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Biology

ओडेलेय: खमीर विकास के बहु-पैरामीटर मात्राकरण के लिए एक बड़े पैमाने पर विधि

Published: July 3, 2017 doi: 10.3791/55879
Automatic Translation
1, 1,2, 1, 1,2
1Institute for Systems Biology, 2Center for Infectious Disease Research

Summary

हम व्यक्तिगत खमीर कोशिकाओं के विकास के phenotypes की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं क्योंकि वे समय-व्यतीत माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए ठोस मीडिया पर कालोनियों में बढ़ते हैं, ये खमीर के रहने वाले कक्षों (ओडेलेय) के एक-सेल दोलिंग मूल्यांकन। कॉलोनियों में बढ़ रहे आनुवंशिक रूप से समान कोशिकाओं की जनसंख्या की विविधता को सीधे देखा जा सकता है और मात्रा निर्धारित की जा सकती है।

Abstract

सूक्ष्मजीवों के विकास के phenotypes उनके अंतर्निहित आनुवंशिक फिटनेस का एक मजबूत संकेतक हैं और उन्हें 3 विकास नियमों में विभाजित किया जा सकता है: अंतराल चरण, लॉग-चरण और स्थिर चरण। प्रत्येक विकास चरण विभिन्न पर्यावरणीय और आनुवंशिक स्थितियों से संबंधित फिटनेस के विभिन्न पहलुओं को प्रकट कर सकता है। उच्च संकल्प और वृद्धि के सभी 3 चरणों के मात्रात्मक माप आम तौर पर प्राप्त करना मुश्किल है। यहां हम लिविंग एरेज़ ऑफ़ यीस्ट (ओडेलेय) के एक-सेल दोहरीकरण मूल्यांकन नामक एक परख के माध्यम से ठोस मीडिया पर सभी 3 विकास चरणों को चिह्नित करने के लिए एक विस्तृत विधि प्रस्तुत करते हैं। ऑडेलेल टाइम-लिक्स्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए ठोस मीडिया पर कॉलोनियों में बढ़ रहे व्यक्तिगत कोशिकाओं के विकास के फेनोटॉप्स को मात्रा में बताते हैं। यह विधि जनसंख्या के समान कोशिकाओं में प्रत्येक विकास पैरामीटर के साथ जनसंख्या की विविधता का प्रत्यक्ष निरीक्षण कर सकती है, जो कि उपनिवेशों में बढ़ती हैं। जनसंख्या की विविधता आनुवंशिक और एपिगेनेटिक विनियमन को समझने के लिए एक अद्वितीय परिप्रेक्ष्य प्रदान करती है, और इसके जवाबआनुवांशिक और पर्यावरण संबंधी परेशानियां यद्यपि ओडेले की पद्धति को खमीर के प्रयोग से प्रदर्शित किया जाता है, तो इसका उपयोग सूक्ष्म जीवाणु बनाने वाले किसी भी कॉलोनी पर किया जा सकता है जो उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी द्वारा दिखाई देता है।

Introduction

सूक्ष्मजीवों के विकास के फीनोटाइप्स को दी गई पर्यावरणीय स्थिति में अंतर्निहित आनुवंशिक फिटनेस का एक मजबूत संकेत है। विकास को कक्षा में अलग-अलग 3 अलग-अलग विकास व्यवस्थाओं में विभाजित किया गया है: अंतराल चरण, लॉग-चरण, और स्थिर-चरण वृद्धि 1 । प्रत्येक विकास चरण में फिटनेस के विभिन्न पहलुओं को प्रकट किया जा सकता है जो विभिन्न पर्यावरणीय और आनुवांशिक स्थितियों पर निर्भर हैं। उदाहरण के लिए, अंतराल के समय, या एक जीव कितना घातीय वृद्धि की शुरुआत से पहले अंतराल में खर्च करता है, यह एक जीव की बदलती पर्यावरणीय परिस्थितियों का जवाब देने की क्षमता का संकेत हो सकता है 2 । लॉग-चरण वृद्धि के दौरान दोहरीकरण के समय, सेलुलर फिटनेस का सबसे सामान्य मीट्रिक, प्रतिरूप के लिए पर्यावरणीय सामग्रियों का मेटाबोलाइजिंग और उपयोग द्वारा विभाजित करने के लिए जीव की क्षमता की समग्र दक्षता का पता चलता है। स्थिर चरण, जहां लॉग-चरण के बाद की वृद्धि तेजी से कम हो जाती है, वह नियमित रूप से फिटनेस का एक और संकेतक हैली स्पॉट-आधारित खमीर वृद्धि assays में विकास अंत बिंदु के रूप में इस्तेमाल किया।

खमीर 3 , 4 , 5 में विकास खण्डों के मूल्यांकन के लिए कई खमीर विकास आक्षेप वर्तमान में उपलब्ध हैं और माना जाता है। इन assays प्राथमिक रूप से ठोस या तरल मीडिया पर खमीर बढ़ने के तरीकों पर आधारित हैं। ठोस मीडिया पर, कॉलोनी पिनिंग एनीसन एक छोटी सी कोशिकाओं को एक पिन के साथ ठोस एगर पर स्थानांतरित करते हैं, और खमीर कोशिकाओं को एक निर्धारित अवधि के लिए बढ़ने की अनुमति है। कालोनियों को तब इमेजेट किया जाता है और उनके आकार की तुलना टर्मिनल समापन बिंदु 6 पर की जाती है । इन कॉलोनी पिनिंग एनीसन ने जेनोम चौड़ा स्क्रीन बनाने के लिए मजबूत और स्केलेबल साबित किया है। हाल ही में, फ्लैट-बिल्लैन स्कैनर और सिंगल लेंस पलटा (सीएलआर) कैमरों का आवधिक इमेजिंग इन एशेज में समय के साथ कॉलोनी विकास रिकॉर्ड करने के लिए शामिल किया गया है। 7 , 8, 9 हालांकि, इन उपकरणों का संकल्प उन्हें एकल कोशिकाओं का पता लगाने से रोकता है और इस प्रकार, इन कॉलोनी लगाए गए एसेल्स सीधे अंतराल के समय का निरीक्षण नहीं करते हैं और अलग-अलग कोशिकाओं के बीच भिन्नता का पालन नहीं कर सकते हैं जो कॉलोनियों में बढ़ते हैं।

