Summary
Gepresenteerd hier zijn twee antilichaam gebaseerde eiwit-eiwit interactie onderzoekstechnieken: immunofluorescentie en immunoprecipitation. Deze technieken zijn geschikt voor de studie van de fysieke interacties tussen eiwitten voor de ontdekking van nieuwe onderdelen van cellulaire signaalroutes en begrip eiwit dynamiek.
Abstract
Eiwit-eiwitinteractie zijn belangrijk voor het begrip cellulaire signalering cascades en herkenbare roman traject onderdelen en eiwit dynamiek. De meerderheid van cellulaire activiteiten vereist fysieke interactie tussen proteïnen. Te analyseren en kaart van deze interacties, werden verschillende experimentele technieken evenals bioinformatica tools ontwikkeld. Autophagy is een mobiele recycling mechanisme waarmee de cellen om te gaan met andere stressoren, met inbegrip van nutriënten ontbering, chemicaliën en hypoxie. Om signalering autophagy-gebeurtenissen beter te begrijpen en te ontdekken van nieuwe factoren die regelen van eiwitcomplexen in autophagy, trad we eiwit-eiwit interactie schermen. Validatie van de resultaten van deze screening vereist het gebruik van immunofluorescentie en immunoprecipitation technieken. In dit systeem, specifieke autophagy-gerelateerde eiwit-eiwitinteractie die we ontdekt werden getest in Neuro2A (N2A) en HEK293T cellijnen. Details over de technische procedures die zijn uitgelegd in deze gevisualiseerde experiment papier.
Introduction
Macroautophagy (autophagy, hierin) is een mechanisme van cellulaire spanning die wordt gekenmerkt door de inbeslagneming van bulk cytoplasma, eiwitten en organellen in dubbele membraan blaasjes autophagic blaasjes genoemd. Door de fusie van de buitenste laag van het dubbele membraan, autophagic blaasjes en hun lading zijn geleverd aan lysosomen en daarin1gedegradeerd. Autophagy treedt op basale laag in alle soorten van de cellen en alle organismen, homeostatische functies zoals de aantasting van het eiwit en organel (b.v., mitochondriën) omzet. Onder omstandigheden leiden tot cellulaire stress, zoals honger, autophagy is snel upregulated en maakt de cel energie niveaus en fundamentele metabolisme1,2,3te handhaven.
Ongeveer 30 autophagy genen hebben gekloond uit de gist en hun eiwitproducten bleken een rol te spelen in verschillende stadia van het autophagic proces, inclusief vesikel nucleatie, uitbreiding, blaasje fusion laat endosome/lysosoom en aantasting van de lading 4 , 5. Orthologs van de meerderheid van deze genen zijn geïdentificeerd en studies in verschillende organismen bevestigd behoud van hun cellulaire functies6. Studies in de afgelopen tien jaar is gebleken dat verschillende autophagy-gerelateerde eiwitcomplexen en eiwit-eiwitinteractie bestaan en dat ze autophagy trajecten in een ingewikkelde en gecontroleerde manier regeren. Kruispunten, back-ups en feedback feedforward mechanismen bestaan, en ze laten de cel te coördineren autophagy met andere verwante evenementen (zoals vesiculaire secretie, lysosoom biogenese, sortering en transport van de endosomal7, enz.) In een onbevooroordeelde gist-twee hybride-scherm met behulp van de autophagy proteïne ATG5 als aas, (ATG5 is een belangrijke autophagy eiwitten die betrokken zijn bij het E2-achtige conjugating systeem dat LC3 lipidation in honger bemiddelt geïnduceerde autophagy), hebben wij vastgesteld Receptor geactiveerd C-Kinase 1 (RACK1; GNB2L1) als een sterke interactor en een roman autophagy onderdeel8. Nog belangrijker is, is het scherm laat zien dat de ATG5-RACK1-interactie onmisbaar voor autophagy inductie door klassieke autophagy inductoren (d.w.z., honger en mTOR remming was).
