اليمين لركز، عن، خميرة، الخلايا، تبقع تبقع، إلى داخل، دائرة، E07.
- العودة إلى لكمة المنشأ ومركز في مجال الرؤية.
- تعيين أصل لهذه القيمة عن طريق الضغط على زر "مجموعة" ( الشكل 3A ، الأزرق السهام). الآن انتقل إلى موقف H18 والتركيز باستخدام المسمار عرافة الأقرب إلى هذا الموقع. ثم الانتقال إلى موقف L07 والتركيز باستخدام المسمار عرافة الأقرب إلى هذا الموقع. ثم الانتقال إلى موقف E07 والتركيز باستخدام المسمار عرافة الأقرب إلى هذا الموقع.
- كرر الخطوات من 5،5-7،7 حسب الضرورة إلى أن تظل هذه المواقف في التركيز.
- تحقق من التركيز في المركز وعلى حواف في البقع E12، H12، L12. ضبط نطاق ضبط تلقائي للصورة إذا كانت قيم التركيز البؤري Z، كما هو مبين في قيمة Z، أكبر من ± نطاق ضبط تلقائي للصورة (على سبيل المثال ، اضبط نطاق ضبط تلقائي للصورة على 60 ميكرون قيمة Z لنقطة مركزية أكبر من ± 40 ميكرون).
- اضغط على زر إعادة الضبط لأن ذلك سيؤدي إلى تنشيط خصائص الزر، ثم اضغط علىأوديلاي ( الشكل 3A ، السهام الخضراء). اختر الدليل لحفظ البيانات. تأكد من توفر مساحة كافية بالسيارة.
ملاحظة: المجهر بجمع البيانات لمدة 48 ساعة، أو حتى يتم إغلاق البرنامج.
6. معالجة أوديلاي البيانات
- افتح ODELAY_IPT.exe أو استخدم البرنامج النصي ODELAY_Image_Processing_Tool_v7.m البرنامج النصي ( الشكل 3C ).
- إعداد * ODELAYExpDisc.xlsx جداول البيانات إكسل.
- قم بتسمية التجربة في الخلية B1.
- حدد إيماج ديركتوري حيث يتم تخزين ملفات الصور E07 - H18.
- حدد دليل البيانات حيث سيتم كتابة البيانات.
- اكتب التاريخ الذي بدأت فيه التجربة في الخلية B04. استخدم التنسيق مم / د / يي.
- اكتب وقت التخفيف في الخلية C04. هذه المرة ما يقرب من خمس دقائق قبل جمع الصورة الأولى. استخدم النسق ه: ممب حيث ه هو ل h و مم هو دقيقة.
- إضافة في أسماء سلالة وفقا to لوحة المصدر (الخطوة 3.1). بسبب الطريقة التي رصدت سلالات، يتم ترتيبها على أوديلاي أغاروس الشريحة. الخلايا في جدول البيانات B31-B126 هي لوحة المصدر، في حين أن الخلايا C31 - C126 هي المواقع الفورية في لوحة أديلاي أجار.
- ثم اضغط على زر "بيانات العملية" وحدد * ODELAYExpDisc.xlsx الذي تم إعداده للتو.
- انتظر 16-24 ساعة اعتمادا على نظام الكمبيوتر المستخدم لمعالجة البيانات.
- عند معالجة الصور، سيظهر دليل باسم "أوديلاي ويل داتا" وملف "* _Index_ODELAYData.mat". اضغط على زر "تحميل البيانات" وحدد "* _Index_ODELAYData.mat" الملف الذي تم إنشاؤه للتو. سيؤدي ذلك إلى تحميل مجموعة البيانات التي تمت معالجتها للتو. سيتم إدراج "*" في اسم الملف وفقا لاسم التجربة المدخلة في جدول بيانات إكسيل.
- بعد تحميل البيانات، فحص ذلك باستخدام شريط الوقت وجدت عبر القاع، انقر على مربع صورة لرؤية منحنيات النمو وأو تلك البقعة، أو العثور على بئر من الفائدة في القائمة على اليسار ثم تحميل الصور لتلك القائمة.
