Summary
Præsenteres her er to antistof-baseret protein-protein interaktion forskningsteknikker: immunofluorescens og immunoprecipitation. Disse teknikker er egnet til at studere fysiske samspil mellem proteiner til opdagelsen af nye komponenter af cellulær signalering veje og forståelse protein dynamics.
Abstract
Protein-protein interaktioner er vigtige for forståelsen cellulær signalering kaskader og identificere roman pathway komponenter og protein dynamics. Fleste af cellulære aktiviteter kræver fysisk interaktion mellem proteiner. For at analysere og kortlægge disse interaktioner, blev forskellige eksperimentelle teknikker såvel som bioinformatik værktøjer udviklet. Autophagy er en cellulær genanvendelse mekanisme, der tillader cellerne til at håndtere forskellige stressfaktorer, herunder næringsstof afsavn, kemikalier og hypoxi. For bedre at forstå autophagy-relaterede signalering begivenheder og til at opdage nye faktorer, der regulerer proteinkomplekser i autophagy udført vi protein-protein interaktion skærme. Validering af disse screening resultater kræver brug af immunofluorescens og immunoprecipitation teknikker. I dette system, specifikke autophagy-relaterede protein-protein interaktioner, der opdagede vi blev testet i Neuro2A (N2A) og HEK293T cellelinjer. Nærmere oplysninger om de anvendte tekniske procedurer er forklaret i denne visualiseret eksperiment papir.
Introduction
Macroautophagy (autophagy, heri) er et cellulært stress mekanisme, der er karakteriseret ved binding af bulk cytoplasma, proteiner og organeller i dobbelt membran vesikler kaldet autophagic vesikler. Gennem fusion af det ydre lag af den dobbelt membran, autophagic blærer og deres last er leveret til lysosomer og forringet deri1. Autophagy opstår på lav basal niveauer i alle celletyper og i alle organismer, udfører homeostatiske funktioner såsom protein nedbrydning og organelle (fx, mitokondrierne) omsætning. Under vilkår, som fører til cellulært stress, såsom sult, autophagy er hurtigt upregulated og tillader cellen at opretholde energi niveauer og basale stofskifte1,2,3.
Omkring 30 autophagy gener er blevet klonet fra gæren og deres proteinprodukter blev vist sig at spille en rolle i forskellige stadier af den autophagic proces, herunder vesikel Nukleering, ekspansion, vesikel fusion til sent endosome/lysosomet og last forringelsen 4 , 5. Orthologs af fleste af disse gener er blevet identificeret og undersøgelser i forskellige organismer bekræftet bevarelse af deres cellulære funktioner6. Undersøgelser i det sidste årti viste, at flere autophagy-relaterede proteinkomplekser og protein-protein interaktioner findes, og at de regulerer autophagy veje i en indviklet og kontrolleret måde. Vejkryds, sikkerhedskopier, feedback og feedforward mekanismer eksisterer, og de tillader cellen at koordinere autophagy med andre relaterede begivenheder (såsom vesikulære sekretion, lysosomet Biogenese, endosomal sortering og transport7, osv.) I en fordomsfri gær-to hybrid skærmen ved hjælp af autophagy proteinet ATG5 som en agn, (ATG5 er en vigtig autophagy protein involveret i E2-lignende conjugating-systemet, der medierer LC3 lipidation i sult induceret autophagy), vi har identificeret Receptor aktiveres C-Kinase 1 (RACK1; GNB2L1) som en stærk dataflowdiagrammer og en roman autophagy komponent8. Vigtigere, viste skærmen, at ATG5-RACK1 interaktion var uundværlig for autophagy induktion af klassisk autophagy induktorer (dvs., sult og mTOR hæmning).
