Summary
Мы представляем метод количественного определения фенотипов роста отдельных дрожжевых клеток при их превращении в колонии на твердой среде с использованием временной микроскопии, называемой одноклеточной удвоенной оценкой живых массивов дрожжей (ODELAY). Неоднородность гетерогенности генетически идентичных клеток, растущих в колонии, может быть непосредственно обнаружена и количественно определена.
Abstract
Фенотипы роста микроорганизмов являются ярким показателем их генетической пригодности и могут быть разделены на 3 режима роста: лаг-фаза, логарифмическая фаза и стационарная фаза. Каждая фаза роста может выявить различные аспекты фитнеса, связанные с различными экологическими и генетическими условиями. Высоких и количественных измерений всех трех фаз роста, как правило, трудно получить. Здесь мы приводим подробный метод охарактеризовать все 3 фазы роста на твердых средах, используя анализ, называемый одноклеточным удвоением оценки живых массивов дрожжей (ODELAY). ODELAY количественно оценивает фенотипы роста отдельных клеток, растущих в колонии на твердых средах, с использованием временной микроскопии. Этот метод может непосредственно наблюдать гетерогенность популяции с каждым параметром роста в генетически идентичных клетках, растущих в колонии. Эта гетерогенность населения предлагает уникальную перспективу для понимания генетической и эпигенетической регуляции, а также ответы наГенетических и экологических возмущений. В то время как метод ODELAY продемонстрирован с использованием дрожжей, его можно использовать на любом микроорганизме, образующем колония, который видим с помощью микроскопии с помощью яркого поля.
Introduction
Фенотипы роста микроорганизмов являются сильным показателем их генетической пригодности для данного состояния окружающей среды. Рост классически разделяется на 3 разных режима роста: лаг-фаза, логарифмическая фаза и рост стационарной фазы 1 . Каждая фаза роста может выявлять различные аспекты фитнеса, которые зависят от различных экологических и генетических условий. Например, время запаздывания или время, которое организм проводит в лаг-фазе до начала экспоненциального роста, могут указывать на способность организма реагировать на измененные условия окружающей среды 2 . Удвоение времени при логарифмическом росте, наиболее распространенной метрике клеточной пригодности, показывает общую эффективность способности организма делиться за счет метаболизма и использования экологических материалов для репликации. Стационарная фаза, где рост после логарифмической фазы быстро снижается, является еще одним показателем пригодности, который является регулярнымВ качестве конечной точки роста в анализах роста дрожжей на основе пятен.
В настоящее время доступно несколько анализов роста дрожжей и рассматриваются стандартные методы оценки фенотипов роста дрожжей 3 , 4 , 5 . Эти анализы в основном основаны на методах выращивания дрожжей либо на твердых, либо в жидких средах. На твердых средах анализы колонии колоний переносят небольшое количество клеток на твердый агар с помощью штифта, и клеткам дрожжей дают возможность расти в течение определенного периода времени. Затем отображаются колонии и их размеры сравниваются в терминальной конечной точке 6 . Эти анализы колонии колонии оказались надежными и масштабируемыми для создания геномных экранов. Совсем недавно в эти анализы были включены периодические изображения с использованием плоских сканеров и камер с одним объективом Reflex (SLR) для регистрации роста колонии с течением времени 7 , 8, 9 . Тем не менее, разрешение этих устройств не позволяет им обнаруживать отдельные клетки, и, таким образом, эти тесты колониального колонии непосредственно не наблюдают время запаздывания и не могут наблюдать изменения между отдельными клетками, которые растут в колонии.
Анализы роста на основе жидкости также использовались для выполнения экранов 3 генома. Сочетание анализа роста жидкости с временной микроскопией выявило гетерогенность популяции в период удвоения генетически идентичных отдельных клеток, что дает важную перспективу для понимания генетической регуляции и адаптации к окружающей среде. Однако этот анализ не измеряет другие аспекты роста, такие как время запаздывания и пропускная способность 10 . Здесь мы представляем метод охарактеризовать все три фазы роста колониеобразующих микроорганизмов на твердых средах с использованием анализа, который мы называем ODELAY 11 . ODELAY состоит из utiliZing с высокой пропускной способностью для записи изображений одиночных клеток, растущих в колонии на твердых средах. Эта популяция отдельных клеток, растущих в колониях, выявляет гетерогенность популяции, которая не обнаруживается другими менее чувствительными измерениями, такими как оценка конечной точки. Мы демонстрируем метод на дрожжах, но ODELAY может применяться к любому организму, который проявляет контраст в яркой полевой микроскопии.
Protocol
1. Приготовление запаса геля агарозы
- Взвесьте 2 г агарозы высокой чистоты.
