ODELAY: En storskala metode til kvantificering af gærvækst i flere parametre

Summary

Vi præsenterer en metode til kvantificering af vækstfænotyper af individuelle gærceller, da de vokser ind i kolonier på faste medier ved anvendelse af tidsforskydningsmikroskopi betegnet, En-celledobbeltbedømmelse af levende arrays af gær (ODELAY). Befolknings heterogenitet af genetisk identiske celler, der vokser ind i kolonier, kan observeres og kvantificeres direkte.

Abstract

Vækstfænotyper af mikroorganismer er en stærk indikator for deres underliggende genetiske egnethed og kan adskilles i 3 vækstregimer: lagfase, logfase og stationær fase. Hver vækstfase kan afsløre forskellige aspekter af fitness, der er relateret til forskellige miljømæssige og genetiske forhold. Højopløsnings- og kvantitative målinger af alle 3 faser af vækst er generelt vanskelige at opnå. Her præsenterer vi en detaljeret metode til at karakterisere alle 3 vækstfaser på fast medium ved hjælp af et assay kaldet En-celle Doubling Evaluering af Living Arrays of Yeast (ODELAY). ODELAY kvantificerer vækstfænotyper af individuelle celler, der vokser ind i kolonier på fast medium ved anvendelse af tidsforskydningsmikroskopi. Denne metode kan direkte observere befolknings heterogenitet med hver vækstparameter i genetisk identiske celler, der vokser ind i kolonier. Denne population heterogenitet tilbyder et unikt perspektiv for forståelse af genetisk og epigenetisk regulering og svar påGenetiske og miljømæssige forstyrrelser. Mens ODELAY-metoden er demonstreret ved anvendelse af gær, kan den anvendes på enhver kolonidannende mikroorganisme, der er synlig ved lyse feltmikroskopi.

Introduction

Vækstfænotyper af mikroorganismer er en stærk indikator for deres underliggende genetiske egnethed til en given miljøtilstand. Væksten er klassisk adskilt i 3 forskellige vækstregimer: lagfase, logfase og stationær fase vækst ¹ . Hver vækstfase kan afsløre forskellige aspekter af fitness, som er afhængige af forskellige miljømæssige og genetiske forhold. For eksempel kan lagretid eller den tid, en organism bruger i lagfase før starten af ​​eksponentiel vækst, indikere en organismes evne til at reagere på ændrede miljøforhold ² . Doblingstid under logfasevækst, den mest almindelige metric for cellulær træning, afslører den samlede effektivitet af en organisations evne til at opdele ved at metabolisere og udnytte miljømaterialer til replikation. Stationær fase, hvor vækst efter logfase hurtigt reduceres, er en anden indikator for fitness, som er regelmæssigAnvendes som et vækstendipunkt i punktbaserede gærvækstassays.

Flere gærvækstassays er aktuelt tilgængelige og betragtes som standardmetoder til evaluering af vækstfænotyper i gær ^{3 , 4 , 5} . Disse analyser er primært baseret på metoder til dyrkning af gær enten på faststof eller i flydende medier. På faste medier overfører koloni-pinningsassays et lille antal celler på fast agar med en pin, og gærceller får lov til at vokse i en bestemt tidsperiode. Kolonier afbildes derefter og deres størrelser sammenlignes ved et terminal endepunkt ⁶ . Disse kolonibestemmelsesanalyser har vist sig robuste og skalerbare til at generere genomsamlede skærme. For nylig er periodisk billeddannelse ved hjælp af fladskanningsscannere og kameraer med enkeltlinsrefleks (SLR) blevet indarbejdet i disse analyser for at registrere koloni-vækst over tid ^{7 , 8, 9} . Imidlertid forhindrer opløsningen af ​​disse indretninger dem fra at detektere enkeltceller, og disse koloni-pinning-analyser observerer således ikke direkte lagtid og kan ikke observere variation mellem de enkelte celler, der vokser ind i kolonier.