Immunofluorescens-baserede metoder er almindeligt anvendt til at overvåge protein-protein interaktioner. Disse teknikker er hovedsagelig baseret på antistoffer, og hjælp til at visualisere interaktioner og bekræfte cellulære lokaliseringer. I denne teknik, fluorescerende tag konjugerede antistoffer, der er specifikke for proteiner af interesse er generelt bruges til specifik farvning. Hver protein kan være mærket med antistoffer koblet til forskellige fluorescerende farvestoffer. Ved hjælp af protein-specifikke antistoffer, angiver en overlapning i signalet når billeder flettes Co lokalisering af proteiner under Konfokal mikroskopi. Teknikken er gældende til celler eller væv, selv. Immunfluorescens teknikker give et fingerpeg om interaktion dynamics, og hjælpe med at identificere størrelsen og fordelingen af proteinkomplekser, mens tracking generelle ændringer i cellulære morfologi under forskellige betingelser9. Immunoprecipitation er en anden almindeligt anvendte antistof-baseret teknik, der giver mulighed for analyse af samspillet mellem givet proteiner10. Brug af denne teknik, proteiner af interesse er isoleret fra celler eller væv ekstrakter ved hjælp af specifikke antistoffer, hvilket resulterer i udfældning af proteiner, der er i en kompleks eller i kontakt med et protein af interesse. Co-immunoprecipitation, hvor proteinet og dets Co dataflowdiagrammer opdages, afslører ikke kun interaktion mellem de to proteiner, men kan måle styrken af interaktion under forskellige omstændigheder11.
Denne protokol beskriver i detaljer vigtigste teknikker, der blev brugt til at bekræfte og karakterisere ATG5-RACK1 og RACK1-LC3 interaktion. Fokus er på immunofluorescens og immunoprecipitation teknikker, med vægt på kritiske faser og faldgruber for autophagy forskning, samt fejlfinding forslag.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. immunofluorescens
- Vedligehold HEK293T menneskelige embryonale nyre celler i DMEM høje glukose medium, og N2A musen neuroblast celler i DMEM lav glucose medium, i en 5% CO 2-befugtet inkubator ved 37 ° C. Supplere dyrkningsmedier med 10% varme-inaktiverede føtal kvæg (FBS) serum, antibiotika (50 U/mL penicillin, 50 µg/mL streptomycin), og L-glutamin (2 mM).
- Frigør cellerne ved hjælp af 0,25% trypsin. Først fjerne medier af cellekultur derefter cellerne vaskes med 10 mL sterilt fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og inkuberes med trypsin ved 37 ° C i 5 min. Deaktiver trypsin ved at tilføje 2 mL DMEM medium 1 mL.
- Vask pladen godt af pipettering. Fjerne 10 µL af celle løsning og bland det med 10 µL af trypan blå. Tæl antallet af levende celler ved hjælp af en hemocytometer.
- Både HEK293T og N2A er vedhængende cellelinjer, dog HEK293T celler løsnes fra pladen let. Derfor, hvis arbejder med HEK293T cellelinie, pels coverslides med sterile filtreret 0,01% poly-L-lysin før såning cellerne.
- Sted sterilt coverslides i en 10 cm petriskål. Tilføje den passende mængde af poly-L-lysin løsning på hver coverslide. Ruger coverslides med poly-L-lysin løsning i 10 min.
- Fjerne poly-L-lysin løsning.
Bemærk: Poly-L-lysin er genbrugelige; Det er valgfrit at indsamle og genanvende det til yderligere forsøg. Da poly-L-lysin er giftige, vente, indtil alle løsning på coverslides helt fordamper, og derefter gendanne poly-L-lysin. - Vaske coverslides med steril PBS.
- Tilsættes 1 mL DMEM til hver brønd med en 12-godt plade. Placere en coverslide i hver brønd.
- Frø 20.000 celler/brønd, dråbe for dråbe mens ryste pladen på samme tid for en homogen fordeling af celler på coverslides. Holde celler i CO 2 inkubator ved 37 ° C og tilføje stoffet så at den samlede inkubationstiden ikke overstiger 48 timer, dvs., for 3 h Torin behandling, tilføje stoffet på 45 h post såning.
- For RACK1-LC3 interaktion undersøgelser, Torin 1, rapamycin og sult blev brugt som autophagy induktorer. Celler blev inkuberet med Torin 1 3 h (250 nM endelige koncentration); med rapamycin for 16 h (200 nM endelige koncentration); og med Earle ' s Balanced Salt løsning (EBSS) i 2 timer for at sulte celler.
Bemærk: Inkubation i DMEM med 10% FBS blev brugt som kontrol tilstand.
- For RACK1-LC3 interaktion undersøgelser, Torin 1, rapamycin og sult blev brugt som autophagy induktorer. Celler blev inkuberet med Torin 1 3 h (250 nM endelige koncentration); med rapamycin for 16 h (200 nM endelige koncentration); og med Earle ' s Balanced Salt løsning (EBSS) i 2 timer for at sulte celler.
