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Biology

Étude des Interactions protéine-protéine dans la recherche de l’autophagie

Published: September 9, 2017 doi: 10.3791/55881

Summary

Présentées ici sont deux techniques de recherche d’interaction protéine-protéine de base d’anticorps : immunofluorescence et immunoprécipitation. Ces techniques ne conviennent pas pour l’étude des interactions physiques entre les protéines pour la découverte de nouvelles composantes des voies de signalisation cellulaires et pour comprendre la dynamique de protéine.

Abstract

Interactions protéines-protéines sont importantes pour les cascades de signalisation cellulaire compréhension et identification des composants de voie nouvelle et dynamique des protéines. La majorité des activités cellulaires nécessite des interactions physiques entre les protéines. Pour analyser et cartographier ces interactions, les différentes techniques expérimentales ainsi que des outils bioinformatiques ont été développés. Autophagie est un téléphone cellulaire, mécanisme qui permet aux cellules faire face aux différents stress, y compris l’hypoxie, produits chimiques et la privation nutritive de recyclage. Afin de mieux comprendre les événements de signalisation liés à autophagie et de découvrir de nouveaux facteurs régulateurs complexes protéiques dans autophagie, nous avons réalisé des écrans d’interaction protéine-protéine. Validation de ces résultats de dépistage nécessite l’utilisation de l’immunofluorescence et techniques de l’immunoprécipitation. Dans ce système, les interactions protéine-protéine autophagie spécifique que nous avons découvert ont été testées en Neuro2A (N2A) et des lignées de cellules HEK293T. Détails des procédures techniques utilisées sont expliquées dans le présent document expérience visualisées.

Introduction

Macroautophagy (autophagie, ci-après) est un mécanisme de stress cellulaire qui se caractérise par la séquestration du cytoplasme en vrac, les protéines et les organelles dans les vésicules de membrane double appelés autophagiques vésicules. Par fusion de la couche externe de la membrane double, vésicules autophagiques et leurs cargaisons sont envoyées vers les lysosomes et dégradent y1. Autophagie se produit à faible taux de base dans tous les types de cellules et dans tous les organismes exerçant des fonctions homéostatiques tels que la dégradation des protéines et organelle (p. ex., mitochondries) chiffre d’affaires. Dans des conditions menant à des stress cellulaire, comme la famine, autophagie est rapidement augmentée et permet à la cellule de maintenir des niveaux d’énergie et le métabolisme de base1,2,3.

Environ 30 autophagie gènes ont été clonés à partir de la levure et de leurs produits protéiques ont été montrés à jouer un rôle dans les différentes étapes du processus autophagique, y compris la nucléation de la vésicule, l’expansion, la fusion des vésicules de l’endosome tardif/lysosome et la dégradation de la cargaison 4 , 5. orthologues de la majorité de ces gènes ont été identifiés et études dans divers organismes ont confirmé la préservation de leurs fonctions cellulaires6. Études dans la dernière décennie a montré que plusieurs autophagie liés complexes protéiques et interactions protéine-protéine existent et qu’elles régissent les voies autophagie de manière complexe et contrôlée. Intersections, sauvegardes, vos commentaires et feedforward mécanismes existent, et ils permettent à la cellule de coordonner l’autophagie avec d’autres événements connexes (tels que la sécrétion vésiculaire, biogenèse lysosome, endosomale tri et transport7, etc.) Dans un écran impartiale levure-double hybride utilisant la protéine de l’autophagie ATG5 comme un appât, (ATG5 est une protéine de l’autophagie clés impliquées dans le système de conjugaison E2-like qui médie LC3 lipidation en famine induite par autophagie), nous avons identifié le récepteur activé C-Kinase 1 (racks 1 ; GNB2L1) comme un interacteur forte et une composante d’autophagie roman8. Ce qui est important, l’écran a montré que l’interaction ATG5-racks 1 était indispensable pour l’induction d’autophagie par inducteurs autophagie classique (c'est-à-dire, la famine et le mTOR inhibition).