Immunofluorescentie gebaseerde methoden worden vaak gebruikt om te controleren van eiwit-eiwitinteractie. Deze technieken zijn voornamelijk gebaseerd op antilichaam en helpen te visualiseren interacties en cellulaire lokalisaties te bevestigen. Bij deze techniek, TL tag geconjugeerde antilichamen die specifiek zijn voor proteïnen van belang zijn in het algemeen gebruikt voor een specifieke kleuring. Elke proteïne kan worden aangeduid met de antilichamen, gekoppeld aan verschillende fluorescente kleurstoffen. Een overlapping in het signaal wanneer afbeeldingen worden samengevoegd met eiwit-specifieke antilichamen, en geeft aan dat de co lokalisatie van eiwitten onder confocale microscopie. De techniek is van toepassing op cellen of zelfs weefsels. Immunofluorescentie technieken geven aanwijzingen over de dynamiek van de interactie, en helpen bij het identificeren van de grootte en de distributie van eiwitcomplexen, terwijl het bijhouden van algemene wijzigingen in cellulaire morfologie onder verschillende omstandigheden9. Immunoprecipitation is een andere veel gebruikte antilichaam gebaseerde techniek die het mogelijk voor de analyse van de wisselwerking maakt tussen gegeven eiwitten10. Met behulp van deze techniek, eiwitten van belang zijn geïsoleerde van cellen of weefsel wordt geëxtraheerd met behulp van specifieke antilichamen, resulterend in de precipitatie van de eiwitten die in een complex of in contact met een proteïne van belang. Co-immunoprecipitation, waar de eiwitten en zijn mede interactor worden gedetecteerd, blijkt niet alleen de interactie tussen de twee eiwitten, maar kan meten de sterkte van interactie onder verschillende omstandigheden11.
Dit protocol beschrijft in detail belangrijke technieken die werden gebruikt om te bevestigen en karakteriseren van ATG5-RACK1 en RACK1-LC3 interactie. De focus ligt op immunofluorescentie en immunoprecipitation technieken, met nadruk van kritische stappen en valkuilen voor autophagy onderzoek, evenals het oplossen van problemen met suggesties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. immunofluorescentie
- HEK293T handhaven menselijke embryonale nier cellen in DMEM hoge glucose medium en N2A muis neuroblast cellen in DMEM lage glucose medium, een 5% CO 2-bevochtigde incubator bij 37 ° C. Aanvulling van de voedingsbodems met 10% warmte-geïnactiveerd foetale runderen (FBS) serum, antibiotica (50 U/mL penicilline, 50 µg Mo/mL streptomycine), en L-glutamine (2 mM).
- Loskoppelen de cellen met behulp van 0,25% trypsine. Eerst Verwijder het medium van de cultuur van de cel dan de cellen met 10 mL steriele-fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) wassen en incubeer met 1 mL trypsine bij 37 ° C gedurende 5 min. Inactivate trypsine door toevoeging van 2 mL DMEM middellange.
- Wassen de plaat goed door pipetteren. 10 µL van cell oplossing verwijderen en meng dit met 10 µL van trypan blauw. Het aantal levende cellen met behulp van een hemocytometer.
- Zowel HEK293T en N2A zijn aanhangend cellijnen, echter HEK293T cellen loskoppelen van de plaat gemakkelijk. Daarom, als u werkt met cellijn van HEK293T, jas de coverslides met steriele gefilterd 0,01% poly-L-lysine vóór het zaaien van de cellen.
- Plaats steriele coverslides in een 10 cm petrischaal. Voeg de juiste hoeveelheid poly-L-lysine oplossing op elke coverslide. Incubeer de coverslides met poly-L-lysine oplossing voor 10 min.
- Verwijderen de poly-L-lysine oplossing.
Opmerking: Poly-L-lysine is opnieuw bruikbaar; het is optioneel om te verzamelen en opnieuw gebruiken voor verdere experimenten. Aangezien poly-L-lysine giftig is, wachten totdat alle van de oplossing op de coverslides volledig is verdampt, en herstel daarna de poly-L-lysine. - Wassen van de coverslides met steriele PBS.
- Voeg 1 mL DMEM in elk putje van de plaat van een 12-well. Plaatsen van een coverslide in elk putje.
- Zaad 20.000 cellen per putje, druppel voor druppel terwijl het schudden van de plaat op hetzelfde moment voor een homogene verdeling van de cellen in de coverslides. Houden van cellen in de CO-2 incubator bij 37 ° C en de drug toe te voegen zodat de totale incubatietijd 48 uur niet overschrijdt, dat wil zeggen, voor 3 h Torin behandeling, de drug toevoegen op 45 h post zaaien.
- Voor RACK1-LC3 interactie studies, Torin 1 rapamycin en honger werden gebruikt als autophagy inductoren. Cellen werden ge¨ uncubeerd met Torin 1 3 h (250 nM-eindconcentratie); met rapamycin voor 16 h (200 nM-eindconcentratie); en met Earle ' s evenwichtig zout oplossing (EBSS) voor 2 h om de cellen verhongeren.
Opmerking: Incubation in DMEM met 10% FBS werd gebruikt als besturingselement voorwaarde.
- Voor RACK1-LC3 interactie studies, Torin 1 rapamycin en honger werden gebruikt als autophagy inductoren. Cellen werden ge¨ uncubeerd met Torin 1 3 h (250 nM-eindconcentratie); met rapamycin voor 16 h (200 nM-eindconcentratie); en met Earle ' s evenwichtig zout oplossing (EBSS) voor 2 h om de cellen verhongeren.