- توليد الرسوم البيانية من المعلمات النمو السكاني عن طريق الضغط على زر "الكمان مؤامرة". وهذا سيولد مؤامرة هو مبين في الشكل 4 أو الشكل 6 .
Representative Results
ويظهر مثال صور من الخميرة المتنامية في الوقت الفاصل بين المجهري في الشكل 3B . بعد معالجة الصور الفاصل الزمني، يتم عرض مجموعة بيانات تمثيلية مقارنة سلالات الخميرة BY4741 و BY4742 في الشكل 4 . في هذا المثال مجموعة البيانات، هناك القليل جدا من الاختلاف في مضاعفة الوقت بين المواقف المختلفة على لوحة. إذا تم إعداد المتوسطة الاغاروز سيئة، ثم انحراف واضح في كل من مضاعفة الوقت والوقت تأخر سوف تكون واضحة في مواقف البقعة التي تتزامن مع المنطقة المشوهة من هلام الاغاروز. في حين أن أوقات مضاعفة تبدو موحدة نسبيا، وهذا المثال يبين الاختلافات في قياسات الوقت تأخر. ويظهر الشكل 6 مجموعة بيانات أكثر اتساقا. في هذه البيانات كل من الوقت تأخر ومضاعفة الوقت موحدة.
فيليز / ftp_upload / 55879 / 55879fig1.jpg "/>
الشكل 1: الجمعية العفن أغار.
وترد مكونات قالب أجار في ( A ). تجميع قاعدة كما هو مبين في ( B ) ومن ثم المشبك قاعدة مع مقاطع الموثق الصغيرة. وضع القطع تستقيم أطول في تجويف القاعدة ( C ) ومن ثم معسكر الشرائح إلى القالب كما هو مبين في ( D ). وجهة نظر جانبية تبين زاوية القالب والتوجه للقالب كيرف اللازمة لفصل متسق من أجار من الشريحة الزجاجية ( E ). لاحظ موقف الإبهام و فورفينجرز، فضلا عن خط مستقيم من أجار فصل من الشريحة ( F ) ولاحظ السهم الأفقي. يجب أن يتحرك خط الفصل بالتساوي بعيدا في اتجاه الأسهم العمودية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
= "jove_content" فو: كيب-together.within-بادج = "1"> 
الشكل 2: سونيكاتيون وإكتشاف الأسلوب.
يصوتن لوحة في الماء الجليدي واستخدام حامل دلو الطرد المركزي للمساعدة في دعم لوحة ( A ). وضع لوحات من الخطوات 3.8.1 للخروج على لوحة الاغاروز ( B ). أيضا، وترتيب النصائح بحيث اليسار معظم مربع طرف لديه طرف واحد في موقف C10 وبعد ذلك أربع نصائح أخرى مع نهايات قطع حتى لا تحطم حامل لوحة ( C ). وضع النصائح المتبقية في أربعة مربعات بحيث يتم احتلال الداخلية 24 وظائف نصائح ( D ). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
55879fig3.jpg "/>
الشكل 3: أوديلاي واجهة المستخدم الرسومية.
لقطة شاشة لواجهة المستخدم الرسومية ل "ODELAY_Microscopecontrol.m" ( A ). هذه الواجهة تسمح رصد الكاميرا وضبط إعدادات الإضاءة المجهر ل إبيفلورزنت وسائط مشرق الميدان. تشير الأسهم الحمراء إلى أزرار التركيز والمرسلة التي تنشط الكاميرا للحصول على الصور بسرعة وفتح مصراع الضوء المرسلة على التوالي. وتستخدم الأسهم الزرقاء لتحريك مرحلة المنشأ ومن ثم وضع الأصل مع زر "الأصل المنشأ" و "تعيين" زر. الأسهم الخضراء تشير إلى "إعادة تعيين" و "أوديلاي !!!" الأزرار التي تعيد تعيين أوضاع صورة أوديلاي إلى الظروف الحالية وتبدأ مجموعة صور أوديلاي. الوقت الفاصل بين الصور من الخميرة التي تنمو على المتوسطة الصلبة في 0 و 3 و 6 و 9 ساعة بعد اكتشاف ( B ). لقطة شاشة لواجهة المستخدم الرسومية ل "ODELAY_IPT.m" أو ث ه أوديلاي صورة أداة معالجة ( C ). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: مثال إخراج أوديلاي.