Væskebaserede vækstassays er også blevet anvendt til at udføre genomsamlede skærme ³ . Kobling af et væskevækstassay med tidsforskydningsmikroskopi afslørede populations heterogenitet i fordoblingstiden for genetisk identiske individuelle celler, hvilket giver et vigtigt perspektiv for forståelse af genetisk regulering og miljøtilpasning. Imidlertid måler dette assay ikke andre aspekter af vækst såsom forsinkelsestid og bæreevne ¹⁰ . Her præsenterer vi en metode til at karakterisere alle tre vækstfaser af kolonidannende mikroorganismer på fast medium ved hjælp af et assay, som vi betegner ODELAY ¹¹ . ODELAY består af utiliZing high-through time-lapse mikroskopi for at optage billeder af enkeltceller, der vokser ind i kolonier på fastmedier. Denne population af individuelle celler, der vokser ind i kolonier, afslører den underliggende befolknings heterogenitet, som ikke påvises af andre mindre følsomme målinger såsom terminal endepunktscoring. Vi demonstrerer metoden på gær, men ODELAY kan anvendes til enhver organisme, der viser kontrast i lysfeltmikroskopi.

Protocol

1. Fremstilling af agarosegelbestand

1. Afvej 2 g agarose med høj renhed.
2. Tilsæt agarosen til en 500 ml flaske og optag deres samlede masse.
3. Beregn målmassen af ​​flasken plus 2 g agarose med 150 g ultra rent vand, og tilsæt derefter 150 g ultra rent vand til inden for 0,1 g af denne målmasse.
4. Bemærk flaskenes masse plus agarosen og vandet.
5. Placer flasken i en mikrobølgeovn og sørg for at passe på flasken med en løst hætte på toppen for at minimere vandfordampningen, mens du opvarmer agarosen.
6. Mikrobølgen flasken i 15 - 20 s bursts efterfulgt af kort hvirvlende flasken for at blande agarose og vand. Gentag denne procedure, indtil opløsningen koger, og blandingen er homogen.
   FORSIGTIG: Pas på at undgå skoldende hud med damp, der kommer ud af flasken. Også flasken bliver varm, og passende beskyttelse, såsom en autoklaverhandske, er nødvendig for at undgå skade.
7. Når den smeltede agarose er homogen, vejes flasken igen og tilsæt ultralugt vand til inden for 0,1 g af den oprindelige masse. Dette vil erstatte vand, der er tabt på grund af fordampning.
8. Før den smeltede agarose størkner, hvirvles for at blande i det tilsatte vand for at sikre homogenitet.
9. Aliquot 15,2 g agarose i 9 - 50 ml plastrør.
10. Opvarm rørene, indtil det er nødvendigt.