- Na 48u van totale incubatietijd, verwijder het medium op de coverslides en was ze met 1 mL PBS.
- Om op te lossen van de cellen, Incubeer de cellen met 1 mL ijs koud steriele gefilterde 4% paraformaldehyde (PFA) in 1 x PBS (pH 7.4), gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur zonder enige agitatie.
Aangezien PFA gevoelig voor licht is, houden (belangrijk) de plaat in het donker tijdens de incubatietijd; die betrekking hebben op de plaat met aluminiumfolie kan helpen. Bovendien PFA is giftig, dus, werken in een zuurkast terwijl de vaststelling van de cellen.
Opmerking: Houd er rekening mee dat de fixatie stap in immunofluorescentie experimenten moet worden geoptimaliseerd, als specifieke antilichamen kunnen werken beste met behulp van verschillende fixatie agenten en voorwaarden. - Na 20 min van PFA incubatie, verwijdert u eerst de PFA-oplossing op de coverslides en daarna wassen elk monster 3 keer met 1 mL steriele gefilterde PBS. Op deze stap, (belangrijk) was de putjes één voor één om niet te laat ze drogen. Vermijd drogen want het zal met de daaropvolgende reacties van de cellen interfereren, de morfologie van de cel wijzigen en verhogen van niet-specifieke signalen.
- Wanneer de wash voltooid is, blijven de monsters in 1 mL PBS op ice.
- Bereid de blokkerende oplossing: PBS met 0,1% boviene serumalbumine (BSA) en 0,1% saponine.
- Is een 6-well afdekplaat met paraffine film. Ervoor zorgen dat de bodem plaat glad na de dekking van de film paraffine is. De 6-well-plate label.
- Met pincet, overdracht de coverslides van de 12-Wells-platen aan de 6-Wells-platen bedekt met paraffine film.
- Negeren van de PBS op coverslides en voeg 100 µL van het blokkeren van de oplossing op elk coverslide voor permeabilization. Incubeer de monsters op ijs voor 30 min.
- Bereiden het primaire antilichaam in het blokkeren van de oplossing. Voorafgaand aan de experimenten, het optimaliseren van de antilichaam-verdunningen om te definiëren van de beste werken concentraties voor kleuring.
Opmerking: bijvoorbeeld LC3 antilichaam wordt gebruikt bij een verdunning 1:100 oplossing tijdelijk blokkeren. - Na de 30 min incubatie, negeren de blokkerende oplossing en de monsters zachtjes met 1 mL PBS eens wassen.
- Voeg 100 µL van primair antilichaam oplossing voor elke coverslide. Incubeer de monsters bij kamertemperatuur gedurende 1 uur, in een roteerapparaat.
Opmerking: Incubatietijd met het primaire antilichaam moet worden geoptimaliseerd. Afhankelijk van het antilichaam, kan een overnachting incubatie bij 4 ° C wenselijk zijn. Het is het beste om te broeden op een shaker zachtjes (100 rotaties/min) te gelijkelijk verdelen het antilichaam op de coverslides. - Na incubatie met het primaire antilichaam, wassen van monsters individueel, 3 keer met 1 mL PBS.
- Voorbereiden 1:500 secundair antilichaam blokkeren oplossing (optimalisaties van verdunningen van het secundaire antilichaam kunnen nodig zijn). Hier, anti-konijn IgG Alexa Fluor 568 werd gebruikt als een secundair antilichaam anti-konijn.
- Broeden de monsters met de 100 µL van secundair antilichaam oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur op een shaker. Aangezien de fluorophore-geëtiketteerden secundaire antilichamen zijn gevoelig voor licht, (belangrijke) Bewaar deze oplossing in het donker. Leg de monsters in het donker tijdens en na de incubatie van secundair antilichaam.
- Na de incubatie van secundair antilichaam, wassen de plaat 3 keer met PBS.
Opmerking: Die zijn gebaseerd op ervaring, sommige antilichamen hebben hoge achtergrond signalen die niet kunnen worden uitgesloten door de PBS wast. Als omgaan met dergelijke een antilichaam, na stap 1.21, kan het bijhouden van de monsters in PBS bij 4 ° C gedurende 6 uur helpen.- Indien nodig, vlek de cellen met een DNA-bindende kleurstof, zoals Hoechst, ter gelegenheid van de kernen.
- Om vlekken van meer dan één eiwit, gelden dezelfde procedure vanaf stap 1.16 voor de tweede proteïne.
- Zorg ervoor dat er geen soorten reactiviteit tussen de antilichamen is bij het uitvoeren van de kleuring met meer dan één antilichaam (b.v., gebruik muis en konijn antilichamen).