तरल-आधारित वृद्धि assays भी जीनोम चौड़ा स्क्रीन 3 प्रदर्शन करने के लिए नियोजित किया गया है समय-चूक माइक्रोस्कोपी के साथ एक तरल वृद्धि परख को जोड़कर आनुवंशिक रूप से समान व्यक्तिगत कोशिकाओं के दोगुनी समय में आबादी विविधता का पता चला, जो आनुवांशिक विनियमन और पर्यावरण अनुकूलन को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण परिप्रेक्ष्य प्रदान करता है। हालांकि, इस परख विकास के अन्य पहलूओं को माप नहीं करता है जैसे कि अंतराल के समय और क्षमता 10 । यहाँ हम ओडेले 11 की परिभाषा के माध्यम से ठोस मीडिया पर कॉलोनी बनाने वाले सूक्ष्मजीवों के सभी तीन विकास चरणों को चिह्नित करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। ओडेले में यूटीली के होते हैंठोस माध्यमों पर कॉलोनियों में बढ़ने वाले एकल कोशिकाओं की छवियों को रिकॉर्ड करने के लिए उच्च थ्रूपूट समय चूक माइक्रोस्कोपी को ज़िंग करना। कॉलोनियों में बढ़ रहे व्यक्तिगत कोशिकाओं की यह आबादी अंतर्निहित आबादी विविधता का पता चलता है, जो अन्य कम संवेदनशील मापों जैसे टर्मिनल एंडपॉइंट स्कोरिंग से नहीं पता है। हम खमीर पर विधि का प्रदर्शन करते हैं, लेकिन उदर क्षेत्र माइक्रोस्कोपी में इसके विपरीत दिखने वाले किसी भी जीव के लिए ओडेलेल लागू किया जा सकता है।

Protocol

1. Agarose जेल स्टॉक की तैयारी

  1. उच्च शुद्धता वाले agarose के 2 ग्राम वजन।
  2. Agarose को 500 मिलीलीटर बोतल में जोड़ें और उनका संयुक्त द्रव्यमान रिकॉर्ड करें।
  3. 150 लीटर अल्ट्रा-शुद्ध पानी के साथ बोतल के प्लस 2 जी एगरोज़ के लक्ष्य द्रव्यमान की गणना करें, फिर 150 ग्राम अल्ट्रा-शुद्ध पानी को इस लक्ष्य द्रव्यमान के 0.1 ग्राम में जोड़ें।
  4. बोतल के द्रव्यमान से प्लस agarose और पानी नोट करें
  5. बोतल को माइक्रोवेव में रखें और agarose को गर्म करते समय पानी की वाष्पीकरण को कम करने के लिए शीर्ष पर एक ढीला टोपी के साथ बोतल फिट करने के लिए सुनिश्चित करें।
  6. 15 - 20 के फटने में बोतल में माइक्रोवेव, संक्षेप में agarose और पानी मिश्रण करने के लिए बोतल घूमते हुए इस प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक कि समाधान उबल रहा न हो और मिश्रण सजातीय हो।
    सावधानी: बोतल से बचने वाली भाप से त्वचा को जलाने से बचने के लिए सावधानी बरतें। इसके अलावा, बोतल गर्म हो जाएगा स्पर्श और उपयुक्त संरक्षण, जैसे कि आटोक्लेव दस्ताने, चोट से बचने के लिए आवश्यक है
  7. पिघला हुआ agarose समरूप होने के बाद, बोतल फिर से तौलना और मूल द्रव्यमान के 0.1 ग्राम के भीतर ultrapure पानी जोड़ें। यह वाष्पीकरण के कारण किसी भी पानी को खो देगा।
  8. पिघला हुआ agarose ठोस होने से पहले, एकरूपता को सुनिश्चित करने के लिए जोड़ा पानी में मिश्रण करने के लिए घूमती है।
  9. विभाज्य 15.2 ग्राम agarose में 9 - 50 मिलीलीटर प्लास्टिक ट्यूबों।
  10. आवश्यक होने तक ट्यूबों को फ्रिज करें

