Summary
Wij presenteren een methode voor het kwantificeren van groeifenotypes van individuele gistcellen, aangezien zij groeien in kolonies op vaste media met behulp van tijdlapse microscopie, één-celdubbelevaluatie van levende arrays van gist (ODELAY). Bevolkings heterogeniteit van genetisch identieke cellen die in kolonies groeien, kunnen direct worden waargenomen en gekwantificeerd.
Abstract
Groei fenotypes van micro-organismen zijn een sterke indicator van hun onderliggende genetische fitness en kunnen gescheiden worden in 3 groeistelsels: lagfase, logfase en stationaire fase. Elke groeifase kan verschillende aspecten van fitness tonen die verband houden met verschillende milieu- en genetische omstandigheden. Hoge resolutie en kwantitatieve metingen van alle 3 fasen van groei zijn over het algemeen moeilijk te verkrijgen. Hier presenteren wij een gedetailleerde methode om alle 3 groeifasen op vaste media te karakteriseren met behulp van een test, die de 'One-cell Doubling Evaluation of Living Array of Yeast' (ODELAY) noemt. ODELAY kwantificeert groeifenotypen van afzonderlijke cellen die in kolonies groeien op vaste media met behulp van tijdverloopmicroscopie. Deze methode kan direct de populatie heterogeniteit met elke groeiparameter in genetisch identieke cellen waarnemen in kolonies, waarnemen. Deze populatie heterogeniteit biedt een uniek perspectief voor het begrijpen van genetische en epigenetische regulering, en reacties opGenetische en milieuverstoringen. Terwijl de ODELAY methode wordt aangetoond met behulp van gist, kan het worden gebruikt op elk colonievormend micro-organisme dat zichtbaar is door lichte veldmicroscopie.
Introduction
Groei fenotypes van micro-organismen zijn een sterke indicator van hun onderliggende genetische geschiktheid voor een gegeven milieuconditie. Groei wordt klassiek gescheiden in 3 verschillende groeistelsels: lagfase, logfase en stationaire fase groei 1 . Elke groeifase kan verschillende aspecten van fitness tonen die afhankelijk zijn van diverse milieu- en genetische omstandigheden. Bijvoorbeeld, vertragingstijd of de tijdsduur die een organisme in lagfase besteedt voor het begin van de exponentiële groei kan duiden op het vermogen van een organisme om te reageren op gewijzigde milieuomstandigheden 2 . Verdubbelingstijd tijdens logfasegroei, de meest voorkomende metrieke van cellulaire fitness, onthult de algehele efficiëntie van het vermogen van een organisme om te verdelen door metaboliseren en gebruik maken van milieuproducten voor replicatie. Stationaire fase, waar de groei na logfase snel wordt verminderd, is een andere indicator van fitness, die regelmatig isWordt gebruikt als groeipuntpunt in spot-gebaseerde gistgroeitesten.
Verscheidene gistgroeitesten zijn momenteel beschikbaar en beschouwd als standaardmethoden voor het evalueren van groeifenotypen in gist 3 , 4 , 5 . Deze analyses zijn in hoofdzaak gebaseerd op methoden voor het kweken van gist, ook niet op vaste stoffen of in vloeibare media. Op vaste media overdragen koloniepennen assays een klein aantal cellen op vaste agar met een pen en gistcellen mogen gedurende een bepaalde periode groeien. Kolonies worden vervolgens afgebeeld en hun maten worden vergeleken bij een eindpunt 6 . Deze kolonie-pinning-analyses zijn bewezen robuust en schaalbaar om genoom-brede schermen te genereren. Meer recent, zijn periodieke beeldvorming met behulp van flatbed scanners en Single Lens Reflex (SLR) camera's opgenomen in deze analyses om de groei van de kolonie op tijd op te nemen 7 , 8, 9 . Echter, de resolutie van deze apparaten voorkomt dat ze enkelvoudige cellen detecteren en bijgevolg observeert deze kolonie-pinningsassays niet de vertragingstijd direct en kan ze geen variatie zien tussen de afzonderlijke cellen die in kolonies groeien.
Vloeibas gebaseerde groeieresultaten zijn ook toegepast om genoom-brede schermen 3 uit te voeren . Koppeling van een vloeibare groei-analyse met time-lapse microscopie onthulde heterogeniteit van de populatie in de verdubbelingstijd van genetisch identieke afzonderlijke cellen, die een belangrijk perspectief biedt voor het begrijpen van genetische regulering en milieu-aanpassing. Deze maatregel meet echter geen andere aspecten van groei zoals vertragingstijd en draagvermogen 10 . Hier presenteren we een methode om alle drie de groeifasen van kolonievormende micro-organismen op vaste media te karakteriseren met behulp van een test die we termen ODELAY 11 noemen. ODELAY bestaat uit utiliZing high-through time-lapse microscopie om afbeeldingen van enkele cellen op te nemen die groeien in kolonies op vaste media. Deze populatie van individuele cellen die in kolonies groeien onthult de onderliggende bevolkings heterogeniteit, die niet gedetecteerd wordt door andere minder gevoelige metingen, zoals eindpunten van eindpunten. We tonen de methode op gist, maar ODELAY kan toegepast worden op elk organisme dat contrast toont in heldere veldmicroscopie.