Opmerking: Hier, RACK1 is gekleurd als de tweede eiwit met behulp van anti-RACK1 primaire antilichamen en anti-muis IgG Alexa Fluor 488 secundaire antilichamen met behulp van dezelfde concentraties bovengenoemde.
- Zorg ervoor dat er geen soorten reactiviteit tussen de antilichamen is bij het uitvoeren van de kleuring met meer dan één antilichaam (b.v., gebruik muis en konijn antilichamen).
- Bereid de montage oplossing: 50% Glycerol in 1 x PBS. Filter door een filter 22 µm.
- Veeg de dia's met ethanol met behulp van een pluisvrije doekje en 10 µL montage oplossing toevoegen aan elke dia. Met behulp van een pincet, plaats de coverslides op elk dropso dat de kant met de cellen in direct contact met het medium van de montage is. Verwijderen van de overtollige montage oplossing voorzichtig met behulp van pluisvrije doekjes.
- Verzegelen de coverslides met een doorzichtige nagellak. Eerste, het stabiliseren van de coverslides door toevoeging van druppels nagellak op de 4 hoeken en vervolgens zegel ze volledig.
- Analyseren van de monsters onder een TL of confocal microscoop zo spoedig mogelijk, omdat het fluorescent signaal kan na een paar uur bleekmiddel.
- Detach and graaf de cellen als in stap 1.2 en 1.3 beschreven.
- Als werken met HEK293T cellen, seed 4 miljoen cellen voor elke voorwaarde in petrischalen van 15 cm. Als werken met N2A cellen, seed 5 miljoen cellen in petrischalen van 15 cm. Incubeer de cellen in een CO 2 incubator bij 37 ° C tot het einde van het experiment.
- Behandelen de cellen met de desbetreffende drugs of de voorwaarden voor een bepaalde duur, zodat de totale incubatietijd van de cellen niet meer dan 48 h.
Opmerking: Voor de immunoprecipitation proeven in deze studie, werden cellen behandeld gedurende 3 uur met Torin 1 (250 nM), 16 h met rapamycin (200 nM), en 2 h met EBSS. DMEM met 10% FBS werd toegevoegd aan de cellen als het besturingselement. - Na 48 h van totale incubatietijd, verwijder het medium en het oogsten van de cellen. Aangezien HEK293T cellen gemakkelijk van de plaat loskoppelen, kan wassen van de plaat met ijs koud PBS toereikend zijn voor de oogst. Echter N2A cellen meer resistent zijn tegen detachement; cel schrapers gebruiken om te helpen met het oogsten van de cellen.
- Verzamelen van alle cellen in de buizen microcentrifuge.
- Centrifuge monsters bij 16.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C. Discard het supernatant en wassen de pellet met 1 mL PBS door schorsing van het opnieuw door pipetteren.
- Centrifuge Herhaalstap, maar op de hoogste snelheid van de centrifuge bij 4 ° C gedurende 15 min. Verwijder het supernatant.
- Bereiden Radio Immuno-neerslag Assay (RIPA) buffer voordat het experiment.
Opmerking: Er zijn 3 soorten RIPA buffer; kiezen op basis van de intensiteit van de interactie van de eiwitten wordt onderzocht (zie onderstaande formules).- Als er een sterke eiwit-eiwit interactie, kiest u de regelmatige RIPA buffer.
- Als de interactie zwak is, kiest u milde RIPA of mildere RIPA.
Opmerking: De recepten van deze buffers zijn in de volgende stappen. Alle buffers die worden gebruikt in immunoprecipitation tests moeten worden aangevuld met proteaseinhibitors.- Bereiden regelmatig RIPA Buffer met 1% NP-40 150 mM NaCl, 0,5% natrium deoxycholate en 0,1% natrium dodecyl sulfaat 50 mM Tris pH 8.
- Bereiden milde RIPA Buffer met 1% NP-40 150 mM NaCl en 0,25% natrium deoxycholate in 50 mM Tris pH 7.5.
- Bereiden de mildere RIPA Buffer met 1% Triton-X 100, 137 mM NaCl, 1% glycerol en 1 mM natrium orthovanadate in 50 mM Tris pH 7.4.
- Na het kiezen van de juiste RIPA buffer, aanvulling van de buffer met proteaseinhibitors (RIPA +). Vervolgens lyse de cellen met 3 x het volume van de cel pellet in RIPA +.
- Vortex de schorsing voor 15 s. houden op ijs voor 5 min. vortex en slagroom 5 keer herhaal en centrifugeer dan de monsters bij 16.000 x g gedurende 15 min bij 4 ° C.
- Overbrengen in het supernatant een schone microcentrifuge buis en centrifuge restant cel puin te verwijderen. Supernatant overbrengen in een schone buis.