2. ओडेलेय Agarose मीडिया की तैयारी

  1. चुंबकीय हलचल बार के साथ कोमल सरगर्मी के तहत एक हॉटप्लेट पर ढक्कन के लिए 400 एमएल का विआयनीकृत पानी उबाल लें।
  2. चरण 1 के चरण में 10 एमएएल के 10 एमएएल ( जैसे , खमीर निकालें पेप्टोोन (वाईईपी), या पूर्ण अनुपूरक मिश्रण (सीएसएम)) को 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 15.2 ग्रा। Agarose विभाज्य से जोड़ें।
    नोट: सीएसएम माध्यम ग्लास स्लाइड पर चिपका जाता है। यदि सीएसएम मीडिया फॉर्म्युलेशन का उपयोग करना है, तो मध्यम सूत्रीकरण के लिए बाँझ पानी में 5 μL 50% वाइट पॉलीथीन ग्लाइकोल (पीईजी) जोड़ें। पीईजी एक को रोकता हैढालना जारी होने के दौरान कांच की स्लाइड्स पर चिपके हुए से गार और खमीर विकास को रोकना नहीं है।
  3. अतिरिक्त 100 एक्स पोषक तत्वों की ज़रूरतों को जोड़ने के लिए, यदि आवश्यक हो, और इस चरण से 1 एमएल तक कुल जोड़ा गया मात्रा लाने के लिए पानी का उपयोग करें।
  4. 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब को चरण 2.1 से उबलते पानी में रखने से पहले जोड़ा गया मीडिया और पूरक के साथ agarose विभाज्य का वजन।
  5. 16 मिनट के बाद, 50 मिलीलीटर ट्यूब निकालें और एक भंवर का उपयोग करके मिश्रण को होमोजीज़ करें। 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब पर तंग बांधने वाला टोपी रखें।
    नोट: बीकर पर एक ढक्कन पूरी ट्यूब समान रूप से गर्मी में मदद करता है अन्यथा ठोस agarose की एक फिल्म फार्म और संभवतः पिघल नहीं होगा। इस समय के दौरान, यह agarose मोल्ड इकट्ठा करने के लिए सुविधाजनक है ( चित्रा 1 )।
  6. मिश्रण को एक भंवर का उपयोग करके होमोजेनइज़ करें
  7. सभी अकर मिश्रित और पिघला हुआ सुनिश्चित करने के लिए अतिरिक्त 2 मिनट के लिए उबाल लें।
  8. ट्यूब का वजन और अल्ट्रा शुद्ध बाँझ पानी से खो दिया किसी भी बड़े पैमाने की जगह।
  9. 2 एमएल का 10 एक्स कार्बन-खट्टा जोड़ेंसीई अभिकर्मक ( उदाहरण के लिए, 20% वाय / वी ग्लूकोज) और भंवर से agarose माध्यम समाधान प्राप्त करने के लिए।
    नोट: ग्लास स्लाइड्स का पृथक्करण: जब मोल्ड को इकट्ठा किया जाता है, तो यह सुनिश्चित करने के लिए सावधानी बरती जानी चाहिए कि सही दिशा में लंबे समय तक चक्कर लगाए जाएंगे। इसका कारण यह है कि लेज़र ऐक्रेलिक में कटौती करता है, यह एक शंकु के रूप में कट जाता है, जिसकी वजह से 90 डिग्री पक्षों के बजाय थोड़ा सा कोण होता है तब जब ढालना बेंगलटॉप पर रखा जाता है तो कांच को कार्गो से मुक्त करने के लिए, स्पेसर के किनारे के साथ एक तीव्र कोण होना चाहिए। तीव्र कोण ग्लास के ऊपरी हिस्से से अगर दूर के किनारे को दबाने में सहायता करता है क्योंकि मोल्ड स्पेसर के बाहरी किनारे को कम किनारे ( चित्रा 1 ) के बारे में धुरी है। परिणाम कांच के शीर्ष टुकड़े से अगर का अधिक सुसंगत विभाजन है।
    नोट: तेल, सिलिकॉन स्प्रे या यहां तक ​​कि वाणिज्यिक खिड़की के उपचार जैसे कांच के लिए लागू मोल्ड रिजल्ट एजेंटों का उपयोग नहीं किया जाना चाहिए क्योंकि वे एस अगर का उर्जा और संभवतः विकास को रोकना ये तरीकों से कुछ अभ्यास लगातार चलने लगते हैं।
  10. मजबूर हवा का उपयोग करके 70% इथेनॉल और सूखे के साथ एक्स 1 मिमी मोटी कांच की स्लाइड्स में एक्स 2 3 में साफ करें।
  11. चित्रा 1 में दिखाए गए अनुसार 70% इथेनॉल, सूखे, और इकट्ठे हुए स्वच्छ एक्रिलिक मोल्ड। तीन नीचे के टुकड़े ले लो, दिखाया गया है, और उन्हें इकट्ठा ताकि दो समान टुकड़े सैंडविच तीसरे टुकड़ा ( चित्रा 1 बी )। दो छोटे बाइंडर क्लिप ( चित्रा 1 सी ) का उपयोग कर प्रत्येक पक्ष के आधार टुकड़े दबाना। उतार चढ़ाव को सुनिश्चित कर लें कि लेजर केरफ सही तरीके से तैनात है ( चित्रा 1 ई )।
  12. मोल्ड पर साफ और सूखे गिलास स्लाइड रखें और दूसरी तरफ दूसरी कांच की तरफ स्लाइड करते हुए उसे पकड़ कर रखें। एक बड़ी बांधने वाली क्लिप के साथ असेंबली को दबाना ( चित्रा 1 डी )। बड़ी बाइंडर क्लिप के साथ दोनों स्लाइड्स को दबाना (Lass = "xfig"> चित्रा 1 डी)। सुनिश्चित करें कि ऊपरी बाइंडर क्लिप एक्रिलिक के साथ ग्लास स्लाइड ओवरलैपिंग के संपर्क में है।
  13. शेष बाइंडर क्लिप जोड़ें दोबारा, सुनिश्चित करें कि clamps स्लाइड से संपर्क करें जहां यह ऐक्रेलिक ( चित्रा 1 डी ) ओवरलैप करता है।
    नोट: पिघला हुआ एगर के साथ इकट्ठे मोल्ड भरने से पहले, यह सुनिश्चित करें कि मोल्ड के अंदरूनी हिस्से के साथ लगभग 70 μL पिघला हुआ एगर मीडिया pipetting द्वारा किनारों को बंद कर दिया गया है। यह अगर जल्दी से मजबूत होगा और किसी भी लीक को रोकने।
  14. मोल्ड एगर के साथ मोल्ड भरें, जिससे साँचे में हवा के बुलबुले को फँसाने से बचें।
    नोट: यह मोल्ड के किनारे पर पिघला हुआ तार को धीरे-धीरे pipetting द्वारा पूरा किया जा सकता है इसे भरने के बाद, मोल्ड को लगभग 40 मिनट से 1 घंटे के लिए लगभग 23 डिग्री सेल्सियस परिवेश तापमान पर शांत करने दें। यदि बहुत लंबे समय तक ठंडा करने की अनुमति दी जाती है तो साला मोल्ड में फ्रैक्चर हो सकता है।
    नोट: ढालना पृथक्करण: एक समान ठोस सुनिश्चित करने के लिए कास्ट अगर से ढालना का उचित हटाने आवश्यक हैखमीर विकास के लिए अगर पैड इस कदम पर ढालना के कुशल पृथक्करण सुनिश्चित करने में विफलता के कारण वृद्धि के अंतर का कारण होगा जो ठोस अगर पैड में खामियों के कारण हो। इस चरण का अभ्यास करने के लिए कई बार सिफारिश की जाती है।
  15. नीचे की बाइंडर क्लिप को हटाकर प्रारंभ करें ढालना के नीचे हिस्से को निकालें जो तीन सैंडविच टुकड़े के होते हैं। स्लाइड्स को उन्हें संपीड़ित करके रखें और फिर बाइंडर क्लिप निकालें। बाइंडर क्लिप को हटाने के दौरान ढालना पक्षों को टक्कर न दें। यह मीडिया को खराब करेगा।
  16. बेंच शीर्ष के किनारे पर ढालना रखें ताकि नीले बिंदु के साथ मोल्ड की ओर का सामना करना पड़ रहा है और निचले बाएं कोने में ( चित्रा 1 ई )। ऐक्रेलिक के नीचे स्थित अंगूठे रखें और मोल्ड के अंदरूनी किनारे की तरफ से ऊपर की ओर की पहली उंगली रखें।
  17. धीरे-धीरे और मोल्ड के खिलाफ अंगूठे के साथ सावधानी से धक्का करें, जैसे कि उसके निचले किनारे ( चित्रा 1 एफ ) के बारे में मोल्ड स्पेसर को पिवट करना। लगातार लागू करेंलेकिन धीरे-धीरे बढ़ते दबाव उपयोगकर्ताओं को एक ब्रेक दिखाई देगा और वायु बुलबुले उस रेखा के किनारे दिखाई देंगे जहां कांच का ढालना मोल्ड स्पेसर को कवर किया जाएगा।
  18. प्रारंभिक ब्रेक लाइन देखने के बाद, अंगूठे के साथ आगे बढ़ना जारी रखें और लगातार दबाव लागू करें। अगर इस बिंदु पर गिलास से दूर ( चित्रा 1 एफ ) तोड़ना शुरू कर देना चाहिए। ढालना ऊपर की ओर धुरा जारी रखें यह ग्लास बिना स्लाइड किए बगैर उठाएगा। एक लाइन जहां काँच ग्लास से दूर छील रही है, उसे प्रारंभिक ब्रेक लाइन से दूर जाना चाहिए।
    नोट: इस बिंदु पर, अगर कांच के नीचे और ऊपर दोनों के लिए चिपके हुए हैं यह कभी-कभी बाएं किनारे के किनारे होते हैं जब तक इस क्षेत्र में विकृत क्षेत्र उस क्षेत्र में नहीं है जहां खमीर देखा गया है, यह ठीक होना चाहिए।
  19. जैसा कि कांच पूरी तरह से नि: शुल्क आता है, इसे पकड़ो और मोल्ड से पूरी तरह से इसे हटा दें। फिर दूसरे ढालना टुकड़े को एक समान गति से हटा दें जिससे कि टुकड़े को बिना कगार पर ले जायें। स्लाइड्स को एक में रखेंबाँझ टिप बॉक्स नीचे कुछ बाँझ उच्च शुद्धता पानी के साथ। अगले दिन उपयोग करने के लिए बॉक्स को बंद करें और 4 ° CO / N पर स्टोर करें। यदि लंबे समय तक संग्रहीत है, तो विकास दर असंगत हो जाएगी