Protocol
1. Bereiding van agarose gelvoorraad
- Weeg 2 g agarose met een hoge zuiverheid af.
- Voeg de agarose toe aan een 500 ml fles en schrijf de gecombineerde massa op.
- Bereken de doelmassa van de fles plus 2 g agarose met 150 g ultrazuiver water en voeg dan 150 g ultrazuiver water toe aan binnen 0,1 g van deze doelmassa.
- Let op de massa van de fles plus de agarose en het water.
- Plaats de fles in een magnetron en zorg ervoor dat u de fles vastzet met een losse dop op de bovenkant om de waterverdamping te minimaliseren terwijl u de agarose verhit.
- Magnetron de fles in 15 - 20 s bursts gevolgd door de fles kort te draaien om de agarose en water te mengen. Herhaal deze procedure tot de oplossing kookt en het mengsel is homogeen.
VOORZICHTIG: Zorg ervoor dat de huid niet wordt afgespild met stoom die uit de fles komt. Ook wordt de fles heet en kan de bescherming beschadigd worden, zoals een autoclaafhandschoen. - Nadat de gesmolten agarose homogeen is, weeg de fles weer en voeg ultrauw water toe binnen 0,1 g van de originele massa. Dit zal vervangen worden door het verlies van water door verdamping.
- Voordat de gesmolten agarose stollt, wervel om te mengen in het toegevoegde water om homogeniteit te waarborgen.
- Aliquot 15,2 g agarose in 9 - 50 ml plastic buizen.
- Koel de buizen naar behoefte.
2. Voorbereiden van ODELAY Agarose Media
- Verhit 400 ml gedeïoniseerd water in een overdekte beker, op een kookplaat onder zacht roeren met een magnetische roerbalk.
- Voeg 2 ml 10X media ( bijv . Gist Extract Pepton (YEP) of Complete Supplement Mengsel (CSM) toe aan een 15,2 g agarose-aliquot in een 50 ml conische buis uit stap 1.10.
OPMERKING: CSM-medium heeft de neiging om vast te houden aan de glazen glijbanen. Als u CSM media formuleringen gebruikt, voeg dan 5 μL 50% wt polyethyleenglycol (PEG) in steriel water toe aan de mediumformulering. De PEG voorkomt de aGar van het vasthouden aan de glazen glijbanen tijdens het loslaten van de schimmel en verhindert de gistengroei niet. - Voeg extra 100X voedingssupplementen toe, indien nodig, en gebruik water om het totale toegevoegde volume van deze stap naar 1 ml te brengen.
- Weeg de agarose-aliquot met extra media en supplementen voordat u de 50 ml kegelbuis in kokend water van stap 2.1 plaatst.
- Na 16 minuten haal de 50 ml buis uit en meng het mengsel met een draaikolk. Houd de dop vast aan de 50 ml conische buis vast.
OPMERKING: Een deksel op de beker helpt de gehele buis gelijkmatig te verwarmen, anders vormt een film van vaste agarose en eventueel niet smelt. Ook tijdens deze tijd is het handig om de agarosevorm te monteren ( figuur 1 ). - Homogeniseer het mengsel met behulp van een draaikolk.
- Kook nog 2 minuten om ervoor te zorgen dat alle agar gemengd en gesmolten is.
- Weeg buis en vervang eventuele massa die met ultrazuiver steriel water is verloren.
- Voeg 2 ml 10X carbonzuur toeCe reagens ( bijv . 20% w / v glucose) en vortex om agarose medium oplossing te verkrijgen.
OPMERKING: Scheiding van glazen glijbanen: Bij het monteren van de mal moet erop worden gezorgd dat de lange afstandhouders met de juiste oriëntatie in de vorm worden geplaatst. Dit komt doordat de laser de acryl snijdt, het heeft de neiging om te knippen als een kegel, waarbij het deel met een beetje hoekige zijden wordt verlaten in plaats van precies 90 ° kanten. Dan moet de rand van de spacer op een scherpe hoek zijn met de agar wanneer de vorm op de bencht geplaatst wordt om het glas uit de agar te laten lossen. De scherpe hoek helpt de rand van de agar weg van het bovenste glas te comprimeren, aangezien de buitenrand van de schimmelruimte om de onderrand draait (zie figuur 1 ). Het resultaat is een consistente scheiding van de agar uit het bovenste glas.
OPMERKING: Mould release agentia toegepast op het glas zoals oliën, siliciumsprays of zelfs commerciële vensterbehandelingen mogen niet gebruikt worden omdat ze de s verontreinigen Oppervlak van de agar en mogelijk de groei remmen. Deze methoden hebben een aantal praktijken om consistent te zijn. - Reinig vier 2 in x 3 in x 1 mm dikke glijbanen met 70% ethanol en droog met gedwongen lucht.