- Verdun de eiwit lysates 1:50 en bereiden een 96-wells-plaat met blanco en normen. De monsters verdund.
- Mix monsters met Bradford oplossing 1:20. Incubeer gedurende 15 min. in het donker.
- Meet de optische dichtheid bij 595 nm golflengte. Berekenen van de eiwitconcentratie extinctie waarden voor elk monster gebruiken.
- De dag vóór het oogsten van de cellen, eiwit A Plus kralen koppelen aan antilichamen die specifiek voor de proteïne van belang zijn.
- De rand van een tip van de 200 µL met behulp van schaar te knippen en 25 µL van de kraal drijfmest te gebruiken voor elke voorwaarde.
- Wassen de kralen een keer met 1 mL PBS, eenmaal met 1 mL RIPA buffer en één keer met 1 mL RIPA +. Uitvoeren van de stappen wassen op 3300 x g, 4 ° C voor 1 min.
- Na de laatste wash, voeg 300 µL van RIPA + op de parels en toevoegen van 1,5 µg antilichaam dat specifiek is voor het eiwit te worden neergehaald.
- Broeden de buizen 's nachts bij 4 ° C op een rotator (20 rotaties/min).
Opmerking: Hier, ATG5 was immunoprecipitated met behulp van antilichamen van specifieke anti-ATG5.
- Na de overnachting incubatie van kralen met het antilichaam, de kralen keer met PBS, eenmaal met RIPA en eenmaal met RIPA + wassen zoals beschreven in stap 2.12.2.
- Toevoegen 2 mg eiwit lysate op de parels voor elke voorwaarde en het totale volume aan 300 µL met RIPA + buffer/buis te voltooien. Incubeer de buizen 's nachts op een rotator bij 4 ° C.
- Na de incubatie, wassen de parels zoals hiervoor is beschreven (stap 2.12.2).
- Na de laatste wash, een kleinere Pipetteer tip te gebruiken om alle de bovendrijvende vloeistof zonder het aanraken van de kralen.
- Voeg toe 10 µL van 3 x laden kleurstof: 6% SDS, 30% Glycerol, β-Mercaptoethanol 16% en 0,1% Bromophenol blauw in 1M Tris-HCl pH 6.8.
- De input controles met behulp van ten minste 100 µg eiwit lysate voor elke voorwaarde voor te bereiden. Egaliseren van de volumes van de monster met behulp van water en voeg de juiste hoeveelheid 3 x laden kleurstof toe.
- Kook monsters bij 95 ° C gedurende 10 min.
Opmerking: Meestal wanneer het koken van de monsters, de doppen van de buizen spontaan kunnen openen en monsters gaan verloren. Dit voorkomen door het houden van de doppen afgesloten met een specifieke GLB blocker. - Spin de monsters en de belasting op SDS-pagina gelen te scheiden van de proteïnen volgens hun grootte met behulp van standaardprotocollen.
Opmerking: In deze studie over RACK1 en ATG5, monsters werden doorlopen 12% polyacrylamide gels op 80 V voor 30 min, en vervolgens op 120 V voor ongeveer 90 min. Echter, voor de kleinere proteïnen zoals LC3, met behulp van 15% polyacrylamide gels is geschikter. - Als de gel uitgevoerd is voltooid, overbrengen in de eiwitten nitrocellulose of PVDF membranen met behulp van beide methoden voor natte of semi-droge overdracht. Dan, het blokkeren van de membranen van incubatie in 5% non-fat melk in PBS met 0,05% Tween-20 (PBST) bij kamertemperatuur voor 1 h. Wash membranen 3 keer met PBST voor 5 min.
- Laat de membranen met primaire antilichamen bij werken concentraties gedurende 1 uur bij kamertemperatuur inwerken. Gebruik voor primair antilichaam verdunningen, BSA met rode oplossingen (5% BSA Cohn V-Fractie, natriumazide 0.02% in PBST, pH 7.5; fenol red toegevoegd als een pH-markering toevoegen) om het hergebruik van antilichamen.
Opmerking: Verdun bijvoorbeeld ATG5 antilichaam 2.000 x in de rode oplossing.- Aan het eind van de incubatietijd, wassen de membranen 3 keer met PBST.
- Broeden de membranen met HRP-geconjugeerde secundaire antilichamen die werden opgesteld in 5% non-fat melk oplossing (hier, anti-konijn IgG bij 1:10.000 werd gebruikt). Daarna wassen de membranen 3 x met PBST voor 5 min.
- Maken de ECL-oplossing: 25 mM luminol, 9 mM coumarinezuur, 3 x 10 -4% H 2 O 2 in 70 mM Tris-HCl pH 8,8. Gebruik verse H 2 O 2 voor elk experiment.