3. ओडेले संस्कृति तैयार करना

  1. ओ / एन की वृद्धि के लिए 96-अच्छी तरह से एक प्लेट में तनाव डालना
  2. अगले दिन, 200 μL मीडिया में 20 μL रातोंरात संस्कृति में एक नई प्लेट में 220 μL कुल मात्रा के लिए पतला।
  3. एक प्लेट रीडर में प्रत्येक संस्कृति के 600 एनएम (ओडी 600) पर ऑप्टिकल घनत्व को मापें। प्लेट रीडर और एक तरल हैंडलिंग रोबोट का उपयोग करना, 3.3.1 - 3.3.6 चरणों के स्वचालित कमजोर पड़ने वाले प्रोटोकॉल का पालन करें। थाली में संस्कृतियों को मैन्युअल रूप से लगभग 0.1 OD600 (वैकल्पिक) में पतला।
    1. प्लेट रीडर पर, "नया बनाएं" के तहत "प्रयोग" को दबाएं। ODELAYDilution.exp चुनें और प्रयोग चलाएं। परीक्षा का नाम ओडेलेले के रूप में दर्ज करें "दिनांक" "समय" "प्रयोग नाम" चलना।
    2. एस पर क्लिक करेंटैस्टिक्स टैब और फिर एक्सेल आइकन पर क्लिक करें। डेटा को एक अंगूठे ड्राइव में सहेजें और इसे एक तरल हैंडलिंग रोबोट कंप्यूटर पर ट्रांसफ़र करें।
    3. रोबोट का लेआउट और मेथड एडिटर खोलें। विधि फ़ाइल "ODELAYDilution_v1.med" खोलें। निष्पादनीय "Convert_SynergyFiles.exe" चलाएं लक्ष्य OD600 के लिए 0.09 दर्ज करें।
    4. "ग्लू सुधार" और "Gal Correction" को 0.05 पर क्लिक करें। एक समान प्लेट में रिक्त मीडिया को मापें "फ़ाइल जनरेट करें" पर क्लिक करें विधि संपादक में फ़ाइल का चयन करें। रनटाइम कमजोर पड़ने वाले प्रोग्राम को खोलने के लिए विधि शुरू करने के लिए स्टॉपलाइट आइकन पर क्लिक करें।
    5. सुनिश्चित करें कि ट्यूबों को बिना खुल कर दिया गया है और प्लेटों में ढक्कन हटा दिए गए हैं और धूल कवर को टिप्स से निकाल दिया गया है। डेक लेआउट द्वारा इंगित के रूप में तरल हैंडलिंग रोबोट के डेक पर लोड प्लेट्स, ट्यूब और टिप्स लोड करें।
    6. कमजोर पड़ने वाले कार्यक्रम को चलाने के लिए "प्ले" बटन पर क्लिक करें। 50 μL युक्तियों की सही संख्या का चयन करें। 300 μL युक्तियों की सही संख्या का चयन करें। के बारे में रुकोप्रक्रिया चलाने के लिए 12 मिनट
  4. रोबोट से कमजोर पड़ने की प्लेट ले लीजिए, सुझावों को कवर करें, और 15 एमएल मीडिया ट्यूबों को संक्षिप्त करें। संस्कृति 5-6 घंटे के लिए थाली 30 डिग्री सेल्सियस पर
  5. दूसरे कमजोर पड़ने से पहले 1 से 2 घंटे पहले माइक्रोस्कोप के लिए ऊष्मायन कक्षों को चालू करना सुनिश्चित करें। उन्हें डिग्री सेल्सियस पर संतुलित करने या प्रयोग के लिए आवश्यक तापमान की अनुमति दें।
  6. कमजोर पड़ने के चरणों को दोहराएं 3.3 - 3.4, लेकिन agarose स्लाइड पर संस्कृतियों खोलने के लिए 0.01 - 0.02 के एक OD600 के लिए पतला संस्कृतियों।
  7. एक धातु फ्रीजर सील के साथ कमजोर पड़ने की प्लेट को कवर करें।
  8. प्लेट को पकड़ने के लिए एक अपकेंद्रित्र धातु बाल्टी-फिटिंग का उपयोग करके बर्फ के पानी में तैरने वाली प्लेट के साथ 30 एस के लिए बर्फ के स्नान में कमजोर पड़ने की प्लेट को दोहराएं ( चित्रा 2 ए )। पतली प्लेट से सपाट तली प्लेट में सोनेटेड संस्कृतियों को स्थानांतरित करें। लेबल 4 x 96-अच्छी तरह से फ्लैट नीचे प्लेट्स 1, 2, 3 और 4 ( चित्रा 2 बी )।
    1. स्थानांतरण 150 &# 181; कुओं से एल्यूशन की ए 101 - डी 0 6 कुओं में C04 - प्लेट के एफ 0 9 लेबल 1। फिर कुएं ए07 - डी 12 से 150 μL को कुंडल प्लेट से स्थानांतरित करें, प्लेटों के कुएं C04- F09 में 2 ले लें। फिर 150 μL कुओं से पतला प्लेट की ई01 - H06 कुओं C04 - प्लेट के एफ 0 9 लेबल 3. अंत में कुएं से E07 - H12 कुओं से कमजोर पड़ने की प्लेट के 150 μL हस्तांतरण - कुएं C04 में - प्लेट के एफ 0 9 लेबल 4
  9. चरण 4 पर आगे बढ़ें, खोजना चालू करें

