ODELAY: Metodo su vasta scala per la quantificazione multiparametrica della crescita del lievito

Summary

Presentiamo un metodo per quantificare i fenotipi di crescita delle singole cellule di lieviti in quanto crescono in colonie su supporti solidi utilizzando la microscopia a tempo scaduto denominata "Valutazione doppia di una sola cellula vivente di lievito" (ODELAY). L'eterogeneità delle popolazioni di cellule geneticamente identiche in colonie può essere direttamente osservata e quantificata.

Abstract

I fenotipi di crescita dei microrganismi sono un indicatore forte della loro forma genetica sottostante e possono essere segregati in 3 regimi di crescita: fase a fase di fase, fase log-fase e fase stazionaria. Ogni fase di crescita può rivelare diversi aspetti della forma fisica che sono legati a varie condizioni ambientali e genetiche. Le misurazioni ad alta risoluzione e quantitativa di tutte e tre le fasi di crescita sono generalmente difficili da ottenere. Qui presentiamo un metodo dettagliato per caratterizzare tutte le tre fasi di crescita su supporti solidi usando un saggio chiamato Valutazione delle matrici viventi di lieviti (ODELAY) di una sola cellula. ODELAY ha quantificato i fenotipi di crescita di singole cellule che crescono in colonie su supporti solidi utilizzando microscopia a tempo trascorso. Questo metodo può osservare direttamente l'eterogeneità della popolazione con ogni parametro di crescita in cellule geneticamente identiche che crescono in colonie. Questa eterogeneità della popolazione offre una prospettiva unica per comprendere la regolazione genetica e epigenetica, e le risposte aPerturbazioni genetiche e ambientali. Mentre il metodo ODELAY è dimostrato utilizzando il lievito, può essere utilizzato su qualsiasi microrganismo che produce la colonia che è visibile dalla microscopia a campo luminoso.

Introduction

I fenotipi di crescita dei microrganismi sono un forte indicatore della loro forma genetica sottostante a una determinata condizione ambientale. La crescita è classicamente segregata in 3 diversi regimi di crescita: la fase a ritardo, la fase log-fase e la fase stazionaria ¹ . Ogni fase di crescita può rivelare diversi aspetti della forma fisica che dipendono da varie condizioni ambientali e genetiche. Ad esempio, il tempo di ritardo o la lunghezza di tempo che un organismo trascorre in fase di ritardo prima dell'inizio della crescita esponenziale può essere indicativo della capacità di un organismo di rispondere alle condizioni ambientali alterate ² . Il tempo di raddoppiamento durante la fase di fase log-phase, la metrica più comune di idoneità cellulare, rivela l'efficienza complessiva dell'abilità di un organismo di dividere metabolizzando e utilizzando materiali ambientali per la replica. La fase stazionaria, in cui la crescita dopo la fase log-fase è rapidamente ridotta, è un altro indicatore di idoneità, che è regolareUtilizzata come punto finale di crescita nei test di crescita del lievito a base di spot.

Sono attualmente disponibili diversi test di crescita del lievito e considerati metodi standard per la valutazione dei fenotipi di crescita nel lievito ^{3 , 4 , 5} . Questi dosaggi sono basati principalmente sui metodi per la coltivazione di lieviti sia su supporti solidi che liquidi. Sui supporti solidi, i test di colonizzazione della colonia trasferiscono un piccolo numero di cellule su agar solido con un perno e le cellule di lievito sono lasciate crescere per un determinato periodo di tempo. Le colonie vengono poi visualizzate e le loro dimensioni vengono confrontate ad un terminale terminale ⁶ . Questi test di colonizzazione della colonia sono stati dimostrati robusti e scalabili per generare schermi di genoma. Più recentemente, in questi saggi sono state incorporate immagini periodiche con scanner a piatto e telecamere a riflessione a lenti singole (SLR) per registrare la crescita della colonia nel tempo ^{7 , 8, 9} . Tuttavia, la risoluzione di questi dispositivi impedisce loro di individuare singole celle e, di conseguenza, questi dosaggi della colonia non osservano direttamente il ritardo e non possono osservare variazioni tra le singole cellule che crescono in colonie.

I test di crescita a base liquida sono stati impiegati anche per eseguire schermi a livello genomico ³ . Accoppiare un test di crescita liquido con la microscopia a tempo trascorso ha rivelato l'eterogeneità della popolazione nel tempo di raddoppiamento delle cellule geneticamente identiche, che offre una prospettiva importante per comprendere la regolazione genetica e l'adattamento ambientale. Tuttavia, questo dosaggio non misura altri aspetti della crescita, come il tempo di ritardo e la capacità di trasporto ¹⁰ . Qui presentiamo un metodo per caratterizzare tutte le tre fasi di crescita dei microrganismi che formano la colonia su supporti solidi usando un saggio di cui abbiamo termine ODELAY ¹¹ . ODELAY consiste di utiliZing la microscopia ad alta velocità di throughput per registrare le immagini delle cellule singole che crescono in colonie su supporti solidi. Questa popolazione di singole cellule che crescono in colonie rivela l'eterogeneità della popolazione che non è rilevata da altre misurazioni meno sensibili come il punteggio finale di terminale. Noi dimostriamo il metodo sul lievito, ma ODELAY può essere applicato a qualsiasi organismo che mostra il contrasto in microscopia a campo luminoso.