- Efter 48 h af samlede inkubationstiden, fjerne medier på coverslides og vaske dem med 1 mL PBS.
- At fastsætte celler, inkuberes celler med 1 mL is kold sterile filtrerede 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i 1 x PBS (pH 7,4), i 20 min. ved stuetemperatur uden nogen agitation.
Da PFA er følsomme over for lys, holde (vigtigt) pladen i mørke under inkubationstiden; dækker plade med alufolie kan hjælpe. Desuden PFA er giftigt, derfor, arbejde under et stinkskab mens fastsættelse af cellerne.
Bemærk: Husk, at fiksering skridt i immunofluorescens eksperimenter skal optimeres, som specifikke antistoffer kan arbejde bedst ved hjælp af forskellige fiksering agenter og betingelser. - Efter 20 min af PFA inkubation, først fjerne PFA løsning på coverslides og derefter vaske hver prøve 3 gange med 1 mL sterilt filtrerede PBS. På dette trin, (vigtigt) vaske wells én efter én for ikke at lade dem tørre. Undgå tørring da det vil forstyrre efterfølgende reaktioner i cellerne, ændre celle morfologi og øge uspecifikke signaler.
- Når vask er afsluttet, holde prøver i 1 mL PBS på ice.
- Forbereder den blokerende løsning: PBS med 0,1% bovint serumalbumin (BSA) og 0,1% saponin.
- Omfatter en 6-godt plade med paraffin film. Sikre at den plade bunden er glat efter paraffin film dækker. Mærke den 6-godt plade.
- Bruger pincet, overførsel af coverslides fra 12-godt plader til 6-godt plader beklædt med paraffin film.
- Kassere PBS på coverslides og tilsæt 100 µL blokerende løsning på hver coverslide for permeabilization. Inkuber prøver på is i 30 min.
- Forbereder de primære antistof i blokerende løsning. Før eksperimenter, optimere antistof fortyndinger for at definere de bedste arbejde koncentrationer for farvning.
Bemærk: For eksempel LC3 antistof er brugt på en 1: 100 fortynding i blokerende løsning. - Efter 30 min inkubation, kassere den blokerende løsning og vaske prøver forsigtigt med 1 mL PBS engang.
- Tilsættes 100 µL af primære antistof løsning til hver coverslide. Inkuber prøverne ved stuetemperatur i 1 time på en shaker.
Bemærk: Inkubationstiden med det primære antistof skal optimeres. Afhængigt af antistof, kan en natten inkubation ved 4 ° C være at foretrække. Det er bedst at udruge på en shaker forsigtigt (100 omdrejninger/min) lige så distribuere antistof på coverslides. - Efter inkubation med det primære antistof, vaske prøver individuelt, 3 gange med 1 mL PBS.
- Forbered 1: 500 sekundær antistof i blokerende løsning (optimeringer af fortyndinger af det sekundære antistof kan være nødvendigt). Her, anti-kanin IgG Alexa Fluor 568 blev brugt som en sekundær anti-kanin antistof.
- Inkuberes prøver med de 100 µL af sekundær antistof løsning i 1 time ved stuetemperatur på en shaker. Da de fluorophore-mærket sekundære antistoffer er følsomme over for lys, (vigtigt) holde løsningen i mørke. Placer prøverne i mørke under og efter sekundær antistof inkubation.
- Efter inkubationen sekundær antistof vaske plade 3 gange med PBS.
Bemærk: Baed sig erfaringer, nogle antistoffer har høj baggrund signaler, som ikke kan fjernes af PBS vasker. Hvis beskæftiger sig med sådan et antistof, efter trin 1,21, kan holde prøverne i PBS ved 4 ° C for 6 h bidrage.- Hvis det er nødvendigt, pletten celler med en DNA-bindende farvestof, som Hoechst, til at markere atomkerner.
- For at plette mere end én protein, gælder samme procedure fra trin 1.16 for den anden protein.
- Sørg for at der ikke er nogen arter reaktivitet mellem antistoffer ved udførelse af farvning med mere end én antistof (fx, brug mus og kanin antistoffer).
Bemærk: Her, RACK1 er farvet som det andet protein ved hjælp af anti-RACK1 primære antistoffer og anti-mus IgG Alexa Fluor 488 sekundære antistoffer ved hjælp af de samme koncentrationer ovennævnte.
