Estudo das interações proteína-proteína em pesquisa de autofagia

Summary

Apresentados aqui são duas técnicas de pesquisa de interação da proteína-proteína baseada em anticorpos: imunofluorescência e imunoprecipitação. Estas técnicas são apropriadas para estudar interações físicas entre proteínas para a descoberta de novos componentes das vias de sinalização celulares e dinâmica de compreensão da proteína.

Abstract

Interações da proteína-proteína são importantes para cascatas de sinalização celular de compreensão e identificação via novela componentes e dinâmica da proteína. A maioria dos celulares atividades exigem interações físicas entre proteínas. Para analisar e mapear essas interações, foram desenvolvidas várias técnicas experimentais como ferramentas de Bioinformática. Autofagia é um celular, mecanismo que permite que as células lidar com estressores diferentes, incluindo hipoxia, produtos químicos e nutriente privação de reciclagem. Para entender melhor a sinalização de eventos relacionados a autofagia e descobrir novos fatores que regulam a complexos de proteínas em autofagia, realizamos telas de interação da proteína-proteína. Validação destes resultados de rastreio requer o uso de técnicas de imunoprecipitação e imunofluorescência. Neste sistema, interações específicas relacionadas a autofagia da proteína-proteína que descobrimos foram testadas em Neuro2A (N2A) e HEK293T linhas de celulares. Detalhes dos procedimentos técnicos utilizados são explicadas neste documento visualizado experimento.

Introduction

Macroautophagy (autofagia, neste documento) é um mecanismo de estresse celular que se caracteriza por sequestro de citoplasma em massa, proteínas e organelas em vesículas de membrana dupla chamadas vesículas autophagic. Através da fusão da camada externa da membrana dupla, vesículas autophagic e sua carga são entregues aos lisossomos e degradado nele¹. Autofagia ocorre em níveis basais baixos em todos os tipos de células e em todos os organismos, realizando funções homeostáticas como degradação proteica e volume de negócios das organelas (por exemplo, as mitocôndrias). Sob condições que levaram ao estresse celular, tais como a fome, a autofagia é rapidamente upregulated e permite que a célula manter os níveis de energia e metabolismo básico^1,2,3.

Cerca de 30 genes de autofagia foram clonados de levedura e seus produtos de proteína foram mostrados a desempenhar um papel em várias etapas do processo de autophagic, incluindo a nucleação de vesículas, a expansão, a fusão de vesículas atrasado endosome/lisossomo, e degradação de carga ^{4 , 5}. Orthologs da maioria destes genes têm sido identificados e estudos em vários organismos confirmaram a preservação de suas funções celulares⁶. Estudos na última década que mostraram vários autofagia relacionados com complexos de proteínas e interações da proteína-proteína existem e que eles governam vias de autofagia de forma intrincada e controlada. Interseções, backups, feedback e feedforward mecanismos existem, e eles permitem que a célula coordenar autofagia com outros eventos relacionados (tais como biogênese lisossoma secreção vesicular, CDDP triagem e transporte⁷, etc.) Em uma tela de imparcial fermento-dois híbrido usando a proteína de autofagia ATG5 como uma isca, (ATG5 é uma proteína de autofagia chave envolvidos no sistema de conjugação de E2, como que medeia LC3 lipidation de fome induzida autofagia), nós identificamos Receptor ativado C-quinase 1 (RACK1; GNB2L1) como um forte interactor e um componente de autofagia romance⁸. Importante, a tela mostrou que a interação ATG5-RACK1 era indispensável para indução de autofagia por indutores de autofagia clássica (ou seja, à fome e mTOR inibição).