2. Forberedelse af ODELAY Agarose Media

1. Opvarm 400 ml deioniseret vand for at koge i et overdækket bægerglas, på en kogeplade under forsigtig omrøring med en magnetisk omrørerstang.
2. Tilsæt 2 ml 10X medier ( f.eks . Gær Extract Pepton (YEP) eller Komplet Supplement Blanding (CSM)) til en 15,2 g agarose-alikvot i et 50 ml konisk rør fra trin 1.10.
   BEMÆRK: CSM-medium har tendens til at holde fast ved glasskinnerne. Hvis du bruger CSM-medieformuleringer, tilsættes 5 μl 50% wt polyethylenglycol (PEG) i sterilt vand til medieformuleringen. PEG'en forhindrer aGar fra at holde sig til glasskinnerne under skimmelfrigivelse og hæmmer ikke gærvækst.
3. Tilføj yderligere 100X næringsstoffer tilskud, hvis det er nødvendigt, og brug vand for at bringe det samlede tilsatte volumen fra dette trin til 1 ml.
4. Væg agarosalikoten med tilsatte medier og kosttilskud, før du placerer det 50 ml koniske rør i kogende vand fra trin 2.1.
5. Efter 16 minutter skal du tage 50 ml røret og homogenisere blandingen ved hjælp af en hvirvel. Hold hætten fast fast på det 50 ml koniske rør.
   BEMÆRK: Et låg på bægeret hjælper med at opvarme hele røret jævnt ellers vil en film af fast agarose danne og muligvis ikke smelte. Også i løbet af denne tid er det hensigtsmæssigt at samle agaroseformen ( figur 1 ).
6. Homogeniser blandingen ved hjælp af en hvirvel.
7. Kog i yderligere 2 minutter for at sikre, at alt agar blandes og smeltes.
8. Vægrør og udskift eventuel masse tabt med ultra rent sterilt vand.
9. Tilsæt 2 ml 10X kulsyreCe reagens ( fx 20% w / v glucose) og hvirvel til opnåelse af agarosemediumopløsning.
   BEMÆRK: Separation af glasskinner: Ved montering af støbeformen skal man sørge for at de lange afstandsstykker placeres i formen med korrekt orientering. Dette skyldes, at når laseren skærer akryl, har den tendens til at skære som en kegle, der forlader delen med lidt vinklede sider i stedet for nøjagtigt 90 ° sider. Så når formen er anbragt på benken for at frigøre glasset fra agar, skal afstanden af ​​afstanden være i en spids vinkel med agar. Den akutte vinkel hjælper med at komprimere agarets kant væk fra det øverste stykke glas, idet formkavens yderside er drejet om den nedre kant (se figur 1 ). Resultatet er en mere ensartet adskillelse af agar fra det øverste stykke glas.
   BEMÆRK: Mouldfrigøringsmidler, der påføres glas som olier, siliciumsprayer eller endda kommercielle vinduesbehandlinger, bør ikke anvendes, fordi de vil forurene s Agarets overflade og muligvis hæmmer væksten. Disse metoder tager en vis praksis at være konsistente.
10. Rengør fire 2 i x 3 i x 1 mm tykke glasskinner med 70% ethanol og tør med brug af tvungen luft.
11. Rengør akrylforme med 70% ethanol, tør og saml som vist i Figur 1 . Tag de tre bundstykker som vist, og monter dem så de to ens stykker sandwicher det tredje stykke ( Figur 1B ). Klip basisstykkerne på hver side ved hjælp af to små bindemiddelklip ( figur 1C ). Placer ophængene i formen, og sørg for, at laserskinnen er korrekt placeret ( Figur 1E ).
12. Placer det rensede og tørrede glasskinne på formen og hold det på plads, mens du sætter et andet glasskinne på den anden side. Klap forsamlingen med et større bindemiddelklips ( figur 1D ). Klip begge glider ned med større bindemiddelklip (Lass = "xfig"> Figur 1D). Sørg for, at det øvre bindemiddelklip er i kontakt med glasskiven overlappende med akryl.
13. Tilføj resterende bindemiddelklip. Igen skal du sørge for, at klemmerne kommer i kontakt med billedet, hvor det overlapper akrylet ( figur 1D ).
    BEMÆRK: Før du fylder den samlede form med smeltet agar, skal du sikre dig, at kanterne forsegles ved pipettering omkring 70 μl smeltet agarmedium langs formens indre side. Denne agar vil hurtigt størkne og forhindre eventuelle lækager.
14. Fyld støbeformen med smeltet agar, og sørg for at undgå fangstbobler i formen.
    BEMÆRK: Dette kan opnås ved langsomt pipettering af den smeltede agar langs formens kant. Efter det er fyldt, lad støbeformen afkøle i 40 minutter til 1 time ved ca. 23 ° C omgivende temperatur. Hvis det får lov til at afkøle for længe, ​​kan agaren bryde i formen.
    BEMÆRK: Skimmelseparation: Korrekt fjernelse af støbeformen fra støbt agar er afgørende for at sikre et ensartet faststofAgarpude til gærvækst. Manglende sikring af effektiv adskillelse af støbeformen ved dette trin vil forårsage vækstforskelle, som kan henføres til mangler i den faste agarpude. Øvelse af dette trin et par gange anbefales.
15. Start med at fjerne bundklipset. Fjern bunddelen af ​​formen, der består af de tre sandwichede stykker. Hold gliderne ved at komprimere dem og fjern derefter klæbestrimlerne. Sørg for ikke at støde støbeformens sider, mens du fjerner bindemiddelklip. Dette vil deformere medierne.
16. Placer formen på kanten af ​​bænkens top, så at formen af ​​formen med den blå prik vender opad og i nederste venstre hjørne ( Figur 1E ). Placer tommelfingrene under akryl og fingeren på toppen mod forkanten af ​​formen.
17. Skub langsomt og forsigtigt op med tommelfingeren mod formen, som om vi drejer formeafstanden omkring dens nederste kant ( figur 1F ). Påfør konstantMen langsomt stigende pres. Brugere vil se en pause og luftboble vises langs linjen, hvor det øverste glas dækker formeafstanden.
18. Efter at have set den første pause, fortsæt med at trykke op med tommelfinger og anvende konstant tryk. Agar skal begynde at bryde væk fra glasset på dette tidspunkt ( figur 1F ). Fortsæt med at dreje formen opad. Dette løfter glasset uden at glide det. En linje, hvor agaren skrælner væk fra glasset, bør fortsætte med at bevæge sig væk fra den oprindelige pause.
    BEMÆRK: På dette tidspunkt klæber agaret til både bunden og toppen af ​​glasset. Dette vil lejlighedsvis forekomme med venstre mest kant. Så længe området deformeres ikke er i det område, hvor gær er spottet, bør det være fint.
19. Da glasset kommer helt fri, tag det og fjern det helt fra formen. Fjern derefter det andet støbeformstykke med en lignende bevægelse for at løfte stykket frit uden at flytte agaret. Placer diasene i aSteril tip kasse med nogle sterile høj renhed vand i bunden. Luk boksen og opbevar ved 4 ° CO / N til brug næste dag. Hvis der opbevares længere, vil vækstraterne blive inkonsekvente.