4. एक स्वचालित तरल स्पॉटिंग रोबोट का उपयोग करते हुए एगर पर दिखाना

  1. अपने humidified बाँझ पिपेट बक्से से 4 डिग्री CO / N (चरण 2.1 9 से) में संग्रहीत agarose स्लाइड निकालें।
  2. यदि आवश्यक हो, तो साफ रेजर ब्लेड के साथ agarose माध्यम के कोनों को ट्रिम कर दें ताकि वे स्लाइड चैम्बर पर फिट हो सकें।
  3. माउंट बंद स्लाइड क्लैंप निकालें। सावधानीपूर्वक मंच चैम्बर माउंट के recessed क्षेत्र में अगर थाली जगह।
    नोट: सुनिश्चित करें कि यास्लाइड का आईनेटेशन प्रयोग से प्रयोग के अनुरूप है।
  4. चैंबर के निचले भाग के साथ क्लैंप फ्लश है यह सुनिश्चित करने के लिए जांचें यदि यह कुटिल है, तो स्लाइड पूरी तरह से recessed क्षेत्र में बैठा नहीं हो सकता है। स्पॉटिंग रोबोट की केंद्र प्लेट स्थिति में लेवलिंग स्पेसर रखें। यह स्पेसर स्लेवलिंग शिकंजे के लिए संपर्क प्रदान करता है ताकि स्लाइड चैंबर को युक्तियों के साथ समतल किया जा सके।
  5. मेज पर प्लेटें अपने कोक्डेंट के क्रम में रखें। प्लेट्स 1, 2, 3 और 4 को बाएं से दाएं ( चित्रा 2 बी ) का आदेश दिया गया।
  6. टिप्स दें ताकि आंतरिक 24 कुओं C04-F09 4 खाली टिप बॉक्स में युक्तियों के साथ कब्जा कर लिया हो। एक पांचवें बॉक्स को सी 10 की स्थिति में एक टिप की आवश्यकता होगी, साथ ही साथ एपे, ए 12, एच 01, और एच 12 पदों में अपने छोरों के छोर के साथ 4 युक्तियां टिप प्लेट क्लैंप ( चित्रा 2 सी और 2 डी ) के लिए ये 4 कट ऑफ टिप्स स्थिरता प्रदान करते हैं।
  7. स्ल से शीर्ष कवर निकालेंआईडीसी चेंबर माउंट
  8. रोबोट नियंत्रण खोलना कार्यक्रम की शुरुआत साइट में पहली टिप पंच रखें। इस agarose में एक छेद पंच चाहिए जो बाद में मूल समन्वय aligning के लिए इस्तेमाल किया जाएगा प्लेस प्लेट 1 को तरल हैंडलिंग रोबोट पर पहले चतुर्भुज को हाजिर करने के लिए। सुनिश्चित करें कि ढक्कन हटा दिया गया है और खोलने वाले कार्यक्रम को जारी रखें।
  9. यह सुनिश्चित करने के लिए जांचें कि सभी स्थान मौजूद हैं। इसके अलावा, उनके लिए ~ 30 एस प्रतीक्षा करें। जब स्पॉट व्यास के बारे में 1 मिमी हो, तो प्रोग्राम जारी हो सकता है। बायोहेज़र्ड कंटेनर में उपयोग की गई युक्तियों को खाली करें और रोबोट पर नए सुझाव दें। 2 एनडी क्वाड्रंट प्लेट के लिए प्लेट 1 को बाहर निकालना।
  10. तीसरा चतुर्थांश के लिए दोहराएं और 4 वें क्वाड्रंट के लिए दोबारा दोहराएं।
  11. जब स्पॉट सूख रहे हैं, तो स्लाइड चैंबर कवर की जगह और उपकरण को फ्लिप करें।
  12. एयर फिल्टर के साथ टयूबिंग कनेक्शन स्थापित करें।
  13. कक्ष के ऊपर की ओर एक गिलास स्लाइड रखें
    नोट: कमीशन के लिए यह स्लाइड महत्वपूर्ण हैएगर को गर्मी प्रवाह एनजी और कक्ष के उद्देश्य आवरण पर्ची पर संक्षेपण के गठन को कम करता है इस आवरण पर्ची को मत भूलना। माइक्रोस्कोप कॉन्फ़िगरेशन के आधार पर, यह कवर स्लिप रोशनी की तरफ से उद्देश्य पक्ष पर संक्षेपण के कारण हीटिंग को रोकता है।
  14. कक्ष के उद्देश्य पक्ष पर गर्म हवा को उड़ाने के लिए एक प्रशंसक बनाओ यह पंखे कवर स्लिप पर बनाने से संक्षेपण को रोकता है। बबबले के माध्यम से 10 एमएल / मिनट के लिए हवा का प्रवाह दर निर्धारित करें

5. माइक्रोस्कोप पर ओडेले चल रहा है

  1. स्क्रिप्ट "ODELAY_Microscope_Control.m" चलाएं
  2. संचरित प्रकाश शटर खोलने के लिए "शटर" पर क्लिक करें और फिर उच्च कैमरा दर ( चित्रा 3 ए , रेड तीर) आरंभ करने के लिए "फोकस" बटन पर क्लिक करें।
  3. "मूल जाओ" पर क्लिक करें और मंच पर जाने के लिए उस मूल निशान को ढूंढें जो कि अगर में छिद्रित हो।
  4. फिर थोड़ी तेज़ी से सही करने के लिए आगे बढ़ेंE07 क्षेत्र में खमीर कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित
  5. मूल पंच पर वापस जाएं और उसे देखने के क्षेत्र में केन्द्रित करें।
  6. "सेट" बटन ( चित्रा 3 ए , ब्लू तीर) दबाकर इस मान को मूल में सेट करें। अब H18 की स्थिति में जाने और उस स्थान के सबसे निकटतम हेक्स स्क्रू का उपयोग करने पर ध्यान केंद्रित करें। फिर L07 की स्थिति में ले जाएं और उस स्थान के सबसे निकटतम हेक्स स्क्रू का उपयोग करने पर ध्यान केंद्रित करें। फिर E07 की स्थिति में जाने और उस स्थान के सबसे निकटतम हेक्स स्क्रू का उपयोग करने पर ध्यान केंद्रित करें।
  7. जब तक उन स्थितियों को ध्यान में नहीं रखा जाता है तब तक आवश्यक चरणों 5.5 - 5.7 दोहराएं।
  8. केंद्र में और किनारों पर ई 12, एच 12, एल 12 के स्थान पर फोकस देखें ऑटोफोकस श्रेणी को समायोजित करें यदि फ़ोकस Z- मान, जैसा कि Z- मान द्वारा इंगित किया गया है, ± ऑटफोकस श्रेणी से अधिक है ( जैसे ।, एक केंद्र स्थान के लिए 60 माइक्रोन जेड-मान को ऑटोफोकस श्रेणी सेट करें जो ± से अधिक है 40 माइक्रोन)
  9. रीसेट बटन दबाएं क्योंकि यह बटन गुणों को सक्रिय करेगा और फिर दबाएंऑडेलेय ( चित्रा 3 ए , ग्रीन तीर)। डेटा को बचाने के लिए निर्देशिका चुनें। सुनिश्चित करें कि पर्याप्त ड्राइव स्थान उपलब्ध है।
    नोट: माइक्रोस्कोप 48 घंटे के लिए डेटा एकत्र करता है, या जब तक कार्यक्रम बंद नहीं होता है।