- Sørg for at der ikke er nogen arter reaktivitet mellem antistoffer ved udførelse af farvning med mere end én antistof (fx, brug mus og kanin antistoffer).
- Forberede montering løsning: 50% Glycerol i 1 x PBS. Filtreres gennem et 22 µm filter.
- Tørre dias med ethanol ved hjælp af en fnugfri serviet og tilføje 10 µL montering løsning til hvert dias. Bruger en pincet, placere coverslides på hver dropso, at siden med celler er i direkte kontakt med montering medium. Kassér overskydende montering løsning forsigtigt ved hjælp af fnugfri klude.
- Forsegle coverslides med en gennemsigtig neglelak. Først, stabilisere coverslides ved at tilføje dråber af neglelak på 4 kanter og derefter forsegle dem helt.
- Analysere prøverne under et mikroskop for fluorescerende eller Konfokal hurtigst muligt, da de fluorescerende signal kan blege efter et par timer.
- Detach og tælle cellerne som beskrevet i trin 1.2 og 1.3.
- Hvis arbejder med HEK293T celler, seed 4 millioner celler for hver betingelse i 15-cm petriskåle. Hvis arbejder med N2A celler, frø 5 millioner celler i 15 cm petriskåle. Inkuber celler i en CO 2 inkubator ved 37 ° C indtil udgangen af eksperimentet.
- Behandle celler med relevante narkotika eller betingelserne for en afgrænset varighed, således at den samlede inkubationstiden af cellerne ikke overstiger 48 h.
Bemærk: For immunoprecipitation testene i denne undersøgelse, celler blev behandlet for 3 h med Torin 1 (250 nM), 16 h med rapamycin (200 nM), og 2 h med EBSS. DMEM med 10% FBS blev tilføjet til cellerne, som kontrolelementet. - Efter 48 h af samlede inkubationstiden, fjerne medier og høste cellerne. Da HEK293T celler løsnes let fra pladen, kan vask pladen med is kold PBS være tilstrækkelig til høst. Dog er N2A celler mere modstandsdygtige over for udstationering; Brug celle skrabere til at høste cellerne.
- Indsamle alle celler i microcentrifuge rør.
- Centrifuge prøver på 16.000 x g i 15 min. ved 4 ° C. Fjern supernatanten og vask pellet med 1 mL PBS ved at suspendere det igen af pipettering.
- Gentage centrifuge trin, men på den højeste centrifuge hastighed ved 4 ° C i 15 min. supernatanten.
- Forberede Radio Immuno-nedbør Assay (RIPA) buffer før du starter eksperimentet.
Bemærk: Der er 3 typer af RIPA buffer; Vælg efter interaktion intensiteten af de proteiner, der undersøges (Se formler nedenfor).- Hvis der er en stærk protein-protein interaktion, vælge den regelmæssige RIPA buffer.
- Hvis interaktionen er svag, skal du vælge enten mild RIPA eller mildere RIPA.
Bemærk: Opskrifter på disse buffere er i følgende trin. Alle buffere, der er brugt i immunoprecipitation tests bør suppleres med proteasehæmmere.- Udarbejde regelmæssige RIPA Buffer ved hjælp af 1% NP-40, 150 mM NaCl, 0,5% natrium deoxycholate og 0,1% sodium dodecyl sulphate i 50 mM Tris pH 8.
- Forberede mild RIPA Buffer ved hjælp af 1% NP-40, 150 mM NaCl og 0,25% natrium deoxycholate i 50 mM Tris pH 7,5.
- Forbereder den mildere RIPA Buffer ved hjælp af 1% Triton-X 100, 137 mM NaCl, 1% glycerol og 1 mM natrium orthovanadate i 50 mM Tris pH 7,4.
- Efter valget af den passende RIPA buffer, supplere bufferen med proteasehæmmere (RIPA +). Derefter, lyse celler med 3 x mængden af celle pellet i RIPA +.
- Vortex suspension for 15 s. holde den på is i 5 min. Gentag vortex og glasur 5 gange og derefter centrifugeres prøver på 16.000 x g i 15 min. ved 4 ° C.
- Overføre supernatanten til en ren microcentrifuge rør og centrifugeres at fjerne rest celle debris. Overføre supernatanten til en ren tube.
- Fortyndes protein lysates 1:50 og forberede en 96-brønd plade med blank og standarder. Fortynd prøver.