3. ODELAY Culture Preparation

1. Lay ud stammer i en 96-brønds plade for O / N vækst.
2. Den næste dag fortyndes 20 μl overnightkultur i 200 μl medier for 220 μl total volumen i en ny plade.
3. Mål den optiske densitet ved 600 nm (OD600) af hver kultur i en pladelæser. Brug en pladelæser og en flydende håndteringsrobot, følg den automatiske fortyndingsprotokol i trin 3.3.1 - 3.3.6. Fortynd kulturen manuelt i pladen til ca. 0,1 OD600 (valgfri).
   1. På pladelæseren skal du trykke på "Eksperiment" under "Opret nyt". Vælg ODELAYDilution.exp og kør eksperimentet. Indtast eksperimentnavn som ODELAY "Dato" "Tid" "Eksperimentnavn" iteration.
   2. Klik på sTatistik fanen og derefter klikke på Excel ikonet. Gem dataene til et tavle og overfør det til en flydende håndteringsrobotcomputer.
   3. Åbn robotens layout og metode editor. Åbn metoden filen "ODELAYDilution_v1.med". Kør den eksekverbare "Convert_SynergyFiles.exe". Indtast 0,09 for mål OD600.
   4. Klik på "Glu Correction" og "Gal Correction" til 0.05. Mål blanke medier i en identisk plade. Klik på "Generer fil". Vælg filen i metode editoren. Klik på stoplysikonet for at starte metoden for at åbne runtimefortyndingsprogrammet.
   5. Sørg for, at rørene er uafskårne, og pladerne har låger fjernet og støvdæksler fjernes fra tip. Læg plader, rør og spidser på væskebehandlingsrobotens dæk, som angivet af dæklayoutet.
   6. Klik på "Afspil" knappen for at køre fortyndingsprogrammet. Vælg det korrekte antal 50 μL tips. Vælg det korrekte antal 300 μL tips. Vent på12 min for processen at løbe.
4. Tag fortyndingspladen fra roboten, dække spidserne og genindtag 15 ml medietør. Kultur pladen i 5-6 timer ved 30 ° C.
5. Ca. 1-2 timer før start af anden fortynding sørg for at tænde inkubationskamrene til mikroskopet. Lad dem ligestille ved ° C eller den temperatur, der kræves for eksperimentet.
6. Gentag fortyndingstrinene 3.3 - 3.4, men fortyndede kulturer til en OD600 på 0,01-0,02 for at spotte kulturerne på agaroseskinner.
7. Dæk fortyndingspladen med en metalfritætning.
8. Sonikér fortyndingspladen i et isbad i 30 s, hvor pladen flyder i isvand ved hjælp af en centrifugemetal-bucket til at holde pladen ( figur 2A ). Overfør de sonikerede kulturer fra fortyndingspladen til en flad bundplade. Etiket 4 x 96 brønds flade bundplader 1, 2, 3 og 4 ( figur 2B ).
   1. Overfør 150 &# 181; L af fortyndingspladen fra brøndene A01 - D06 i brøndene C04 - F09 af pladen mærket 1. Derefter overføres 150 μl af fortyndingspladen fra brøndene A07 - D12 til brøndene C04 - F09 af pladen mærket 2. Derefter overføres 150 μl Af fortyndingspladen fra brøndene E01 - H06 til brøndene C04 - F09 af pladen mærket 3. Tilslut 150 μL fortyndingspladen fra brøndene E07 - H12 til brøndene C04 - F09 af pladen mærket 4.
9. Gå videre til trin 4, Spotting on Agar.

