ODELAY: En storskalig metod för multiparameterkvantificering av jästtillväxt

Summary

Vi presenterar en metod för att kvantifiera tillväxtfenotyper av enskilda jästceller när de växer in i kolonier på fast media med användning av tidsfördröjningsmikroskopi betecknad, encellsdubblande utvärdering av levande arrays av jäst (ODELAY). Befolknings heterogenitet av genetiskt identiska celler som växer till kolonier kan observeras och kvantifieras direkt.

Abstract

Mikroorganismernas tillväxtfenotyper är en stark indikator på deras underliggande genetiska egenskaper och kan segregeras i tre tillväxtregimer: lagfas, logfas och stationär fas. Varje tillväxtfas kan avslöja olika aspekter av fitness som är relaterade till olika miljö- och genetiska förhållanden. Högupplösning och kvantitativa mätningar av alla 3 faser av tillväxt är i allmänhet svåra att erhålla. Här presenterar vi en detaljerad metod för att karakterisera alla 3 tillväxtfaser på fast media med hjälp av en analys som kallas encellsdubblande utvärdering av levande arrays av jäst (ODELAY). ODELAY kvantifierar tillväxtfenotyper hos individuella celler som växer in i kolonier på fast media med användning av tidsfördröjningsmikroskopi. Denna metod kan direkt observera populations heterogenitet med varje tillväxtparameter i genetiskt identiska celler som växer till kolonier. Denna population heterogenitet erbjuder ett unikt perspektiv för att förstå genetisk och epigenetisk reglering och svar påGenetiska och miljömässiga störningar. Medan ODELAY-metoden demonstreras med användning av jäst kan den användas på vilken kolonistillande mikroorganism som är synlig genom ljusfältmikroskopi.

Introduction

Växtfenotyper av mikroorganismer är en stark indikator på deras underliggande genetiska kondition till ett givet miljötillstånd. Tillväxten klassificeras klassiskt i 3 olika tillväxtregimer: lagfas, logfas och stationär fastillväxt ¹ . Varje tillväxtfas kan avslöja olika aspekter av fitness som är beroende av olika miljö- och genetiska förhållanden. Till exempel kan fördröjningstid eller hur lång tid en organism tillbringar i lagfas före starten av exponentiell tillväxt, vara en indikation på organismens förmåga att reagera på förändrade miljöförhållanden ² . Fördubblingstiden under logfasstillväxten, den vanligaste metriska av cellulär fitness, avslöjar den totala effektiviteten hos en organisms förmåga att dela upp genom metabolisering och användning av miljömaterial för replikation. Stationär fas, där tillväxt efter logfasen snabbt reduceras, är en annan indikator på fitness, vilket är regelbundetAnvändes som en tillväxtändpunkt i punktbaserade jästtillväxtanalyser.

Flera jästtillväxtanalyser är för närvarande tillgängliga och betraktas som standardmetoder för utvärdering av tillväxtfenotyper i jäst ^{3 , 4 , 5} . Dessa analyser baseras huvudsakligen på metoder för odling av jäst antingen på fast eller i flytande media. På fasta medier överför koloni-pinningsanalyser ett litet antal celler på fast agar med en stift, och jästceller får växa under en bestämd tidsperiod. Kolonierna avbildas därefter och deras storlekar jämförs vid en slutändpunkt ⁶ . Dessa kolonifästningsanalyser har visat sig vara robusta och skalbara för att generera genomomsatta skärmar. På senare tid har periodisk bildbehandling med hjälp av bäddsskannrar och enkla linsreflex-kameror (SLR) inkorporerats i dessa analyser för att registrera kolonitillväxten över tiden ^{7 , 8, 9} . Upplösningen av dessa anordningar förhindrar emellertid dem att detektera enskilda celler och sålunda observerar dessa koloninbindningsanalyser inte direkt fördröjningstid och kan inte observera variation mellan de enskilda cellerna som växer in i kolonier.