Méthodes axées sur l’immunofluorescence sont utilisées pour surveiller les interactions protéine-protéine. Ces techniques sont principalement axés sur les anticorps et aident à visualiser les interactions et de confirmer la localisation cellulaire. Dans cette technique, fluorescentes tag conjugués anticorps spécifiques aux protéines d’intérêt sont généralement utilisés pour la coloration spécifique. Chaque protéine peut-être être étiqueté avec des anticorps couplés à des fluorochromes différents. À l’aide d’anticorps spécifiques de la protéine, une superposition du signal lorsque des images sont fusionnés indique la co-localisation des protéines sous microscopie confocale. Cette technique est applicable à des cellules ou tissus même. Techniques d’immunofluorescence fournissent des indices sur la dynamique de l’interaction et aident à identifier la taille et la distribution des complexes de protéines, tout en poursuivant l’évolution générale de la morphologie cellulaire sous différentes conditions9. L’immunoprécipitation est une autre technique souvent utilisée axée sur les anticorps qui permet l’analyse des interactions entre données protéines10. En utilisant cette technique, les protéines d’intérêt sont isolés des cellules ou tissus extraits à l’aide d’anticorps spécifiques, ce qui entraîne la précipitation des protéines qui sont dans un complexe ou en contact avec une protéine d’intérêt. Co-Immunoprécipitation, où la protéine et son co interacteur sont détectés, révèle non seulement l’interaction entre deux protéines, mais permet de mesurer sa force d’interaction sous différentes circonstances11.

Ce protocole décrit dans les techniques de clés de détail qui ont servi à confirmer et à caractériser les interactions ATG5-racks 1 et racks 1-LC3. L’accent est mis sur les techniques d’immunofluorescence et immunoprécipitation, avec l’accent des étapes critiques et des pièges pour la recherche de l’autophagie, mais aussi suggestions de dépannage.