Opmerking: De reactie begint na H 2 < /sub > O 2 toevoeging en het blijft gedurende ongeveer 20 minuten.- Broeden de membranen en X-ray films voor 20 min in ECL. Ontwikkelen en te corrigeren in een donkere kamer.
- Om te controleren de co-immunoprecipitation van eiwitten met sluiten of overlappende molecuulgewichten, kan het nodig te strippen van de antistoffen af de membranen door de membranen bij 60 ° C gedurende 30 minuten in de stripper buffer aan het broeden zijn: (25 mM Tris-HCl pH 2 en 1% SDS). Herhaal stap 2,20 tot en met 2.23
- om te controleren voor co-immunoprecipitation met verschillende antilichamen. Bijvoorbeeld werd na ATG5 detectie en strippen van de membranen, RACK1 eiwit getest op de dezelfde membranen met behulp van een anti-RACK1 primair antilichaam (1:1, 000) en secundaire antilichamen (1:10, 000). Β-actine werd gebruikt als het besturingselement laden; en IgG signaal werd gebruikt als het besturingselement laden voor immunoprecipitated monsters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
In Figuur 1 een voorbeeld van een mede-localisatie wordt resultaat verkregen met behulp van dit protocol weergegeven. Een figuur uit onze recente papier wordt8gepresenteerd. Hier, werd endogene RACK1 eiwit gekleurd in het groen, terwijl endogene LC3 werd gekleurd in rood. De gele punten die worden waargenomen in de samengevoegde afbeeldingen geven aan sites van overlap tussen de groene en rode signalen. Dus vertegenwoordigen de gele stippen de gedeeltelijke co lokalisatie van deze twee eiwitten.
Figuur 1 : Resultaten van de representatieve immunofluorescentie. HEK293T cellen werden gekweekt op coverslides. Cellen werden behandeld of niet behandeld met rapamycin (Rapa, 200 nM, 16 h) Torin 1 (Torin, 250 nM, 3 h) en/of uitgehongerd in EBSS (Stv, 2 h). Vervolgens werden de endogene eiwitten immunostained met behulp van anti-RACK1 en anti-LC3 primaire antilichamen. Cellen werden geanalyseerd onder een confocal microscoop. CNT, niet-behandelde cellen; Samenvoegen, overlay van greenand redsignals. Witte arrowsshow yellowcytoplasmic stippen met RACK1 en LC3 mede-localisatie. Dit onderzoek werd oorspronkelijk gepubliceerd door Erbil et al. 8 Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
In Figuur 2, wordt een voorbeeld van een endogene immunoprecipitation resultaat gepresenteerd. In deze figuur, ATG5 eiwit was neergeslagen en RACK1 co-immunoprecipitation was gedetecteerd onder verschillende omstandigheden. Normaal konijnenserum werd gebruikt als een negatieve controle.
Figuur 2: Vertegenwoordiger immunoprecipitation resultaten. HEK293T cellen werden behandeld niet behandeld met rapamycin (Rapa 200 nM, 16 h) of Torin 1 (Torin, 250 nM, 3 h) of uitgehongerd in EBSS (2 h). Endogene ATG5 eiwit was immunoprecipitated uit cel extracten met anti-ATG5-antilichamen die waren gekoppeld aan eiwit A Plus kralen. Anti-ATG5 en anti-RACK1 antilichamen werden gebruikt voor immunoblotting. Serum, controle konijnenserum. Dit onderzoek werd oorspronkelijk gepubliceerd door Erbil et al. 8. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Deze resultaten wijzen erop dat RACK1 eiwit bij autophagy trajecten betrokken is. RACK1 eiwit samen met de LC3 eiwit op de autophagosome-achtige structuren zijn gelokaliseerd tijdens autophagy inductie. Bovendien, co-immunoprecipitation resultaten toonden aan dat RACK1 en ATG5 eiwitten waren interactie zelfs op basale voorwaarden, en de interactie niveaus verhoogd onder autophagy activeren voorwaarden. Wij eerder bevestigd met behulp van p62 afbraak en LC3-II accumulatie proeven in de aanwezigheid of afwezigheid van lysosomale remmers (Bafilomycin A, E64D/Pepstatin A) dat de autophagic flux niet onder de proefomstandigheden8was geremd. Dus de resultaten die hier gepresenteerd en elders is gebleken dat de RACK1-ATG5 interactie belangrijk voor de eerste stadia van autophagy is.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Immunoprecipitation en immunofluorescentie technieken zijn cruciaal voor de studie van eiwit-eiwitinteractie. Hoewel deze twee technieken vaak gebruikt worden en gevestigde, verscheidene criteria moeten worden overwogen om te definiëren van de kwaliteit van de experimenten tijdens het gebruik van deze technieken.