- Mix prøver med Bradford løsning 1:20. Inkuber i 15 min. i mørke.
- Måling af ekstinktionen på 595 nm bølgelængde. Beregne proteinkoncentration ved hjælp af absorbans værdier for hver proeve.
- Dagen før høst celler, par protein A Plus perler med antistoffer, der er specifikke for protein interesse.
- Skære kanten af en 200 µL tip ved hjælp af saks og bruge 25 µL fra perle gylle for hver betingelse.
- Vaske perlerne engang med 1 mL PBS, én gang med 1 mL RIPA buffer, og en gang med 1 mL RIPA +. Udføre trinene vask på 3.300 x g, 4 ° C i 1 min.
- Efter den sidste vask, tilsæt 300 µL af RIPA + på perlerne og tilføje 1,5 µg antistof, der er specifikke for protein til at blive trukket.
- Ruger rør natten over ved 4 ° C på en rotator (20 omdrejninger/min.).
Bemærk: Her, ATG5 var immunoprecipitated ved hjælp af specifikke anti-ATG5 antistoffer.
- Efter natten inkubation af perler med antistoffet, vaske perlerne engang med PBS, én gang med RIPA, og en gang med RIPA + som beskrevet i trin 2.12.2.
- Tilføje 2 mg protein lysate på perler for hver betingelse og fuldføre det samlede volumen til 300 µL med RIPA + buffer/rør. Der inkuberes rør natten på en rotator ved 4 ° C.
- Efter inkubation, vaske perlerne som tidligere beskrevet (trin 2.12.2).
- Efter den sidste vask, bruge en mindre afpipetteres tip til at fjerne alle supernatanten uden at røre perlerne.
- Tilføje 10 µL af 3 x lastning farvestof: 6% SDS, 30% Glycerol, 16% β-Mercaptoethanol og 0,1% Bromophenol blå i 1M Tris-HCl pH 6,8.
- Forberede indgangskontrolmulighederne bruger mindst 100 µg protein lysate for hver betingelse. Udligne prøve diskenheder ved hjælp af vand og tilføje den passende mængde af 3 x lastning farvestof.
- Kog prøver ved 95 ° C i 10 min.
Bemærk: Normalt når kogende prøverne, caps rør kan åbne spontant og prøver er tabt. Undgå dette ved at holde caps lukket med en specifik cap blocker. - Spin ned prøver og belastning på SDS-PAGE gels til at adskille proteiner ifølge deres størrelser bruger standardprotokoller.
Bemærk: I denne undersøgelse på RACK1 og ATG5, prøver blev kørt gennem 12% polyacrylamidgeler på 80 V i 30 min, og derefter på 120 V til ca 90 min. Men for mindre proteiner som LC3, bruger 15% polyacrylamidgeler er mere egnet. - Når gelen kører er fuldført, overførsel af proteiner til nitrocellulose eller PVDF membraner ved hjælp af enten våd eller halvtør overførselsmetoder. Derefter blokere membraner af inkubation i 5% fedtfrit mælk i PBS med 0,05% Tween 20 (PBST) ved stuetemperatur for 1 h. vask membranerne 3 gange med PBST i 5 min.
- Inkuberes membraner med primære antistoffer på arbejde koncentrationer i 1 time ved stuetemperatur. For primære antistof fortyndinger, bruge BSA indeholdende røde løsninger (5% BSA Cohn V brøkdel, 0,02% natriumazid i PBST, pH 7,5; tilføje Phenol rød tilføjet som pH markør) at tillade genbrug af antistoffer.
Bemærk: For eksempel, fortyndes ATG5 antistof 2.000 x i den røde løsning.- For enden af inkubationstiden vaske membranerne 3 gange med PBST.
- Inkuberes membraner med HRP-konjugerede sekundære antistoffer, der blev udarbejdet i 5% fedtfrit mælk løsning (her, anti-kanin IgG på 1:10.000 blev brugt). Derefter vaskes membraner 3 x med PBST i 5 min.
- Gøre ECL løsning: 25 mM luminol, 9 mM coumaric syre, 3 x 10 -4% H 2 O 2 i 70 mM Tris-HCl pH 8,8. Bruge friske H 2 O 2 til hvert eksperiment.