Vätskebaserade tillväxtanalyser har också använts för att utföra genombredsskärmar ³ . Koppling av en flytande tillväxtanalys med tidsförlustmikroskopi avslöjade populations heterogenitet vid fördubblingstiden för genetiskt identiska enskilda celler, vilket ger ett viktigt perspektiv för förståelse av genetisk reglering och miljöanpassning. Denna mätning mäter emellertid inte andra aspekter av tillväxt, såsom fördröjningstid och bärkapacitet ¹⁰ . Här presenterar vi en metod för att karakterisera alla tre tillväxtfaser av kolonidannande mikroorganismer på fast media med hjälp av en analys som vi betecknar ODELAY ¹¹ . ODELAY består av utiliZing high-through time-lapse mikroskopi för att spela in bilder av enskilda celler som växer in i kolonier på fast media. Denna population av enskilda celler som växer in i kolonier avslöjar den underliggande befolknings heterogeniteten, vilken inte detekteras av andra mindre känsliga mätningar såsom terminaländpunkts-poäng. Vi demonstrerar metoden på jäst, men ODELAY kan appliceras på någon organism som visar kontrast i ljusfältmikroskopi.

Protocol

1. Framställning av agarosgelagret

1. Väg ut 2 g agaros med hög renhet.
2. Lägg agarosen i en 500 ml flaska och registrera sin kombinerade massa.
3. Beräkna flaskens målmassa plus 2 g agaros med 150 g extremt rent vatten, tillsätt sedan 150 g ultra rent vatten till inom 0,1 g av denna målmassa.
4. Notera flaskans massa plus agaros och vatten.
5. Placera flaskan i en mikrovågsugn och se till att du passar på flaskan med ett löst lock på toppen för att minimera vattenavdunstning under uppvärmning av agarosen.
6. Mikrovågsugnen flaskan i 15 - 20 s burst följt av kort swirling flaskan för att blanda agaros och vatten. Upprepa denna procedur tills lösningen kokar och blandningen är homogen.
   VARNING: Var försiktig så att du undviker skållande hud med ånga som flyr från flaskan. Dessutom kommer flaskan att bli varm, och lämpligt skydd, såsom en autoklavhandske, krävs för att undvika skador.
7. När den smälta agarosen är homogen, väger flaskan igen och tillsätt ultralätt vatten till inom 0,1 g av den ursprungliga massan. Detta kommer att ersätta eventuellt vatten som förlorats på grund av avdunstning.
8. Innan den smälta agarosen stelnar, virvel för att blanda i det tillsatta vattnet för att säkerställa homogenitet.
9. Aliquot 15,2 g agaros i 9 - 50 ml plaströr.
10. Kyl rören tills det behövs.