Métodos baseados em imunofluorescência são comumente usados para monitorar as interações da proteína-proteína. Estas técnicas são principalmente à base de anticorpos e ajudam a visualizar as interações e confirmar suas localizações celulares. Nesta técnica, fluorescente tag anticorpos conjugados que são específicos para as proteínas de interesse são geralmente usadas para a coloração específica. Cada proteína pode ser rotulada com anticorpos acoplados a corantes fluorescentes diferentes. Usando anticorpos específicos de proteínas, uma sobreposição no sinal quando imagens são mescladas indica a localização co das proteínas sob microscopia confocal. A técnica é aplicável para as células ou tecidos mesmo. Técnicas de imunofluorescência fornecem pistas sobre a dinâmica de interação e ajudam a identificar o tamanho e a distribuição de complexos de proteínas, enquanto o rastreamento de alterações gerais na morfologia celular sob diferentes condições de⁹. Imunoprecipitação é outra técnica comumente usada de anticorpo-baseado que permite a análise de interações entre proteínas¹⁰de dado. Usando esta técnica, as proteínas de interesse são isoladas de células ou tecidos extrai usando anticorpos específicos, originando a precipitação de proteínas em um complexo ou em contacto com uma proteína de interesse. Co-imunoprecipitação, onde a proteína e sua co interactor são detectados, revela não só a interação entre as duas proteínas, mas pode medir a sua força de interação sob circunstâncias diferentes¹¹.

Este protocolo descreve em técnicas de chave de detalhe que foram usadas para confirmar e caracterizar a interação ATG5-RACK1 e RACK1-LC3. O foco é sobre as técnicas de imunofluorescência e imunoprecipitação, com ênfase de passos críticos e armadilhas para pesquisa de autofagia, bem como sugestões de resolução de problemas.