4. Spotting på agar ved hjælp af en automatiseret væskespotting robot

1. Fjern agaroseskinnerne gemt ved 4 ° C / N (fra trin 2.19) fra deres befugtede sterile pipettekasser.
2. Om nødvendigt skal du trimme hjørnerne af agarosemediet med et rent knivblad for at sikre, at de passer på glidekammeret.
3. Tag glideklemmen ud af foden. Placér agarpladen forsigtigt i det forsænkede område af scenekammeret.
   BEMÆRK: Sørg for, at ellerIentation af diaset er konsistent fra eksperiment til eksperiment.
4. Kontroller, at klemmen er flush med bunden af ​​kammeret. Hvis det er skævt, er det muligvis ikke helt at sætte billedet i det forsænkede område. Placer nivelleringsafstanden i spottrobotens midterpladeposition. Denne afstandsstykke giver kontakt til nivelleringsskruerne, således at glidekammeret kan udjævnes med spidserne.
5. Placer pladerne på bordet i rækkefølge af deres kvadrant. Plader 1, 2, 3 og 4 bestilt fra venstre mod højre ( figur 2B ).
6. Udsæt spidserne, så de indre 24 brønde C04 - F09 er optaget med tips i 4 tomme spidsbokse. En femte boks skal have et tip i C10-positionen samt 4 tips med deres ender afskåret i A01, A12, H01 og H12 positionerne. Disse 4 afskårne spidser giver stabilitet til spidspladen ( figur 2C og 2D ).
7. Fjern topdækslet fra slIde kammer mount.
8. Placer den første tipstans i startstedet for robotstyringsspottingsprogrammet. Dette bør slå et hul i agarosen, som senere vil blive brugt til at tilpasse oprindelseskoordinaten. Placér plade 1 på den flydende håndteringsrobot for at se den første kvadrant. Sørg for, at låget er fjernet, og fortsæt spotteprogrammet.
9. Kontroller, at alle pletter er til stede. Vent også ~ 30 s for at de skal tørre. Når pletterne er omkring 1 mm i diameter, kan programmet fortsætte. Tøm de brugte tips i biohazardbeholderen, og læg nye tips på robotten. Skift plade 1 til ^2. kvadrantplade.
10. Gentag for den tredje kvadrant. Og gentag igen for den fjerde kvadrant.
11. Når pletterne er tørre, skal du udskifte glidekammerdækslet og flippe apparatet over.
12. Installer slangeforbindelserne med et luftfilter.
13. Placer et glasskinne på oversiden af ​​kammeret.
    BEMÆRK: Dette dias er afgørende for reduktionNg varmevæsken til agar og minimerer dannelsen af ​​kondensering på kammerets objektive dækningsside. Glem ikke dette dækslip. Afhængigt af mikroskopkonfigurationen forhindrer dette dækslip opvarmning fra belysningssiden fra at forårsage kondens på objektivsiden.
14. Placer en ventilator for at blæse varm luft på kammerets objektive side. Denne ventilator forhindrer dannelse af kondens på dækslet. Indstil luftstrømningshastigheden gennem bobleren til 10 ml / min.

5. Kører ODELAY på mikroskop

1. Kør scriptet "ODELAY_Microscope_Control.m".
2. Klik på "Shutter" for at åbne den overførte lyslukker og derefter "Focus" -knappen for at starte høj kamerahastigheden ( Figur 3A , Røde pile).
3. Klik på "Gå Oprindelse" og flyt scenen for at finde oprindelsesmærket, der blev stanset i agar.
4. Kør så lidt til højre tilFokus på gærceller spottet i område E07.
5. Flyt tilbage til oprindelsesstemplet og centrer det i synsfeltet.
6. Indstil oprindelsen til denne værdi ved at trykke på knappen "Set" ( Figur 3A , Blue Arrows). Flyt nu til position H18 og fokus med hexskruen tættest på den pågældende placering. Flyt derefter til position L07 og fokus med hexskruen tættest på den pågældende placering. Flyt derefter til position E07 og fokus med hexskruen nærmest den pågældende placering.
7. Gentag trin 5.5 - 5.7 efter behov, indtil disse positioner forbliver i fokus.
8. Kontroller fokuset i midten og på kanterne på punkterne E12, H12, L12. Juster autofokusområdet, hvis fokus Z-værdierne, som angivet ved Z-værdien, er større end ± autofokusområdet ( f.eks . Indstil autofokusområdet til 60 μm Z-værdien for et midtpunkt, der er større end ± 40 μm).
9. Tryk på reset-knappen, da dette vil aktivere knappegenskaberne, og tryk derefter påODELAY ( figur 3A , grønne pile). Vælg mappen for at gemme dataene. Sørg for, at der er nok ledig plads.
   BEMÆRK: Mikroskopet indsamler data i 48 timer, eller indtil programmet er lukket.