- Maak acrylvormen schoon met 70% ethanol, droog en monteer zoals afgebeeld in Figuur 1 . Neem de drie onderstukken, zoals afgebeeld, en monteer ze zodat de twee identieke stukken het derde stuk sandwichen ( figuur 1B ). Klem de basisstukken aan beide zijden aan met behulp van twee kleine binderclips ( figuur 1C ). Plaats de staander in de vorm en zorg ervoor dat de laserkapper correct is gepositioneerd ( Figuur 1E ).
- Plaats de gereinigde en gedroogde glazen glijplaat op de mal en houd hem vast terwijl u een tweede glazen glijbaan aan de andere kant plaatst. Bevestig de montage met een grotere bindmiddelclip ( Figuur 1D ). Pak beide glijbanen vast met grotere bindclips (Lass = "xfig"> Figuur 1D). Zorg ervoor dat de bovenste bindmiddelclip in contact is met de glazen glijbaan die overlapt met de acryl.
- Voeg resterende bindclips toe. Zorg er nogmaals voor dat de klemmen contact opnemen met de dia, waar het de acryl overlappt ( Figuur 1D ).
OPMERKING: Voordat u de gemonteerde vorm met gesmolten agar opvult, dient u ervoor te zorgen dat de randen door middel van pipettering ongeveer 70 μl gesmolten agarmedia langs de binnenzijde van de vorm worden verzegeld. Deze agar zal snel stollen en voorkomen dat er lekken ontstaan. - Vul de vorm met gesmolten agar, zorg ervoor dat de luchtbellen in de mal voorkomen worden.
OPMERKING: dit kan worden bereikt door langzaam de gesmolten agar langs de rand van de mal te pipetteren. Nadat het is gevuld, laat de vorm gedurende 40 minuten tot 1 uur afkoelen bij ongeveer 23 ° C omgevingstemperatuur. Als het te lang afkoelt, kan de agar in de mal breken.
OPMERKING: Schimmelvorming: Het verwijderen van de schimmelvorming van de gegoten agar is essentieel om een uniforme vaste stof te waarborgenAgar pad voor gistengroei. Als u niet in staat bent om de schimmelvorming op deze stap doeltreffend te scheiden, veroorzaakt u groeiverschillen die te wijten zijn aan onvolkomenheden in het solide agarpaneel. Dit is een paar keer aanbevolen om deze stap uit te oefenen. - Begin door de onderste binder clip te verwijderen. Verwijder het onderste gedeelte van de mal die bestaat uit de drie ingebonden stukken. Houd de dia's vast door ze te comprimeren en verwijder vervolgens de bindclips. Zorg ervoor dat u de vormkanten niet stoot terwijl u de bindklemmen verwijdert. Dit zal de media vervormen.
- Plaats de mal op de rand van de bankbovenkant zodat de zijde van de mal met de blauwe stip naar boven en in de linker benedenhoek staat ( Figuur 1E ). Plaats duimen onder de acryl en de eerste vinger aan de bovenkant naar de binnenkant van de mal.
- Duw langzaam en zorgvuldig met de duim tegen de matrijs omhoog, alsof de malafstand tussen de onderrand ( figuur 1F ) draait. Breng constant aanMaar langzaam toenemende druk. Gebruikers zullen een pauze zien en luchtbellen verschijnen langs de lijn waar het bovenste glas de vormruimte verdeelt.
- Nadat u de eerste pauze hebt gezien, blijft u met duimen omhoog duwen en constant druk toepassen. De agar moet op dit moment vanaf het glas wegbreken ( figuur 1F ). Ga door de vorm naar voren te draaien. Dit zal het glas opheffen zonder te glijden. Een lijn waar de agar wegvalt van het glas, moet zich verder bewegen van de eerste breeklijn.
OPMERKING: op dit punt stopt de agar aan zowel de bodem als de bovenkant van het glas. Dit gebeurt af en toe met de linker meest rand. Zolang het gebied vervormd is, is het niet in het gebied waar gist is gespot, dit zou goed moeten zijn. - Als het glas helemaal vrij komt, pak het en verwijder het helemaal uit de mal. Verwijder vervolgens het andere vormstuk met een soortgelijke beweging om het stuk los te maken zonder de agar te verplaatsen. Plaats de glijbanen in eenSteriele puntendoos met wat steriel water met hoge zuiverheid in de bodem. Sluit de doos en bewaren bij 4 ° CO / N voor gebruik de volgende dag. Als u langer wordt opgeslagen, worden de groeitempo inconsistent.
3. ODELAY Cultuurvoorbereiding
- Lay-out stammen in een 96-put plaat voor O / N groei.
- De volgende dag verdunnen 20 μL van de nachtcultuur in 200 μl media voor 220 μl totaal volume in een nieuwe plaat.
- Meet de optische dichtheid bij 600 nm (OD600) van elke cultuur in een plaatlezer. Volg het geautomatiseerde verdunningsprotocol van stappen 3.3.1 - 3.3.6 met behulp van een plaatlezer en een vloeibare behandelingsrobot. Verdun de culturen handmatig in de plaat tot ongeveer 0,1 OD600 (optioneel).