تقارن مجموعة البيانات هذه السلالات BY4741 و BY4742 على وسائط يبد. هذا الرقم هو مثال على شريحة أغاروس المعدة جيدا. ومع ذلك، إعدادات ضبط تلقائي للصورة ليست الأمثل. البيانات المقدمة في كل عمود، من اليسار إلى اليمين، هي: القدرة الاستيعابية في لوغ 2 من منطقة المستعمرة؛ مضاعفة الوقت، نظرا في دقيقة. و تأخر الوقت، نظرا في دقيقة. في هذا المثال، مضاعفة مرات من جميع البقع على خط أجار الشريحة حتى جيدا مع كمية صغيرة من زيادة مضاعفة الوقت نحو العمود. ومع ذلك، تختلف فترات التأخر اختلافا كبيرا في مجموعة البيانات هذه._upload / 55879 / 55879fig4large.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: أمثلة منحنى النمو.
يوضح هذا المثال كيف يمكن أن يؤدي التركيز الأولي الضعيف إلى زيادة وقت التأخير (t لاغ ) المقدر ( A )، في حين أن الموضع المجاور يظهر وقت تأخر أقصر ( B ). t د هو مضاعفة الوقت في دقيقة، و t تأخر هو الوقت تأخر في دقيقة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: مثال لتجربة الاختبار المنفذة بشكل جيد.
هزامبل من سلالة BY4742 اختبارها بعد استبدال لمبة الهالوجين التنغستن مع إضاءة الصمام الثنائي وضمان ضبط تلقائي للصورة يتم تعيين بشكل صحيح. ويبدو أن جميع الأوقات مضاعفة تتداخل بشكل جيد ويبدو أن فترات التأخر متسقة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
فحص أوديلاي لديه عدة نقاط حاسمة لضمان القياسات المظهرية يمكن الاعتماد عليها وموثوق بها. النقطة الحرجة الأولى هي إعداد ثابت للثقافات الخميرة. يجب توخي الحذر لحصاد خلايا الخميرة من النمو اللوغاريتمي. إذا كانت الثقافات قد المشبعة، ثم سيتم زيادة عدم التجانس سكانها والتي قد تشوش عدم التجانس الناجم عن العوامل الوراثية أو البيئية (على سبيل المثال، مصدر الكربون) 11 . النقطة الحرجة الثانية هي التحضير المستمر لوسائل الإعلام. بشكل عام، ينبغي إنشاء كمية كبيرة من 10X حل وسائل الإعلام الأسهم ثم استخدامها على مر الزمن لتقليل آثار دفعة. إن صياغة وسائل الإعلام بالوزن، كلما أمكن، يساعد على تحسين اتساق الوسط مع مرور الوقت من خلال ضمان كثافة الأجار والمحتوى الكلي للماء من الاغاروز يمكن رصدها عن كثب. النقطة الحرجة الثالثة تنطوي على تقليل أو القضاء على أي تشوه الميكانيكية للأغاروز ليديا. التشوه الميكانيكي للوسائط الأكثر شيوعا يحدث أثناء فصل الاغاروز عن الشرائح الزجاجية. كما هو الحال مع العديد من التقنيات المخبرية، مطلوب الممارسة لإتقان هذه الخطوة.
التباين في وقت التأخر كما هو مبين في الشكل 4 ، وغالبا ما ترتبط واحدة من العوامل الثلاثة: تشوه الميكانيكية من وسط الاغاروز، والاختلاف في سمك أجار مصبوب، أو مصدر ضوء غير مستقر. إذا كان الوسيط الاغاروز يختلف في Z- الارتفاع عبر مجموعة رصدت، قد تطغى ارتفاع الارتفاع نطاق روتين ضبط تلقائي للصورة، مما تسبب في الصور الأولية لتكون قليلا من التركيز. لهذا السبب، والتحقق من ارتفاع التركيز في بقع متعددة في المركز وعلى طول حواف مجموعة رصدت لضمان روتين ضبط تلقائي للصورة لديه ما يكفي من Z- مجموعة للعثور على التركيز. إذا لزم الأمر، استخدم لوحة ضبط تلقائي للصورة لزيادة نطاق التركيز وزيادة عدد خطوات التركيز.