6. प्रोसेसिंग ओडेलेय डाटा

  1. ODELAY_IPT.exe को खोलें या स्क्रिप्ट ODELAY_Image_Processing_Tool_v7.m स्क्रिप्ट ( चित्रा 3C ) का उपयोग करें।
  2. एक * ODELAYExpDisc.xlsx एक्सेल स्प्रैडशीट तैयार करें।
  3. सेल B1 में प्रयोग को नाम दें
  4. छवि निर्देशिका का चयन करें जहां छवि फ़ाइलें E07 - H18 संग्रहीत हैं।
  5. डेटा निर्देशिका का चयन करें जहां डेटा लिखा जाएगा।
  6. तिथि लिखें जब प्रयोग सेल B04 में शुरू किया गया था। प्रारूप MM / DD / YYYY का उपयोग करें
  7. सेल C04 में कमजोर पड़ने का समय लिखें इस बार लगभग 1 मिनट पहले पहली छवि एकत्र की जाती है। HH: MMpm प्रारूप का उपयोग करें जहां एच एच एच के लिए है और एमएम न्यूनतम के लिए है
  8. टी के अनुसार तनाव नामों में जोड़ेंओ स्रोत प्लेट (चरण 3.1)। जिस तरह से तनाव देखा जाता है, उन्हें ओडेलेय एगरोज स्लाइड पर पुन: संगठित किया जाता है। स्प्रैडशीट B31-B126 में सेल स्रोत प्लेट हैं, जबकि सेल C31 - C126 ऑडेलेय एगर प्लेट में स्थान स्थान हैं।
  9. फिर "प्रक्रिया डेटा" बटन दबाएं और * ODELAYExpDisc.xlsx का चयन करें जो अभी तैयार है।
  10. डेटा संसाधित करने के लिए उपयोग किए जाने वाले कंप्यूटर सिस्टम के आधार पर 16-24 घंटे की प्रतीक्षा करें।
  11. जब छवियों को संसाधित किया जाता है, तो "ओडेलेय वेल डेटा" नामक एक डायरेक्टरी और एक फाइल "* _Index_ODELAYData.mat" दिखाई जाएगी। "लोड डेटा" बटन दबाएं और "* _Index_ODELAYData.mat" फ़ाइल का चयन करें जो अभी जेनरेट किया गया था। इससे डेटा सेट को लोड किया जाएगा जो अभी संसाधित किया गया था। फ़ाइल नाम में "*" एक्सेल स्प्रैडशीट में दर्ज किए गए प्रयोग नाम के अनुसार सूचीबद्ध किया जाएगा
  12. आंकड़ों को लोड करने के बाद, यह नीचे की ओर पाया गया समय बार का उपयोग करके निरीक्षण करें, विकास के लिए curves f देखने के लिए एक छवि वर्ग पर क्लिक करेंया उस स्थान पर, या बायीं तरफ सूची में रूचि का ख्याल ढूंढें और उसके बाद उस सूची के लिए चित्र लोड करें
  13. "वायलिन प्लॉट" बटन दबाकर आबादी के विकास मापदंडों के हिस्टोग्राम उत्पन्न करें यह चित्रा 4 या चित्र 6 में दिखाया गया एक साजिश उत्पन्न करेगा।

Representative Results

समय व्यतीत माइक्रोस्कोपी में खमीर की बढ़ती छवियों का चित्रा 3 बी में दिखाया गया है। समय चूक छवियों को संसाधित करने के बाद, एक प्रतिनिधि डेटा सेट की तुलना में खमीर उपभेदों BY4741 और BY4742 चित्रा 4 में दिखाया गया है। इस उदाहरण डेटासेट में, प्लेट पर विभिन्न पदों के बीच समय दोहरीकरण में बहुत कम भिन्नता है। यदि agarose मध्यम खराब तरीके से तैयार किया जाता है, तो दोनों दोगुनी समय और अंतराल के समय में एक स्पष्ट विचलन स्पष्ट हो जाएगा स्पॉट स्थितियों में जो agarose जेल के विकृत क्षेत्र के साथ मेल खाती है। जबकि दोगुनी समय अपेक्षाकृत समान दिखता है, यह उदाहरण अंतराल समय माप में भिन्नता दिखाता है। एक अधिक सुसंगत डेटा सेट चित्र 6 में दिखाया गया है। इस डाटासेट में लैग का समय और दोहरीकरण समय समान है।

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चित्रा 1: अग्रवर्ती मोल्ड विधानसभा
अगर ढालना के घटक ( ए ) में दिखाए गए हैं ( बी ) में दिखाए गए बेस को इकट्ठा करें और फिर छोटे बाइंडर क्लिप के साथ आधार को दबाना। बेस ( सी ) के गुहा में लंबे समय तक सीधे टुकड़े रखें और फिर स्लाइड ( डी ) में दिखाए गए अनुसार मोल्ड को स्लाइड करें। गिलास स्लाइड ( ई ) से अर्ग के सुसंगत पृथक्करण के लिए आवश्यक ढालना कार्फ के ढालना और अभिविन्यास के कोण को दर्शाते हुए एक ओर देखें। अंगूठे और अग्रदूतों की स्थिति, साथ ही साथ स्लाइड ( एफ ) से पृथक अगर की सीधी रेखा को नोट करें और क्षैतिज तीर को नोट करें। अलगाव लाइन ऊर्ध्वाधर तीरों की दिशा में समान रूप से दूर जाना चाहिए। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