Protocol

1. imunofluorescência

1. HEK293T manter rim embrionário humano células em meio de glicose alta DMEM, e pilhas de neuroblasto N2A do rato em DMEM baixa média de glicose, em um 5% CO ₂-umidificada incubadora a 37 ° C. Complementar os meios de cultura com soro bovino fetal 10% inactivadas pelo calor (FBS), antibióticos (50 U/mL penicilina, estreptomicina 50 de µ g/mL) e L-glutamina (2mm).
2. Separar as células usando a tripsina 0,25%. Primeiro remova a mídia de cultura celular e depois lavar as células com 10 mL estéril fosfato salino (PBS) e incube com 1 mL de tripsina a 37 ° C por 5 min. inativar tripsina, adicionando 2 mL de meio de DMEM.
3. Lavar a placa bem pipetando. Remover 10 µ l de solução de célula e misturá-lo com 10 µ l de trypan azul. Contar o número de células vivas, usando um hemocytometer.
4. Ambos HEK293T e N2A é linhas de células aderentes, no entanto, as células HEK293T desanexar da placa facilmente. Portanto, se trabalhar com linha de celular HEK293T, casaco do coverslides com estéril filtrados 0,01% poli-L-lisina antes da semeadura das células.
   1. Lugar coverslides estéril em uma placa de Petri de 10 cm. Adicione a quantidade apropriada de solução de poli-L-lisina sobre cada coverslide. Incubar a coverslides com solução de poli-L-lisina durante 10 min.
   2. Remover a solução de poli-L-lysine.
      Nota: Poli-L-lisina é re-utilizável; é opcional coletar e reutilizá-la para novas experiências. Desde que a poli-L-lisina é tóxico, esperar até que todos da solução sobre o coverslides completamente evapora e recuperar o poli-L-lisina.
   3. Lavar o coverslides com PBS estéril.
5. Adicionar 1 mL de DMEM em cada poço de uma placa de 12. Coloque um coverslide em cada poço.
6. Semente 20.000 células/poço, gota a gota, agitando a placa ao mesmo tempo para uma distribuição homogênea de células sobre o coverslides. Manter as células no CO ₂ incubadora a 37 ° C e adicionar a droga para que o tempo de incubação no total não ultrapasse 48 h, ou seja, para 3h tratamento Torin, adicionar a droga na semeadura de post 45 h. Estudos de interação de
   1. para RACK1-LC3, Torin 1, rapamicina e fome foram usados como indutores de autofagia. As células foram incubadas com 1 Torin para 3h (concentração final nM 250); com rapamicina para 16 h (concentração final nM 200); e com Earle ' s Balanced Salt solução (EBSS) por 2h para células de fome.
      Nota: Incubação em DMEM com 10% FBS foi usado como a condição de controle.
7. Após 48 h de tempo de incubação total, remova a mídia sobre a coverslides e lave-os com 1 mL de PBS.
8. Para consertar as células, Incube as celulas com 1 mL gelo frio estéril filtrada 4% paraformaldeído (PFA) em 1X PBS (pH 7,4), por 20 min em temperatura ambiente sem qualquer agitação.
   Desde que o PFA é sensível à luz, manter (importante) a placa no escuro durante o período de incubação; pode ajudar a cobrir o prato com papel alumínio. Além disso, PFA é tóxico, portanto, trabalhar sob uma coifa ao reparar as células.
   Nota: Tenha em mente que a fixação passo em experimentos de imunofluorescência deve ser otimizada, como os anticorpos específicos podem funcionar melhor usando agentes de fixação diferentes e condições.
9. Depois de 20 min de incubação de PFA, primeiro remova a solução PFA no coverslides e depois lavar cada amostra 3 vezes com 1 mL de PBS filtrado estéril. At esta etapa, (importante) lavar os poços, um por um, para não deixá-los secar. Evitar a secagem desde que irá interferir com reações subsequentes das células, alterar a morfologia da célula e aumentar os sinais inespecíficos.
10. Quando a lavagem for concluída, mantenha as amostras em 1 mL de PBS na Ice.
11. Preparar a solução de bloqueio: PBS com saponina de albumina de soro bovino (BSA) e 0,1% 0,1%.
12. Cobrir uma placa de 6 com película de parafina. Certifique-se de que a placa inferior é suave após o revestimento de película de parafina. Rotular a placa 6.
13. Usando uma pinça, o coverslides de transferência das placas 12-poços para as placas de 6-poços cobertos com a película de parafina.
14. Descartar a PBS na coverslides e adicionar 100 µ l de solução para cada coverslide para permeabilização de bloqueio. Incubar as amostras no gelo por 30 min.
15. Preparar o anticorpo primário em solução de bloqueio. Antes das experiências, otimizar as diluições de anticorpo para definir as melhores concentrações de trabalho para a coloração.
    Nota: por exemplo, LC3 anticorpo é usado com uma diluição de 1: 100 em solução de bloqueio.
16. Após a incubação de 30 min, descartar a solução de bloqueio e lavar as amostras delicadamente com 1 mL de PBS uma vez.
Adicione 100 µ l de solução de anticorpo primário para cada coverslide de
17. . Incubar as amostras à temperatura ambiente durante 1 h, um agitador.
    Nota: O tempo de incubação com o anticorpo primário deve ser otimizado. Dependendo o anticorpo, uma incubação overnight a 4 ° C pode ser preferível. É melhor incubar um agitador suavemente (100 rotações/min) para distribuir igualmente o anticorpo sobre o coverslides.
18. Após a incubação com o anticorpo primário, lavar as amostras individualmente, 3 vezes com 1 mL de PBS.
19. 1: 500 preparar anticorpo secundário no bloqueio de solução (otimizações de diluições do anticorpo secundário podem ser necessárias). Aqui, anti-coelho IgG Alexa Fluor 568 utilizou-se como um anticorpo secundário de anti-coelho.
    1. Incubar as amostras com a 100 µ l de solução anticorpo secundário por 1h à temperatura ambiente em um shaker. Uma vez que os anticorpos secundários fluoróforo-etiquetados são sensíveis à luz, (importante) manter a solução no escuro. Colocar as amostras no escuro durante e após a incubação do anticorpo secundário.
20. Após a incubação do anticorpo secundário, lavar a placa 3 vezes com PBS.
    Nota: Baed em experiência, alguns anticorpos têm sinais de fundo elevado que não podem ser eliminados pela PBS lava. Se lidar com tal um anticorpo, depois passo 1.21, manter as amostras em PBS a 4 ° C, durante 6 h pode ajudar.
    1. Se necessário, manchar as células com um corante de ligação a DNA, tais como a Hoechst, para marcar os núcleos.
21. Para manchar mais do que uma proteína, aplicar o mesmo procedimento a partir da etapa 1.16 para a segunda proteína.
    1. Certifique-se que não há nenhuma reatividade de espécies entre os anticorpos ao realizar a coloração com mais de um anticorpo (por exemplo, uso do mouse e coelho anticorpos).
       Nota: Aqui, RACK1 está manchada como a segunda proteína usando anti-RACK1 anticorpos primários e os secundários anticorpos IgG Alexa Fluor 488 anti-rato usando as mesmas concentrações acima mencionadas.
22. Preparar a solução de montagem: 50% glicerol em 1X PBS. Filtrar com um filtro de 22 µm.
23. Limpe as lâminas com etanol utilizando um cotão e adicionar solução de montagem 10 µ l de cada slide. Usando uma pinça, coloque o coverslides em cada dropso que o lado com as células está em contato direto com o meio de montagem. Descartar a solução de montagem excesso suavemente usando toalhetes fiapos.
24. Selar o coverslides com um esmalte transparente. Primeiro, estabilizar o coverslides adicionando gotas de esmalte nas 4 bordas e depois selá-los completamente.
25. Analisar as amostras sob um microscópio confocal ou fluorescente logo que possível, desde que o sinal fluorescente pode descorar depois de algumas horas.