شرط ثالث ممكنأيون التي قد تؤدي إلى ضعف التركيز هو مصدر الضوء غير مستقر أو الخفقان، والتي يمكن أن تعطل درجة التركيز المحسوبة ل Z- الارتفاع محددة. تنغستن لمبات الهالوجين تميل إلى وميض جيدا قبل المصابيح تحترق. ويلاحظ تأثير ضعف التركيز في مثال واحد حيث تنحني منحنيات النمو بين النقاط الزمنية الأولى والثانية ( الشكل 5 A )، في حين أن البقعة المجاورة ليس لديها نفس الانخفاض ( الشكل 5 B ). في هذه الحالة، تم تخفيف حالة التركيز الفقراء عن طريق استبدال مصدر ضوء الهالوجين التنغستن.
في الممارسة العملية، وجد الباحثون أن للحد من وميض من 100W لمبات الهالوجين التنغستن، تحتاج المصابيح لتحل محل كل 500 ساعة أو تقريبا كل 2 أشهر عندما المجاهر هي تحت الاستخدام الكثيف. لتجنب قضايا التركيز الفقراء من لمبة الخفقان، واستبدال مصدر ضوء الهالوجين التنغستن في كثير من الأحيان أو استبدال لمبة الهالوجين مع مصدر ضوء الصمام الثنائي. لمثال على مجموعة البيانات التي تظهر تباين منخفض في أوقات مضاعفة وكذلك فترات تأخر أكثر اتساقا هو مبين في الشكل 6 . وقد اتخذت هذه البيانات مع إضاءة الصمام الثنائي الذي يوفر إضاءة أكثر استقرارا مع مرور الوقت أثناء تنفيذ ضبط تلقائي للصورة.
في حين أن العديد من النقاط المذكورة هنا لتحسين إعداد وسائل الإعلام قد تبدو واضحة، في الأدب معظم الشاشات على نطاق واسع لا تكرار جيدا مع بعضها البعض 8 ، 11 . ولذلك، فقد وصفنا بعناية إعداد الثقافات ووسائل الإعلام الاغاروز بحيث يمكن إنشاء شاشات المظهري أكثر استنساخا.
مقايسة أوديلاي محدودة حاليا في الإنتاجية عند مقارنته بتثبيت الفحوصات القائمة مثل المصفوفات الجينية الاصطناعية أو فحص المسح الضوئي- O- ماتيك. في حين أن هذه الأساليب تزيد من عدد من السلالات التي يتم قياسها، فإنها تفتقر إلى القدرة على حل الخلايا الفردية أوبالتالي لا يمكن قياس التغاير السكاني التي نلاحظ داخل سلالات الخميرة نسلي. أصل هذا التغاير السكاني ليس مفهوما حاليا، ولكن دمج التكنولوجيا والحساب كما هو موضح هنا يتيح فرصة لمعالجة موضوعية الآليات الخلوية الكامنة 12 .
ويود المؤلفون أن نلاحظ أن أوديلاي هو الأمثل حاليا فقط للعلامة التجارية المجهر محددة ونوع الجسم. تعديل أوديلاي لأنظمة المجهر الأخرى هو على التوالي إلى الأمام ولكن سوف تتطلب معرفة أبي المصدر المفتوح 13 . ومع ذلك، يتم كتابة كل من أبي وكذلك البرامج النصية أوديلاي أن تتكيف بسهولة لأنظمة مختلفة والفحوصات التجريبية.