2. Förberedande ODELAY-agarosmedium

1. Värm 400 ml avjoniserat vatten för att koka i en täckt bägare, på en kokplatta under försiktig omrörning med en magnetisk omrörningsstång.
2. Tillsätt 2 ml 10X-media ( t.ex. jästextraktpepton (YEP) eller komplett tillsatsblandning (CSM)) till en 15,2 g agarosalikvot i ett 50 ml koniskt rör från steg 1.10.
   OBS: CSM-medium tenderar att hålla fast vid glasskivorna. Om du använder CSM-medieformuleringar, sätt 5 μL 50% vikt polyetylenglykol (PEG) i sterilt vatten till medieformuleringen. PEG förhindrar aGar från att hålla fast vid glasskivorna under mögelfrisättning och inhiberar inte jästtillväxt.
3. Lägg till ytterligare 100X näringsämnen, om det behövs, och använd vatten för att få den totala tillsatta volymen från detta steg till 1 ml.
4. Väg agarosalikoten med tillsatt medium och tillsatser innan du placerar det 50 ml koniska röret i kokande vatten från steg 2.1.
5. Efter 16 min tar du 50 ml röret och homogeniserar blandningen med en virvel. Håll locket ordentligt fastsatt på 50 ml koniskt rör.
   OBS! Ett lock på bägaren hjälper till att värma hela röret jämnt, annars bildas en film med fast agaros och eventuellt inte smälter. Även under denna tid är det lämpligt att montera agarosformen ( Figur 1 ).
6. Homogenisera blandningen med hjälp av en virvel.
7. Koka i ytterligare 2 minuter för att säkerställa att all agar blandas och smälts.
8. Vägrör och ersätt eventuell massa förlorad med ultrarent sterilt vatten.
9. Tillsätt 2 ml 10x kolsyraCe reagens (t ex 20% vikt / volym glukos) och virvel för att erhålla agarosmediumlösning.
   OBS: Separering av glasskivor: Vid montering av formen måste man se till att de långa distanserna placeras i formen med rätt orientering. Detta beror på att när lasern skär akryl, tenderar den att skära som en kon, som lämnar delen med något vinklade sidor istället för exakt 90 ° sidor. Sedan när formen är placerad på bänkskivan för att frigöra glaset från agar, ska distansens kant vara i en spetsig vinkel med agar. Den akuta vinkeln hjälper till att komprimera agarets kant bort från den övre delen av glaset, eftersom formkavarens yttre kant svänger runt underkanten (se figur 1 ). Resultatet är en mer konsekvent separation av agar från glasets övre del.
   OBS: Mögelfrigöringsmedel som appliceras på glaset som oljor, kiselsprutor eller till och med kommersiella fönsterbehandlingar bör inte användas eftersom de kommer att förorena s Agarets yta och hämmar eventuellt tillväxten. Dessa metoder tar viss övning att vara konsekventa.
10. Rengör fyra 2 i x 3 i x 1 mm tjocka glasskivor med 70% etanol och torka med tvångsluft.
11. Rengör akrylformar med 70% etanol, torr och montera som visas i Figur 1 . Ta de tre bottenbitarna, som visat, och montera dem så att de två identiska bitarna smörjer den tredje delen ( Figur 1B ). Kläm basstyckena på varje sida med två små bindemedelsklämmor ( Figur 1C ). Placera stolparna i formen och se till att laserskärmen är korrekt placerad ( Figur 1E ).
12. Placera det rengjorda och torkade glasskyddet på formen och håll det på plats medan du placerar en andra glasskiva på andra sidan. Kläm samman enheten med ett större bindemedelsklämma ( Figur 1D ). Kläm ner båda objektglasen med större bindemedelsklämmor (Lass = "xfig"> Figur 1D). Se till att det övre bindsklämman är i kontakt med glasskivan överlappande med akryl.
13. Lägg till resterande bindemedelsklämmor. Återigen, se till att klämmorna kontaktar bilden där den överlappar akrylet ( Figur 1D ).
    OBS! Innan du fyller den monterade formen med smält agar, se till att kanterna förseglas genom pipettering ca 70 | il smält agarmedium längs formens inre sida. Denna agar kommer snabbt att stelna och förhindra eventuella läckor.
14. Fyll på mögel med smält agar, se till att undvika fångstbubblor i formen.
    OBS: Detta kan åstadkommas genom långsamt pipettering av den smälta agar längs formen. Efter det är fyllt, låt formen svalna i 40 min till 1 h vid omkring 23 ° C omgivningstemperatur. Om den får svalna för länge kan agaren bryta i formen.
    ANMÄRKNING: Mögelseparation: Korrekt avlägsnande av gjutformen från den gjutna agaren är avgörande för att säkerställa ett likformigt fast materialAgarplatta för jästtillväxt. Underlåtenhet att säkerställa effektiv separation av formen vid detta steg kommer att orsaka tillväxtskillnader som kan hänföras till brister i den fasta agarplattan. Att öva detta steg ett par gånger rekommenderas.
15. Börja med att ta bort bottenbindsklämman. Ta bort bottendelen av formen som består av de tre smörgåsarna. Håll skivorna genom att komprimera dem och ta bort bindsklämmorna. Var noga med att inte stöta på mögelsidorna när du tar bort bindsklämmorna. Detta kommer att deformera media.
16. Placera formen på kanten av bänkskivan så att formen av formen med den blå pricken är vänd uppåt och i nedre vänstra hörnet ( Figur 1E ). Placera tummarna under akryl och pekfingret på toppen mot formen på insidan.
17. Skjut långsamt och försiktigt upp med tummen mot formen, som om du vrider formen på mellansidan om dess undre kant ( Figur 1F ). Applicera konstantMen sakta ökar trycket. Användare ser en paus och luftbubblan dyker upp längs linjen där det övre glaset täcker mögelavståndet.
18. Efter att ha sett den ursprungliga radelinen fortsätter du att trycka upp tummen och applicera konstant tryck. Agar bör börja bryta sig bort från glaset vid denna punkt ( Figur 1F ). Fortsätt att svänga formen uppåt. Detta lyfter glaset utan att glida det. En linje där agaren skäller bort från glaset bör fortsätta att röra sig bort från den ursprungliga brytlinjen.
    OBS: Vid denna punkt klibbar agar både i botten och på toppen av glaset. Detta kommer ibland att ske med den vänstra kanten. Så länge som deformerade områdena inte ligger i det område där jäst ses, borde det vara bra.
19. När glaset kommer helt fritt, ta det och ta av det helt från formen. Ta sedan bort det andra formstycket med hjälp av en liknande rörelse för att lyfta stycket fritt utan att flytta agaret. Placera bilderna i aSteril tipplåda med lite sterilt vatten med hög renhet i botten. Stäng lådan och förvara vid 4 ° CO / N för användning nästa dag. Om de lagras längre, blir tillväxten inkonsekvent.