< classe p = "SaritaE_TITLE "> 2. Imunoprecipitação

1. desanexar e contagem das células como descritas nos passos 1.2 e 1.3.
2. De se trabalhar com células HEK293T, sementes 4 milhões de células para cada condição em placas de Petri 15 cm. Se trabalhar com células N2A, sementes de 5 milhões de células em placas de Petri 15 cm. Incubar as células numa incubadora de CO ₂ a 37 ° C até o final do experimento.
3. Tratar as células com as drogas relevantes ou condições por um prazo definido para que o tempo de incubação total das células não exceda 48 h.
   Nota: Para os testes de imunoprecipitação, neste estudo, as células foram tratadas por 3h com Torin 1 (250 nM), 16 h com rapamicina (200 nM) e 2 h com EBSS. DMEM com 10% FBS foi adicionado às células, como o controle.
4. Após 48 h de tempo de incubação total, remova a mídia e as células da colheita. Desde HEK293T células desprender facilmente do prato, lavar a placa com gelo frio PBS pode ser adequado para a colheita. No entanto, as células N2A são mais resistentes ao desprendimento; Raspe a célula para ajudar a colher as células.
   1. Recolher todas as pilhas em tubos microcentrifuga.
5. Amostras de centrífuga a 16.000 x g durante 15 min a 4 ° C. descartar o sobrenadante e lavar o sedimento com 1 mL de PBS por re-suspenso em pipetando.
6. Repita a etapa de centrifugação, mas para a maior velocidade de centrifugação a 4 ° C, durante 15 min. descartar o sobrenadante.
7. Buffer de ensaio de imuno-precipitação de rádio (RIPA) preparar antes de começar o experimento.
   Nota: Existem 3 tipos de amortecedor de RIPA; escolha de acordo com a intensidade de interação das proteínas sendo investigado (ver fórmulas abaixo).
   1. Se houver uma interação da proteína-proteína forte, escolha o amortecedor de RIPA regular.
   2. Se a interação é fraca, escolha suave RIPA ou mais suave RIPA.
      Nota: As receitas desses buffers são nas etapas a seguir. Todos os buffers que são usados em testes de imunoprecipitação devem ser complementados com inibidores de protease.
      1. Preparar o amortecedor de RIPA regular usando 1% NP-40, 150 mM NaCl, Deoxycholate do sódio de 0,5% e 0,1% sulfato dodecyl de sódio em 50 mM Tris de pH 8.
      2. Preparar suave RIPA Buffer usando Deoxycholate do 1% NP-40, 150 mM NaCl e 0,25% de sódio em 50 mM Tris de pH 7.5.
      3. Preparar o amortecedor de RIPA mais suave usando 1% Triton X 100, 137 mM de NaCl, 1% de glicerol e 1mm ortovanadato de sódio em 50 mM Tris de pH 7,4.
8. Depois de escolher o amortecedor RIPA apropriado, complementar o buffer com inibidores de protease (RIPA +). Em seguida, lisar as células com 3x o volume do centrifugado em RIPA +.
9. Vortex a suspensão por 15 s. mantê-lo no gelo por 5 min. repetir o vórtice e confeiteiro 5 vezes e então Centrifugar as amostras a 16.000 x g durante 15 min a 4 ° C.
10. Transferir o sobrenadante para um tubo limpo microcentrifuga e centrífuga para remover os resíduos de célula remanescente. Transferir o sobrenadante para um tubo limpo.
11. Diluir a proteína lysates 01:50 e prepara uma placa de 96 poços com espaço em branco e padrões. Diluir as amostras.
    1. Amostras de mistura com Bradford solução 01:20. Incube por 15 min no escuro.
    2. Medir a densidade óptica em comprimento de onda de 595 nm. Calcular a concentração de proteína usando valores de absorvância para cada amostra.
12. o dia antes da colheita das células, casal mais grânulos de proteínas com anticorpos que são específicos para a proteína de interesse.
    1. Cortar a borda de uma ponta de 200 µ l com uma tesoura e use 25 µ l de chorume o talão para cada condição.
    2. Lave os grânulos de uma vez com 1 mL de PBS, uma vez com 1 mL de tampão RIPA e uma vez com 1 mL RIPA +. Realizar as etapas de lavagem a 3.300 x g, 4 ° C, durante 1 min.
    3. Após a última lavagem, adicione 300 µ l de RIPA + sobre as contas e adicione 1,5 µ g anticorpo é específico para a proteína a ser puxado para baixo.