Protocol

1. Preparazione dello stock di gel agarosio

1. Pesare 2 g di agarosio ad alta purezza.
2. Aggiungere l'agarosio ad una bottiglia da 500 ml e registrare la loro massa combinata.
3. Calcolare la massa target della bottiglia più 2 g di agarosio con 150 g di acqua ultra-pura, quindi aggiungere 150 g di acqua ultra-pura entro 0,1 g di questa massa target.
4. Si noti la massa della bottiglia più l'agarosio e l'acqua.
5. Mettere la bottiglia in un forno a microonde e assicurarsi di montare la bottiglia con un cappuccio allentato in cima per ridurre al minimo l'evaporazione dell'acqua durante il riscaldamento dell'agarosio.
6. Microonde la bottiglia in 15-20 minuti di esplosioni seguita da brevemente avvolgendo la bottiglia per mescolare l'agarosio e l'acqua. Ripetere questa procedura fino a quando la soluzione non è bollente e la miscela è omogenea.
   ATTENZIONE: Fare attenzione a non scaldare la pelle con vapore che esce dalla bottiglia. Inoltre, la bottiglia diventa calda al tocco e per evitare lesioni è necessaria una protezione adeguata, ad esempio un guanto di autoclave.
7. Dopo che l'agarosio fuso è omogeneo, pesare nuovamente la bottiglia e aggiungere acqua ultrapure entro 0,1 g della massa originale. Ciò sostituirà qualsiasi acqua persa dovuta all'evaporazione.
8. Prima che l'agarosio fuso si solidifichi, ruotare per mescolare nell'acqua aggiunta per garantire l'omogeneità.
9. Aliquota 15,2 g di agarosio in tubi di plastica da 9 a 50 ml.
10. Frigorifero i tubi fino a quando necessario.