Bemærk: Reaktionen starter efter Hansen 2 < /sub > O 2 tilføjelse og det fortsætter i ca 20 min.- Inkuberes membraner og X-ray film i 20 min. i ECL. Udvikle og lave dem i et mørkt rum.
- For at kontrollere co-immunoprecipitation af proteiner med tæt eller overlappende Molekylær vægt, kan det være nødvendigt at fratage antistoffer slukke membranerne af inkubere membraner på 60 ° C i 30 min i stripping bufferen: (25 mM Tris-HCl pH 2 og 1% SDS).
- Gentag trin 2,20 til 2.23 at tjekke for co-immunoprecipitation med forskellige antistoffer. For eksempel blev efter ATG5 opdagelse og fjernelse af membraner, RACK1 protein testet på samme membraner ved hjælp af et anti-RACK1 primære antistof (1:1, 000) og sekundære antistoffer (1:10, 000). Β-Actin blev brugt som lastning kontrol; og IgG signal blev brugt som kontrolelementet lastning immunoprecipitated prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I figur 1 et eksempel på en fælles lokalisering er resultat, der opnås ved hjælp af denne protokol vist. En figur fra vores seneste papir præsenteres8. Her, var endogene RACK1 protein farvede i grøn, mens endogene LC3 var farvet i rødt. De gule prikker, der er observeret i de flettede billeder viser steder overlap mellem de grønne og røde signaler. De gule prikker udgør således den delvise Co lokalisering af disse to proteiner.
Figur 1 : Repræsentant immunofluorescens resultater. HEK293T celler blev kulturperler på coverslides. Celler var behandles eller ikke behandles med rapamycin (Rapa, 200 nM, 16 h) eller Torin 1 (Torin, 250 nM, 3 h) eller sultet i EBSS (Stv, 2 h). Derefter var endogene proteiner immunostained ved hjælp af anti-RACK1 og anti-LC3 primære antistoffer. Celler blev analyseret under en Konfokal mikroskop. CNT, ubehandlede celler; Flet, overlejring af greenand redsignals. Hvid arrowsshow yellowcytoplasmic prikker med RACK1 og LC3 Co lokalisering. Denne forskning blev oprindeligt offentliggjort af Erbil et al. 8 venligst klik her for at se en større version af dette tal.
I figur 2præsenteres et eksempel på en endogen immunoprecipitation resultat. I denne figur, ATG5 protein blev fældet og RACK1 co-immunoprecipitation blev registreret under forskellige betingelser. Normalt kaninserum blev brugt som en negativ kontrol.
Figur 2: Repræsentative immunoprecipitation resultaterne. HEK293T celler blev behandlet ikke behandlet med rapamycin (Rapa, 200 nM, 16 h) eller Torin 1 (Torin, 250 nM, 3 h) eller sultet i EBSS (2 h). Endogene ATG5 protein var immunoprecipitated fra celle ekstrakter ved hjælp af anti-ATG5 antistoffer, der var koblet til protein A Plus perler. Anti-ATG5 og anti-RACK1 antistoffer blev brugt til immunoblotting. Serum, kontrol kaninserum. Denne forskning blev oprindeligt offentliggjort af Erbil et al. 8. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Disse resultater viser, at RACK1 protein er involveret i autophagy veje. RACK1 protein Co lokaliseret med LC3 protein på autophagosome-lignende strukturer under autophagy induktion. Co-immunoprecipitation resultaterne viste desuden, at RACK1 og ATG5 proteiner interaktion selv på basale forhold, og de interaktion øges under autophagy aktivering betingelser. Vi bekræftede tidligere bruger p62 nedbrydning og LC3-II ophobning tests i tilstedeværelse eller fravær af lysosomale hæmmere (Bafilomycin A, E64D/Pepstatin A) at autophagic flux ikke var hæmmet under forsøgsbetingelser8. Derfor resultaterne præsenteres her og andre steder viste, at RACK1-ATG5 interaktion er vigtig i de indledende faser af autophagy.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Immunoprecipitation og immunfluorescens teknik er af afgørende betydning for studiet af protein-protein interaktioner. Selv om disse to teknikker er udbredte og veletablerede, flere kriterier bør overvejes at definere kvaliteten af eksperimenter, mens du bruger disse teknikker.