= "Jove_content" के लिए: रख-एक साथ। इन-पेज = "1"> चित्र 2
चित्रा 2: सोनिकिंग और स्पॉटिंग विधि
प्लेट ( ए ) का समर्थन करने में मदद करने के लिए बर्फ के पानी में प्लेट को पैकेट और एक अपकेंद्रित्र बाल्टी धारक का इस्तेमाल करना। एगरोस प्लेट ( बी ) पर खोलने के लिए प्लेटें 3.8.1 से प्लेटें लगाएं। इसके अलावा, युक्तियों का प्रबंध करें ताकि बाएं सबसे टिप बॉक्स के पास सी 10 की स्थिति में एक टिप हो और उसके बाद चार अन्य युक्तियां समाप्त हो जाएंगी ताकि वे प्लेट धारक ( सी ) को क्रैश न करें। चार बक्से में शेष टिप्स रखें ताकि आंतरिक 24 टिप्स पदों पर कब्जा कर लिया हो ( डी )। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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चित्रा 3: ओडेले ग्राफिकल यूजर इंटरफेस
"ODELAY_Microscopecontrol.m" ( ए ) के लिए ग्राफिकल यूजर इंटरफेस की एक स्क्रीन शॉट यह इंटरफ़ेस कैमरा की निगरानी और एपिफ्लोरोसेंट और उज्ज्वल क्षेत्र मोड के लिए माइक्रोस्कोप रोशनी सेटिंग्स को समायोजित करने की अनुमति देता है। लाल तीर फोकस और संचरित बटन को इंगित करते हैं जो कैमरे को तुरंत छवियों को प्राप्त करने के लिए सक्रिय करता है और क्रमशः संचरित प्रकाश शटर खोलता है। नीले तीर का उपयोग मूल के चरण को स्थानांतरित करने के लिए किया जाता है और फिर "गो मूल" बटन और "सेट" बटन के साथ मूल सेट करना। हरे तीर "रीसेट" और "ओडेले !!!" को इंगित करते हैं बटन जो कि वर्तमान परिस्थितियों में ओडेले छवि मोड को रीसेट करते हैं और ओडेलेई छवि संग्रह आरंभ करते हैं। खमीर की समय-विराम की छवियों को खोलने के बाद 0, 3, 6 और 9 घंटे में ठोस माध्यम पर बढ़ रहा है ( बी )। "ODELAY_IPT.m" या वें के लिए ग्राफिकल यूजर इंटरफेस की एक स्क्रीन शॉट ई ओडेले इमेज प्रोसेसिंग टूल ( सी ) इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4: उदाहरण ऑडेले आउटपुट।
यह डाटासेट YPD मीडिया पर BY4741 और BY4742 की तुलना करता है। यह आंकड़ा अच्छी तरह से तैयार की गई agarose स्लाइड का एक उदाहरण है; हालांकि, ऑटोफोकस सेटिंग्स इष्टतम नहीं हैं प्रत्येक कॉलम में बाएं से दाएं प्रस्तुत आंकड़े इस प्रकार हैं: कॉलोनी क्षेत्र के लॉग 2 में ले जाने की क्षमता; दोगुना समय, मिनट में दिया गया; और अंतराल के समय, मिनट में दिए गए इस उदाहरण में, अगर स्लाइडर लाइन पर सभी स्थानों के दोगुनी समय में स्तंभ की ओर बढ़ती हुई दोहरीकरण के समय की छोटी मात्रा हालांकि, इस डेटासेट में अंतराल का समय काफी भिन्न होता है।_upload / 55879 / 55879fig4large.jpg "target =" _ blank "> कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: विकास वक्र उदाहरण
यह उदाहरण दर्शाता है कि खराब प्रारंभिक फोकस अनुमानित अंतराल समय (टी लैग ) को बढ़ाने के कारण ( ए ) को बढ़ा सकता है, जबकि आसन्न स्थिति थोड़ी देर के समय ( बी ) को दर्शाती है। टी डी में दोहरीकरण का समय है, और टी अंतराल न्यूनतम समय है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 6
6 चित्रा: अच्छी तरह से निष्पादित टेस्ट प्रयोग का उदाहरण
एक ईडायोड प्रकाशक के साथ टंगस्टन हलोजन बल्ब की जगह करने के बाद BY4742 तनाव का उदाहरण और ऑटोफोकस को सुनिश्चित करना ठीक से सेट किया गया है। सभी दोहरीकरण के समय अच्छी तरह से ओवरलैप होने लगते हैं और लैग के समय लगातार दिखाई देते हैं। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

Discussion

ओडेलेई परख में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और विश्वसनीय फीनोटाइपिक माप सुनिश्चित करने के लिए कई महत्वपूर्ण बिंदु हैं। पहला महत्वपूर्ण मुद्दा खमीर संस्कृतियों की लगातार तैयारी है लॉगरिदमिक वृद्धि से खमीर कोशिकाओं को फसल करने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। यदि संस्कृतियों ने संतृप्त किया है, तो उनकी आबादी विविधता बढ़ जाएगी जो आनुवंशिक या पर्यावरणीय ( जैसे, कार्बन स्रोत) कारकों 11 के कारण विविधता को दूर कर सकती है। दूसरा महत्वपूर्ण मुद्दा मीडिया की लगातार तैयारी है। सामान्य तौर पर, 10 एक्स स्टॉक मीडिया समाधान की एक बड़ी मात्रा उत्पन्न होनी चाहिए और इसके बाद बैच प्रभाव को कम करने के लिए समय पर उपयोग किया जाना चाहिए। जब भी संभव हो, वज़न के माध्यम से मीडिया को तैयार करता है, तो अगर की घनत्व सुनिश्चित करके मध्यम समय की संगति में सुधार और एजोज की समग्र जल सामग्री को बारीकी से निगरानी रखी जा सकती है। तीसरे महत्वपूर्ण बिंदु में मुझे agarose के किसी भी यांत्रिक विरूपण को कम करने या नष्ट करना शामिल हैव्यास। कांच की स्लाइड्स से agarose के अलग होने के दौरान मीडिया के मैकेनिकल विरूपण सबसे अधिक हो जाएगा। कई प्रयोगशाला तकनीकों के साथ, इस कदम को मास्टर करने के लिए अभ्यास की आवश्यकता होती है।

चित्रा 4 में दर्शाए गए अंतराल के समय में भिन्नता, अक्सर तीन कारकों में से एक से संबंधित होती है: agarose माध्यम के यांत्रिक विरूपण, ढाला या मोटाई में परिवर्तन, या अस्थिर प्रकाश स्रोत। यदि agarose मध्यम भिन्नता वाले सरणी में ज़ेड ऊंचाई में बदलता रहता है, तो ऊंचाई भिन्नता ऑटोफोकस रूटीन की सीमा को कम कर सकती है, जिससे प्रारंभिक छवियों को फ़ोकस से थोड़ी दूर किया जा सकता है। इस कारण से, केंद्र में और स्पॉटेड सरणी के किनारों पर फोकस की ऊंचाई को जांचें ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि ऑटोफोकस रूटीन में फ़ोकस लगाने के लिए पर्याप्त ज़ेड रेंज है। यदि आवश्यक हो, फोकस रेंज को बढ़ाने के लिए और फ़ोकसिंग चरणों की संख्या में वृद्धि करने के लिए ऑटोफ़ोकस पैनल का उपयोग करें।

एक तीसरा संभावित कंडिटआयन जो खराब फोकस का कारण बन सकता है एक अस्थिर या अस्थिरता प्रकाश स्रोत है, जो एक विशिष्ट Z- ऊंचाई के लिए गणना फ़ोकस स्कोर को बाधित कर सकता है। टंगस्टन हलोजन बल्ब झिलमिलाहट से पहले अच्छी तरह से बल्ब बाहर जला है। खराब फोकस का प्रभाव एक उदाहरण में मनाया जाता है जहां वृद्धि पहली और दूसरी बार अंक ( चित्रा 5 ए ) के बीच में गिरावट आती है, जबकि आसन्न जगह में एक ही डुबकी ( चित्रा 5 बी ) नहीं है। इस मामले में, टंगस्टन हलोजन प्रकाश स्रोत की जगह, खराब फोकस स्थिति को कम कर दिया गया था।