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Protocol

1. immunofluorescence

  1. maintenir HEK293T rein embryonnaire humain cellules dans un milieu DMEM hyperglycémie et cellules de neuroblastes N2A souris en DMEM basse moyenne de glucose, dans un 5 % CO 2-humidifié incubateur à 37 ° C. Compléter les milieux de culture avec du sérum 10 % inactivés par la chaleur de foetus bovins (FBS), antibiotiques (50 U/mL de pénicilline, 50 µg/mL de streptomycine) et L-glutamine (2 mM).
  2. Détacher les cellules à l’aide de 0,25 % de trypsine. Tout d’abord, retirez le support de la culture cellulaire puis laver les cellules avec 10 mL stérile phosphate salin (PBS) et incuber 1 ml de trypsine à 37 ° C pendant 5 min. désactiver la trypsine en ajoutant 2 mL de milieu de DMEM.
  3. Laver la plaque bien en pipettant également. Enlever 10 µL de solution de cellule et mélangez-le avec 10 µL de bleu trypan. Compter le nombre de cellules vivantes à l’aide d’un hémocytomètre.
  4. Les deux HEK293T et N2A est des lignées de cellules adhérentes, cependant, les cellules HEK293T se détachent de la plaque facilement. Par conséquent, si vous travaillez avec une lignée de cellules HEK293T, manteau la coverslides avec stérile filtrée 0,01 % poly-L-lysine avant d’ensemencer les cellules.
    1. Lieu coverslides stérile dans une boîte de Pétri de 10 cm. Ajouter la quantité appropriée de la solution de la poly-L-lysine sur chaque coverslide. Incuber le coverslides avec la solution de la poly-L-lysine pour 10 min.
    2. Supprimer la solution de la poly-L-lysine.
      Remarque : La Poly-L-lysine est réutilisable ; Il est facultatif de recueillir et de la réutiliser pour d’autres expériences. La poly-L-lysine étant toxique, attendez jusqu'à ce que toute la solution sur la coverslides s’évapore complètement et ensuite récupérer la poly-L-lysine.
    3. Laver les coverslides avec du PBS stérile.
  5. Ajouter 1 mL DMEM dans chaque puits d’une plaque de 12 puits. Placer un coverslide dans chaque puits.
  6. Graine 20 000 cellules/puits, goutte à goutte et en agitant la plaque en même temps pour une répartition homogène des cellules sur la coverslides. Garder les cellules dans le CO 2 incubateur à 37 ° C et ajouter le médicament afin que le temps d’incubation totale ne dépasse pas 48 h, c'est-à-dire pendant 3 h traitement de Torin, ajouter le médicament au 45 h post semis. Études sur les interactions
    1. pour racks 1-LC3, Torin 1, la rapamycine et la famine ont été utilisés comme inducteurs de l’autophagie. Les cellules sont incubées avec Torin 1 pendant 3 h (concentration finale 250 nM) ; avec la rapamycine pendant 16 h (concentration finale 200 nM) ; et avec Earle ' s Balanced Salt Solution (EBSS) pendant 2 h afin d’affamer les cellules.
      Remarque : L’Incubation en DMEM avec 10 % de BF a été utilisé comme la condition de contrôle.
  7. Après 48 h de temps d’incubation totale, retirez le support sur les coverslides et les laver avec 1 mL de PBS.
  8. Pour fixer les cellules, incuber les cellules avec 1 mL glace froide stérile filtrée 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans du PBS 1 x (pH 7,4), pendant 20 min à température ambiante sans aucune agitation.
    PFA étant sensible à la lumière, garder (important) la plaque dans l’obscurité pendant la période d’incubation ; peut aider à couvrir la plaque avec du papier aluminium. Par ailleurs, l’IFP est toxique, donc, travailler sous une hotte de laboratoire tout en fixant les cellules.
    Remarque : Gardez à l’esprit que la fixation étape dans des expériences d’immunofluorescence doit être optimisé, que des anticorps spécifiques peuvent fonctionner mieux, à l’aide de fixation différents agents ou conditions de.
  9. Après 20 min d’incubation de la PFA, enlevez d’abord la solution PFA sur le coverslides et laver ensuite chaque échantillon 3 fois avec du PBS filtré stérile 1 mL. À cette étape, (importante) laver les puits un manière à ne pas laisser sécher. Éviter le séchage puisqu’elle va interférer avec des réactions subséquentes des cellules, changer la morphologie cellulaire et augmenter les signaux non spécifique.
  10. Une fois le lavage terminé, conserver les échantillons dans 1 mL de PBS sur la glace.
  11. Préparer la solution de blocage : PBS avec 0,1 % Bovine Serum Albumin (BSA) et 0,1 % de saponine.
  12. Couvrir une plaque 6 puits avec film de paraffine. Assurez-vous que le fond de la boîte est lisse après la pelliculeuse de paraffine. L’étiquette de la plaque 6 puits.
  13. à l’aide de pinces à épiler, transfert le coverslides sur les plaques de 12 puits aux plaques 6 puits recouverts de film de paraffine.
  14. Jeter le PBS sur coverslides et ajouter 100 µL de solution sur chaque coverslide pour perméabilisation de blocage. Incuber les échantillons sur la glace pendant 30 min.
  15. Préparer l’anticorps primaire en bloquant la solution. Avant les expériences, optimiser les dilutions d’anticorps pour définir les meilleures concentrations de travail pour souiller.
    NOTE : par exemple, LC3 anticorps sert à une dilution au 1/100 en bloquant la solution.
  16. Après l’incubation de 30 min, jeter la solution de blocage et laver une fois les échantillons doucement avec 1 mL de PBS.
  17. Ajouter 100 µL de solution d’anticorps primaire à chaque coverslide. Incuber les échantillons à la température ambiante pendant 1 h, sur un agitateur.
    NOTE : Les temps d’Incubation avec l’anticorps primaire doit être optimisé. Selon l’anticorps, une incubation durant la nuit à 4 ° C peut être préférable. Il est préférable de les incuber dans un shaker, verser doucement (100 rotations par minute) de distribuer également l’anticorps sur la coverslides.
  18. Après incubation avec l’anticorps primaire, laver les échantillons individuellement, 3 fois avec 1 mL de PBS.
  19. Prepare anticorps secondaire au 1/500 en bloquant la solution (optimisations des dilutions de l’anticorps secondaire peuvent être nécessaires). Ici, le anti-lapin IgG Alexa Fluor 568 a été utilisé comme un anticorps de anti-lapin secondaire.
    1. Incuber les échantillons avec les 100 µL de solution d’anticorps secondaire pendant 1 h à température ambiante sur un agitateur. Puisque les anticorps secondaires marqué fluorophore sont sensibles à la lumière, (important) conserver la solution dans l’obscurité. Placer les échantillons dans l’obscurité pendant et après l’incubation de l’anticorps secondaire.
  20. Après l’incubation de l’anticorps secondaire, laver la plaque 3 fois avec du PBS.
    NOTE : Baed sur l’expérience, certains anticorps ont des signaux de fond élevé qui ne peuvent pas être éliminées par le PBS se lave. Si vous traitez avec un tel anticorps, après l’étape 1.21, conserver les échantillons dans du PBS à 4 ° C pendant 6 h peut aider.
    1. Le cas échéant, détachant les cellules avec un colorant de liaison à l’ADN, comme Hoechst, pour marquer les noyaux.
  21. Pour souiller plus d’une protéine, appliquez la même procédure à partir de l’étape 1.16 pour la deuxième protéine.
    1. S’assurer qu’il n’y a aucune réactivité des espèces entre les anticorps lorsque vous effectuez une coloration avec plus d’un anticorps (p. ex., utilisation des anticorps de souris et lapin).
      Remarque : Ici, racks 1 est taché comme la deuxième protéine à l’aide d’anti-racks 1 anticorps primaires et anticorps secondaires de anti-souris IgG Alexa Fluor 488 en utilisant les mêmes concentrations mentionnées ci-dessus.
  22. Préparez la solution de montage : 50 % glycérol dans du PBS 1 x. Filtrer sur un filtre 22 µm.
  23. Essuyer les lames avec de l’éthanol à l’aide d’un chiffon non pelucheux et ajouter 10 µL de solution de montage à chaque diapositive. À l’aide d’une pince, placer le coverslides sur chaque dropso que le côté avec les cellules est en contact direct avec le milieu de montage. Jeter la solution de montage excès délicatement à l’aide de chiffons pelucheux.
  24. Joint le coverslides avec un vernis à ongles transparent. Tout d’abord, stabiliser le coverslides en ajoutant des gouttes de vernis à ongles sur les 4 bords et puis les sceller complètement.
  25. Analyse des échantillons sous un microscope à fluorescent ou confocal dès que possible, étant donné que le signal fluorescent peut blanchir après quelques heures.
< classe p = « jove_title "> 2. Immunoprécipitation