    4. Incubar os tubos a noite a 4 ° C, em rotacao (20 rotações/min).
       Nota: Aqui, ATG5 era immunoprecipitated usando anticorpos específicos anti-ATG5.
13. Após a incubação overnight de grânulos com o anticorpo, lave os grânulos de uma vez com PBS, uma vez com a RIPA e uma vez com RIPA + conforme descrito na etapa 2.12.2.
14. Adicionar 2 mg de proteína lisada em grânulos para cada condição e completa o volume total de 300 µ l com RIPA + tubo de buffer /. Incubar os tubos durante a noite em um rotador a 4 ° C.
15. Após a incubação, lave os grânulos como descritos anteriormente (etapa 2.12.2).
    1. Após a última lavagem, use a ponta da pipeta menor para remover todo o sobrenadante sem tocar os grânulos.
    2. Adicionar 10 µ l de 3 x tintura de carregamento: 6% SDS, 30% de glicerol, 16% β-Mercaptoetanol e azul de bromofenol 0,1% em 1M Tris-HCl pH 6,8.
16. Preparar os controles de entrada usando o mínimo de 100 µ g proteína lisada para cada condição. Equalizar os volumes de amostra usando a água e adicionar o volume apropriado de 3x carregando tintura.
17. Amostras de ferver a 95 ° C por 10 min.
    Nota: Normalmente quando ferver as amostras, as tampas dos tubos podem abrir espontaneamente e amostras são perdidas. Evitar isto mantendo as tampas fechadas com um bloqueador específico cap.
18. Spin para baixo as amostras e carga em geles de SDS-PAGE para separar as proteínas de acordo com seus tamanhos usando protocolos padrão.
    Nota: Neste estudo sobre RACK1 e ATG5, as amostras foram executadas através de géis de poliacrilamida 12% em 80 V por 30 min e depois em 120 V para aproximadamente 90 min. No entanto, por mais pequenas proteínas tais como LC3, usar géis de poliacrilamida de 15% é mais adequado.
19. Após o gel executando completo, transferir as proteínas para nitrocelulose ou membranas PVDF usando qualquer um dos métodos transferência molhada ou semi-seca. Em seguida, bloquear as membranas de incubação no leite desnatado de 5% em PBS com 0,05% Tween 20 (PBST) à temperatura ambiente para membranas de 1 h. lavagem 3 vezes com PBST 5 min.
20. Incuba as membranas com anticorpos primários em concentrações de trabalho por 1h à temperatura ambiente. Para diluições de anticorpo primário, use BSA contendo soluções vermelhas (5% BSA Cohn V fração, 0,02% de azida de sódio em PBST, pH 7,5; adicionar vermelho de fenol adicionado como um marcador de pH) para permitir a reutilização de anticorpos.
    Nota: por exemplo, dilua ATG5 anticorpo x 2.000 na solução de vermelho.
    1. No final do tempo de incubação, lavar as membranas 3 vezes com PBST.
21. Incubar as membranas com anticorpos secundarios conjugados a HRP que foram preparadas em solução de leite desnatado de 5% (aqui, anti-IgG de coelho no 1:10.000 foi usado). Em seguida, lave as membranas 3 x com PBST 5 min.
22. Fazem a solução ECL: 25mm luminol, ácido cumarínico 9mm, 3 x 10 ^-4% H ₂ O ₂ em pH 70 mM Tris-HCl 8,8. Usar o fresco H ₂ O ₂ para cada experimento.
    Nota: A reação começa após H 2 < /sub > O ₂ adição e continua por aproximadamente 20 min.
    1. Incubar as membranas e raio-x filmes por 20 min em ECL. Desenvolver e corrigi-los em uma sala escura.
23. Para verificar a co-imunoprecipitação de proteínas com close ou sobreposição de pesos moleculares, pode ser necessário retirar os anticorpos fora das membranas incubando as membranas a 60 ° C por 30 min no buffer de descascamento: (pH 25 mM Tris-HCl 2 e 1% SDS).
24. 2.20 a 2.23 repita os passos para verificar se há co-imunoprecipitação usando anticorpos diferentes. Por exemplo, após ATG5 de detecção e remoção das membranas, proteínas RACK1 foi testada sobre as membranas mesmas usando um anticorpo primário anti-RACK1 (1:1, 000) e anticorpos secundários (01:10, 000). Β-actina foi usado como o controle de carregamento; e sinal de IgG foi usado como o controle de carregamento para amostras de immunoprecipitated.