3. ODELAY Culture Preparation

1. Lägg ut stammar i en 96-brunnsplatta för O / N-tillväxt.
2. Nästa dag späd 20 μl över nattkultur i 200 μl media för 220 μl total volym i en ny platta.
3. Mät den optiska densiteten vid 600 nm (OD600) av varje kultur i en plattläsare. Använd en plåtläsare och en flytande hanteringsrobot, följ det automatiska utspädningsprotokollet i steg 3.3.1 - 3.3.6. Späd ut kulturerna manuellt i plattan till ungefär 0,1 OD600 (valfritt).
   1. På plåtsläsaren trycker du på "Experiment" under "Skapa nytt". Välj ODELAYDilution.exp och kör experimentet. Ange experimentnamnet som ODELAY "Date" "Time" "Experiment Name" iteration.
   2. Klicka på sTabellen och klicka sedan på ikonen Excel. Spara data till en tummin enhet och överföra den till en robotdator med flytande hantering.
   3. Öppna robotens layout och metodredigerare. Öppna Metodfilen "ODELAYDilution_v1.med". Kör Exekverbara "Convert_SynergyFiles.exe". Ange 0,09 för mål OD600.
   4. Klicka på "Glu Correction" och "Gal Correction" till 0.05. Mät blanka medier i en identisk platta. Klicka på "Generera fil". Välj filen i metodredigeraren. Klicka på stoplight-ikonen för att starta metoden för att öppna runtime-spädningsprogrammet.
   5. Kontrollera att rören är oskyddade och plåtarna har lock bort och dammskydd avlägsnas från spetsarna. Belasta plåtar, rör och spetsar på vätskehanteringsrobottens däck, vilket anges av däcklayouten.
   6. Klicka på "Spela" -knappen för att köra utspädningsprogrammet. Välj rätt antal 50 μL tips. Välj rätt antal 300 μL tips. Vänta på12 min för processen att springa.
4. Ta ut spädningsplattan från roboten, täcka spetsarna och dra ihop 15 ml media rör. Kultur plattan i 5-6 h vid 30 ° C.
5. Ungefär 1 - 2 timmar innan du börjar den andra spädningen, var noga med att slå på inkubationskamrarna för mikroskopet. Låt dem jämviktas vid ° C eller temperaturen som krävs för experimentet.
6. Upprepa utspädningsstegen 3,3 - 3,4, men utspädda kulturer till en OD600 av 0,01-0,02 för att spotta kulturerna på agarosglas.
7. Täck utspädningsplattan med en metallfrysningstätning.
8. Sonikera utspädningsplattan i ett isbad i 30 s med plattan som flyter i isvatten med hjälp av en centrifugemetallspackel för att hålla plattan ( bild 2A ). Överför de sonikerade kulturerna från utspädningsplattan till en platt bottenplatta. Etikett 4 x 96 brunnar platta plattor 1, 2, 3 och 4 ( Figur 2B ).
   1. Överför 150 &# 181; L av utspädningsplattan från brunnarna A01 - D06 i brunnarna C04 - F09 på plattan märkt 1. Överför sedan 150 μL utspädningsplattan från brunnarna A07 - D12 i brunnarna C04 - F09 på plattan märkt 2. Överför sedan 150 μl Av utspädningsplattan från brunnar E01 - H06 i brunnarna C04 - F09 på skylten märkt 3. Överför slutligen 150 μL av utspädningsplattan från brunnarna E07 - H12 till brunnar C04 - F09 av skylten märkt 4.
9. Gå vidare till steg 4, Spotting on Agar.