- Klik op de plaatlezer op "Experiment" onder "Creëer nieuw". Kies ODELAYDilution.exp en voer het experiment uit. Voer de experimentnaam in als ODELAY "Date" "Time" "Experiment Name" iteratie.
- Klik op de sTabblad tabellen en klik vervolgens op het Excel-icoon. Sla de gegevens op op een thumb drive en over te brengen naar een robot robot computer.
- Open de Robot's Layout and Method Editor. Open het methodebestand "ODELAYDilution_v1.med". Voer de uitvoerbare "Convert_SynergyFiles.exe" uit. Voer 0,09 voor doel OD600 in.
- Klik op "Glu Correction" en "Gal Correction" op 0,05. Meet blanco media in een identieke plaat. Klik op "Generate File". Selecteer het bestand in de methode-editor. Klik op het pictogram stoplicht om de methode te starten om het runtime-verdunningsprogramma te openen.
- Zorg ervoor dat de buizen niet open zijn en de platen hebben deksels verwijderd en de stofafdekkingen worden verwijderd van de tips. Laad platen, buizen en uiteinden op het dek van de vloeistofverwerkende robot, zoals aangegeven door de deklay-out.
- Klik op de knop 'Afspelen' om het verdunningsprogramma te starten. Selecteer het juiste aantal 50 μL tips. Selecteer het juiste aantal 300 μL tips. Wacht over12 minuten voor het proces te lopen.
- Neem de verdunningsplaat uit de robot, bedek de tips en pak de 15 ml mediabuisjes op. Kweek de plaat gedurende 5 - 6 uur bij 30 ° C.
- Ongeveer 1 - 2 uur voor het starten van de tweede verdunning zorg ervoor dat u de incubatiekamers voor de microscoop inschakelt. Laat ze evenwaren bij ° C of de temperatuur die nodig is voor het experiment.
- Herhaal de verdunningsstapjes 3.3 - 3.4, maar verdunde culturen aan een OD600 van 0,01-0,02 om de culturen op agaroseglazen te spotten.
- Bedek de verdunningsplaat met een metalen vriezerafdichting.
- Soniceer de verdunningsplaat in een ijsbad gedurende 30 s met de plaat die in ijswater drijft met behulp van een centrifuge metalen emmer om de plaat vast te houden ( figuur 2A ). Breng de sonicated culturen over van de verdunningsplaat naar een platte bodemplaat. Label 4 x 96-brede platte bodemplaten 1, 2, 3 en 4 ( Figuur 2B ).
- Overdracht 150 &# 181; L van de verdunningsplaat uit putten A01 - D06 in putten C04 - F09 van plaat gemerkt 1. Vervolgens 150 μL van de verdunningsplaat uit putten A07 - D12 in putjes C04 - F09 van plaat gemerkt 2. Vervolgens 150 μL Van de verdunningsplaat uit de putjes E01 - H06 in putten C04 - F09 van de plaat gemarkeerd. 3. Breng 150 μL van de verdunningsplaat van de putjes E07 - H12 uiteindelijk over in putjes C04 - F09 van de plaat gemerkt 4.
- Ga verder naar stap 4, Spotting on Agar.
4. Spotting op agar met behulp van een geautomatiseerde vloeibare spotting robot
- Verwijder de agarose glijbanen die zijn opgeslagen bij 4 ° C / N (vanaf stap 2.19) van hun bevochtigde steriele pipetdozen.
- Indien nodig, trim de hoeken van het agarosemedium met een schoon scheermesje om ervoor te zorgen dat ze op de glijkamer passen.
- Verwijder de diafragma van de beugel. Plaats de agarplaat voorzichtig in het inbouwvak van de podiumkamer.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de ofDe afname van de dia is consistent van experiment tot experiment. - Controleer of de klem in de bodem van de kamer staat. Als het schuin is, dan is de dia mogelijk niet volledig in het ingebouwde gebied. Plaats de nivelleringsruimte in de middenplaatpositie van de spottrobot. Deze afstandsbediening zorgt voor contact voor de nivelleringsschroeven, zodat de diafragment met de tips kan worden geliquideerd.
- Plaats de borden op de tafel in volgorde van hun kwadrant. Platen 1, 2, 3 en 4 besteld van links naar rechts ( figuur 2B ).
- Leg de tips omhoog zodat de binnenste 24 putjes C04 - F09 met tips in 4 lege tipkasten worden bezet. Een vijfde doos moet één tip in de C10 positie hebben, evenals 4 tips met hun uiteinden afgesneden in de A01, A12, H01 en H12 posities. Deze 4 snijpunten zorgen voor stabiliteit voor de tipplaatklem ( Figuur 2C en 2D ).
- Verwijder de bovenklep van de slIde kamer mount.
- Plaats de eerste tip punch in de startplaats van het robot control spotting programma. Dit moet een gat in de agarose steken, die later gebruikt wordt voor het aanpassen van de oorsprong coördinaat. Plaats plaat 1 op de vloeistofverwerkende robot om het eerste kwadrant te detecteren. Zorg ervoor dat de deksel is verwijderd en ga door met het spotting programma.