Representative Results

Na Figura 1 um exemplo de localização de co é mostrado o resultado obtido usando este protocolo. Uma figura do nosso papel recente é apresentada⁸. Aqui, proteína endógena RACK1 estava manchada de verde, enquanto LC3 endógena estava manchado de vermelho. Os pontos amarelos que são observados nas fotos mescladas indicam sites de sobreposição entre os sinais verdes e vermelhos. Assim, os pontos amarelos representam a localização co parcial destas duas proteínas.

Figura 1 : Resultados representativos da imunofluorescência. HEK293T células foram cultivadas em coverslides. As células foram tratadas ou não tratadas com rapamicina (Rapa, 200 nM, 16 h) ou 1 Torin (Torin, 250 nM, 3 h), ou morreu de fome EBSS (Stv, h 2). Então as proteínas endógenas foram immunostained usando anticorpos primários anti-RACK1 e anti-LC3. As células foram analisadas sob um microscópio confocal. CNT, células não tratados; Mesclagem, sobreposição de redsignals verdee. Pontos de yellowcytoplasmic de arrowsshow branco com RACK1 e LC3 localização co. Esta pesquisa foi originalmente publicada por Erbil et al ⁸ clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Na Figura 2, é apresentado um exemplo de um resultado de imunoprecipitação endógena. Nesta figura, ATG5 proteína foi precipitada e RACK1 co-imunoprecipitação foi detectada em condições diferentes. Soro normal de coelho foi usado como um controle negativo.