Første, primære antistoffer, der er brugt i disse test skal være specifik for proteiner af interesse. For at sikre dette, skal du bruge shRNA knockdowns eller knockout celler til at teste specificiteten af det pågældende antistof. Derudover bruge positive kontroller, eller behandling af celler med en kendt inducer af protein af interesse. Batch til batch variationer af antistoffer findes så godt. Derudover kan nogle polyklonale antistoffer eller sera har høj baggrund og uspecifikke bands. Selv om nogle af disse bands kan være alternative former for protein af interesse, generelt de resultat af krydsreaktivitet af polyklonale antistoffer med relaterede proteiner eller de kan være ikke-specifikke interactors. Monoklonale antistoffer er generelt mere specifikt i denne forstand, selv om signaler genereret kan være svagere. Bekræftelse af antistof specificitet med mærket proteiner og etablerede anti-tag antistoffer kan være nyttig, men endogene interaktioner er stadig mere værdifuld og væsentlig.
Co lokalisering eller co-immunoprecipitation test vil ikke endeligt fastslå om protein-protein interaktioner er direkte. Det er muligt, at yderligere partnere kan mægle de observerede interaktion. Faktisk, i figur 1, en delvis Co lokalisering af proteiner, RACK1 og LC3 blev observeret, der kunne være et tegn på deres interaktion; dog tests direkte bindende såsom in vitro- pull-down-undersøgelser, ved hjælp af rekombinante proteiner eller fluorescens resonans energi overføre (FRET) mikroskopi kan bruges til at fastslå, om de observerede interaktion er direkte eller ej. På den anden side vil teknikker såsom gel filtrering bidrage til at afdække komplekse protein interaktioner, der vedrører mere end to proteiner i en mere overbevisende måde. En mere grundig analyse af immunofluorescens resultaterne fra et autophagy synspunkt vil være at overvåge autophagy induktion ved at tælle antallet af prikker, der er positive for LC3 autophagy markør i hver celle, da en stigning af antallet af LC3 positive prikker korrelerer med antallet af autophagosomes. Brugen af Pearsons koefficient, Lis metode eller Manders' koefficienter tests giver bedre kvantitativ og sammenlignende vurdering af de eksperimentelle resultater.
Et andet vigtigt punkt er validering af interaktioner ved hjælp af uafhængige teknikker og forskellige cellelinjer. Nogle interaktioner kan være artefakter, der er relateret til klistrede af proteiner eller protein overekspression. Hvis ikke omhyggeligt vaskes, er ATG5 protein også tilbøjelige til at holde sig til de perler, der anvendes i immunoprecipitations (både Agarosen eller sepharose perler). Derudover i immunfluorescens test, kan protein overekspression danne aggregater, der ligner autophagosomes eller autolysosomes. Derfor, mens de udfører forbigående transfections ved hjælp af co transfekteret fluorescerende proteiner som kontrolelementet Transfektion effektivitet, i immunoblots, udtryk niveauer af proteiner af interesse kan sammenlignes med fluorescerende protein niveauer i uddrag ved hjælp af specifikke antistoffer, leverer en metode til normalisering.
I alle disse tests er reproducerbarhed af resultaterne af allerstørste betydning. Vi foretrækker at gentage hvert forsøg mindst 3 - 4 gange at være overbevist om opnåede resultater. Vi udfører også lignende eksperimenter i mindst to forskellige cellelinjer til at bevise, at vores observationer ikke celle type-specifikke. Derudover bør korrekte positive og negative kontroller (fx, perler alene eller kontrol antistoffer plus serum til immunoprecipitation prøver) planlægges at nå rigtige konklusioner. Under optimering af immunofluorescens teknikker er det nyttigt at have en sekundær antistof eneste kontrol hvor primære antistof er udeladt. Denne kontrol Sørg for der observeret signaler stammer fra den primære antistof binding til protein af interesse, og ikke fra en ikke-specifik binding af den sekundære antistof.