- Controleer of alle plekken aanwezig zijn. Wacht ook ~ 30 s zodat ze kunnen drogen. Wanneer de plekken ongeveer 1 mm in diameter zijn, kan het programma doorgaan. Leeg de gebruikte tips in de biohazard container en plaats verse tips op de robot. Schakel plaat 1 uit voor de 2e kwadrantplaat.
- Herhaal voor het derde kwadrant. En herhaal opnieuw voor het vierde kwadrant.
- Wanneer de vlekken droog zijn, vervang de klep van de diafragma en draai het apparaat om.
- Installeer de slangverbindingen met een luchtfilter.
- Plaats een glazen glijbaan op de bovenkant van de kamer.
OPMERKING: deze dia is cruciaal voor verminderingNg de warmteflux naar de agar en minimaliseert de vorming van condensatie op de objectieve afdekklepzijde van de kamer. Vergeet niet deze cover slip. Afhankelijk van de microscoopconfiguratie voorkomt deze afdekplaat verhitting van de verlichtingszijde om condensatie op de objectieve kant te veroorzaken. - Plaats een ventilator om de hete lucht op de objectieve kant van de kamer te blazen. Deze ventilator voorkomt dat condensatie op de afdekkap vormt. Zet de luchtstroom door de bubbler tot 10 mL / min.
5. ODELAY draaien op microscoop
- Voer het script 'ODELAY_Microscope_Control.m' uit.
- Klik op de "Shutter" om de verzonden lichtluiter te openen en vervolgens de "Focus" knop om de hoge camera snelheid te starten ( Afbeelding 3A , Rode pijlen).
- Klik op "Ga herkomst" en verplaats het podium om het origineelmerk te vinden dat in de agar werd geslagen.
- Ga dan een beetje naar rechts naarFocus op gistcellen die in gebied E07 zijn opgespoord.
- Ga terug naar de origineelpunch en centreer het in het zichtveld.
- Stel de oorsprong in op deze waarde door op de knop "Set" te drukken ( Figuur 3A , Blauwe pijlen). Ga nu naar positie H18 en focus met behulp van de hexadekschroef die dichtst bij die locatie ligt. Ga dan naar positie L07 en focus met behulp van de zeskroef die dichtst bij die locatie ligt. Ga dan naar positie E07 en focus met behulp van de hex-schroef dichtst bij die locatie.
- Herhaal stap 5.5 tot en met 5.7, indien nodig, totdat die posities in focus blijven.
- Controleer de focus in het midden en aan de randen op plekken E12, H12, L12. Stel het autofocusbereik in als de Z-waarden van de focus, zoals aangegeven door de Z-waarde, groter zijn dan ± het autofocusbereik ( bijv . Stel het autofocusbereik in op 60 μm de Z-waarde voor een middelpunt die groter is dan ± 40 μm).
- Druk op de reset knop, aangezien dit de knop eigenschappen zal activeren en druk dan opODELAY ( Figuur 3A , Groene Pijlen). Kies de map om de gegevens op te slaan. Zorg ervoor dat er voldoende schijfruimte beschikbaar is.
OPMERKING: De microscoop verzamelt gegevens gedurende 48 uur, of tot het programma is gesloten.
6. Verwerking ODELAY Data
- Open de ODELAY_IPT.exe of gebruik het script ODELAY_Image_Processing_Tool_v7.m script ( Figuur 3C ).
- Bereid een * ODELAYExpDisc.xlsx Excel-spreadsheet op.
- Noem het experiment in cel B1.
- Selecteer de Image Directory waar de afbeelding bestanden E07 - H18 zijn opgeslagen.
- Selecteer de Data Directory waar gegevens worden geschreven.
- Schrijf de datum waarop het experiment is begonnen met cel B04. Gebruik het formaat MM / DD / JJJJ.
- Schrijf de verdunningstijd in cel C04. Deze keer is ongeveer vijf minuten voordat de eerste afbeelding wordt verzameld. Gebruik het formaat HH: MMpm waar HH voor h is en MM is voor min.
- Voeg in de stamnamen toe volgens tO de bronplaat (stap 3.1). Vanwege de manier waarop de stammen worden gespot, worden ze op de ODELAY-agarose-schuif gerangschikt. Cellen in de spreadsheet B31-B126 zijn de bronplaat, terwijl de cellen C31 - C126 de plaats in de ODELAY agarplaat zijn.
- Druk dan op de "Process Data" knop en selecteer de * ODELAYExpDisc.xlsx die net werd voorbereid.
- Wacht 16-24 uur afhankelijk van het computersysteem dat wordt gebruikt om gegevens te verwerken.
- Wanneer de afbeeldingen worden verwerkt, verschijnt een map met de naam "ODELAY Well Data" en een bestand "* _Index_ODELAYData.mat". Druk op de knop 'Gegevens laden' en selecteer het bestand '* _Index_ODELAYData.mat' dat net is gegenereerd. Dit laadt de gegevensset die pas werd verwerkt. De "*" in de bestandsnaam wordt vermeld volgens de experimentnaam die in de Excel-spreadsheet is ingevoerd.