  1. détacher et comptage des cellules comme décrit aux points 1.2 et 1.3.
  2. Si vous travaillez avec des cellules HEK293T, graines 4 millions de cellules pour chaque condition en Pétri de 15 cm. Si vous travaillez avec des cellules N2A, graines 5 millions de cellules en Pétri de 15 cm. Incuber les cellules dans un incubateur à CO 2 à 37 ° C jusqu'à la fin de l’expérience.
  3. Traiter les cellules avec les drogues ou les conditions pour une durée définie pour que le temps d’incubation totale des cellules ne dépasse pas 48 h.
    Remarque : Pour les essais d’immunoprécipitation dans cette étude, les cellules ont été traitées pendant 3 h avec 1 Torin (250 nM), 16 h avec la rapamycine (200 nM) et 2 h avec EBSS. DMEM avec 10 % de BF a été ajouté aux cellules comme contrôle.
  4. Après 48 h de temps d’incubation totale, retirez le support et récolter les cellules. Puisque les cellules HEK293T se détachement facilement de la plaque, laver la plaque de glace PBS froid peut être suffisante pour la récolte. Cependant, les cellules N2A résistent mieux au détachement ; utiliser des grattoirs à cellules afin de récolter les cellules.
    1. Recueillir toutes les cellules dans des tubes de microcentrifuge.
  5. Échantillons de centrifugeuse à 16 000 x g pendant 15 min à 4 ° C. jeter le surnageant et laver le culot avec 1 mL de PBS en la re-suspendant par pipetage.
  6. Répéter l’étape de la centrifugeuse, mais à la vitesse maximale de centrifuger à 4 ° C pendant 15 min. éliminer le surnageant.
  7. Tampon de dosage Immuno-précipitation de Radio préparer (RIPA) avant de commencer l’expérience.
    Remarque : Il existe 3 types de tampon RIPA ; choisir en fonction de l’intensité de l’interaction des protéines étudiées (voir formules ci-dessous).
    1. S’il y a une interaction protéine-protéine solide, choisissez le tampon RIPA régulière.
    2. Si l’interaction est faible, choisir RIPA doux ou doux RIPA.
      Remarque : Les recettes de ces tampons sont dans les étapes suivantes. Tous les tampons qui sont utilisées pour l’immunoprécipitation épreuves devraient être complétés par des inhibiteurs de protéase.
      1. Préparer régulièrement tampon RIPA en utilisant 1 % NP-40, NaCl 150 mM, désoxycholate de sodium 0,5 % et 0,1 % sodium dodécyl sulfate dans 50 mM Tris pH 8.
      2. Préparer doux RIPA tampon à l’aide de désoxycholate de sodium NP-40, NaCl 150 mM et 0,25 % de 1 % en 50 mM Tris pH 7.5.
      3. Préparer le tampon RIPA plus doux en utilisant 1 % Triton X 100, 137 mM NaCl, 1 % de glycérol et orthovanadate de sodium 1 mM à 50 mM Tris pH 7.4.
  8. Après avoir choisi le tampon approprié de RIPA, compléter la mémoire tampon avec les inhibiteurs de la protéase (RIPA +). Puis, lyser les cellules avec 3 x le volume du culot cellulaire dans RIPA +.
  9. Vortex la suspension pendant 15 s. garder sur glace pour 5 min. Répétez vortex et glaçage 5 fois et puis centrifuger les échantillons à 16 000 x g pendant 15 min à 4 ° C.
  10. Transférer le surnageant dans un tube propre microcentrifuge et la centrifugeuse pour retirer les débris cellulaires vestige. Transférer le surnageant dans un tube propre.
  11. Diluer la protéine lysats 01:50 et prépare une plaque à 96 puits avec blank et normes. Diluer les échantillons.
    1. Échantillons de Mix avec Bradford solution 01:20. Incuber pendant 15 min dans le noir.
    2. Mesurer la densité optique à une longueur d’onde de 595 nm. Calculer la concentration de la protéine à l’aide de valeurs d’absorbance pour chaque échantillon.
  12. Le jour avant la récolte des cellules, couple perles A Plus de protéine avec des anticorps spécifiques à la protéine d’intérêt.
    1. Couper le bord d’une pointe 200 µL à l’aide de ciseaux et utiliser 25 µL dans la boue de perle pour chaque condition.
    2. Laver les billes une fois avec 1 mL de PBS, une fois avec 1 mL de tampon de RIPA et une avec 1 mL RIPA +. Effectuer les étapes de lavage à 3 300 x g, 4 ° C pendant 1 min.
    3. Après le dernier lavage, ajouter 300 µL de RIPA + sur les perles et ajoutez 1,5 µg l’anticorps spécifique à la protéine d’être tiré vers le bas.
    4. Incuber les tubes pendant la nuit à 4 ° C sur un rotateur (20 rotations/minute).