2. Preparazione di ODELAY Agarose Media

1. Riscaldare 400 ml di acqua deionizzata per bollire in un bicchiere coperto, su una piastra riscaldante sotto agitazione leggera con una barra magnetica di stirata.
2. Aggiungere 2 ml di media 10X ( es ., Peptone estratto di lievito (YEP) o Miscela completa di integrazione (CSM)) ad una aliquota di agarosio da 15,2 g in un tubo conico da 50 ml di fase 1.10.
   NOTA: il mezzo CSM tende a attaccarsi alle vetrate. Se si utilizzano formulazioni di supporto CSM, aggiungere 5 μl di polietilenglicole (PEG) al 50% in polvere in acqua sterile alla formulazione media. Il PEG impedisce l'aDa attaccarsi alle vetrate durante la rilascio dello stampo e non inibisce la crescita del lievito.
3. Se necessario, aggiungere ulteriori supplementi nutrizionali 100X e utilizzare acqua per portare il volume totale aggiunto da questo punto a 1 ml.
4. Pesare l'aliquota di agarosio con supporti e integratori aggiunti prima di mettere il tubo conico da 50 ml in acqua bollente dalla fase 2.1.
5. Dopo 16 minuti, estrarre il tubo da 50 ml e omogeneizzare la miscela usando un vortice. Tenere il tappo stretto sul tubo conico da 50 ml.
   NOTA: Un coperchio sul bicchiere contribuisce a riscaldare uniformemente l'intero tubo altrimenti un film di agarosio solido si forma e forse non si scioglie. Anche durante questo periodo, è conveniente montare lo stampo agarosio ( Figura 1 ).
6. Homogenizzare la miscela usando un vortice.
7. Far bollire per altri 2 minuti per assicurare che tutto agar sia mescolato e fuso.
8. Pesare il tubo e sostituire qualsiasi massa persa con acqua ultra-pura sterile.
9. Aggiungere 2 ml di acido carbonico 10XCe (per esempio , 20% in peso di glucosio) e vortex per ottenere una soluzione di agarosio.
   NOTA: Separazione delle vetrini in vetro: durante l'assemblaggio dello stampo, occorre prestare attenzione affinché i distanziatori lunghi siano posizionati nello stampo con l'orientamento corretto. Questo perchè quando il laser taglia l'acrilico, tende a tagliare come un cono lasciando la parte con i lati leggermente angolati anziché esattamente 90 °. Allora quando lo stampo è posto sul bancone per liberare il vetro dall'agar, il bordo del distanziatore dovrebbe essere ad angolo acuto con l'agar. L'angolo acuto contribuisce a comprimere il bordo dell'agar lontano dalla parte superiore del vetro poiché il bordo esterno del distanziale dello stampo è ruotato intorno al bordo inferiore (vedi figura 1 ). Il risultato è una separazione più consistente dell'agar dalla parte superiore del vetro.
   NOTA: Gli agenti di rilascio della muffa applicati agli oli di vetro, gli spruzzi di silicio o anche i trattamenti per vetri commerciali non devono essere usati perché contaminano Dell'agar e possibilmente inibire la crescita. Questi metodi richiedono una certa pratica per essere coerenti.
10. Pulite quattro vetrini in vetro x 2 mm x 3 in x 1 mm con etanolo al 70% e asciugate con aria forzata.
11. Stampi acrilici puliti con etanolo del 70%, secco e assemblare come mostrato in figura 1 . Prendete i tre pezzi inferiori, come mostrato, e montateli in modo che i due pezzi identici tagliassino il terzo pezzo ( figura 1B ). Bloccare i pezzi di base su ciascun lato utilizzando due piccoli clip leganti ( figura 1C ). Posizionare i montanti nello stampo assicurandosi che il cerchio laser sia posizionato correttamente ( Figura 1E ).
12. Posizionare la lastra di vetro pulita e asciutta sullo stampo e tenerla in posizione mentre metta una seconda scivolata di vetro dall'altro lato. Bloccare l'assieme con un più grande clip legante ( figura 1D ). Mantenere entrambe le diapositive con clip di legante più grandi (Lass = "xfig"> Figura 1D). Assicurarsi che il clip di legante superiore sia a contatto con la lastra di vetro che si sovrappone con l'acrilico.
13. Aggiungere le clip rimanenti. Ancora una volta, assicurarsi che i morsetti contattino la diapositiva in cui si sovrapponga l'acrilico ( figura 1D ).
    NOTA: Prima di riempire lo stampo assemblato con agar fuso, assicurarsi che i bordi siano sigillati pipettando circa 70 μL di agar agasto fuso lungo il lato interno dello stampo. Questo agaro si solidificherà rapidamente e impedisce eventuali perdite.
14. Riempire lo stampo con agar fuso, accertandosi di evitare di intrappolare bolle d'aria nello stampo.
    NOTA: Ciò può essere effettuato lentamente pipettando l'agar fuso lungo il bordo dello stampo. Una volta riempito, lasciare raffreddare lo stampo per 40 minuti a 1 h a temperatura ambiente circa 23 ° C. Se lasciato raffreddare troppo a lungo l'agar può rompersi nello stampo.
    NOTA: Separazione della muffa: Una corretta rimozione dello stampo dall'agar cast è indispensabile per garantire un solido uniformeAgar pad per la crescita del lievito. La mancata garanzia di una separazione efficace dello stampo a questo punto determinerà differenze di crescita che sono imputabili a imperfezioni nel solido agar pad. Praticare questo passaggio è consigliato alcune volte.
15. Inizia rimuovendo il clip legante inferiore. Rimuovere la parte inferiore dello stampo che consiste dei tre pezzi intagliati. Tenere le diapositive premendo i pezzi e rimuovendo i fermagli. Assicurarsi di non imbrogliare i lati dello stampo mentre rimuove i fermi leganti. Questo deformerà i supporti.
16. Posizionare lo stampo sul bordo del banco in modo che il lato dello stampo con il puntino blu sia rivolto verso l'alto e nell'angolo inferiore sinistro ( Figura 1E ). Posizionare i pollici sotto l'acrilico e il primo dito in alto verso il bordo interno dello stampo.
17. Spingere lentamente e accuratamente con il pollice contro lo stampo, come per il movimento del distanziale dello stampo attorno al bordo inferiore ( Figura 1F ). Applica costanteMa lentamente aumentando la pressione. Gli utenti vedranno una pausa e una bolla d'aria appaiono lungo la linea in cui il vetro superiore copre il distanziatore dello stampo.
18. Dopo aver visto la linea di rottura iniziale, continuare a spingere con i pollici e applicare pressione costante. L'agar dovrebbe iniziare a rompersi dal vetro a questo punto ( Figura 1F ). Continuare a ruotare lo stampo verso l'alto. Questo solleva il vetro senza scivolare. Una linea in cui l'agar sta sbucciando dal vetro dovrebbe continuare a allontanarsi dalla linea di rottura iniziale.
    NOTA: A questo punto, l'agar si attacca sia al fondo che alla parte superiore del bicchiere. Ciò si verifica occasionalmente con il bordo più sinistro. Finché l'area deformata non è nell'area in cui il lievito viene macchiato, questo dovrebbe andar bene.
19. Quando il vetro viene completamente libero, afferra e toglierlo completamente dalla muffa. Quindi rimuovere l'altro pezzo di stampo utilizzando un movimento simile per sollevare il pezzo libero senza spostare l'agar. Posizionare le diapositive in aSterile scatola di punta con qualche sterile acqua di alta purezza nel fondo. Chiudere la scatola e conservare a 4 ° CO / N per l'utilizzo il giorno successivo. Se memorizzati per più tempo, i tassi di crescita diventeranno incoerenti.