- Nadat u de gegevens hebt geladen, controleert u het met behulp van de tijdbalk bovenaan, klik op een afbeelding vierkant om de groeikurven te zien fOf die plek, of vind een bron van belang in de lijst aan de linkerkant en laad vervolgens de afbeeldingen voor die lijst.
- Genereer histogrammen van populatiegroei parameters door op de knop "Viool Plot" te drukken. Hierdoor wordt een grafiek weergegeven in figuur 4 of figuur 6 .
Representative Results
Voorbeeldbeelden van gistgroei in time-lapse microscopie worden getoond in Figuur 3B . Na het verwerken van de time-lapse beelden, wordt een representatieve gegevensverzameling van giststammen BY4741 en BY4742 getoond in Figuur 4 . In dit voorbeeld dataset is er zeer weinig variatie in verdubbelingstijd tussen verschillende posities op de plaat. Als het agarosemedium slecht wordt bereid, zou een duidelijke afwijking in zowel de verdubbelingstijd als de vertragingstijd duidelijk zijn in de vlekposities die samenvallen met het vervormde gebied van de agarosegel. Terwijl de verdubbelingstijden relatief uniform lijken te zijn, toont dit voorbeeld variaties in lagtijdmetingen. In figuur 6 is een consistente dataset weergegeven. In deze dataset zijn zowel vertragingstijd als verdubbelingstijd uniform.
Bestanden / ftp_upload / 55879 / 55879fig1.jpg "/>
Figuur 1: Agar Mold Assembly.
De componenten van de agarvorm worden in ( A ) getoond. Monteer de basis zoals afgebeeld in ( B ) en klem de basis vast met kleine bindklemmen. Plaats de langere staande stukjes in de holte van de basis ( C ) en plaats dan de glijbanen in de vorm zoals aangegeven in ( D ). Een zijaanzicht die de hoek van de matrijs en de oriëntatie van de vormscherf toont die nodig is voor consistente scheiding van de agar uit de glazen glijbaan ( E ). Let op de positie van de duim en voorvingeren, evenals de rechte lijn van de agar die van de dia ( F ) scheidt en let op de horizontale pijl. De scheidingslijn moet gelijkmatig verplaatsen in de richting van de verticale pijlen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
= "Jove_content" voor: keep-together.within-page = "1"> 
Figuur 2: Sonication en Spotting Method.
Soniceer de plaat in ijswater en gebruik een centrifuge emmerhouder om de plaat ( A ) te ondersteunen. Leg de borden van stap 3.8.1 uit voor het spotten op de agaroseplaat ( B ). Zorg ook voor de tips zodat de linkerste tipbox een punt heeft op positie C10 en dan vier andere tips met hun uiteinden afsnijden zodat ze de bordhouder ( C ) niet in de steek laten vallen. Plaats de overige tips in vier dozen, zodat de binnenste 24 tips posities bezet zijn ( D ). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
55879fig3.jpg "/>
Figuur 3: Grafische gebruikersinterface ODELAY.
Een schermafbeelding van de grafische gebruikersinterface voor "ODELAY_Microscopecontrol.m" ( A ). Deze interface laat toezicht op de camera en voor het aanpassen van de instellingen voor microscoopverlichting voor epifluorescente en heldere veldmodi. Rode pijlen wijzen op de toetsen Focus en Transmitted die de camera activeren om snel afbeeldingen te verkrijgen en de overgedragen lichtluiter respectievelijk open te maken. Blauwe pijlen worden gebruikt om het podium voor de oorsprong te verplaatsen en instelt vervolgens de oorsprong met de knop "Ga herkomst" en "Set". Groene pijlen wijzen naar "Reset" en "ODELAY !!!" Knoppen die ODELAY-beeldmodi terugzetten naar de huidige omstandigheden en start ODELAY-beeldverzameling. Time-lapse beelden van gistgroei op vast medium op 0, 3, 6 en 9 uur na het spotten ( B ). Een schermafbeelding van de grafische gebruikersinterface voor "ODELAY_IPT.m" of th E ODELAY Image Processing Tool ( C ). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Voorbeeld ODELAY Output.
Deze dataset vergelijkt de stammen BY4741 en BY4742 op YPD media. Dit cijfer is een voorbeeld van een goed voorbereide agarose dia; De instellingen voor autofocus zijn echter niet optimaal. De gegevens in elke kolom, van links naar rechts, zijn: de draagvermogen in log 2 van het koloniegebied; Verdubbelingstijd, gegeven in min; En vertragingstijd, gegeven in min. In dit voorbeeld verdubbelen de verdubbelingstijden van alle plekken op de agarglijbaan goed met een kleine hoeveelheid verhoogde verdubbelingstijd naar de kolom. De vertragingstijden verschillen echter aanzienlijk in deze dataset._upload / 55879 / 55879fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
Figuur 5: Growth Curve Voorbeelden.
Dit voorbeeld laat zien hoe slecht beginfocus de geschatte vertragingstijd (t lag ) kan verhogen ( A ), terwijl de aangrenzende positie een kortere vertragingstijd ( B ) laat zien. T d is de verdubbelingstijd in min, en t lag is de vertragingstijd in min. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Voorbeeld van goed uitgevoerde testexperiment.