      Remarque : Ici, ATG5 a été immunoprécipitée en utilisant des anticorps spécifiques anti-ATG5.
  13. Après l’incubation d’une nuit ou plus de perles avec l’anticorps, laver les billes une fois avec du PBS, une fois avec RIPA et une avec RIPA + tel que décrit à l’étape 2.12.2.
  14. Ajouter 2 mg de protéine lysat sur les perles pour chaque condition et compléter le volume total à 300 µL avec RIPA + tampon/tube. Incuber les tubes pendant la nuit sur un rotateur à 4 ° C.
  15. Après l’incubation, laver les perles comme décrits précédemment (étape 2.12.2).
    1. Après le dernier lavage, utiliser un plus petit embout de la pipette pour retirer tout le liquide surnageant sans toucher les billes de.
    2. Ajouter 10 µL de 3 x colorant de chargement : 6 % SDS, 30 % de glycérol, 16 % de β-mercaptoéthanol et bleu de bromophénol 0,1 % à 1M Tris-HCl pH 6.8.
  16. Préparer les contrôles d’entrée à l’aide de protéines au moins 100 µg lysat pour chaque condition. Égaliser le volume des échantillons à l’aide de l’eau et ajouter le volume approprié de 3 x chargement colorant.
  17. Échantillons de bouillir à 95 ° C pendant 10 min.
    Remarque : Généralement en bouillant les échantillons, les bouchons des tubes peuvent ouvrir spontanément et échantillons sont perdus. Éviter cela en maintenant les chapeaux fermés avec un bloqueur spécifique cap.
  18. Spin les échantillons et les charge sur gel SDS-PAGE pour séparer les protéines selon leurs tailles à l’aide de protocoles standard.
    Remarque : Dans cette étude sur racks 1 et ATG5, échantillons ont été exécutés par l’intermédiaire de 12 % des gels de polyacrylamide à 80 V pendant 30 min, puis à 120 V pour environ 90 min. Toutefois, pour les protéines plus petites telles que LC3, à l’aide de gels de polyacrylamide de 15 % est plus approprié.
  19. Après que le gel en cours d’exécution est terminé, transférer les protéines à la nitrocellulose ou membranes PVDF à l’aide de deux méthodes de transfert humide ou semi-humide. Ensuite, bloquer les membranes par incubation dans le lait écrémé de 5 % dans du PBS avec 0,05 % Tween 20 (PBST) à température ambiante pour les membranes de lavage 1 h. 3 fois avec PBST pendant 5 min.
  20. Incuber les membranes avec des anticorps primaires à des concentrations de travail pendant 1 h à température ambiante. Pour les dilutions de l’anticorps primaire, utilisez BSA contenant des solutions de rouges (5 % BSA Cohn V Fraction, 0,02 % d’azide de sodium dans du PBST, pH 7,5 ; Ajouter rouge de phénol ajouté comme un marqueur de pH) pour permettre la réutilisation des anticorps.
    NOTE : par exemple, diluer ATG5 anticorps x 2 000 dans la solution rouge.
    1. à la fin de la période d’incubation, laver les membranes 3 fois avec PBST.
  21. Incuber les membranes avec HRP-conjugués Anticorps secondaires qui ont été préparés dans une solution de lait écrémé 5 % (ici, le anti-lapin IgG à 1:10.000 a été utilisé). Puis laver les membranes 3 x avec PBST pendant 5 min.
  22. Faire la solution ECL : 25 mM luminol, l’acide coumarique 9 mM, 3 x 10 -4 % H 2 O 2 à 70 millimètres Tris-HCl pH 8,8. Utilisez des fraîches H 2 O 2 pour chaque expérience.
    Remarque : La réaction démarre après H 2 < /sub > O 2 addition et il se poursuit pendant environ 20 min.
    1. Incuber les membranes et x-ray des films pendant 20 min en Dec. Développer et fixez-les dans une pièce sombre.
  23. Pour vérifier le co-immunoprécipitation des protéines avec close ou chevauchement des poids moléculaires, il peut être nécessaire dépouiller les anticorps hors les membranes en incubant les membranes à 60 ° C pendant 30 min dans le tampon de décapage : (pH 25 mM Tris-HCl 2 et 1 % SDS).
  24. Répéter les étapes 2.20 à 2.23 pour vérifier les co-immunoprécipitation utilisant des anticorps différents. Par exemple, suite à détection ATG5 et décapage des membranes, racks 1 protéine a été testé sur les membranes mêmes en utilisant un anticorps primaire anti-racks 1 (1:1, 000) et des anticorps secondaires (01:10, 000). Β-actine est utilisée comme contrôle chargement ; et signal IgG a été utilisé sous le contrôle de chargement pour les échantillons d’immunoprécipitée.