- Добавить агарозу в бутылку объемом 500 мл и записать их комбинированную массу.
- Рассчитайте целевую массу бутылки плюс 2 г агарозы с 150 г ультрачистой воды, затем добавьте 150 г ультрачистой воды до 0,1 г этой целевой массы.
- Обратите внимание на массу бутылки плюс агарозу и воду.
- Поместите бутылку в микроволновую печь и убедитесь, что она установлена в бутылке с крышкой сверху, чтобы минимизировать испарение воды при нагревании агарозы.
- Микроволновую бутылку через 15-20 с, а затем кратковременно закручивали бутылку для смешивания агарозы и воды. Повторите эту процедуру до тех пор, пока раствор не кипит, и смесь будет однородной.
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Соблюдайте осторожность, чтобы избежать ошпаривания кожи с вытеканием пара из бутылки. Кроме того, бутылка станет горячей на ощупь, и для предотвращения травм необходима соответствующая защита, например, автоклавная перчатка. - После того, как расплавленная агароза будет однородной, снова взвесьте бутылку и добавьте сверхчистую воду с точностью до 0,1 г исходной массы. Это заменит любую потерю воды из-за испарения.
- Перед тем, как расплавленная агароза затвердеет, закрутите, чтобы перемешать в добавленной воде, чтобы обеспечить однородность.
- Аликвоту 15,2 г агарозы в 9 - 50 мл пластиковых труб.
- Охлаждайте трубки до тех пор, пока они не понадобятся.
2. Подготовка ODELAY Agarose Media
- Нагреть 400 мл деионизированной воды, чтобы кипятить в закрытом стакане, на плите при осторожном перемешивании с помощью магнитной мешалки.
- Добавить 2 мл 10X среды ( например , дрожжевого экстракта Пептона (YEP) или полную добавочную смесь (CSM)) в аликвоту агарозы 15,2 г в конической трубке 50 мл с этапа 1.10.
ПРИМЕЧАНИЕ. Среда CSM имеет тенденцию придерживаться стеклянных слайдов. При использовании композиций среды CSM добавьте 5 мкл 50% мас. Полиэтиленгликоля (ПЭГ) в стерильной воде к препарату средней массы. ПЭГ предотвращаетGar от прилипания к стеклянным слайдам во время освобождения плесени и не препятствует росту дрожжей. - Добавьте дополнительные 100X питательные добавки, если необходимо, и используйте воду, чтобы довести общий добавленный объем с этого шага до 1 мл.
- Взвесьте агарозную аликвоту с добавкой среды и добавок перед тем, как поместить 50 мл коническую трубку в кипящую воду со стадии 2.1.
- Через 16 минут выньте 50 мл пробирку и гомогенизируйте смесь, используя вихрь. Держите колпачок плотно закрепленным на конической трубке 50 мл.
ПРИМЕЧАНИЕ. Крышка на стакане равномерно нагревает всю трубку, иначе пленка из твердой агарозы будет образовываться и, возможно, не таять. Также в это время удобно собирать агарозную форму ( рис. 1 ). - Гомогенизируйте смесь, используя вихрь.
- Кипятите еще 2 мин, чтобы весь агар был смешан и расплавлен.
- Взвесьте трубку и замените любую потерю массы ультрачистой стерильной водой.
- Добавить 2 мл 10-кратного углекислотного( Например , 20% мас. / Об. Глюкозы) и вихря для получения раствора агарозной среды.
ПРИМЕЧАНИЕ. Разделение стеклянных слайдов: при сборке пресс-формы необходимо следить за тем, чтобы длинные распорки были помещены в форму с правильной ориентацией. Это связано с тем, что, когда лазер разрезает акрил, он имеет тенденцию резать, когда конус оставляет часть со слегка угловыми сторонами, а не ровно на 90 °. Затем, когда форму помещают на столешницу для выпуска стекла из агара, край прокладки должен быть под острым углом с агаром. Острый угол помогает сжать край агара от верхней части стекла, поскольку внешний край разделителя формы поворачивается вокруг нижней кромки (см. Рисунок 1 ). В результате получается более последовательное отделение агара от верхней части стекла.
ПРИМЕЧАНИЕ. Средства для выпуска пресс-форм, применяемые к стеклу, такие как масла, кремниевые спреи или даже коммерческие обработки окон, не должны использоваться, поскольку они загрязняют Urface агара и, возможно, ингибирует рост. Эти методы требуют определенной практики. - Очистите четыре стеклянных слайда толщиной 2 х 3 дюйма х 1 мм с 70% этанолом и высушите их с помощью принудительного воздуха.