Figura 2: Resultados de representante da imunoprecipitação. HEK293T células foram tratadas ou não tratadas com rapamicina (Rapa, 200 nM, 16 h) ou 1 Torin (Torin, 250 nM, 3 h) ou morreram de fome nos EBSS (2H). Proteína endógena de ATG5 foi immunoprecipitated de extratos de células usando anticorpos anti-ATG5 que foram acoplados para grânulos de proteína A mais. Anticorpos anti-ATG5 e anti-RACK1 foram usados para immunoblotting. Soro, soro de coelho de controle. Esta pesquisa foi originalmente publicada por Erbil et al ⁸. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Estes resultados indicam que RACK1 proteína está envolvida nas vias de autofagia. Proteína de RACK1 co localizada com a proteína LC3 nas estruturas autophagosome, como durante a indução de autofagia. Além disso, o co-imunoprecipitação resultados mostraram que proteínas RACK1 e ATG5 foram interagindo mesmo em condições basais, e os níveis de interação aumentaram sob autofagia ativando condições. Nós confirmamos anteriormente usando p62 degradação e testes de acumulação LC3-II na presença ou ausência de inibidores dos lisossomos (Bafilomycin A, E64D/Pepstatin A) que autophagic fluxo não foi inibido sob as condições experimentais⁸. Portanto, os resultados apresentaram aqui e em outros lugares, mostrou que a interação de RACK1-ATG5 é importante para as fases iniciais de autofagia.

Discussion

As técnicas de imunoprecipitação e imunofluorescência são cruciais para o estudo das interações da proteína-proteína. Embora estas duas técnicas são comumente usadas e bem estabelecida, diversos critérios devem ser considerados para definir a qualidade das experiências ao usar estas técnicas.

Anticorpos primários, primeiros que são usados em testes devem ser específicos para as proteínas de interesse. Para garantir isso, use knockdowns shRNA ou células de nocaute para testar a especificidade do anticorpo em questão. Além disso, use controles positivos ou tratar as células com um conhecido indutor da proteína de interesse. Lote a lote, existem variações de anticorpos também. Além disso, alguns Anticorpos policlonais ou soros podem ter fundo elevado e faixas não específicas. Embora algumas dessas bandas podem ser formas alternativas da proteína de interesse, em geral, elas resultam de reatividade cruzada de Anticorpos policlonais com proteínas relacionadas ou podem ser interactianos específico. Os anticorpos monoclonais são em geral mais específico neste sentido, embora os sinais gerados podem ser mais fracos. A confirmação da especificidade do anticorpo com proteínas etiquetadas e estabelecidos os anticorpos antietiqueta pode ser útil, mas interações endógenas são ainda mais valiosos e essenciais.

Testes de localização co ou co-imunoprecipitação não estabelecerá definitivamente se interações da proteína-proteína são diretas. É possível que os parceiros adicionais podem mediar as interações observadas. Com efeito, na Figura 1, uma localização co parcial de proteínas RACK1 e LC3 observou-se, que pode ser um sinal de sua interação; no entanto, obrigatório direto testes como em vitro suspenso ensaios utilizando proteínas recombinantes ou microscopia de fluorescência ressonância energia transferência (FRET) pode ser usada para estabelecer se as interações observadas são diretas ou não. Por outro lado, técnicas como filtração de gel vão ajudar a desvendar as interações proteína complexa, envolvendo mais de duas proteínas de maneira mais convincente. Uma análise mais rigorosa dos resultados da imunofluorescência de uma perspectiva de autofagia seria para monitorar a indução de autofagia contando o número de pontos que são positivas para o marcador de autofagia LC3 em cada célula, desde um aumento do número de LC3 pontos positivos se correlaciona com o número de autophagosomes. Uso do coeficiente de Pearson, método de Li ou testes de coeficientes dos Manders fornecer melhor avaliação quantitativa e comparativa dos resultados experimentais.

Outro ponto importante é a validação de interações usando técnicas independentes e linhas celulares diferentes. Algumas interações podem ser artefatos que estão relacionados com a rigidez de proteínas ou superexpressão da proteína. Se não cuidadosamente lavado, a proteína ATG5 também é propensa a manter as contas que são usadas em moleculas (ambas agarose ou sepharose grânulos). Além disso, nos testes de imunofluorescência, superexpressão da proteína pode formar agregados que se parecem com autophagosomes ou autolysosomes. Portanto, durante a execução de transfections transientes usando proteínas fluorescentes co transfectadas como o controle de eficácia de transfeccao, em immunoblots, níveis de expressão de proteínas de interesse podem ser comparados com os níveis de proteína fluorescente nos extratos usando anticorpos específicos, fornecendo um método de normalização.