Eerste, primaire antilichamen die worden gebruikt in deze tests moet specifiek voor de proteïnen van belang. Om hiervoor te zorgen, shRNA knockdowns of knock-out cellen gebruiken om te testen van de specificiteit van het antilichaam in kwestie. Bovendien gebruik van de positieve controles, of behandelen van cellen met een bekende inductor van de proteïne van belang. Batch tot batch variaties van antilichamen bestaan ook. Bovendien, sommige polyclonal antilichamen of sera wellicht hoge achtergrond en niet-specifieke banden. Hoewel sommige van deze banden alternatieve vormen van de proteïne van belang zijn mogelijk, in het algemeen zij voortvloeien uit Kruisallergie van polyclonal antilichamen met de verwante proteïnen of kunnen zij niet-specifieke interactors. Monoclonal antilichamen zijn in algemene specifieker in deze zin, hoewel signalen gegenereerd zwakker worden kunnen. De bevestiging van de antilichamenspecificiteit met tagged eiwitten en gevestigde anti-label antilichamen nuttig kan zijn, maar de endogene interacties zijn nog meer waardevolle en essentiële.
Co lokalisatie of co-immunoprecipitation tests zal niet definitief vaststellen of eiwit-eiwitinteractie direct zijn. Het is mogelijk dat aanvullende partners de waargenomen interacties kunnen bemiddelen. Inderdaad, in Figuur 1, een gedeeltelijke co lokalisatie van RACK1 en LC3 eiwitten werd waargenomen, die zouden kunnen worden een teken van hun interactie; echter test directe bindende zoals in vitro pull-down testen met behulp van recombinant eiwitten of fluorescentie Resonance Energy Transfer (FRET) microscopie kan worden gebruikt om vast te stellen of de waargenomen interacties directe of niet zijn. Aan de andere kant, zal technieken zoals gel filtratie helpen om te ontdekken de interacties van de complexe eiwitten voor meer dan twee eiwitten in een meer overtuigende wijze. Een striktere analyse van de resultaten van de immunofluorescentie vanuit het perspectief van een autophagy zou moeten controleren autophagy inductie door het tellen van het aantal stippen die positief voor de LC3 autophagy marker in elke cel, aangezien een verhoging van het aantal LC3 positieve punten correleert met het aantal autophagosomes. Gebruik van de Pearson's coëfficiënt, Li's methode of Manders coëfficiënten tests bieden betere kwantitatieve en vergelijkende beoordeling van de experimentele resultaten.
Een ander belangrijk punt is de validatie van afzonderlijke interacties met behulp van onafhankelijke technieken en verschillende cellijnen. Sommige interacties mogelijk artefacten die gerelateerd zijn aan de kleverigheid van proteïnen of eiwit overexpressie. Als niet zorgvuldig gewassen, is de ATG5-eiwit ook gevoelig voor het vasthouden aan de kralen die worden gebruikt in immunoprecipitations (zowel agarose of sepharose kralen). Bovendien, in immunofluorescentie proeven, kan eiwit overexpressie vormen aggregaten die er als autophagosomes of autolysosomes uitzien. Dus, tijdens het uitvoeren van voorbijgaande transfections met mede-transfected fluorescente proteïnen als de transfectie werkzaamheid controle, in immunoblots, expressie niveaus van proteïnen van belang kunnen worden vergeleken met fluorescerende eiwitniveaus in met behulp van extracten specifieke antilichamen, bieden een methode voor normalisatie.
In al deze proeven is de reproduceerbaarheid van de resultaten van het allergrootste belang. Wij liever herhaal elke experiment ten minste 3 - 4 keer te worden overtuigd van de verkregen resultaten. Wij voeren ook soortgelijke experimenten in ten minste twee verschillende cellijnen om te bewijzen dat onze observaties niet cel type-specifieke zijn. Bovendien moeten de juiste positieve en negatieve controles (b.v., kralen alleen of besturingselement antilichamen plus serum voor immunoprecipitation tests) te bereiken van de juiste conclusies worden gepland. Tijdens de optimalisatie van immunofluorescentie technieken is het nuttig te beschikken over een secundair antilichaam enige besturingselement waar primair antilichaam wordt weggelaten. Dit besturingselement ervoor dat waargenomen signalen zijn afkomstig uit de primair antilichaam binding aan de proteïne van belang, en niet uit een niet-specifieke binding van het secundaire antilichaam.