3. Preparazione della cultura ODELAY

1. Disporre i ceppi in una piastra da 96 pozzetti per la crescita di O / N.
2. Il giorno dopo, diluire 20 μL di coltura durante la notte in 200 μL di media per 220 μL di volume totale in una nuova piastra.
3. Misurare la densità ottica a 600 nm (OD600) di ogni coltura in un lettore di piastre. Utilizzando un lettore di piastre e un robot di movimentazione del liquido, seguire il protocollo di diluizione automatico dei passaggi 3.3.1 - 3.3.6. Diluire manualmente le colture nella piastra a circa 0,1 OD600 (opzionale).
   1. Sul lettore di piastra, premi "Esperimento" sotto "crea nuovi". Scegli ODELAYDilution.exp e fai funzionare l'esperimento. Inserisci il nome dell'esperimento come ODELAY "Itinerario" Nome "Esperimento" "Ora" "Ora".
   2. Fare clic su sScheda tattica e quindi fare clic sull'icona di Excel. Salvare i dati su un'unità a pollice e trasferirla in un computer robot robot.
   3. Aprire il Layout di Robot e il metodo Editor. Aprire il file Metodo "ODELAYDilution_v1.med". Eseguire l'eseguibile "Convert_SynergyFiles.exe". Immettere 0.09 per il target OD600.
   4. Fare clic su "Glu Correction" e "Gal Correction" a 0,05. Misurare i supporti vuoti in una targhetta identica. Fai clic su "Genera file". Selezionare il file nell'editor di metodo. Fare clic sull'icona Stoplight per avviare il metodo per aprire il programma di diluizione di runtime.
   5. Assicurarsi che i tubi siano scollegati e le piastre hanno i coperchi rimossi e le coperture di polvere siano rimosse da punte. Caricare le piastre, i tubi e le punte sul ponte del robot di movimentazione del liquido, come indicato dal layout del ponte.
   6. Fare clic sul pulsante "Riproduci" per eseguire il programma di diluizione. Selezionare il numero corretto di 50 μL consigli. Selezionare il numero corretto di 300 μL consigli. Aspetta12 min per il processo da eseguire.
4. Prendete la piastra di diluizione dal robot, coprite le punte e raccogliete i tubi di media da 15 ml. Coltivare la piastra per 5 - 6 h a 30 ° C.
5. Circa 1 - 2 ore prima di iniziare la seconda diluizione assicurarsi di accendere le camere di incubazione per il microscopio. Lasciarli equilibrare a ° C o la temperatura richiesta per l'esperimento.
6. Ripetere le fasi di diluizione 3.3 - 3.4, ma diluire le culture ad un OD600 di 0.01 - 0.02 per individuare le culture su diapositive agarose.
7. Coprire la piastra di diluizione con una guarnizione di congelatore metallico.
8. Sonicare la piastra di diluizione in un bagno di ghiaccio per 30 secondi con la piastra galleggiante in acqua ghiacciata usando una benna di metallo centrifuga per tenere la piastra ( Figura 2A ). Trasferire le colture soniche dalla piastra di diluizione a una piastra di fondo piatta. Etichetta 4 piatti a fondo piatto da 96 pozzetti 1, 2, 3 e 4 ( figura 2B ).
   1. Trasferimento 150 &# 181; L della piastra di diluizione dai pozzetti A01-D06 nei pozzetti C04-F09 della piastra etichettata 1. Quindi trasferire 150 μL della piastra di diluizione dai pozzi A07-D12 nei pozzetti C04-F09 della piastra etichettata 2. Quindi trasferire 150 μL Della piastra di diluizione dai pozzetti E01 - H06 nei pozzetti C04 - F09 della lastra etichettata 3. Infine trasferire 150 μL della piastra di diluizione dai pozzetti E07 - H12 nei pozzetti C04 - F09 della piastra etichettata 4.
9. Passare al punto 4, Spotting on Agar.