Een eVoorbeeld van de BY4742-stam getest na het vervangen van een wolfraam halogeenlamp met een diode verlichting en het garanderen dat de autofocus correct is ingesteld. Alle verdubbelingstijden lijken goed te overlappen en de vertragingstijden lijken consistent te zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
De ODELAY-analyse heeft verschillende kritische punten om reproduceerbare en betrouwbare fenotypische metingen te waarborgen. Het eerste kritieke punt is de consistente bereiding van de gistculturen. Er moet voorzichtig zijn om de gistcellen uit de logaritmische groei te oogsten. Als de culturen verzadigd zijn, zal hun populatie heterogeniteit worden verhoogd, die heterogeniteit kan veroorzaken die wordt veroorzaakt door genetische of milieu- ( bijvoorbeeld koolstofbron) factoren 11 . Het tweede kritieke punt is de consistente voorbereiding van de media. In het algemeen moet een groot volume van 10X stock media oplossing gegenereerd worden en vervolgens over de tijd gebruikt worden om de batcheffecten te minimaliseren. Het formuleren van media per gewicht, waar mogelijk, helpt bij het verbeteren van de consistentie van het medium met verloop van tijd door de dichtheid van agar te waarborgen en het totale watergehalte van de agarose kan nauwlettend worden gecontroleerd. Het derde kritieke punt omvat het minimaliseren of elimineren van elke mechanische vervorming van de agarose mijdia. Mechanische vervorming van de media komt meestal voor tijdens het scheiden van de agarose uit de glazen glijbanen. Zoals bij veel laboratoriumtechnieken is de oefening vereist om deze stap te beheersen.
Variatie in vertragingstijd zoals afgebeeld in figuur 4 , is vaak gerelateerd aan één van de drie factoren: mechanische vervorming van het agarosemedium, variatie in de gevormde agar dikte of een instabiele lichtbron. Als het agarose medium varieert in Z-hoogte over het gespot array, kan de hoogtevariatie het bereik van de autofocus routine overspoelen, waardoor de initiële afbeeldingen iets flauw zijn. Controleer daarom de focushoogte op meerdere plekken in het midden en langs de randen van de gevlekt array om ervoor te zorgen dat de autofocus routine voldoende Z-bereik heeft om de focus te vinden. Gebruik indien nodig het autofocus paneel om het focusbereik te verhogen en het aantal focusings stappen te verhogen.
Een derde mogelijke conditIonen die tot slechte focus kan leiden, is een instabiele of flikkerende lichtbron, die de berekende focuspunt voor een bepaalde Z-hoogte kan verstoren. De gloeilampen van wolfraamhalogen hebben de neiging om goed te flikkeren voordat de bollen uitbranden. Het effect van slechte focus wordt waargenomen in één voorbeeld waar de groeikurven tussen de eerste en tweede tijdspunten duiken ( Figuur 5A), terwijl de aangrenzende plek niet dezelfde dip heeft ( Figuur 5B ). In dit geval werd de arme focus conditie verlicht door de wolfraam halogeen lichtbron te vervangen.
In de praktijk hebben de auteurs geconstateerd dat de gloeilampen om de flikker van 100W wolfraam halogeenlampen moeten verminderen, elke 500 uur of ongeveer elke 2 maanden vervangen worden wanneer de microscopen zwaar worden gebruikt. Om slechte focus problemen van een flikkerende lamp te vermijden, vervang de wolfraam halogeenlichtbron vaak of vervang de halogeenlamp met een diode lichtbron. EenVoorbeeld van een dataset die een lage variatie in verdubbelingstijden laat zien, evenals meer uniforme lagertijden is weergegeven in figuur 6 . Deze dataset werd genomen met een diodeverlichting, die tijdens de uitvoering van de autofocus stabielere verlichting geeft.
Terwijl veel van de hier genoemde punten voor het optimaliseren van de media voorbereiding lijken te zijn, zijn de meeste grootschalige schermen niet goed met elkaar 8 , 11 in de literatuur. Daarom hebben we de voorbereiding van culturen en agarose media nauwkeurig beschreven, zodat meer reproduceerbare fenotypische schermen kunnen worden gegenereerd.
De ODELAY assay is momenteel beperkt in doorvoer in vergelijking met pinning gebaseerde assays zoals synthetische genetische arrays of de Scan-O-Matic assay. Hoewel deze methoden het aantal getallen die worden gemeten, verhogen, hebben ze geen vermogen om individuele cellen te oplossen aNd kan dus de bevolkings heterogeniteit die we observeren in clonale giststammen niet meten. De oorsprong van deze populatie heterogeniteit wordt momenteel niet begrepen, maar de samenvoeging van technologie en berekening zoals hier wordt aangetoond biedt een kans om objectief de onderliggende cellulaire mechanismen 12 aan te pakken.
De auteurs willen er rekening mee dat ODELAY momenteel alleen geoptimaliseerd is voor een specifiek microscoopmerk en lichaamstype. Het wijzigen van ODELAY voor andere microscoopsystemen is rechtdoor maar vereist kennis van de open source API 13 . Echter, zowel de API als de ODELAY scripts zijn geschreven om gemakkelijk aan te passen aan verschillende systemen en experimentele analyses.