- Очистите акриловые формы с 70% этанолом, высушите и собрайте, как показано на рисунке 1 . Возьмите три нижних куска, как показано на рисунке, и соберите их так, чтобы две одинаковые части сэндвич с третьей частью ( рис. 1B ). Закрепите части основания на каждой стороне двумя маленькими скобками ( рис. 1C ). Поместите стойки в пресс-форму, убедившись, что лазерный керф правильно расположен ( рис. 1E ).
- Поместите очищенный и высушенный стеклянный предмет на пресс-форму и удерживайте его на месте, помещая второй стеклянный предмет на другую сторону. Закрепите узел с помощью более крупного связующего ( рис. 1D ). Зажмите обе слайды с помощью более крупных зажимов для связующих (Lass = "xfig"> Рисунок 1D). Убедитесь, что верхний связующий зажим находится в контакте с стеклянным слайдом, перекрывающимся акрилом.
- Добавьте оставшиеся связующие зажимы. Опять же, убедитесь, что зажимы касаются слайда, где он перекрывает акрил ( рисунок 1D ).
ПРИМЕЧАНИЕ. Перед заполнением собранной формы расплавленным агаром убедитесь, что края герметизированы путем пипетирования около 70 мкл расплавленной агаровой среды вдоль внутренней стороны формы. Этот агар быстро затвердевает и предотвращает любые утечки. - Заполните пресс-форму расплавленным агаром, следя за тем, чтобы избежать попадания пузырьков воздуха в пресс-форму.
ПРИМЕЧАНИЕ. Это может быть достигнуто путем медленной пипетирования расплавленного агара вдоль края формы. После того, как он будет заполнен, дайте пресс-форме остыть в течение 40 минут до 1 часа при температуре окружающей среды около 23 ° C. Если позволено слишком быстро охладиться, агар может переломиться в пресс-форме.
ПРИМЕЧАНИЕ. Разделение пресс-формы. Правильное удаление формы из литого агара имеет важное значение для обеспечения однородного твердогоАгар для роста дрожжей. Неспособность обеспечить эффективное разделение формы на этой стадии приведет к различиям в росте, которые могут быть связаны с несовершенствами в твердой агаровой подушке. Рекомендуется применять этот шаг несколько раз. - Начните с удаления нижнего связующего. Снимите нижнюю часть пресс-формы, которая состоит из трех зажатых кусков. Держите слайды, сжимая их, а затем удалите зажимы связующего. Обязательно не ударяйте стороны формы при удалении связующих зажимов. Это приведет к деформированию носителя.
- Поместите пресс-форму на край скамьи, чтобы сторона формы с синей точкой была направлена вверх и в левом нижнем углу ( рис. 1Е ). Поместите пальцы под акрилом и первым пальцем сверху к внутреннему краю формы.
- Медленно и осторожно надавливайте большим пальцем на плесень, как бы поворачивая распорку пресс-формы вокруг ее нижнего края ( рис. 1F ). Применить константуНо медленно увеличивая давление. У пользователей появится разрыв и воздушный пузырь, появляющийся вдоль линии, где верхнее стекло покрывает прокладку пресс-формы.
- Увидев начальную линию прерывания, продолжайте подталкивать пальцами и применяйте постоянное давление. Агар должен начать отрываться от стекла в этот момент ( рис. 1F ). Продолжайте поворачивать форму вверх. Это поднимет стекло, не сдвигая его. Линия, где агар отслаивается от стекла, должен продолжать отходить от начальной линии разлома.
ПРИМЕЧАНИЕ. В этот момент агар прилипает к нижней и верхней части стекла. Это будет происходить с самым левым краем. Пока область деформирована не в области, где дрожжи замечены, это должно быть хорошо. - Когда стекло полностью освободится, возьмите его и полностью удалите из формы. Затем удалите другую часть пресс-формы, используя аналогичное движение, чтобы снять кусочек без перемещения агара. Поместите слайды вСтерильный ящик для чашек с некоторой стерильной водой высокой чистоты в нижней части. Закройте коробку и храните ее при 4 ° CO / N для использования на следующий день. Если хранить дольше, темпы роста станут непоследовательными.
3. Подготовка культуры ODELAY
- Выложите штаммы в 96-луночный планшет для роста O / N.
- На следующий день разведите 20 мкл ночной культуры в 200 мкл среды для общего объема 220 мкл в новой пластине.
- Измерьте оптическую плотность при 600 нм (OD600) каждой культуры в планшетном ридере. Используя устройство для считывания пластин и робот для обработки жидкости, следуйте автоматизированному протоколу разбавления по этапам 3.3.1 - 3.3.6. Вручную разбавьте культуры в пластине примерно до 0,1 OD600 (необязательно).