4. Spotting på agar med hjälp av en automatiserad vätskespottrobot

1. Ta bort agarosglasen som lagras vid 4 ° C / N (från steg 2.19) från deras fuktade sterila pipettlådor.
2. Om så behövs, trimma agarosmediums hörn med ett rent rakblad så att de passar på glidkammaren.
3. Ta bort glidklemmen från fästet. Placera agarplattan försiktigt i det försänkta området på scenkammarfästet.
   OBS! Kontrollera att ellerIentation av bilden är konsekvent från experiment till experiment.
4. Kontrollera att klämman spolas i kammarens botten. Om det är krökt kan det hända att glidskenan inte sitter helt i det försänkta området. Placera nivelleringsavståndet i spottrobotens mittplatta. Denna spacer ger kontakt för nivelleringsskruvarna så att glidkammaren kan jämnas med spetsarna.
5. Placera plattorna på bordet i enlighet med deras kvadrant. Plattorna 1, 2, 3 och 4 beställdes från vänster till höger ( figur 2B ).
6. Placera tipsen så att de inre 24 brunnarna C04 - F09 är upptagna med tips i 4 tomma tipslådor. En femte låda måste ha ett spets i C10-positionen, samt 4 tips med sina ändar avskurna i A01, A12, H01 och H12 positionerna. Dessa 4 avskurna tips ger stabilitet för spetsplattans klämma ( Figur 2C och 2D ).
7. Ta bort övre kåpan från slIde kammare mount.
8. Placera den första tipsstämpeln i startplatsen för robotkontrollspottningsprogrammet. Detta borde stansa ett hål i agarosen som senare används för att anpassa ursprungskoordinaten. Placera plattan 1 på den flytande hanteringsroboten för att fånga den första kvadranten. Kontrollera att locket är avlägset och fortsätt spottprogrammet.
9. Kontrollera att alla fläckar är närvarande. Vänta också ~ 30 s för att de ska torka. När fläckarna är ca 1 mm i diameter kan programmet fortsätta. Töm de använda tipsen i biohazard-behållaren och lägg färskt tips på roboten. Byt ut plattan 1 för 2: ^e kvadrantplattan.
10. Upprepa för den tredje kvadranten. Och upprepa igen för den ^fjärde kvadranten.
11. När fläckarna är torra, byt ut glidkammarens lock och vänd apparaten över.
12. Montera slanganslutningarna med ett luftfilter.
13. Placera en glasskiva på kammarens övre sida.
    OBS! Den här bilden är avgörande för reduceringNg värmeflödet till agar och minimerar bildandet av kondensation på kammarens objektiva täckglidssida. Glöm inte detta omslag. Beroende på mikroskopkonfigurationen förhindrar den här täckskyddet att värme från belysningssidan orsakar kondens på målsidan.
14. Placera en fläkt för att blåsa hetluft på kammarens objektiva sida. Denna fläkt förhindrar att kondens bildas på locket. Ställ in luftflödet genom bubblan till 10 ml / min.

5. Kör ODELAY på mikroskop

1. Kör skriptet "ODELAY_Microscope_Control.m".
2. Klicka på "Shutter" för att öppna den överförda lampan och sedan "Focus" -knappen för att initiera hög kamerahastighet ( Figur 3A , Röda pilar).
3. Klicka på "Gå ursprung" och flytta scenen för att hitta ursprungsmarkeringen som stansades i agar.
4. Flytta sedan något till höger tillFokusera på jästceller som ses i område E07.
5. Flytta tillbaka till ursprungsstämpeln och centrera den i synfältet.
6. Ställ in ursprunget till det här värdet genom att trycka på knappen "Set" ( Figur 3A , Blåpilar). Nu flyttar du till läge H18 och fokuserar med hexskruven närmast den platsen. Flytta sedan till läge L07 och fokusera med hjälp av hexskruven närmast den platsen. Gå sedan till position E07 och fokusera med hjälp av hexskruven närmast den platsen.
7. Upprepa steg 5.5 - 5.7 efter behov tills dessa positioner förblir i fokus.
8. Kontrollera fokus i mitten och vid kanterna på fläckarna E12, H12, L12. Justera autofokusområdet om fokus Z-värdena, som anges med Z-värdet, är större än ± autofokusområdet ( t.ex. , ställ autofokusområdet till 60 μm Z-värdet för en mittpunkt som är större än ± 40 | im).
9. Tryck på återställningsknappen eftersom detta aktiverar knappegenskaperna och tryck sedan påODELAY ( Figur 3A , gröna pilar). Välj katalogen för att spara data. Se till att tillräckligt med bilutrymme är tillgängligt.
   OBS! Mikroskopet samlar in data i 48 timmar, eller tills programmet är stängt.