Em todos esses testes, a reprodutibilidade dos resultados é de extrema importância. Nós preferimos repetir pelo menos 3 - 4 vezes de cada experiência convenceu-se dos resultados obtidos. Também realizamos experimentos semelhantes pelo menos duas linhas de célula diferente para provar que nossas observações não são específicas do tipo de célula. Além disso, controles positivos e negativos corretos (por exemplo, grânulos sozinhos ou anticorpos controle mais soro para testes de imunoprecipitação) devem ser planejados para chegar a conclusões corretas. Durante a otimização de técnicas de imunofluorescência, é útil ter um controle único anticorpo secundário onde é omitido o anticorpo primário. Este controle certifique-se que observados sinais se originam a partir de ligação do anticorpo primário para a proteína de interesse e não de uma ligação não-específica do anticorpo secundário.

O número de complexos de proteína reguladora autofagia e outros eventos biológicos está aumentando na descoberta, no entanto, a pesquisa está longe de ter um quadro completo. Embora técnicas de alto rendimento como espectrometria de massa ou previsões baseadas em Bioinformática continuam a revelar as redes de interação para várias proteínas relacionadas a autofagia, confirmação dessas interações usando bioquímica clássica e métodos de microscopia é importante a fim de descobrir as propriedades funcionais e dinâmicas desta via celular básica e importante.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Trypsin EDTA Solution A	Biological Industries	BI03-050-1A
PBS	GE Healthcare	SH-30256.01
DMEM (high glucose)	Sigma	5671
DMEM (low glucose)	Sigma	5546
Trypan Blue	Sigma	T8154
Hemocytometer	Sigma	Z359629-1EA
coverslides	Jena Bioscience	CSL-103
slides	Isolab	I.075.02.005
Poly-L-Lysine	Sigma	P8920
Torin	Tocris	4247
DMSO	Sigma	VWRSAD2650
EBSS	Biological Industries	BI02-010-1A
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	15812-7
BSA	Sigma	A4503
Saponin	Sigma	84510
LC3 Antibody	Sigma	L7543
Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 568	Invitrogen	A11011
RACK1 Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-17754
Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11001
NP-40	Applichem	A16694.0250
Sodium Chloride	Applichem	A9242.5000
Sodium deoxycholate	Sigma	30970
Sodium dodecyl sulphate (SDS)	Biochemika	A2572
Trizma Base	Sigma	T1503
Triton-X	Applichem	4975
Sodium orthovanadate	Sigma	450243
ATG5 Antibody	Sigma	A0856
Glycerol	Applichem	A4453
β-Mercaptoethanol	Applichem	A1108.0250
Bromophenol blue	Applichem	A3640.0005
Non-Fat milk	Applichem	A0830
Tween 20	Sigma	P5927
Sodium Azide	Riedel de Haen	13412
Phenol red	Sigma	114537-5G
anti-rabbit IgG , HRP conjugated	Jackson Immuno.	1110305144
Luminol	Fluka	9253
Coumeric Acid	Sigma	C9008
Hydrogen Peroxide	Merck	K35522500604
anti mouse IgG, HRP conjugated	Jackson Immuno.	115035003
β-Actin Antibody	Sigma	A5441
Normal rabbit serum	Santa Cruz Biotechnology	sc-2027
Rapamycin	Sigma	R0395
Protein A-Agarose Beads	Santa Cruz Biotechnology	sc-2001
fetal bovine serum	Biowest	S1810-500
penicillin/streptomycin solution	Biological Industries	03-031-1B
L-glutamine	Biological Industries	BI03-020-1B
Bradford Solution	Sigma	6916
Nitocellulose membrane	GE Healthcare	A10083108
X-ray Films	Fujifilm	47410 19289
Protease inhibitor	Sigma	P8340