- На планшетном ривере нажмите «Эксперимент» в разделе «Создать новое». Выберите ODELAYDilution.exp и запустите эксперимент. Введите название эксперимента в качестве ODELAY «Дата» «Время» «Имена экспериментов».
- Нажмите на sTatistics, а затем щелкните значок Excel. Сохраните данные на флэш-накопитель и перенесите их на компьютер робота для обработки жидкости.
- Откройте редактор макета робота и редактор методов. Откройте файл метода «ODELAYDilution_v1.med». Запустите исполняемый файл «Convert_SynergyFiles.exe». Введите 0.09 для целевого OD600.
- Нажмите «Коррекция глюка» и «Гал-коррекция» до 0,05. Измерьте заготовку в идентичной пластине. Нажмите «Создать файл». Выберите файл в редакторе методов. Нажмите на значок стоп-сигнала, чтобы запустить метод, чтобы открыть программу разбавления времени выполнения.
- Удостоверяются, что трубки не открываются, а пластины имеют крышки, и пылезащитные крышки удаляются с наконечников. Загрузите пластины, трубки и наконечники на палубу робота для обработки жидкости, как указано в расположении колоды.
- Нажмите кнопку «Воспроизвести», чтобы запустить программу разбавления. Выберите правильное количество советов по 50 мкл. Выберите правильное количество 300 мкл. Подождите12 минут для запуска процесса.
- Возьмите пластину для разбавления от робота, закройте наконечники и повторите 15-миллилитровые пробирки. Культивируйте планшет в течение 5-6 часов при температуре 30 ° C.
- Примерно за 1 - 2 часа перед началом второго разбавления обязательно включите инкубационные камеры для микроскопа. Позвольте им уравновешиваться при ° C или температуре, требуемой для эксперимента.
- Повторите шаги разбавления 3,3-3,4, но разбавьте культуры до OD600 0,01-0,02 для определения культур на агарозных слайдах.
- Накройте пластину для разбавления металлическим уплотнением морозильной камеры.
- Сонатрите разбавляющую пластину на ледяной бане в течение 30 с с пластиной, плавающей в ледяной воде, с помощью центрифужного металлического ковшового фитинга, чтобы удерживать пластину ( рис. 2А ). Перенесите обработанные ультразвуком культуры с пластины для разбавления на плоскую нижнюю пластину. Этикетка 4 x 96-луночные плоские нижние пластины 1, 2, 3 и 4 ( рисунок 2B ).
- Трансфер 150 &№ 181; L разрезной пластины из лунок A01 - D06 в лунки C04 - F09 пластины, помеченной 1. Затем переместите 150 мкл разбавляющей пластины из лунок A07 - D12 в лунки C04 - F09 пластины, помеченной 2. Затем переместите 150 мкл Разбавляющей пластины из колодцев E01 - H06 в лунки C04 - F09 пластины, помеченной 3. Наконец, переносите 150 мкл разбавляющей пластины из колодцев E07 - H12 в лунки C04 - F09 пластины, помеченной 4.
- Перейдите к шагу 4, «Пятно на агаре».
4. Пятнистость на агаре с использованием автоматизированного робота для определения пятен
- Удалите агарозные слайды, хранящиеся при 4 ° СО / Н (с шага 2.19) из их увлажненных стерильных ящиков для пипеток.
- При необходимости отрежьте углы агарозной среды чистым лезвием бритвы, чтобы они поместились в камеру скольжения.
- Снимите скобу с крепления. Осторожно поместите пластину агара в углубленную область крепления камеры.
ПРИМЕЧАНИЕ. Убедитесь, чтоУстойчивость слайда согласуется с экспериментом и экспериментом. - Убедитесь, что зажим заподлицо с нижней частью камеры. Если он криволинейный, то ползунок может не полностью усаживаться в углубленной области. Поместите выравнивательную прокладку в положение центральной пластины робота-пятнистости. Эта распорка обеспечивает контакт для выравнивающих винтов, так что ползунок можно выровнять с помощью наконечников.
- Поместите пластины на стол в порядке их квадранта. Плиты 1, 2, 3 и 4 упорядочены слева направо ( рис. 2B ).
- Выложите наконечники так, чтобы внутренние 24 лунки C04 - F09 были заняты кончиками в 4 пустых наконечника. Пятый ящик должен иметь один наконечник в положении C10, а также 4 кончика с обрезанными концами в положениях A01, A12, H01 и H12. Эти четыре срезанных наконечника обеспечивают стабильность зажимного наконечника ( рис. 2C и 2D ).
- Снимите верхнюю крышку со слотаОбразная камера.