6. Bearbetning av ODELAY-data

1. Öppna ODELAY_IPT.exe eller använd scriptet ODELAY_Image_Processing_Tool_v7.m-skriptet ( Figur 3C ).
2. Gör ett * ODELAYExpDisc.xlsx Excel-kalkylblad.
3. Nämn experimentet i cell Bl.
4. Välj bildkatalog där bildfilerna E07 - H18 är lagrade.
5. Välj datakatalogen där data kommer att skrivas.
6. Skriv datum då experimentet startades i cell B04. Använd formatet MM / DD / ÅÅÅÅ.
7. Skriv ut spädningstiden i cell C04. Den här tiden är ungefär fem minuter innan den första bilden samlas in. Använd formatet HH: MMpm där HH är för h och MM är för min.
8. Lägg till i stamnamnen enligt tO källplattan (steg 3.1). På grund av det sätt på vilket stammar upptäcks, ombildas de på ODELAY-agarosliden. Celler i kalkylbladet B31-B126 är källplattan, medan cellerna C31 - C126 är spotplatserna i ODELAY agarplattan.
9. Tryck sedan på "Processdata" -knappen och välj den * ODELAYExpDisc.xlsx som just var klar.
10. Vänta 16-24 h beroende på datorsystemet som används för att bearbeta data.
11. När bilderna bearbetas visas en katalog med namnet "ODELAY Well Data" och en fil "* _Index_ODELAYData.mat". Tryck på knappen "Ladda data" och välj filen "* _Index_ODELAYData.mat" som just skapades. Detta laddar datasatsen som just behandlades. "*" I filnamnet kommer att listas enligt experimentnamnet som skrivits in i Excel-kalkylbladet.
12. Efter att ha laddat in data, inspektera den med hjälp av tidsfältet som finns längst ner, klicka på en bildtorg för att se tillväxtkurvor fEller den platsen, eller hitta en intressant intresse i listan till vänster och ladda sedan bilderna för den listan.
13. Generera histogram av befolkningstillväxtparametrar genom att trycka på "Violin Plot" -knappen. Detta kommer att generera en plot som visas i Figur 4 eller Figur 6 .

Representative Results

Exempelbilder av jästtillväxt i time-lapse-mikroskopi visas i figur 3B . Efter bearbetning av tidsförlängningsbilderna visas en representativ datamängd som jämför jäststammar BY4741 & BY4742 i Figur 4 . I det här exempeldatasetet är det mycket liten variation i fördubblingstiden mellan olika positioner på plattan. Om agarosmediet framställes dåligt skulle en uppenbar avvikelse i både fördubblingstiden och fördröjningstiden vara uppenbar i de spotpositioner som sammanfaller med den deformerade regionen av agarosgelén. Medan fördubblingstiderna verkar vara relativt likformiga, visar detta exempel variationer i lagtidsmätningar. En mer konsekvent datasats visas i Figur 6 . I denna dataset är både fördröjningstid och fördubblingstid enhetlig.

Filer / ftp_upload / 55879 / 55879fig1.jpg "/>
Figur 1: Agar Mould Assembly.
Komponenterna i agarformen visas i ( A ). Montera basen enligt bild ( B ) och klistra sedan på basen med små bindemedelsklämmor. Placera de längre stående bitarna i kaviteten på basen ( C ) och läger sedan glidarna i formen som visas i ( D ). En sidovy som visar vinkeln på formen och orienteringen av formskärmen som erfordras för konsekvent separation av agar från glasskenan ( E ). Observera tummens och framkantenes position, liksom den raka linjen i agar som skiljer sig från sliden ( F ) och notera den horisontella pilen. Separationslinjen ska röra sig jämnt i riktning mot de vertikala pilarna. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

= "Jove_content" fo: keep-together.within-page = "1">
Figur 2: Sonication och Spotting Method.
Sonikera plattan i isvatten och använd en centrifughinkhållare för att stödja plattan ( A ). Lägg plåtarna från steg 3.8.1 för spotting på agarosplattan ( B ). Ordna också tipsen så att den vänstra, mest tipsbara rutan har ett spets i position C10 och sedan fyra andra spetsar med sina ändar avskurna så att de inte kollapsar platthållaren ( C ). Placera de återstående spetsarna i fyra lådor så att de inre 24 spetspositionerna är upptagna ( D ). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