व्यवहार में, लेखकों ने पाया है कि 100W टंगस्टन हलोजन बल्ब की झिलमिलाहट को कम करने के लिए, प्रत्येक 500 घंटे या लगभग हर 2 महीने प्रतिस्थापित किया जाना चाहिए जब सूक्ष्मदर्शी भारी उपयोग में हैं चंचल बल्ब से खराब फोकस वाले मुद्दों से बचने के लिए, टंगस्टन हलोजन प्रकाश स्रोत की जगह अक्सर या डायोड प्रकाश स्रोत के साथ हलोजन बल्ब की जगह। एकएक डाटासेट का उदाहरण जो दोहरीकरण के समय में कम भिन्नता दिखाता है और साथ ही अधिक वर्दी लैग का समय चित्रा 6 में दिखाया गया है। यह डेटासेट एक डायोड प्रकाशक के साथ लिया गया था जो कि ऑटोफोकस का प्रदर्शन करते समय अधिक स्थिर रोशनी प्रदान करता है।

हालांकि मीडिया तैयारी को अनुकूलित करने के लिए यहां बताए गए कई बिंदु स्पष्ट हो सकते हैं, साहित्य में, अधिकांश बड़े स्केल स्क्रीन एक दूसरे के साथ अच्छी तरह से दोहराए नहीं जाते हैं 8 , 11 इसलिए, हमने सावधानीपूर्वक संस्कृतियों और agarose मीडिया की तैयारी का वर्णन किया है ताकि अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य फ़िनोटाइपिक स्क्रीन उत्पन्न हो सकें।

सिंथेटिक आनुवंशिक सरणियों या स्कैन-ओ-मेटाटिक परख जैसे पिनिंग आधारित assays की तुलना में ओडेले परख वर्तमान में थ्रूपूट में सीमित है। हालांकि इन विधियों में मापा जाने वाले उपभेदों की संख्या में वृद्धि हुई है, लेकिन उन्हें व्यक्तिगत कोशिकाओं को हल करने की क्षमता नहीं हैइस प्रकार हम आबादी विविधता को माप नहीं सकते हैं जो हम क्लोनल खमीर उपभेदों के भीतर देखते हैं। इस आबादी की विविधता की उत्पत्ति वर्तमान में समझ में नहीं आ रही है, लेकिन तकनीक और विलय की मर्जिंग जैसा कि यहां दिखाया गया है, वह अंतर्निहित सेलुलर तंत्र 12 को निष्पक्ष रूप से संबोधित करने का अवसर प्रदान करता है।

लेखकों को यह नोट करना है कि वर्तमान में केवल एक विशिष्ट माइक्रोस्कोप ब्रांड और शरीर के प्रकार के लिए अनुकूलित किया गया है। अन्य सूक्ष्मदर्शी प्रणालियों के लिए ODELAY संशोधित करना सीधे आगे है लेकिन ओपन सोर्स एपीआई 13 के ज्ञान की आवश्यकता होगी। हालांकि, एपीआई और साथ ही ओडेलेय लिपियों को आसानी से विभिन्न प्रणालियों और प्रयोगात्मक assays के लिए अनुकूलित करने के लिए लिखा जाता है।

चूंकि ओडेले मूल रूप से खमीर के लिए विकसित किया गया था, हम माइकोबैक्टीरियम स्मेग्मैटिस के विकास को ध्यान में रखते हुए इसे बिना किसी संशोधन के उपयोग में ला पाए हैं। सूक्ष्मजीव बनाने वाली अन्य कॉलोनी का निरीक्षणस्रोत कोड में परिवर्तन के साथ संभव 11 प्रदान सामान्य तौर पर, ओडेलेई विभिन्न पर्यावरणीय परिस्थितियों और आनुवांशिक उलझनों के तहत विकसित सूक्ष्मजीवों की तुलना करने के लिए एक शक्तिशाली और लचीला उपकरण है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों ने यूरीआईआर आरआर022220 और पी 50 जीएम076547 को अमेरिका के नेशनल इंस्टिट्यूट ऑफ हेल्थ से जेडीए को अनुदान के द्वारा इस काम के लिए समर्थन स्वीकार किया है। एफडीएम कैनेडियन इंस्टीट्यूट फॉर हेल्थ रिसर्च के साथ एक पोस्टडॉक्टरल फेलो है हम समर्थन के लिए लक्समबर्ग सेंटर फॉर सिस्टम्स बायोमेडिसिन और लक्ज़मबर्ग विश्वविद्यालय का भी धन्यवाद करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose UltraPure ThermoFisher 16500500 Gel Temp 36C, Gel Strength (1%) 1.2 g/sq cm
Yeast Extract Peptone (YEP) Fisher Scientific BP1422-2
Complete Suplement Mixture (CSM) Fisher Scientific MP114560222
Polyethylene Glycol 3350 (av. mol. wt. 3000-3700) SigmaAldrich P2906
Yeast Strain BY4741 ThermoFisher 95400.BY4741
Yeast Strain BY4742 ThermoFisher 95400.BY4742
50 mL Falcon tubes Corning 430291 1 case
15 mL Falcon tubes Corning 352096
2 x 3 inch 1.0 mm thick slides 1/2 gross VWR 48382-179
96-well plate flat bottom Corning 353072
Hydra liquid handleing robot Thermo 1096-DT-100
Hamilton Microlab Star Liquid Handleing Robot Hamilton
hydra 100 mL tips Extended Length DARTS Thermo 5527
Synergy H4 Plate Reader Biotek H4MLFAD
Leica DMI6000 B Microscope Leica
Leica 10X/0.3NA objective Leica 11506289
Hamamatsu ORCA Flash 4.0 Camera Hamamatsu C11440-22CU
MATLAB with image processing tool box Mathworks
MicroManager Open Imaging https://micro-manager.org/
ODELAY Microscope Control (MATLAB scripts and GUI) www.aitchisonlab.com\ODELAY for Matlab scripts and software
ODELAY Microscope Chamber www.aitchisonlab.com\ODELAY for Mechanincal Drawings
ODELAY Agar Molds www.aitchisonlab.com\ODELAY for mold drawings

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References

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  3. Yoshikawa, K., et al. Comprehensive phenotypic analysis for identification of genes affecting growth under ethanol stress in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 9 (1), 32-44 (2009).
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  13. Edelstein, A. D., et al. Advanced methods of microscope control using µManager software. J Biol Methods. 1 (2), e10 (2014).

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सेलुलर जीवविज्ञान अंक 125 विकास दर अंतराल का समय क्षमता रखने फिटनेस मूल्यांकन खमीर फेनोटाइप परख
ओडेलेय: खमीर विकास के बहु-पैरामीटर मात्राकरण के लिए एक बड़े पैमाने पर विधि
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Herricks, T., Mast, F. D., Li, S.,… More

Herricks, T., Mast, F. D., Li, S., Aitchison, J. D. ODELAY: A Large-scale Method for Multi-parameter Quantification of Yeast Growth. J. Vis. Exp. (125), e55879, doi:10.3791/55879 (2017).

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