- Поместите первый наконечник наконечника в начальный участок программы обнаружения робота. Это должно пробить отверстие в агарозе, которое позже будет использоваться для выравнивания координат начала координат. Поместите пластину 1 на робот для обработки жидкости, чтобы определить первый квадрант. Убедитесь, что крышка снята и продолжите программу определения пятен.
- Убедитесь, что все пятна присутствуют. Кроме того, подождите ~ 30 с, чтобы они высохли. Когда пятна имеют диаметр около 1 мм, программа может продолжаться. Опорожните использованные наконечники в контейнере с биологической опасностью и поместите свежие наконечники на робот. Замените пластину 1 для пластины 2- го квадранта.
- Повторите для третьего квадранта. Повторите еще раз для 4- го квадранта.
- Когда пятна сухие, замените крышку камеры скольжения и переверните аппарат.
- Установите трубные соединения с воздушным фильтром.
- Поместите стеклянный предмет на верхнюю сторону камеры.
ПРИМЕЧАНИЕ. Этот слайд имеет решающее значение для сокращенияПоток тепла к агару и минимизирует образование конденсата на стороне скольжения объектива. Не забывайте об этом обложке. В зависимости от конфигурации микроскопа этот прокол крышки предотвращает нагрев со стороны освещения от конденсации на стороне объектива. - Установите вентилятор, чтобы нагреть горячий воздух на объектив. Этот вентилятор предотвращает образование конденсата на крышке. Установите расход воздуха через барботер до 10 мл / мин.
5. Запуск ODELAY на микроскопе
- Запустите скрипт «ODELAY_Microscope_Control.m».
- Нажмите «Затвор», чтобы открыть передаваемый световой затвор, а затем кнопку «Фокус», чтобы начать высокую скорость камеры ( рис. 3А , «Красные стрелки»).
- Нажмите «Go Origin» и переместите сцену, чтобы найти отметку начала, которая была пробита в агаре.
- Затем слегка двигайтесь вправоСосредоточиться на дрожжевых клетках, замеченных в области E07.
- Вернитесь к началу координат и центрируйте его в поле зрения.
- Установите значение источника в это значение, нажав кнопку «set» ( Рисунок 3A , «Синие стрелки»). Теперь переместитесь в позицию H18 и сфокусируйтесь с помощью шестигранного винта, ближайшего к этому месту. Затем переместитесь в положение L07 и сфокусируйтесь с помощью шестигранного винта, ближайшего к этому месту. Затем переместитесь в положение E07 и сфокусируйтесь с помощью шестигранного винта, ближайшего к этому месту.
- Повторяйте шаги 5.5 - 5.7 по мере необходимости, пока эти позиции не останутся в фокусе.
- Проверьте фокусировку в центре и по краям в местах E12, H12, L12. Отрегулируйте диапазон автофокусировки, если значения Z-фокуса, указанные в значении Z, превышают ± диапазон автофокуса ( например , установите диапазон автофокусировки на 60 мкм Z-значение для центрального пятна, которое больше, чем ± 40 мкм).
- Нажмите кнопку сброса, так как это активирует свойства кнопки, а затем нажмитеODELAY ( Рисунок 3A , Зеленые стрелки). Выберите каталог для сохранения данных. Убедитесь, что достаточно места на диске.
ПРИМЕЧАНИЕ. Микроскоп собирает данные в течение 48 часов или пока программа не будет закрыта.
6. Обработка данных ODELAY
- Откройте ODELAY_IPT.exe или используйте скрипт ODELAY_Image_Processing_Tool_v7.m ( рисунок 3C ).
- Подготовьте * ODELAYExpDisc.xlsx таблицу Excel.
- Назовите эксперимент в ячейке B1.
- Выберите каталог изображений, в котором хранятся файлы изображений E07 - H18.
- Выберите каталог данных, в котором будут записываться данные.
- Напишите дату начала эксперимента в ячейку B04. Используйте формат MM / DD / YYYY.
- Напишите время разведения в ячейке C04. Это время составляет примерно пять минут до того, как будет собрано первое изображение. Используйте формат HH: MMpm, где HH для h, а MM - мин.
- Добавить в названиях деформаций по tO исходная пластина (шаг 3.1). Из-за того, что штаммы замечены, они перегруппированы на агарозном слайде ODELAY. Клетки в таблице B31-B126 являются исходной пластинкой, а ячейки C31 - C126 - пятнами в пластине агара ODELAY.
- Затем нажмите кнопку «Данные процесса» и выберите * ODELAYExpDisc.xlsx, который был только что подготовлен.
- Подождите 16-24 часов в зависимости от компьютерной системы, используемой для обработки данных.