4. Spotting sull'agar usando un robot automatico di spotting liquido

1. Rimuovere le diapositive agarose conservate a 4 ° CO / N (dalla fase 2.19) dalle loro scatole sterili pipette umidificate.
2. Se necessario, tagliare gli angoli del mezzo agarosio con una lama rasoio pulita per assicurarsi che si adattano alla camera di scorrimento.
3. Rimuovere il morsetto a slitta dal supporto. Posizionare con cautela la piastra di agar nell'area recessata del supporto della camera di fase.
   NOTA: Assicurarsi che l'oL'introduzione della diapositiva è coerente dall'esperimento all'esperimento.
4. Verificare che il morsetto sia a filo con il fondo della camera. Se è croccante, la diapositiva potrebbe non essere completamente inserita nell'area incassata. Posizionare il distanziatore di livellamento nella posizione della piastra centrale del robot da macchiare. Questo distanziale fornisce il contatto per le viti di livellamento in modo che la camera di scorrimento possa essere livellata con le punte.
5. Posizionare le tavole sul tavolo in ordine del loro quadrante. Le piastre 1, 2, 3 e 4 sono ordinate da sinistra a destra ( Figura 2B ).
6. Disporre le punte in modo che i pozzetti interni 24 C04 - F09 siano occupati con punte in 4 scatole di punta vuote. Una quinta casella dovrà avere una punta nella posizione C10, nonché 4 punte con le loro estremità tagliate nelle posizioni A01, A12, H01 e H12. Questi 4 punte taglienti forniscono la stabilità per il morsetto della punta di piastra ( figura 2C e 2D ).
7. Rimuovere il coperchio superiore dalla slAttacco camera.
8. Posizionare il primo punzone di punta nel sito di avvio del programma di spotting di controllo del robot. Questo dovrebbe puntare un foro nell'agarosa che verrà utilizzato successivamente per allineare la coordinata di origine. Posizionare la piastra 1 sul robot di movimentazione del liquido per individuare il primo quadrante. Assicurarsi che il coperchio sia rimosso e continuare il programma di rilevamento.
9. Controllare per assicurarsi che tutti i punti siano presenti. Inoltre, attendere ~ 30 s per asciugare. Quando i punti sono di circa 1 mm di diametro, il programma può continuare. Svuotare i suggerimenti utilizzati nel contenitore a rischio biologico e posizionare suggerimenti freschi sul robot. Spostare la piastra 1 per la piastra quadrangolare 2.
10. Ripeti per il terzo quadrante. E ripete nuovamente per il quarto quadrante.
11. Quando i punti sono asciutti, sostituire il coperchio della camera di scorrimento e far scorrere l'apparecchio.
12. Installare i raccordi del tubo con un filtro dell'aria.
13. Mettere una lastra di vetro sul lato superiore della camera.
    NOTA: questa diapositiva è fondamentale per i redattiIl flusso di calore all'agar e riduce al minimo la formazione di condensa sul lato di scorrimento della copertura obiettivo della camera. Non dimenticate questa copertina. A seconda della configurazione del microscopio, questo scivolo di copertura impedisce il riscaldamento dal lato illuminazione causando condensa sul lato obiettivo.
14. Posizionare un ventilatore per soffiare aria calda sul lato obiettivo della camera. Questo ventilatore impedisce la formazione di condensa sullo scorrimento della copertura. Impostare la portata d'aria attraverso il bubbler fino a 10 ml / min.

5. Corsa ODELAY sul microscopio

1. Eseguire lo script "ODELAY_Microscope_Control.m".
2. Fai clic sul "Otturatore" per aprire l'otturatore di luce trasmesso e poi il pulsante "Focus" per avviare l'alta velocità della fotocamera ( Figura 3A , frecce rosse).
3. Fai clic su "Vai Origine" e sposta la fase per trovare il segno di origine che è stato punzonato nell'agar.
4. Quindi, spostare leggermente a destra versoConcentrarsi sulle cellule di lievito macchiate nella zona E07.
5. Tornare al punzone di origine e centrarla nel campo visivo.
6. Impostare l'origine a questo valore premendo il pulsante "set" ( Figura 3A , frecce blu). Ora passare alla posizione H18 e mettere a fuoco con la vite esagonale più vicina a quella posizione. Quindi passare alla posizione L07 e concentrarsi usando la vite esagonale più vicina a quella posizione. Quindi passare alla posizione E07 e mettere a fuoco con la vite esagonale più vicina a quella posizione.
7. Ripetere i passaggi 5.5 - 5.7 come necessario fino a quando queste posizioni rimangono in moto.
8. Controllare la messa a fuoco nel centro e sui bordi nei punti E12, H12, L12. Regolare l'intervallo di messa a fuoco automatica se i valori Z di messa a fuoco, come indicato dal valore Z, sono maggiori di ± l'intervallo di autofocus ( ad es ., Impostare l'intervallo di autofocus a 60 μm il valore Z per un punto centrale maggiore di ± 40 μm).
9. Premere il pulsante di reset, in quanto ciò attiverà le proprietà del pulsante, quindi premereODELAY ( Figura 3A , frecce verdi). Scegli la directory per salvare i dati. Assicurarsi che sia sufficiente spazio per l'unità.
   NOTA: Il microscopio raccoglie i dati per 48 ore, o fino a quando il programma è chiuso.