6. Behandling af ODELAY-data

1. Åbn ODELAY_IPT.exe eller brug scriptet ODELAY_Image_Processing_Tool_v7.m script ( Figur 3C ).
2. Forbered et * ODELAYExpDisc.xlsx Excel-regneark.
3. Navngiv eksperimentet i celle B1.
4. Vælg billedkataloget, hvor billedfilerne E07 - H18 er gemt.
5. Vælg datakataloget, hvor data vil blive skrevet.
6. Skriv den dato, hvor eksperimentet blev startet i celle B04. Brug formatet MM / DD / ÅÅÅÅ.
7. Skriv fortyndingstiden i celle C04. Denne gang er ca. fem minutter før det første billede er samlet. Brug formatet HH: MMpm hvor HH er for h og MM er for min.
8. Tilføj i stammenavn efter tO kildeplade (trin 3.1). På grund af den måde, spændinger ses på, omlejres de på ODELAY-agaroseskinnen. Celler i regnearket B31-B126 er kildepladen, mens cellerne C31 - C126 er spotplaceringerne i ODELAY-agarpladen.
9. Tryk derefter på "Process Data" -knappen og vælg den * ODELAYExpDisc.xlsx, der netop var forberedt.
10. Vent 16-24 timer afhængigt af computersystemet, der bruges til at behandle data.
11. Når billederne behandles, vises en mappe med navnet "ODELAY Well Data" og en fil "* _Index_ODELAYData.mat". Tryk på "Load Data" knappen og vælg filen "* _Index_ODELAYData.mat", der netop blev genereret. Dette vil indlæse datasættet, der netop blev behandlet. "*" I filnavnet bliver angivet i henhold til eksperimentnavnet, der er indtastet i Excel-regnearket.
12. Efter at have læst dataene skal du kontrollere det ved hjælp af tidslinjen, der findes over bunden, og klik på et billedfelt for at se vækstkurver fEller det pågældende sted eller find en interesse af listen i venstre side og derefter indlæse billederne for den pågældende liste.
13. Generer histogrammer af befolkningsvækstparametre ved at trykke på "Violin Plot" knappen. Dette vil generere et plot vist i figur 4 eller figur 6 .

Representative Results

Eksempelbilleder af gærvækst ved tidsforskydningsmikroskopi er vist i figur 3B . Efter behandling af time-lapse-billederne vises et repræsentativt datasæt, der sammenligner gærstammer BY4741 & BY4742, i figur 4 . I dette eksempeldatasæt er der meget lidt variation i fordoblingstiden mellem forskellige positioner på pladen. Hvis agarosemediet fremstilles dårligt, ville en åbenbar afvigelse i både fordoblingstid og forsinkelsestid være tydelig i de spotpositioner, der falder sammen med den deformerede region af agarosegelen. Mens fordoblingstider synes at være forholdsvis ensartede, viser dette eksempel variationer i lagtidsmålinger. Et mere konsistent datasæt er vist i figur 6 . I dette datasæt er både lagretid og fordoblingstid ensartet.

Filer / ftp_upload / 55879 / 55879fig1.jpg "/>
Figur 1: Agar Mold Assembly.
Agarformens komponenter er vist i ( A ). Monter bunden som vist i ( B ), og klem derefter bunden med små binderklip. Placer de længere oprejste stykker i hulrummet på bunden ( C ), og lej derefter gliderne til formen som vist i ( D ). Et sidebillede, der viser formens vinkel og orientering af støbeformen, der er nødvendig for ensartet adskillelse af agar fra glasskinnen ( E ). Bemærk positionen af ​​tommelfingeren og forefingerne, samt den lige linje af agar, der adskiller sig fra lysbilledet ( F ), og noter den vandrette pil. Adskillelseslinien skal bevæge sig jævnt væk i retning af de lodrette pile. Klik her for at se en større version af denne figur.

= "Jove_content" fo: keep-together.within-page = "1">
Figur 2: Sonikering og spottemetode.
Sonikér pladen i isvand og brug en centrifugebufferholder til at understøtte pladen ( A ). Læg pladerne fra trin 3.8.1 ud for spottet på agarosepladen ( B ). Ordne også tipene, så venstre tippeboks har et spids i position C10 og derefter fire andre spidser med deres ender afskåret, så de ikke kolliderer tallerkenholderen ( C ). Placer de resterende tips i fire kasser, så de indvendige 24 tips er optaget ( D ). Klik her for at se en større version af denne figur.