55879fig3.jpg "/>
Figur 3: Grafisk användargränssnitt ODELAY.
En skärmbild av det grafiska användargränssnittet för "ODELAY_Microscopecontrol.m" ( A ). Detta gränssnitt möjliggör övervakning av kameran och för justering av mikroskopbelysningsinställningarna för epifluorescerande och ljusfältlägen. Röda pilar pekar på knapparna Focus and Transmitted som aktiverar kameran för att snabbt skaffa bilder och öppna den överförda lampan. Blåpilar används för att flytta scenen för ursprunget och sedan ställa in ursprunget med knappen "Starta" och "Set". Gröna pilar pekar på "Reset" och "ODELAY !!!" Knappar som återställer ODELAY bildlägen till de aktuella förhållandena och initierar ODELAY bildsamling. Time-lapse bilder av jäst växer på fast medium vid 0, 3, 6 och 9 timmar efter spotting ( B ). En skärmbild av det grafiska användargränssnittet för "ODELAY_IPT.m" eller th E ODELAY bildbehandlingsverktyg ( C ). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 4: Exempel ODELAY Output.
Denna dataset jämför stammar BY4741 och BY4742 på YPD-media. Denna siffra är ett exempel på en välberedd agarosdia; Inställningarna för autofokus är dock inte optimala. Data som presenteras i varje kolumn, från vänster till höger, är: bärkapaciteten i log ₂ i koloniområdet; Fördubblingstid, givet i min; Och fördröjningstid, angiven i min. I det här exemplet stiger fördubblingstiderna för alla fläckar på agarbilden väl med en liten ökning av fördubblingstiden mot kolonnen. Fördröjningstider varierar emellertid kraftigt i denna dataset._upload / 55879 / 55879fig4large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 5: Growth Curve-exempel.
Detta exempel visar hur dålig inledande fokus kan orsaka att den uppskattade lagringstiden (t- _lag ) ökar ( A ), medan den intilliggande positionen visar en kortare fördröjningstid ( B ). T _d är fördubblingstiden i min, och t _lag är fördröjningstiden i min. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 6: Exempel på väl utfört testförsök.
En eExempel på BY4742-stammen testas efter att en tungstenhalogenlampa har bytts ut med en diodbelysning och att autofokusen är korrekt inställd. Alla fördubblingstider verkar överlappa väl och fördröjningstiderna verkar vara konsekventa. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

ODELAY-analysen har flera kritiska punkter för att säkerställa reproducerbara och pålitliga fenotypiska mätningar. Den första kritiska punkten är konsekvent framställning av jästkulturerna. Försiktighet måste vidtas för att skörda jästcellerna från logaritmisk tillväxt. Om kulturerna är mättade, kommer deras heterogenitet att öka, vilket kan försvaga heterogeniteten orsakad av genetiska eller miljömässiga (till exempel kolkälla) faktorer ¹¹ . Den andra kritiska punkten är konsekvent förberedelse av media. I allmänhet bör en stor volym 10X stockmedia-lösning genereras och sedan användas över tiden för att minimera batcheffekter. Formulering av viktmedia, när det är möjligt, bidrar till att förbättra överensstämmelsen i mediet över tiden genom att säkerställa agarets densitet och det totala vattenhalten i agarosen kan övervakas noga. Den tredje kritiska punkten innebär att minimera eller eliminera eventuell mekanisk deformation av agarosen migdiam. Mekanisk deformation av mediet kommer oftast att ske under separation av agarosen från glasskivorna. Som med många laboratorietekniker krävs övning för att behärska detta steg.

Variation i fördröjningstiden som avbildad i figur 4 är ofta relaterad till en av de tre faktorerna: mekanisk deformation av agarosmediet, variation i den formade agartjockleken eller en instabil ljuskälla. Om agarosmediet varierar i Z-höjd över den prickade matrisen, kan höjdsvariationen överväldiga autofokusrutins intervall, vilket gör att de ursprungliga bilderna blir lite out of focus. Kontrollera därför fokushöjden vid flera fläckar i mitten och längs kanterna på den prickade gruppen för att säkerställa att autofokusrutinen har tillräckligt Z-intervall för att hitta fokus. Vid behov, använd autofokuspanelen för att öka fokusområdet och öka antalet fokuseringssteg.

En tredje möjlig förutsättningJon som kan leda till dåligt fokus är en instabil eller flimmerande ljuskälla, vilket kan störa det beräknade fokusvärdet för en viss Z-höjd. Tungstenhalogenlökar tenderar att flimma bra innan glödlamporna brinner ut. Effekten av dåligt fokus observeras i ett exempel där tillväxtkurvorna sjunker mellan de första och andra tidpunkterna ( Figur 5 A ), medan den intilliggande platsen inte har samma dopp ( Figur 5 B ). I detta fall lindades det dåliga fokusförhållandet genom att ersätta volframhalogenljuskällan.