- Когда изображения будут обработаны, появится каталог с именем «ODELAY Well Data» и файл «* _Index_ODELAYData.mat». Нажмите кнопку «Загрузить данные» и выберите только что созданный файл «* _Index_ODELAYData.mat». Это загрузит набор данных, который был только что обработан. «*» В имени файла будет указан в соответствии с именем эксперимента, введенным в таблицу Excel.
- После загрузки данных проверьте его, используя временную шкалу, найденную в нижней части, щелкните квадрат изображения, чтобы увидеть кривые роста fИли это место, или найдите интерес, который интересен в списке слева, а затем загрузите изображения для этого списка.
- Создайте гистограммы параметров роста населения, нажав кнопку «Скрипка». Это создаст график, показанный на рисунке 4 или на рисунке 6 .
Representative Results
Примеры изображений дрожжей, растущих во временной микроскопии, показаны на рисунке 3B . После обработки изображений с замедленным просмотром на фиг. 4 показан репрезентативный набор данных, сравнивающий дрожжевые штаммы BY4741 & BY4742. В этом примере набора данных очень мало изменений в времени удвоения между различными позициями на пластине. Если агарозная среда плохо подготовлена, то очевидное отклонение как по времени удвоения, так и времени задержки будет очевидным в положениях пятна, которые совпадают с деформированной областью агарозного геля. Хотя времена удвоения кажутся относительно однородными, этот пример показывает изменения в измерениях времени задержки. Более согласованный набор данных показан на рисунке 6 . В этом наборе данных время задержки и удвоения равномерное.
Files / ftp_upload / 55879 / 55879fig1.jpg "/>
Рисунок 1: Агар.
Компоненты формы агара показаны в ( А ). Соберите основание, как показано на ( B ), а затем закрепите основание небольшими зажимами. Поместите более длинные вертикальные куски в полость основания ( C ), а затем расположите слайды до формы, как показано на ( D ). Вид сбоку, показывающий угол формы и ориентацию кристаллизатора формы, необходимый для последовательного отделения агара от стеклянной полки ( E ). Обратите внимание на положение большого пальца и указательных пальцев, а также прямую линию агара, отделяемого от ползуна ( F ), и обратите внимание на горизонтальную стрелку. Линия разделения должна перемещаться равномерно в направлении вертикальных стрелок. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
= "Jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> 
Рисунок 2: Метод ультразвука и спонтания.
Сонатируйте пластину в ледяной воде и используя держатель ведро центрифуги для поддержки пластины ( A ). Положите пластины из этапов 3.8.1 для определения пятен на агарозной пластине ( B ). Кроме того, расположите наконечники так, чтобы левый крайний наконечник имел один наконечник в положении C10, а затем четыре других кончика с обрезанными концами, чтобы они не разрушали держатель пластины ( C ). Поместите остальные наконечники в четыре коробки, чтобы заняли внутренние 24 кончика ( D ). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
55879fig3.jpg "/>
Рисунок 3: Графический пользовательский интерфейс ODELAY.
Снимок экрана графического интерфейса пользователя для «ODELAY_Microscopecontrol.m» ( A ). Этот интерфейс позволяет контролировать камеру и регулировать настройки освещенности микроскопа для режимов эпифлуоресцентного и яркого поля. Красные стрелки указывают на кнопки «Фокус» и «Передано», которые активируют камеру, чтобы быстро получать изображения и открывать передаваемый световой затвор соответственно. Синие стрелки используются для перемещения сцены для начала координат, а затем устанавливают начало координат с помощью кнопки «Происхождение» и кнопки «Установить». Зеленые стрелки указывают на «Сброс» и «ODELAY !!!» Кнопки, которые возвращают режимы изображения ODELAY в текущие условия и инициируют сбор изображений ODELAY. Временные изображения дрожжей, растущих на твердой среде через 0, 3, 6 и 9 ч после определения пятен ( В ). Снимок экрана графического интерфейса пользователя для «ODELAY_IPT.m» или E Инструмент обработки изображений ODELAY ( C ). Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Пример вывода ODELAY.
Этот набор данных сравнивает штаммы BY4741 и BY4742 на носителях YPD. Этот рисунок является примером хорошо подготовленного агарозного слайда; Однако настройки автофокуса не являются оптимальными. Данные, представленные в каждом столбце слева направо, являются: пропускная способность в логе 2 области колонии; Время удвоения, заданное в мин; И время задержки, указанное в мин. В этом примере время удвоения всех пятен на слайде агара хорошо выравнивается с небольшим количеством увеличенного времени удвоения по отношению к колонке. Однако время задержки значительно варьируется в этом наборе данных._upload / 55879 / 55879fig4large.jpg "target =" _ blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Примеры кривых роста.