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Representative Results

Dans la Figure 1 un exemple d’une co-localisation résultat obtenu à l’aide de ce protocole est montré. Une figure de notre récent livre, figure8. Ici, protéine endogène de racks 1 a été coloré en vert, tandis que LC3 endogène a été teinté en rouge. Les points jaunes qui sont observées dans les images fusionnées indiquent les sites de chevauchement entre les signaux rouges et verts. Les points jaunes représentent ainsi la co-localisation partielle de ces deux protéines.

Figure 1
Figure 1 : Résultats représentatifs immunofluorescence. Les cellules HEK293T sont cultivés sur coverslides. Les cellules ont été traités ou non traités par la rapamycine (Rapa, 200 nM, 16 h) ou 1 Torin (Torin, 250 nM, 3 h) ou affamées dans EBSS (Stv, 2 h). Puis protéines endogènes ont été immunomarquées en utilisant des anticorps primaires anti-RACK1 et anti-LC3. Les cellules ont été analysées au microscope confocal. CNT, les cellules non traitées ; Fusion, superposition de coulée redsignals. Arrowsshow yellowcytoplasmic points avec racks 1 et LC3 co-localisation blancs. Cette recherche a été initialement publiée par Erbil et al. 8 s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Dans la Figure 2, un exemple d’un résultat d’immunoprécipitation endogène est présenté. Dans cette figure, protéines ATG5 a été précipitée et racks 1 co-immunoprécipitation a été détecté dans des conditions différentes. Sérum de lapin normal a été utilisé comme contrôle négatif.