Terwijl ODELAY oorspronkelijk was ontwikkeld voor gist, hebben we het zonder veranderingen kunnen gebruiken om de groei van Mycobacterium smegmatis te waarnemen. Observatie van de andere kolonievormende micro-organismen isMogelijk met wijzigingen van de broncode geleverd 11 . Over het algemeen is ODELAY een krachtig en flexibel instrument voor het vergelijken van micro-organismen die onder verschillende milieuomstandigheden en genetische verstoringen worden geteeld.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs erkennen steun voor dit werk door U54 RR022220 en P50 GM076547 te JDA van de Amerikaanse National Institutes of Health. FDM is een postdoctorale collega met de Canadese instituten voor gezondheidsonderzoek. Wij danken ook het Luxemburgse Centrum voor Systemen Biomedicine en de Universiteit van Luxemburg voor ondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose UltraPure | ThermoFisher | 16500500 | Gel Temp 36C, Gel Strength (1%) 1.2 g/sq cm |
| Yeast Extract Peptone (YEP) | Fisher Scientific | BP1422-2 | |
| Complete Suplement Mixture (CSM) | Fisher Scientific | MP114560222 | |
| Polyethylene Glycol 3350 (av. mol. wt. 3000-3700) | SigmaAldrich | P2906 | |
| Yeast Strain BY4741 | ThermoFisher | 95400.BY4741 | |
| Yeast Strain BY4742 | ThermoFisher | 95400.BY4742 | |
| 50 mL Falcon tubes | Corning | 430291 | 1 case |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352096 | |
| 2 x 3 inch 1.0 mm thick slides 1/2 gross | VWR | 48382-179 | |
| 96-well plate flat bottom | Corning | 353072 | |
| Hydra liquid handleing robot | Thermo | 1096-DT-100 | |
| Hamilton Microlab Star Liquid Handleing Robot | Hamilton | ||
| hydra 100 mL tips Extended Length DARTS | Thermo | 5527 | |
| Synergy H4 Plate Reader | Biotek | H4MLFAD | |
| Leica DMI6000 B Microscope | Leica | ||
| Leica 10X/0.3NA objective | Leica | 11506289 | |
| Hamamatsu ORCA Flash 4.0 Camera | Hamamatsu | C11440-22CU | |
| MATLAB with image processing tool box | Mathworks | ||
| MicroManager | Open Imaging | https://micro-manager.org/ | |
| ODELAY Microscope Control (MATLAB scripts and GUI) | www.aitchisonlab.com\ODELAY for Matlab scripts and software | ||
| ODELAY Microscope Chamber | www.aitchisonlab.com\ODELAY for Mechanincal Drawings | ||
| ODELAY Agar Molds | www.aitchisonlab.com\ODELAY for mold drawings |
References
- Zwietering, M. H., Jongenburger, I., Rombouts, F. M., van't Riet, K. Modeling of the bacterial growth curve. Appl Environ Microbiol. 56 (6), 1875-1881 (1990).
- Sellick, C. A., Campbell, R. N., Reece, R. J. Galactose metabolism in yeast-structure and regulation of the leloir pathway enzymes and the genes encoding them. Int Rev Cell Mol Biol. 269, 111-150 (2008).
- Yoshikawa, K., et al. Comprehensive phenotypic analysis for identification of genes affecting growth under ethanol stress in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 9 (1), 32-44 (2009).
- Bryan, A. K., Goranov, A., Amon, A., Manalis, S. R. Measurement of mass, density, and volume during the cell cycle of yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (3), 999-1004 (2010).
- Baryshnikova, A., et al. Quantitative analysis of fitness and genetic interactions in yeast on a genome scale. Nat Methods. 7 (12), 1017-1024 (2010).
- Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327 (5964), 425-431 (2010).
- Collins, S. R., et al. Functional dissection of protein complexes involved in yeast chromosome biology using a genetic interaction map. Nature. 446 (7137), 806-810 (2007).
- Zackrisson, M., et al. Scan-o-matic: High-Resolution Microbial Phenomics at a Massive Scale. G3 (Bethesda). 6 (9), 3003-3014 (2016).
- Bean, G. J., Jaeger, P. A., Bahr, S., Ideker, T. Development of ultra-high-density screening tools for microbial 'omics'. PloS One. 9 (1), e85177 (2014).
- Levy, S. F., Ziv, N., Siegal, M. L. Bet hedging in yeast by heterogeneous, age-correlated expression of a stress protectant. PLoS Biol. 10 (5), e1001325 (2012).
- Herricks, T., et al. One-Cell Doubling Evaluation by Living Arrays of Yeast. ODELAY! G3 (Bethesda). 7 (1), 279-288 (2017).
- Mast, F. D., Ratushny, A. V., Aitchison, J. D. Systems cell biology. J Cell Biol. 206 (6), 695-706 (2014).
- Edelstein, A. D., et al. Advanced methods of microscope control using µManager software. J Biol Methods. 1 (2), e10 (2014).