Этот пример демонстрирует, как плохой начальный фокус может привести к увеличению расчетного времени задержки (t лаг ) ( A ), в то время как смежное положение показывает более короткое время задержки ( B ). T d - время удвоения в мин, t lag - время запаздывания в мин. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Пример экспериментального эксперимента, проведенного с помощью скважины.
EXample теста BY4742, испытанного после замены вольфрамовой галогенной лампы диодной подсветкой и обеспечения правильной установки автофокуса. Все времена удвоения кажутся хорошо перекрывающимися, и время задержки кажется последовательным. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Discussion
Анализ ODELAY имеет несколько критических точек для обеспечения воспроизводимых и надежных фенотипических измерений. Первым критическим моментом является последовательная подготовка культур дрожжей. Необходимо принять меры для сбора дрожжевых клеток от логарифмического роста. Если культуры насыщаются, то их гетерогенность будет увеличиваться, что может привести к запутанности гетерогенности, вызванной генетическими или экологическими ( например, источниками углерода) 11 . Вторая критическая точка - это последовательная подготовка СМИ. В общем случае необходимо создать большой объем 10X-носителя для хранения, а затем использовать с течением времени для минимизации пакетных эффектов. Формулирование среды по массе, когда это возможно, помогает улучшить консистенцию среды во времени, обеспечивая тщательный мониторинг плотности агара и общего содержания воды в агарозе. Третья критическая точка заключается в минимизации или устранении какой-либо механической деформации агарозы менядиаметр Механическая деформация среды чаще всего происходит при отделении агарозы от стеклянных слайдов. Как и во многих лабораторных методах, для освоения этого шага требуется практика.
Изменение времени запаздывания, как показано на рисунке 4 , часто связано с одним из трех факторов: механической деформацией агарозной среды, изменением толщины формованного агара или неустойчивым источником света. Если агарозная среда изменяется по Z-высоте по пятнистой решетке, изменение высоты может нарушить диапазон процедуры автоматической фокусировки, в результате чего начальные изображения будут слегка не в фокусе. По этой причине проверьте высоту фокуса в нескольких точках в центре и по краям пятнистого массива, чтобы убедиться, что процедура автофокусировки имеет достаточный Z-диапазон для нахождения фокуса. При необходимости используйте панель автофокусировки, чтобы увеличить диапазон фокусировки и увеличить количество шагов фокусировки.
Третьим возможным условиемИон, который может привести к плохой фокусировке, - это неустойчивый или мерцающий источник света, который может нарушить расчетную оценку фокуса для определенной Z-высоты. Вольфрамовые галогенные лампы обычно мерцают задолго до выгорания лампочек. Эффект плохого фокуса наблюдается в одном примере, где кривые роста опускаются между первым и вторым временными точками ( рис. 5А ), в то время как соседнее пятно не имеет такого же падения ( рис. 5В ). В этом случае ухудшение состояния фокуса было облегчено за счет замены источника галогенных ламп вольфрама.
На практике авторы обнаружили, что для уменьшения мерцания ламп накаливания вольфрамовых ламп мощностью 100 Вт лампочки необходимо заменять каждые 500 ч или примерно каждые 2 месяца, когда микроскопы находятся в тяжелом состоянии. Чтобы избежать проблем с фокусом от мерцающей лампы, часто заменяйте источник галогенных ламп вольфрама или замените галогенную лампу диодным источником света.Пример набора данных, который показывает низкое изменение времени удвоения, а также более равномерное время задержки, показано на рисунке 6 . Этот набор данных был сделан с диодным осветителем, который обеспечивает более стабильное освещение во времени при выполнении автофокуса.
Хотя многие из упомянутых здесь пунктов для оптимизации подготовки средств массовой информации могут показаться очевидными, в литературе экраны большого масштаба не очень хорошо копируются друг с другом 8 , 11 . Поэтому мы тщательно описали подготовку культур и агарозных сред, чтобы можно было генерировать более воспроизводимые фенотипические экраны.
Анализ ODELAY в настоящее время ограничен пропускной способностью по сравнению с анализами на основе пиннинга, такими как синтетические генетические матрицы или анализ Scan-O-Matic. Хотя эти методы увеличивают количество измеряемых штаммов, им не хватает способности разрешать отдельные клетки aСледовательно, не может измерять гетерогенность популяции, которую мы наблюдаем в рамках клональных штаммов дрожжей. Происхождение этой гетерогенности населения в настоящее время не понимается, но слияние технологий и вычислений, как показано здесь, дает возможность объективно решать основные клеточные механизмы 12 .
Авторы хотели бы отметить, что ODELAY в настоящее время оптимизирован только для конкретного типа микроскопа и типа кузова. Изменение ODELAY для других систем микроскопа является прямым, но потребует знания API 13 с открытым исходным кодом. Тем не менее, как API, так и сценарии ODELAY записываются так, что они легко адаптируются к различным системам и экспериментальным анализам.