Figure 2
Figure 2 : Résultats représentant immunoprécipitation. Les cellules HEK293T étaient traités pas traités avec la rapamycine (Rapa, 200 nM, 16 h) ou 1 Torin (Torin, 250 nM, 3 h) ou étiolées dans EBSS (2 h). Protéine ATG5 endogène a été immunoprécipitée des extraits cellulaires en utilisant des anticorps anti-ATG5 qui sont couplés aux billes A Plus de protéine. Anticorps anti-ATG5 et anti-racks 1 ont été utilisées pour immunoblotting. Sérum, sérum de lapin de contrôle. Cette recherche a été initialement publiée par Erbil et al. 8. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Ces résultats indiquent que les racks 1 protéine est impliquée dans les voies de l’autophagie. Racks 1 protéine localisée conjointement avec la protéine LC3 sur les structures de l’autophagosome-comme au cours de l’induction de l’autophagie. En outre, co-immunoprécipitation résultats ont montré que des protéines RACK1 et ATG5 étaient interaction même en conditions basales, et les niveaux d’interaction a augmenté sous l’autophagie activant des conditions. Nous avons confirmé précédemment à l’aide de dégradation p62 et essais d’accumulation LC3-II en présence ou en absence d’inhibiteurs lysosomales (bafilomycine A, E64D/pepstatine A) que le flux autophages n’est pas inhibée sous les conditions expérimentales8. Par conséquent, les résultats présentés ici et ailleurs ont montré que les racks 1-ATG5 interaction est importante pour les étapes initiales de l’autophagie.

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Discussion

Techniques d’immunoprécipitation et immunofluorescence sont essentiels pour l’étude des interactions protéine-protéine. Bien que ces deux techniques sont couramment utilisés et bien établie, plusieurs critères devraient être considérés pour définir la qualité des expériences tout en utilisant ces techniques.

Tout d’abord, primaires des anticorps qui sont utilisées pour ces épreuves doivent être spécifiques aux protéines d’intérêt. Pour ce faire, utilisez shARN passes rabattues ou cellules knockout pour tester la spécificité de l’anticorps en question. En outre, utiliser des contrôles positifs, ou traiter des cellules avec un inducteur connu de la protéine d’intérêt. Lot à lot de variations d’anticorps existent aussi bien. Par ailleurs, certains anticorps polyclonaux ou sérums peut-être ambiants et bandes non spécifiques. Bien que certaines de ces bandes peuvent être des formes alternatives de la protéine d’intérêt, en général, qu’elles résultent de la réaction croisée des anticorps polyclonaux avec protéines apparentées ou ils peuvent être non spécifiques Interactiens. Les anticorps monoclonaux sont en général plus spécifique en ce sens, bien que les signaux générés peuvent être plus faibles. La confirmation de la spécificité de l’anticorps avec protéines étiquetées et des anticorps anti-balises établies peut être utile, mais les interactions endogènes sont encore plus précieux et indispensable.

Tests de co-localisation ou co-immunoprécipitation définitivement n’établira pas si les interactions protéine-protéine sont directes. Il est possible que d’autres partenaires peuvent médier les interactions observées. En effet, dans la Figure 1, une co-localisation partielle des protéines RACK1 et LC3 a été observée, qui pourrait être un signe de leur interaction ; Toutefois, une liaison directe tests tels que in vitro déroulant des analyses à l’aide de protéines recombinantes ou microscopie Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) peut-être être utilisée pour établir si les interactions observées sont directes ou non. En revanche, les techniques telles que la filtration sur gel vont aidera à découvrir les interactions de protéine complexe impliquant plus de deux protéines de manière plus convaincante. Une analyse plus rigoureuse des résultats du point de vue de l’autophagie immunofluorescence serait de contrôler l’induction de l’autophagie en comptant le nombre de points qui sont positifs pour le marqueur d’autophagie LC3 dans chaque cellule, depuis l’augmentation du nombre de LC3 les points positifs est en corrélation avec le nombre des autophagosomes. Utilisation du coefficient de Pearson, méthode de Li ou tests de coefficients Manders fournissent la meilleure évaluation quantitative et comparative des résultats expérimentaux.

Un autre point important est la validation des interactions à l’aide de techniques indépendants et lignées cellulaires différentes. Certaines interactions peuvent être des artefacts liés à la viscosité de protéines ou de la surexpression de la protéine. Si pas soigneusement lavées, les protéines ATG5 est également sujette à coller aux talons qui sont utilisés dans l’immunoprécipitation (agarose ou Sépharose perles). En outre, dans les tests d’immunofluorescence, surexpression de la protéine peut forment des agrégats qui ressemblent à des autophagosomes ou autolysosomes. Par conséquent, tout en effectuant des transfections transitoires en utilisant conjointement transfectées protéines fluorescentes sous le contrôle de l’efficacité de transfection, en immuno-Blot, niveaux d’expression des protéines d’intérêt peuvent être comparés aux niveaux de la protéine fluorescente dans les extraits à l’aide anticorps spécifiques, fournissant une méthode de normalisation.