6. Elaborazione dei dati ODELAY

1. Aprire ODELAY_IPT.exe o utilizzare lo script ODELAY_Image_Processing_Tool_v7.m ( Figura 3C ).
2. Preparare un foglio di calcolo Excel * ODELAYExpDisc.xlsx.
3. Nome dell'esperimento nella cella B1.
4. Selezionare l'Elenco immagini in cui sono memorizzati i file di immagine E07 - H18.
5. Seleziona la directory dei dati in cui verranno scritti i dati.
6. Scrivi la data in cui è stato avviato l'esperimento nella cella B04. Utilizzare il formato MM / DD / YYYY.
7. Scrivi il tempo di diluizione nella cella C04. Questa volta è circa cinque minuti prima della raccolta della prima immagine. Utilizzare il formato HH: MMpm dove HH è per h e MM è per min.
8. Aggiungere i nomi di ceppo secondo tO la piastra sorgente (fase 3.1). A causa del modo in cui i ceppi sono individuati, sono stati riorganizzati sullo scivolo agarosio ODELAY. Le celle nel foglio elettronico B31-B126 sono la piastra di origine, mentre le celle C31-C126 sono le posizioni spot nella piastra agar ODELAY.
9. Quindi premere il pulsante "Process Data" e selezionare la * ODELAYExpDisc.xlsx appena preparata.
10. Attendere 16-24 h a seconda del sistema informatico utilizzato per elaborare i dati.
11. Quando vengono elaborate le immagini, verrà visualizzata una directory denominata "ODELAY Well Data" e un file "* _Index_ODELAYData.mat". Premere il pulsante "Carica dati" e selezionare il file "* _Index_ODELAYData.mat" appena generato. Questo caricherà il set di dati appena elaborato. Il "*" nel nome del file verrà elencato in base al nome dell'esperimento inserito nel foglio di calcolo Excel.
12. Dopo aver caricato i dati, controllatelo utilizzando la barra temporale trovata sul fondo, fai clic su un quadrato immagine per visualizzare le curve di crescita fO quel punto, o trovare un bene di interesse nell'elenco a sinistra e quindi caricare le immagini per quella lista.
13. Genera istogrammi di parametri di crescita della popolazione premendo il pulsante "Violin Plot". Questo genererà una trama mostrata in Figura 4 o Figura 6 .

Representative Results

Le immagini esemplari di lieviti che crescono in microscopia a tempo trascorso sono mostrate nella Figura 3B . Dopo aver elaborato le immagini di time-lapse, è mostrato in Figura 4 un insieme di dati rappresentativo che confronta i ceppi di lievito BY4741 & BY4742. In questo set di dati di esempio, vi è una scarsa variazione nel tempo di raddoppiamento tra diverse posizioni sulla piastra. Se il mezzo agarosio è preparato male, allora una evidente deviazione sia nel tempo di raddoppiamento che nel tempo di ritardo sarebbe apparente nelle posizioni di scatto che coincidono con la regione deformata del gel agarosio. Mentre i tempi di raddoppiamento sembrano essere relativamente uniformi, questo esempio mostra variazioni nelle misurazioni del tempo di ritardo. Un insieme di dati più coerente è mostrato in Figura 6 . In questo set di dati, sia il tempo di ritardo che il tempo di raddoppiamento sono uniformi.