В то время как ODELAY был первоначально разработан для дрожжей, мы смогли использовать его без модификации, чтобы наблюдать рост Mycobacterium smegmatis . Наблюдение других колониеобразующих микроорганизмовВозможно с изменением исходного кода 11 . В общем, ODELAY - это мощный и гибкий инструмент для сравнения микроорганизмов, выращенных в различных условиях окружающей среды и генетических возмущениях.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы подтверждают поддержку этой работы грантами U54 RR022220 и P50 GM076547 на JDA из Национальных институтов здравоохранения США. FDM является докторантом с канадскими институтами исследований в области здравоохранения. Мы также благодарим Люксембургский центр системной биомедицины и Университет Люксембурга за поддержку.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose UltraPure | ThermoFisher | 16500500 | Gel Temp 36C, Gel Strength (1%) 1.2 g/sq cm |
| Yeast Extract Peptone (YEP) | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Complete Suplement Mixture (CSM) | Fisher Scientific | MP114560222 | |
| Polyethylene Glycol 3350 (av. mol. wt. 3000-3700) | SigmaAldrich | P2906 | |
| Yeast Strain BY4741 | ThermoFisher | 95400.BY4741 | |
| Yeast Strain BY4742 | ThermoFisher | 95400.BY4742 | |
| 50 mL Falcon tubes | Corning | 430291 | 1 case |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352096 | |
| 2 x 3 inch 1.0 mm thick slides 1/2 gross | VWR | 48382-179 | |
| 96-well plate flat bottom | Corning | 353072 | |
| Hydra liquid handleing robot | Thermo | 1096-DT-100 | |
| Hamilton Microlab Star Liquid Handleing Robot | Hamilton | ||
| hydra 100 mL tips Extended Length DARTS | Thermo | 5527 | |
| Synergy H4 Plate Reader | Biotek | H4MLFAD | |
| Leica DMI6000 B Microscope | Leica | ||
| Leica 10X/0.3NA objective | Leica | 11506289 | |
| Hamamatsu ORCA Flash 4.0 Camera | Hamamatsu | C11440-22CU | |
| MATLAB with image processing tool box | Mathworks | ||
| MicroManager | Open Imaging | https://micro-manager.org/ | |
| ODELAY Microscope Control (MATLAB scripts and GUI) | www.aitchisonlab.com\ODELAY for Matlab scripts and software | ||
| ODELAY Microscope Chamber | www.aitchisonlab.com\ODELAY for Mechanincal Drawings | ||
| ODELAY Agar Molds | www.aitchisonlab.com\ODELAY for mold drawings |
References
- Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van't Riet, K. Modeling of the bacterial growth curve. Appl Environ Microbiol. 56 (6), 1875-1881 (1990).
- Sellick, C. A., Campbell, R. N., Reece, R. J. Galactose metabolism in yeast-structure and regulation of the leloir pathway enzymes and the genes encoding them. Int Rev Cell Mol Biol. 269, 111-150 (2008).
- Yoshikawa, K., et al. Comprehensive phenotypic analysis for identification of genes affecting growth under ethanol stress in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 9 (1), 32-44 (2009).
- Bryan, A. K., Goranov, A., Amon, A., Manalis, S. R. Measurement of mass, density, and volume during the cell cycle of yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (3), 999-1004 (2010).
- Baryshnikova, A., et al. Quantitative analysis of fitness and genetic interactions in yeast on a genome scale. Nat Methods. 7 (12), 1017-1024 (2010).
- Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327 (5964), 425-431 (2010).
- Collins, S. R., et al. Functional dissection of protein complexes involved in yeast chromosome biology using a genetic interaction map. Nature. 446 (7137), 806-810 (2007).
- Zackrisson, M., et al. Scan-o-matic: High-Resolution Microbial Phenomics at a Massive Scale. G3 (Bethesda). 6 (9), 3003-3014 (2016).
- Bean, G. J., Jaeger, P. A., Bahr, S., Ideker, T. Development of ultra-high-density screening tools for microbial 'omics'. PloS One. 9 (1), e85177 (2014).
- Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant. PLoS Biol. 10 (5), e1001325 (2012).
- Herricks, T., et al. One-Cell Doubling Evaluation by Living Arrays of Yeast. ODELAY! G3 (Bethesda). 7 (1), 279-288 (2017).
- Mast, F. D., Ratushny, A. V., Aitchison, J. D. Systems cell biology. J Cell Biol. 206 (6), 695-706 (2014).
- Edelstein, A. D., et al. Advanced methods of microscope control using µManager software. J Biol Methods. 1 (2), e10 (2014).