في حين تم تطوير أوديلاي أصلا للخميرة، وكنا قادرين على الاستفادة من ذلك دون تعديل لمراقبة نمو المتفطرة سميغماتيس . مراقبة المستعمرة الأخرى التي تشكل الكائنات الحية الدقيقة هوممكن مع التعديلات على شفرة المصدر المقدمة 11 . بشكل عام، أوديلاي هو أداة قوية ومرنة لمقارنة الكائنات الحية الدقيقة التي تزرع في ظل ظروف بيئية مختلفة واضطرابات وراثية.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
يقر المؤلفون بدعم هذا العمل من خلال المنح U54 RR022220 و P50 GM076547 إلى جد من المعاهد الوطنية الأمريكية للصحة. فدم هو زميل ما بعد الدكتوراه مع المعاهد الكندية للبحوث الصحية. كما نشكر مركز لوكسمبورغ للطب الحيوي للنظم وجامعة لوكسمبورغ على الدعم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose UltraPure | ThermoFisher | 16500500 | Gel Temp 36C, Gel Strength (1%) 1.2 g/sq cm |
| Yeast Extract Peptone (YEP) | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Complete Suplement Mixture (CSM) | Fisher Scientific | MP114560222 | |
| Polyethylene Glycol 3350 (av. mol. wt. 3000-3700) | SigmaAldrich | P2906 | |
| Yeast Strain BY4741 | ThermoFisher | 95400.BY4741 | |
| Yeast Strain BY4742 | ThermoFisher | 95400.BY4742 | |
| 50 mL Falcon tubes | Corning | 430291 | 1 case |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352096 | |
| 2 x 3 inch 1.0 mm thick slides 1/2 gross | VWR | 48382-179 | |
| 96-well plate flat bottom | Corning | 353072 | |
| Hydra liquid handleing robot | Thermo | 1096-DT-100 | |
| Hamilton Microlab Star Liquid Handleing Robot | Hamilton | ||
| hydra 100 mL tips Extended Length DARTS | Thermo | 5527 | |
| Synergy H4 Plate Reader | Biotek | H4MLFAD | |
| Leica DMI6000 B Microscope | Leica | ||
| Leica 10X/0.3NA objective | Leica | 11506289 | |
| Hamamatsu ORCA Flash 4.0 Camera | Hamamatsu | C11440-22CU | |
| MATLAB with image processing tool box | Mathworks | ||
| MicroManager | Open Imaging | https://micro-manager.org/ | |
| ODELAY Microscope Control (MATLAB scripts and GUI) | www.aitchisonlab.com\ODELAY for Matlab scripts and software | ||
| ODELAY Microscope Chamber | www.aitchisonlab.com\ODELAY for Mechanincal Drawings | ||
| ODELAY Agar Molds | www.aitchisonlab.com\ODELAY for mold drawings |
References
- Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van't Riet, K. Modeling of the bacterial growth curve. Appl Environ Microbiol. 56 (6), 1875-1881 (1990).
- Sellick, C. A., Campbell, R. N., Reece, R. J. Galactose metabolism in yeast-structure and regulation of the leloir pathway enzymes and the genes encoding them. Int Rev Cell Mol Biol. 269, 111-150 (2008).
- Yoshikawa, K., et al. Comprehensive phenotypic analysis for identification of genes affecting growth under ethanol stress in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 9 (1), 32-44 (2009).
- Bryan, A. K., Goranov, A., Amon, A., Manalis, S. R. Measurement of mass, density, and volume during the cell cycle of yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (3), 999-1004 (2010).
- Baryshnikova, A., et al. Quantitative analysis of fitness and genetic interactions in yeast on a genome scale. Nat Methods. 7 (12), 1017-1024 (2010).
- Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327 (5964), 425-431 (2010).
- Collins, S. R., et al. Functional dissection of protein complexes involved in yeast chromosome biology using a genetic interaction map. Nature. 446 (7137), 806-810 (2007).
- Zackrisson, M., et al. Scan-o-matic: High-Resolution Microbial Phenomics at a Massive Scale. G3 (Bethesda). 6 (9), 3003-3014 (2016).
- Bean, G. J., Jaeger, P. A., Bahr, S., Ideker, T. Development of ultra-high-density screening tools for microbial 'omics'. PloS One. 9 (1), e85177 (2014).
- Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant. PLoS Biol. 10 (5), e1001325 (2012).
- Herricks, T., et al. One-Cell Doubling Evaluation by Living Arrays of Yeast. ODELAY! G3 (Bethesda). 7 (1), 279-288 (2017).
- Mast, F. D., Ratushny, A. V., Aitchison, J. D. Systems cell biology. J Cell Biol. 206 (6), 695-706 (2014).
- Edelstein, A. D., et al. Advanced methods of microscope control using µManager software. J Biol Methods. 1 (2), e10 (2014).