I praktiken har författarna funnit att glödlamporna behöver bytas ut varje 500 h eller ungefär varannan månad när mikroskopen är i kraftig användning för att minska flimmern på 100W tungstenhalogenlampor. För att undvika dåliga fokusproblem från en blinkande lampa, byt ofta tungsten halogen ljuskälla eller byt ut halogenlampan med en diod ljuskälla. EnExempel på en dataset som visar låg variation i fördubblingstider samt mer enhetliga fördröjningstider visas i Figur 6 . Denna dataset togs med en diodbelysning som ger en mer stabil belysning över tiden medan autofokus utförs.

Medan många av de punkter som nämns här för att optimera mediepreparationen kan tyckas vara uppenbara, replikerar de flesta storskaliga skärmarna inte bra med varandra ^{8 , 11} . Därför har vi noga beskrivit beredningen av kulturer och agarosmedia så att mer reproducerbara fenotypiska skärmar kan genereras.

ODELAY-analysen är för närvarande begränsad i genomströmning jämfört med pinnebaserade analyser såsom syntetiska genetiska arrays eller Scan-O-Matic-analysen. Medan dessa metoder ökar antalet stammar som mäts saknar de förmågan att lösa enskilda celler aNd kan således inte mäta population heterogenitet som vi observerar inom klonala jäststammar. Ursprunget för denna population heterogenitet förstås inte för närvarande, men sammanslagningen av teknik och beräkning som demonstreras här erbjuder en möjlighet att objektivt adressera de underliggande cellulära mekanismerna ¹² .

Författarna vill notera att ODELAY för närvarande endast är optimerad för ett specifikt mikroskopmärke och kroppstyp. Ändring av ODELAY för andra mikroskopssystem är rakt framåt men kräver kunskap om API ^{13 med} öppen källkod. Både API- och ODELAY-skripten skrivs emellertid för att enkelt kunna anpassas till olika system och experimentella analyser.

Medan ODELAY ursprungligen utvecklades för jäst har vi kunnat utnyttja den utan modifiering för att observera tillväxten av Mycobacterium smegmatis . Observation av de andra kolonidannande mikroorganismerna ärMöjligt med ändringar i källkoden som tillhandahålls ¹¹ . I allmänhet är ODELAY ett kraftfullt och flexibelt verktyg för att jämföra mikroorganismer odlade under olika miljöförhållanden och genetiska störningar.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose UltraPure	ThermoFisher	16500500	Gel Temp 36C, Gel Strength (1%) 1.2 g/sq cm
Yeast Extract Peptone (YEP)	Fisher Scientific	BP1422-2
Complete Suplement Mixture (CSM)	Fisher Scientific	MP114560222
Polyethylene Glycol 3350 (av. mol. wt. 3000-3700)	SigmaAldrich	P2906
Yeast Strain BY4741	ThermoFisher	95400.BY4741
Yeast Strain BY4742	ThermoFisher	95400.BY4742
50 mL Falcon tubes	Corning	430291	1 case
15 mL Falcon tubes	Corning	352096
2 x 3 inch 1.0 mm thick slides 1/2 gross	VWR	48382-179
96-well plate flat bottom	Corning	353072
Hydra liquid handleing robot	Thermo	1096-DT-100
Hamilton Microlab Star Liquid Handleing Robot	Hamilton
hydra 100 mL tips Extended Length DARTS	Thermo	5527
Synergy H4 Plate Reader	Biotek	H4MLFAD
Leica DMI6000 B Microscope	Leica
Leica 10X/0.3NA objective	Leica	11506289
Hamamatsu ORCA Flash 4.0 Camera	Hamamatsu	C11440-22CU
MATLAB with image processing tool box	Mathworks
MicroManager	Open Imaging		https://micro-manager.org/
ODELAY Microscope Control (MATLAB scripts and GUI)			www.aitchisonlab.com\ODELAY for Matlab scripts and software
ODELAY Microscope Chamber			www.aitchisonlab.com\ODELAY for Mechanincal Drawings
ODELAY Agar Molds			www.aitchisonlab.com\ODELAY for mold drawings