Het aantal eiwitcomplexen reguleren autophagy en andere biologische gebeurtenissen zijn toeneemt in ontdekking, maar het onderzoek is nog ver verwijderd van een compleet beeld. Hoewel high-throughput technieken zoals massaspectrometrie of bioinformatics gebaseerde voorspellingen blijven te onthullen van netwerken van interactie voor verschillende autophagy-gerelateerde eiwitten, bevestiging van deze interacties met behulp van klassieke biochemie en Microscopie methodes is belangrijk om te ontdekken van functionele en dynamische eigenschappen van dit fundamentele en belangrijke cellulaire traject.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door de wetenschappelijke en technologische onderzoek Raad van Turkije (TUBITAK) 1001 Grant 107T153, de Sabanci Universiteit. SEB en NMK worden ondersteund door een TUBITAK BIDEB 2211 beurs voor Ph.D. studies.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypsin EDTA Solution A | Biological Industries | BI03-050-1A | |
| PBS | GE Healthcare | SH-30256.01 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma | 5671 | |
| DMEM (low glucose) | Sigma | 5546 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Hemocytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| coverslides | Jena Bioscience | CSL-103 | |
| slides | Isolab | I.075.02.005 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Torin | Tocris | 4247 | |
| DMSO | Sigma | VWRSAD2650 | |
| EBSS | Biological Industries | BI02-010-1A | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 15812-7 | |
| BSA | Sigma | A4503 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| LC3 Antibody | Sigma | L7543 | |
| Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11011 | |
| RACK1 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17754 | |
| Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| NP-40 | Applichem | A16694.0250 | |
| Sodium Chloride | Applichem | A9242.5000 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Biochemika | A2572 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Triton-X | Applichem | 4975 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| ATG5 Antibody | Sigma | A0856 | |
| Glycerol | Applichem | A4453 | |
| β-Mercaptoethanol | Applichem | A1108.0250 | |
| Bromophenol blue | Applichem | A3640.0005 | |
| Non-Fat milk | Applichem | A0830 | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Sodium Azide | Riedel de Haen | 13412 | |
| Phenol red | Sigma | 114537-5G | |
| anti-rabbit IgG , HRP conjugated | Jackson Immuno. | 1110305144 | |
| Luminol | Fluka | 9253 | |
| Coumeric Acid | Sigma | C9008 | |
| Hydrogen Peroxide | Merck | K35522500604 | |
| anti mouse IgG, HRP conjugated | Jackson Immuno. | 115035003 | |
| β-Actin Antibody | Sigma | A5441 | |
| Normal rabbit serum | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | |
| Rapamycin | Sigma | R0395 | |
| Protein A-Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2001 | |
| fetal bovine serum | Biowest | S1810-500 | |
| penicillin/streptomycin solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-glutamine | Biological Industries | BI03-020-1B | |
| Bradford Solution | Sigma | 6916 | |
| Nitocellulose membrane | GE Healthcare | A10083108 | |
| X-ray Films | Fujifilm | 47410 19289 | |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 |
References
- Oral, O., Akkoc, Y., Bayraktar, O., Gozuacik, D. Physiological and pathological significance of the molecular cross-talk between autophagy and apoptosis. Histol Histopathol. 31, 479-498 (2016).
- Korkmaz, G., Tekirdag, K. A., Ozturk, D. G., Kosar, A., Sezerman, O. U., Gozuacik, D. MIR376A is a regulator of starvation-induced autophagy. PLoS One. 8, e82556 (2013).
- Itah, Z., et al. Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue. Exp Biol Med (Maywood). 238, 1242-1250 (2013).
- Gozuacik, D., Kimchi, A. Autophagy as a cell death and tumor suppressor mechanism). Oncogene. 23, 2891-2906 (2004).
- Erzurumlu, Y., Kose, F. A., Gozen, O., Gozuacik, D., Toth, E. A., Ballar, P. A unique IBMPFD-related P97/VCP mutation with differential binding pattern and subcellular localization. Int J Biochem Cell Biol. 45, 773-782 (2013).
- Kuzuoglu-Ozturk, D., et al. Autophagy-related gene, TdAtg8, in wild emmer wheat plays a role in drought and osmotic stress response. Planta. 236, 1081-1092 (2012).
- Longatti, A., Tooze, S. A. Vesicular trafficking and autophagosome formation. Cell Death Differ. 16, 956-965 (2009).
- Erbil, S., et al. RACK1 Is an Interaction Partner of ATG5 and a Novel Regulator of Autophagy. J Biol Chem. 291, 16753-16765 (2016).
- Gozuacik, D., Yagci-Acar, H. F., Akkoc, Y., Kosar, A., Dogan-Ekici, A. I., Ekici, S. Anticancer use of nanoparticles as nucleic acid carriers. J Biomed Nanotechnol. 10, 1751-1783 (2014).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59, 94-123 (1995).
- Uetz, P., et al. A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 403, 623-627 (2000).