Antallet af proteinkomplekser regulering af autophagy og andre biologiske hændelser er stigende i opdagelse, men forskningen er langt fra at have et fuldstændigt billede. Selv om høj overførselshastighed teknikker såsom massespektrometri eller Bioinformatik-baserede forudsigelser fortsætter med at afsløre netværk af interaktion for flere autophagy-relaterede proteiner, bekræftelse af disse interaktioner ved hjælp af klassisk biokemi og mikroskopi metoder er vigtigt for at afdække funktionelle og dynamiske egenskaber af denne grundlæggende og vigtig cellulær pathway.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af videnskabelige og teknologiske forskning Rådet af Tyrkiet (TUBITAK) 1001 Grant 107T153, Sabanci Universitet. SEB og NMK understøttes af en TUBITAK BIDEB 2211 stipendium for Ph.D. studier.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin EDTA Solution A | Biological Industries | BI03-050-1A | |
| PBS | GE Healthcare | SH-30256.01 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma | 5671 | |
| DMEM (low glucose) | Sigma | 5546 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Hemocytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| coverslides | Jena Bioscience | CSL-103 | |
| slides | Isolab | I.075.02.005 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Torin | Tocris | 4247 | |
| DMSO | Sigma | VWRSAD2650 | |
| EBSS | Biological Industries | BI02-010-1A | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 15812-7 | |
| BSA | Sigma | A4503 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| LC3 Antibody | Sigma | L7543 | |
| Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11011 | |
| RACK1 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17754 | |
| Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| NP-40 | Applichem | A16694.0250 | |
| Sodium Chloride | Applichem | A9242.5000 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Biochemika | A2572 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Triton-X | Applichem | 4975 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| ATG5 Antibody | Sigma | A0856 | |
| Glycerol | Applichem | A4453 | |
| β-Mercaptoethanol | Applichem | A1108.0250 | |
| Bromophenol blue | Applichem | A3640.0005 | |
| Non-Fat milk | Applichem | A0830 | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Sodium Azide | Riedel de Haen | 13412 | |
| Phenol red | Sigma | 114537-5G | |
| anti-rabbit IgG , HRP conjugated | Jackson Immuno. | 1110305144 | |
| Luminol | Fluka | 9253 | |
| Coumeric Acid | Sigma | C9008 | |
| Hydrogen Peroxide | Merck | K35522500604 | |
| anti mouse IgG, HRP conjugated | Jackson Immuno. | 115035003 | |
| β-Actin Antibody | Sigma | A5441 | |
| Normal rabbit serum | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | |
| Rapamycin | Sigma | R0395 | |
| Protein A-Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2001 | |
| fetal bovine serum | Biowest | S1810-500 | |
| penicillin/streptomycin solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-glutamine | Biological Industries | BI03-020-1B | |
| Bradford Solution | Sigma | 6916 | |
| Nitocellulose membrane | GE Healthcare | A10083108 | |
| X-ray Films | Fujifilm | 47410 19289 | |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 |
References
- Oral, O., Akkoc, Y., Bayraktar, O., Gozuacik, D. Physiological and pathological significance of the molecular cross-talk between autophagy and apoptosis. Histol Histopathol. 31, 479-498 (2016).
- Korkmaz, G., Tekirdag, K. A., Ozturk, D. G., Kosar, A., Sezerman, O. U., Gozuacik, D. MIR376A is a regulator of starvation-induced autophagy. PLoS One. 8, e82556 (2013).
- Itah, Z., et al. Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue. Exp Biol Med (Maywood). 238, 1242-1250 (2013).
- Gozuacik, D., Kimchi, A. Autophagy as a cell death and tumor suppressor mechanism). Oncogene. 23, 2891-2906 (2004).
- Erzurumlu, Y., Kose, F. A., Gozen, O., Gozuacik, D., Toth, E. A., Ballar, P. A unique IBMPFD-related P97/VCP mutation with differential binding pattern and subcellular localization. Int J Biochem Cell Biol. 45, 773-782 (2013).
- Kuzuoglu-Ozturk, D., et al. Autophagy-related gene, TdAtg8, in wild emmer wheat plays a role in drought and osmotic stress response. Planta. 236, 1081-1092 (2012).
- Longatti, A., Tooze, S. A. Vesicular trafficking and autophagosome formation. Cell Death Differ. 16, 956-965 (2009).
- Erbil, S., et al. RACK1 Is an Interaction Partner of ATG5 and a Novel Regulator of Autophagy. J Biol Chem. 291, 16753-16765 (2016).
- Gozuacik, D., Yagci-Acar, H. F., Akkoc, Y., Kosar, A., Dogan-Ekici, A. I., Ekici, S. Anticancer use of nanoparticles as nucleic acid carriers. J Biomed Nanotechnol. 10, 1751-1783 (2014).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59, 94-123 (1995).
- Uetz, P., et al. A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 403, 623-627 (2000).