55879fig3.jpg "/>
Figur 3: ODELAY grafisk brugergrænseflade.
Et skærmbillede af det grafiske brugergrænseflade til "ODELAY_Microscopecontrol.m" ( A ). Denne grænseflader tillader overvågning af kameraet og til justering af indstillingerne for mikroskopbelysning til epifluorescerende og lyse felttilstande. Røde pile peger på knapperne Focus and Transmitted, der aktiverer kameraet for at hente billeder hurtigt og åbne den overførte lyslukker henholdsvis. Blåpile bruges til at flytte scenen for oprindelsen og derefter indstille oprindelsen med knappen "Start" og "Set" knappen. Grønne pile peger på "Reset" og "ODELAY !!!" Knapper, der nulstiller ODELAY-billedtilstande til de aktuelle forhold og initierer ODELAY-billedsamling. Time-lapse billeder af gær vokser på fast medium ved 0, 3, 6 og 9 timer efter spotting ( B ). Et skærmbillede af det grafiske brugergrænseflade til "ODELAY_IPT.m" eller th E ODELAY billedbehandlingsværktøj ( C ). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4: Eksempel ODELAY Output.
Dette datasæt sammenligner stammer BY4741 og BY4742 på YPD-medier. Denne figur er et eksempel på en velforberedt agarose dias; Autofokusindstillingerne er dog ikke optimale. De data, der præsenteres i hver kolonne, fra venstre til højre, er: bæreevne i log ₂ i koloniområdet; Fordoblingstid, givet i min; Og forsinkelsestid, givet i min. I dette eksempel styres fordoblingstiderne for alle pletter på agarrullen godt med en lille smule forøget fordoblingstid mod søjlen. Lagringstider varierer imidlertid betydeligt i dette datasæt._upload / 55879 / 55879fig4large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 5: Vækstkurveeksempler.
Dette eksempel viser, hvordan dårlig startfokus kan medføre, at den estimerede lagretid (t- _lag ) øges ( A ), mens den tilstødende position viser en kortere forsinkelsestid ( B ). T _d er fordoblingstiden i min, og t _lag er lagretiden i min. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 6: Eksempel på veldrevet testeksperiment.
En eEksempel på BY4742-stammen testet efter udskiftning af en wolframhalogenlampe med en diodbelysning og sikring af autofokus er indstillet korrekt. Alle fordoblingstider synes at overlappe godt, og lagringstiderne synes at være konsistente. Klik her for at se en større version af denne figur.

Discussion

ODELAY-analysen har flere kritiske punkter for at sikre reproducerbare og pålidelige fænotypiske målinger. Det første kritiske punkt er konsistent fremstilling af gærkulturer. Der skal udvises forsigtighed for at høste gærcellerne fra logaritmisk vækst. Hvis kulturerne er mættede, vil deres befolknings heterogenitet blive forøget, hvilket kan forvirre heterogenitet forårsaget af genetiske eller miljømæssige ( fx carbonkilde) faktorer ¹¹ . Det andet kritiske punkt er konsekvent forberedelse af medierne. Generelt skal der genereres et stort volumen på 10X stockmedieopløsning og derefter anvendes over tid for at minimere batcheffekter. Formulering af medier efter vægt, når det er muligt, hjælper med at forbedre konsistensen af ​​mediet over tid ved at sikre agarets densitet, og agarosens samlede vandindhold kan overvåges nøje. Det tredje kritiske punkt indebærer minimering eller eliminering af enhver mekanisk deformation af agarosen migdia. Mekanisk deformation af mediet vil oftest forekomme under adskillelse af agarosen fra glasskinnerne. Som med mange laboratorieteknikker er det nødvendigt at praktisere dette trin.

Variation i forsinkelsestid som afbildet i figur 4 er ofte relateret til en af ​​de tre faktorer: mekanisk deformation af agarosemediet, variation i den formede agartykkelse eller en ustabil lyskilde. Hvis agarosemediet varierer i Z-højde over det plettede array, kan højdevariationen overvælde autofokusrutinen, hvilket medfører, at de indledende billeder er lidt ude af fokus. Af denne grund skal du kontrollere fokushøjden på flere steder i midten og langs kanterne af det plettede array for at sikre, at autofokusrutinen har tilstrækkelig Z-rækkevidde til at finde fokus. Hvis det er nødvendigt, skal du bruge autofokuspanelet til at øge fokusområdet og øge antallet af fokuseringstrin.

En tredje mulig betingelseIon, der kan føre til dårlig fokus er en ustabil eller flimrende lyskilde, som kan forstyrre den beregnede fokus score for en bestemt Z-højde. Tungsten halogenpærer har tendens til at flimre godt, før pærerne brænder ud. Effekten af ​​dårlig fokus er observeret i et eksempel, hvor vækstkurverne dyppes mellem de første og anden tidspunkter ( Figur 5 A ), mens det tilstødende punkt ikke har samme dip ( Figur 5 B ). I dette tilfælde blev den fattige fokustilstand lindret ved at erstatte wolfram halogen lyskilden.