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Figura 1: Assemblaggio della muffa di agar.
I componenti dello stampo agar sono mostrati in ( A ). Montare la base come illustrato in ( B ) e quindi fissare la base con piccoli fermi di legante. Posizionare i pezzi più in posizione longitudinale nella cavità della base ( C ) e quindi incollare le diapositive nello stampo come mostrato in ( D ). Una vista laterale che mostra l'angolo dello stampo e l'orientamento del cerchio di stampo necessario per una separazione uniforme dell'agar dalla slitta di vetro ( E ). Notare la posizione del pollice e dei forefingers, così come la linea retta dell'agar che separa dalla diapositiva ( F ) e nota la freccia orizzontale. La linea di separazione deve spostarsi uniformemente in direzione delle frecce verticali. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 2: Metodo di Sonication e Spotting.
Sonicare la piastra in acqua di ghiaccio e utilizzare un supporto per secchi di centrifuga per aiutare a sostenere la piastra ( A ). Posare le piastre dalle fasi 3.8.1 fuori per la macchia sulla piastra agarosa ( B ). Inoltre, predisporre le punte in modo che la scatola sinistra più punta ha una punta nella posizione C10 e poi quattro altri punta con le loro estremità tagliate in modo che non rompino il supporto piastra ( C ). Posizionare i rimanenti rimanenti in quattro scatole in modo che le posizioni interne 24 punte siano occupate ( D ). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Figura 3: Interfaccia utente grafica ODELAY.
Un colpo di schermo dell'interfaccia grafica per "ODELAY_Microscopecontrol.m" ( A ). Questa interfaccia consente di monitorare la fotocamera e di regolare le impostazioni di illuminazione del microscopio per le modalità epifluorescenti e quelle a campo luminoso. Le frecce rosse puntano sui pulsanti Focus e Transmitted che attivano la fotocamera per acquisire rapidamente le immagini e aprire rispettivamente l'otturatore luminoso trasmesso. Le frecce blu vengono utilizzate per spostare lo stadio per l'origine e quindi impostare l'origine con il pulsante "Go Origin" e il pulsante "Set". Le frecce verdi puntano a "Reset" e "ODELAY !!!" Pulsanti che ripristina le modalità di immagine ODELAY alle condizioni attuali e inizia la collezione di immagini ODELAY. Immagini di lieviti che si coltivano su un mezzo solido a 0, 3, 6 e 9 ore dopo la comparsa ( B ). Un colpo di schermo dell'interfaccia grafica per "ODELAY_IPT.m" o th E ODELAY Strumento di elaborazione delle immagini ( C ). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Esempio ODELAY Output.
Questo insieme di dati confronta i ceppi BY4741 e BY4742 su supporti YPD. Questa figura è un esempio di uno scivolo agarosico ben preparato; Tuttavia, le impostazioni di autofocus non sono ottimali. I dati presentati in ciascuna colonna, da sinistra a destra, sono: la capacità di carico nel log ₂ dell'area colonia; Il tempo di raddoppiamento, dato in min; E tempi di ritardo, dati in min. In questo esempio, i tempi di raddoppiamento di tutti i punti sulla linea di agar si allineano bene con una piccola quantità di tempo di raddoppiamento aumentato verso la colonna. Tuttavia, i tempi di ritardo variano notevolmente in questo set di dati._upload / 55879 / 55879fig4large.jpg "target =" _ blank "> Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Esempi di curva di crescita.
Questo esempio dimostra come la focalizzazione iniziale scarsa può causare il tempo di ritardo stimato (t _lag ) per aumentare ( A ), mentre la posizione adiacente mostra un tempo di ritardo più breve ( B ). T _d è il tempo di raddoppiamento in min e t _lag è il tempo di ritardo in min. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Esempio di esperimento di prova eseguito bene.
Un eEsemplare del ceppo BY4742 testato dopo aver sostituito una lampadina alogena al tungsteno con un diodo illuminante e assicurando che l'autofocus sia impostato correttamente. Tutti i tempi di raddoppiamento sembrano sovrapporsi bene ei tempi di ritardo sembrano essere coerenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Il test ODELAY ha diversi punti critici per garantire misure fenotipiche riproducibili e affidabili. Il primo punto critico è la preparazione costante delle colture di lievito. Occorre prestare attenzione a raccogliere le cellule del lievito dalla crescita logaritmica. Se le culture sono saturate, la loro eterogeneità della popolazione sarà aumentata, che può offuscare l'eterogeneità causata da fattori genetici o ambientali ( ad esempio, fonte di carbonio) ¹¹ . Il secondo punto critico è la preparazione coerente dei supporti. In generale, è necessario generare un ampio volume di 10X media media solution e quindi utilizzare nel tempo per ridurre al minimo gli effetti batch. Formulare i supporti in peso, quando possibile, aiuta a migliorare la consistenza del mezzo nel tempo assicurando la densità di agar e il tenore totale dell'acqua dell'agarosio può essere strettamente monitorato. Il terzo punto critico comporta minimizzare o eliminare qualsiasi deformazione meccanica dell'agarosio media. La deformazione meccanica dei supporti si verifica più frequentemente durante la separazione dell'agarosio dalle vetrate. Come per molte tecniche di laboratorio, è necessaria la pratica per capire questo passo.

La variazione del tempo di ritardo come mostrato nella figura 4 è spesso correlata a uno dei tre fattori: deformazione meccanica del mezzo agarosio, variazione dello spessore agarizzato o una sorgente luminosa instabile. Se il mezzo di agarosio varia in altezza Z attraverso l'array spotted, la variazione di altezza può superare l'intervallo della routine di autofocus, causando che le immagini iniziali siano leggermente fuori fuoco. Per questo motivo, controllare l'altezza di messa a fuoco in più punti al centro e lungo i bordi della matrice macchiata per assicurare che la routine di autofocus abbia una sufficiente gamma di Z per trovare la messa a fuoco. Se necessario, utilizzare il pannello Autofocus per aumentare l'intervallo di messa a fuoco e aumentare il numero di passi di messa a fuoco.