Dans tous ces tests, reproductibilité des résultats est d’une importance capitale. L'on préfère répéter chaque expérience au moins 3 - 4 fois pour être convaincu des résultats obtenus. Nous réalisons également des expériences similaires dans au moins deux lignées différentes de prouver que nos observations ne sont pas spécifiques à un type de cellule. En outre, des témoins positifs et négatifs correctes (par exemple, perles seuls ou anticorps de contrôle et sérum pour les essais d’immunoprécipitation) doivent être planifiées pour parvenir à des conclusions correctes. Lors de l’optimisation des techniques d’immunofluorescence, il est utile d’avoir un contrôle seul anticorps secondaire où les anticorps primaire est omis. Ce contrôle s’assurer qui a observé les signaux proviennent de la liaison de l’anticorps primaire de la protéine d’intérêt et pas d’une liaison non spécifique de l’anticorps secondaire.

Le nombre de complexes protéiques régulation autophagie et autres événements biologiques se multiplient dans la découverte, mais la recherche est loin d’avoir une image complète. Bien que haut débit techniques comme la spectrométrie de masse ou de prédictions axée sur la bioinformatique continuent de révéler des réseaux d’interaction pour plusieurs protéines liées à autophagie, confirmation de ces interactions à l’aide de biochimie classique et méthodes de microscopie est important afin de découvrir les propriétés fonctionnelles et dynamiques de cette voie cellulaire fondamentale et importante.

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Disclosures

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par la recherche scientifique et technologique Conseil de Turquie (TUBITAK) 1001 Grant 107T153, l’Université Sabanci. SEB et NMK sont pris en charge par une bourse TUBITAK BIDEB 2211 pour des études de doctorat.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Trypsin EDTA Solution A Biological Industries  BI03-050-1A
PBS GE Healthcare SH-30256.01
DMEM (high glucose) Sigma  5671
DMEM (low glucose) Sigma 5546
Trypan Blue Sigma T8154
Hemocytometer Sigma Z359629-1EA
coverslides Jena Bioscience CSL-103
slides Isolab I.075.02.005
Poly-L-Lysine Sigma  P8920
Torin Tocris 4247
DMSO Sigma VWRSAD2650
EBSS Biological Industries  BI02-010-1A
Paraformaldehyde (PFA) Sigma 15812-7
BSA Sigma  A4503
Saponin Sigma 84510
LC3 Antibody Sigma L7543
Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 568  Invitrogen A11011
RACK1 Antibody Santa Cruz Biotechnology  sc-17754
Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488  Invitrogen A11001
NP-40 Applichem A16694.0250
Sodium Chloride Applichem A9242.5000
Sodium deoxycholate Sigma 30970
Sodium dodecyl sulphate (SDS) Biochemika A2572
Trizma Base Sigma T1503
Triton-X  Applichem 4975
Sodium orthovanadate Sigma 450243
ATG5 Antibody Sigma A0856
Glycerol Applichem A4453
β-Mercaptoethanol  Applichem A1108.0250
Bromophenol blue  Applichem A3640.0005
Non-Fat milk Applichem A0830
Tween 20 Sigma P5927
Sodium Azide Riedel de Haen 13412
Phenol red  Sigma 114537-5G
anti-rabbit IgG , HRP conjugated Jackson Immuno.  1110305144
Luminol Fluka 9253
Coumeric Acid Sigma C9008
Hydrogen Peroxide Merck K35522500604
anti mouse IgG, HRP conjugated Jackson Immuno. 115035003
β-Actin Antibody Sigma  A5441
Normal rabbit serum Santa Cruz Biotechnology sc-2027
Rapamycin Sigma  R0395
Protein A-Agarose Beads Santa Cruz Biotechnology sc-2001
fetal bovine serum  Biowest S1810-500
penicillin/streptomycin solution Biological Industries  03-031-1B
L-glutamine  Biological Industries  BI03-020-1B
Bradford Solution Sigma 6916
Nitocellulose membrane GE Healthcare A10083108
X-ray Films Fujifilm 47410 19289
Protease inhibitor Sigma P8340

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References

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Biologie cellulaire numéro 127 autophagie techniques de l’autophagie interactions protéine-protéine immunoprécipitation immunofluorescence anticorps microscopie confocale Western blot
Étude des Interactions protéine-protéine dans la recherche de l’autophagie
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Erbil-Bilir, S., Kocaturk, N. M.,More

Erbil-Bilir, S., Kocaturk, N. M., Yayli, M., Gozuacik, D. Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research. J. Vis. Exp. (127), e55881, doi:10.3791/55881 (2017).

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