I praksis har forfatterne fundet, at pærerne skal udskiftes hver 500 h eller groft hver anden måned, når mikroskoperne er i kraftig brug, for at reducere flimmeren af ​​100 W wolfram halogenpærer. For at undgå dårlige fokusproblemer fra en flimrende pære, skal du ofte udskifte wolfram halogen lyskilden eller udskifte halogenpæren med en diode lyskilde. enEksempel på et datasæt, som viser lav variation i fordoblingstider samt mere ensartede forsinkelsestider, er vist i figur 6 . Dette datasæt blev taget med en diode illuminator, som giver en mere stabil belysning over tid, mens autofokus udføres.

Mens mange af de punkter, der er nævnt her for at optimere medieforberedelse, synes at være indlysende, lægger de fleste storskalaer i litteraturen sig ikke godt sammen med hinanden ^{8 , 11} . Derfor har vi omhyggeligt beskrevet fremstillingen af ​​kulturer og agarosemedier, således at der kan genereres mere reproducerbare fænotypiske skærme.

ODELAY-assayet er for tiden begrænset i gennemstrømning sammenlignet med pinningbaserede assays, såsom syntetiske genetiske arrays eller Scan-O-Matic-analysen. Mens disse metoder øger antallet af stammer, der måles, mangler de en evne til at løse individuelle celler aNd kan således ikke måle befolknings heterogenitet, som vi observerer inden for klonholdige gærstammer. Oprindelsen af ​​denne population heterogenitet forstås ikke i øjeblikket, men sammenlægningen af ​​teknologi og beregning som vist her giver mulighed for objektivt at adressere de underliggende cellulære mekanismer ¹² .

Forfatterne ønsker at bemærke, at ODELAY i øjeblikket kun er optimeret til et bestemt mikroskopmærke og kropstype. Ændring af ODELAY for andre mikroskopsystemer er lige fremad, men vil kræve viden om open source API ¹³ . Men både API'en og ODELAY-scriptene er skrevet for let at tilpasse til forskellige systemer og eksperimentelle analyser.

Mens ODELAY oprindeligt var udviklet til gær, har vi kunnet udnytte den uden modifikation for at observere væksten af Mycobacterium smegmatis . Observation af de andre kolonidannende mikroorganismer erMuligt med ændringer til kildekoden, der er angivet ¹¹ . Generelt er ODELAY et kraftfuldt og fleksibelt værktøj til sammenligning af mikroorganismer dyrket under forskellige miljømæssige forhold og genetiske forstyrrelser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose UltraPure	ThermoFisher	16500500	Gel Temp 36C, Gel Strength (1%) 1.2 g/sq cm
Yeast Extract Peptone (YEP)	Fisher Scientific	BP1422-2
Complete Suplement Mixture (CSM)	Fisher Scientific	MP114560222
Polyethylene Glycol 3350 (av. mol. wt. 3000-3700)	SigmaAldrich	P2906
Yeast Strain BY4741	ThermoFisher	95400.BY4741
Yeast Strain BY4742	ThermoFisher	95400.BY4742
50 mL Falcon tubes	Corning	430291	1 case
15 mL Falcon tubes	Corning	352096
2 x 3 inch 1.0 mm thick slides 1/2 gross	VWR	48382-179
96-well plate flat bottom	Corning	353072
Hydra liquid handleing robot	Thermo	1096-DT-100
Hamilton Microlab Star Liquid Handleing Robot	Hamilton
hydra 100 mL tips Extended Length DARTS	Thermo	5527
Synergy H4 Plate Reader	Biotek	H4MLFAD
Leica DMI6000 B Microscope	Leica
Leica 10X/0.3NA objective	Leica	11506289
Hamamatsu ORCA Flash 4.0 Camera	Hamamatsu	C11440-22CU
MATLAB with image processing tool box	Mathworks
MicroManager	Open Imaging		https://micro-manager.org/
ODELAY Microscope Control (MATLAB scripts and GUI)			www.aitchisonlab.com\ODELAY for Matlab scripts and software
ODELAY Microscope Chamber			www.aitchisonlab.com\ODELAY for Mechanincal Drawings
ODELAY Agar Molds			www.aitchisonlab.com\ODELAY for mold drawings