Un terzo possibile conditIone che può portare a un cattivo fuoco è una sorgente luminosa instabile o sfarfallante che può interrompere il punteggio di focalizzazione calcolato per una specifica altezza Z. Le lampade alogene del tungsteno tendono a sfarfallare ben prima che le lampadine bruciano. L'effetto di scarsa attenzione viene osservato in un esempio in cui le curve di crescita inumidiscono tra il primo e il secondo punto temporale ( Figura 5 A ), mentre il punto adiacente non ha lo stesso tuffo ( Figura 5 B ). In questo caso, la scarsa condizione di messa a fuoco è stata alleviata sostituendo la sorgente di luce alogena al tungsteno.

In pratica, gli autori hanno scoperto che per ridurre il sfarfallio di lampadine alogene da 100W, le lampadine devono essere sostituite ogni 500 ore circa ogni due mesi quando i microscopi sono sotto uso pesante. Per evitare problemi di messa a fuoco poveri da una lampadina di sfarfallio, sostituire spesso la fonte di luce alogena al tungsteno o sostituire la lampada alogena con una sorgente luminosa a diodi. UnEsempio di un set di dati che mostra una scarsa variabilità dei tempi di raddoppiamento e tempi di ritardo più uniformi è mostrato in Figura 6 . Questo set di dati è stato scattato con un diodo illuminante che fornisce un'illuminazione più stabile nel tempo durante l'esecuzione dell'autofocus.

Mentre molti dei punti menzionati qui per ottimizzare la preparazione dei media potrebbero apparire evidenti, nella letteratura gli schermi di grandi dimensioni non si replicano bene tra loro ^{8 , 11} . Di conseguenza, abbiamo descritto con cura la preparazione di culture e agarosi in modo da generare schermature fenotipiche più riproducibili.

Il test ODELAY è attualmente limitato nel throughput se confrontato con i test basati sul pinning come gli array genetici sintetici o il dosaggio Scan-O-Matic. Mentre questi metodi aumentano il numero di ceppi misurati, non hanno la capacità di risolvere singole cellule aE quindi non è possibile misurare l'eterogeneità della popolazione che osserviamo nei ceppi di lievito clonale. L'origine di questa eterogeneità della popolazione non è attualmente compresa, ma la fusione della tecnologia e del calcolo come qui dimostrato offre un'opportunità per affrontare oggettivamente i meccanismi cellulari sottostanti ¹² .

Gli autori vogliono notare che ODELAY è attualmente ottimizzato solo per uno specifico marchio e tipo di corpo del microscopio. La modifica di ODELAY per altri sistemi di microscopio è diretta, ma richiede la conoscenza dell'API open source ¹³ . Tuttavia, sia l'API che gli script ODELAY sono scritti per essere facilmente adattati a diversi sistemi e test sperimentali.

Mentre ODELAY è stato originariamente sviluppato per il lievito, siamo stati in grado di utilizzarlo senza modifiche per osservare la crescita di Mycobacterium smegmatis . Osservazione dell'altra colonia che formano microrganismi èPossibile con modifiche al codice sorgente fornito ¹¹ . In generale, ODELAY è uno strumento potente e flessibile per confrontare i microrganismi coltivati ​​in condizioni ambientali differenti e perturbazioni genetiche.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose UltraPure	ThermoFisher	16500500	Gel Temp 36C, Gel Strength (1%) 1.2 g/sq cm
Yeast Extract Peptone (YEP)	Fisher Scientific	BP1422-2
Complete Suplement Mixture (CSM)	Fisher Scientific	MP114560222
Polyethylene Glycol 3350 (av. mol. wt. 3000-3700)	SigmaAldrich	P2906
Yeast Strain BY4741	ThermoFisher	95400.BY4741
Yeast Strain BY4742	ThermoFisher	95400.BY4742
50 mL Falcon tubes	Corning	430291	1 case
15 mL Falcon tubes	Corning	352096
2 x 3 inch 1.0 mm thick slides 1/2 gross	VWR	48382-179
96-well plate flat bottom	Corning	353072
Hydra liquid handleing robot	Thermo	1096-DT-100
Hamilton Microlab Star Liquid Handleing Robot	Hamilton
hydra 100 mL tips Extended Length DARTS	Thermo	5527
Synergy H4 Plate Reader	Biotek	H4MLFAD
Leica DMI6000 B Microscope	Leica
Leica 10X/0.3NA objective	Leica	11506289
Hamamatsu ORCA Flash 4.0 Camera	Hamamatsu	C11440-22CU
MATLAB with image processing tool box	Mathworks
MicroManager	Open Imaging		https://micro-manager.org/
ODELAY Microscope Control (MATLAB scripts and GUI)			www.aitchisonlab.com\ODELAY for Matlab scripts and software
ODELAY Microscope Chamber			www.aitchisonlab.com\ODELAY for Mechanincal Drawings
ODELAY Agar Molds			www.aitchisonlab.com\ODELAY for mold drawings